CN108875314A - 一种基于表观遗传学修饰差异的靶基因的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种基于表观遗传学修饰差异的靶基因的检测方法，包括：抽提不同组别样本的外周血游离DNA；针对不同待测靶基因和/或同一靶基因的不同待测区域片段分别设计引物对组；利用引物对组分别对不同组别样本外周血游离DNA在高温变性条件下和低温变性条件下进行实时荧光定量PCR扩增，得到待测靶基因xn和/或同一靶基因待测区域片段xn的△Ctxn；进一步利用回归分析对△Ctxn进行加权计算并得到阈值，据此鉴别或溯源表观遗传学修饰差异的靶基因所在的组别或不同的来源。本发明通过对不同靶基因/或同一靶基因不同区域表观遗传学修饰差异的分析，为鉴别或溯源靶基因的不同来源提供了新的更加便捷的方法。

Description

一种基于表观遗传学修饰差异的靶基因的检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测领域。更具体地，涉及一种基于表观遗传学修饰差异的靶基因的检测方法。
背景技术
研究发现基因的表观遗传学修饰在基因的调控中具有重要的作用，是广谱性基因调控的重要手段，这样在丰度较低的DNA样本中，靶向基因修饰的检测则具有更高的敏感性。表观遗传学调控可发生在DNA水平、组蛋白水平以及染色质整体水平，表观遗传学修饰在基因的调控中主要可概括为三个方面，即书写器(Writer)、阅读器(Reader)、擦除器(Eraser)，书写器主要添加各种修饰，擦除器则是将添加的这些修饰去掉，阅读器是辨认这些修饰的改变并执行不同的功能。这样由书写器-阅读器-擦除器的组成的调控系统可实现对细胞的精确调控。
在DNA的甲基化修饰中，研究发现其修饰位点既可发生在基因的启动子序列中，也可发生在基因体(Gene Body)中。基因启动子的甲基化与基因表达呈负相关(影响转录因子以及RNA聚合酶的结合)，但对基因体中DNA甲基化的功能仍不清楚；在组蛋白的修饰中，组蛋白甲基化因所在的位点不同将具有完全不同甚至相反的功能，正是由于组蛋白的修饰的多样性以及不同位点的差异性，从而形成了所谓的组蛋白密码(Histone Code)。
在真核生物的天然DNA中，核小体是其存在的基本形式，这样位于核小体中组蛋白的各种修饰以及DNA中的甲基化修饰，共同实现对基因表达的最精确的调控。这样某些基因在不同组别样本中的表达不同主要归因于其表观遗传学修饰的差异，鉴定这些差异是目前表观遗传学研究的热点。虽然目前有不少的鉴定方法，如：结合亚硫酸钠处理的MSP、测序、甲基灯等，但通常存在操作步骤繁琐、转化效率不高、难以建立质控标准等问题，这样如何基于表观遗传学修饰差异建立便捷、高效、低成本的检测方法已成为当前的迫切需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于表观遗传学修饰差异的靶基因的检测方法，通过对不同靶基因/或同一靶基因不同区域表观遗传学修饰差异的分析，为鉴别或溯源其不同的来源提供了新的更加便捷的方法。基于该方法，在正常人与肿瘤来源外周血游离DNA中的研究发现，其可用于鉴别肿瘤来源的外周血游离DNA的分析，具有重要的临床价值。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
发明人研究发现，在高的变性温度(94℃)下，表观遗传学修饰对DNA的解链没有明显的影响，表现为完全解链，该条件下定量PCR扩增的Ct值标记为Ct HT；但在低温变性条件(实验条件需要摸索，原则是能测得DNA扩增的最低变性温度)下，表观遗传学修饰则对DNA的解链有较大的影响，表现为解链程度的不同，进而影响PCR扩增的效率，该条件下定量PCR扩增的Ct值标记为CtLT，△Ct＝|Ct HT–Ct LT|。在对靶基因不同区域的定量PCR扩增过程中，发明人发现低温变性条件下一些基因不同区域的扩增效率因样本来源不同而不同，即在低温条件下，相对于正常人，肿瘤患者靶基因中的某些区域片段更难以解链，表现为ΔCt值增大；为进一步证明这种差异来自于与表观遗传学修饰的不同，发明人以稀释后的PCR产物为模板进行再次扩增(该PCR产物为没有任何修饰的裸露DNA)，发现其ΔCt值显著不同于正常人以及肿瘤来源的DNA样本，表明靶基因在两种不同来源的样本中均存在表观遗传学修饰，而且这种表观遗传学修饰在正常人与肿瘤患者中是不同的。这样在不同组别的DNA中，针对可能存在表观遗传学修饰的不同靶基因和/或同一靶基因不同区域设计PCR引物，进行不同变性温度下的定量PCR检测，求得ΔCt值，这样根据ΔCt值的差异可以溯源靶基因的不同来源。
发明人针对不同靶基因和/或同一靶基因不同区域片段，通过大量的筛选实验，获得了特异的引物对组，该引物对组扩增的DNA区域具有明显的表观遗传学修饰，而且该区域在不同组别的样本中具有表观遗传学修饰的差异，为提高基于这种修饰差异鉴别不同组别的DNA准确性，进一步对不同靶基因和/或同一靶基因不同区域片段进行了联合分析，获得了不同靶基因(区域)ΔCt的加权值，并标记为ΔCt加权值，采用该ΔCt加权值的阈值(Cut Off值)对不同组别(来源)的DNA样本进行敏感性与特异性的分析，随着联合分析的靶基因(区域)数目的增多，ΔCt加权值及对应的阈值(Cut Off值)得到优化，其检测的敏感性与特异性得到进一步的提高。
基于以上研究，本发明提供了一种基于表观遗传学修饰差异的靶基因的检测方法，所述方法包括：
1)抽提不同组别(来源)样本的外周血游离DNA(肿瘤患者组和正常人组的外周血游离DNA)；
2)针对不同待测靶基因和/或同一靶基因的不同待测区域片段分别设计引物对组；
3)利用引物对组分别对不同组别(来源)样本的外周血游离DNA在高温变性条件下和低温变性条件下进行实时荧光定量PCR扩增，得到待测靶基因xn和/或同一靶基因待测区域片段xn的△Ct xn；其中，△Ct xn＝|Ct xn-HT–Ct xn-LT|，待测靶基因xn和/或同一靶基因待测区域片段xn在高温变性条件下的Ct值标记为Ct xn-HT，待测靶基因xn和/或同一靶基因待测区域片段xn在低温变性条件下的Ct值标记为Ct xn-LT；
4)利用回归分析对不同待测靶基因和/或同一靶基因不同待测区域片段的△Ct xn进行加权计算，具体公式为：
△Ct加权值＝a1*△Ct x1+a2*△Ct x2+……+an*△Ct xn；
其中，△Ct x1，△Ct x2，……，△Ct xn为不同待测靶基因和/或同一靶基因不同待测区域片段的△Ct值；a,a2,……,an为回归分析对不同靶基因和/或同一靶基因的不同区域片段对应的△Ct值给出的加权系数；
5)根据△Ct加权值得到的阈值鉴别或溯源表观遗传学修饰差异的靶基因所在的组别(来源)。
本发明基于靶基因在不同组别(来源)样本中的表观遗传学修饰不同，建立了DNA扩增效率与表观遗传学修饰差异的对应关系，进一步对不同靶基因多个区域片段△Ct进行加权计算，找到了用以鉴别或溯源靶基因不同组别(来源)的方法。
在本发明中所述高温变性条件为可以使得DNA完全解链的温度，优选的为94℃；所述低温变性条件为可以使得DNA部分解链的温度(根据实验进行确定)，原则上是可检测到DNA扩增的最低变性温度。
进一步，在靶基因的选择中，基于其在正常人与肿瘤中表达的差异性与广谱性，选择P53基因和/或胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因；其中，所述胞嘧啶脱氨酶包括AID基因、APOBEC3B/C基因，其相关分子基因包括YB1基因以及MLH1基因。P53作为肿瘤抑制基因，在几乎所有的肿瘤细胞中存在突变或异常表达，同样胞嘧啶脱氨酶也是在几乎所有的肿瘤细胞中高表达，造成单链DNA中C>T突变，是造成肿瘤细胞出现DNA大量突变的遗传学基础，YB1是一种单链DNA结合蛋白，其在肿瘤中广泛性高表达。MLH1是切除修复蛋白，肿瘤细胞中因DNA突变引起的负反馈，导致其在肿瘤细胞中广泛性高表达。
进一步，在检测区域的选择中，因表观遗传学修饰既可发生在基因的启动子区域，也可发生在基因体中，所以分别选择了启动子区域以及外显子区域进行检测。在本发明中，所述P53基因的待测区域片段包括外显子3区域片段长度为204bp的片段、外显子3区域片段长度为140bp的片段、外显子4区域片段长度为180bp的片段、外显子4区域片段长度为153bp的片段；所述AID基因的待测区域片段选自启动子区域片段长度为145bp的片段、外显子3区域片段长度为169bp的片段；所述APOBEC3B/C基因的待测区域片段选自启动子区域片段长度为135bp的片段；所述YB1基因的待测区域片段选自启动子区域片段长度为102bp的片段；所述MLH1基因的待测区域片段选自外显子1区域片段长度为169bp的片段。
本发明检测结果显示，靶基因一些区域的检测值在不同组别的样本(正常人与肿瘤患者)中具有显著的差异性，而且该区域不仅局限于启动子也可能位于一些外显子中。进一步将不同靶基因和/或同一靶基因不同区域进行组合，经统计学分析得出△Ct的加权值，基于该加权值得出的阈值对不同组别标本进行阴阳性鉴别。另外，研究发现，随着组合的基因(或区域)数目的增加，该检测方法的敏感性与特异性得到更大的提高。
进一步，所述检测引物对组由序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.25所示的核苷酸序列组成的引物对组；
其中，序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2分别为扩增P53基因外显子3区域片段长度为140bp的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.3为扩增该区域片段的探针；SEQ ID No.4和SEQ ID No.5分别为扩增P53基因外显子3区域片段长度为204bp的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.6为扩增该区域片段的探针；序列SEQ ID No.7和SEQ ID No.8分别为扩增P53基因外显子4区域片段长度为153bp的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.9为扩增该区域片段的探针；序列SEQ ID No.10和SEQ ID No.8分别为扩增P53基因外显子4区域片段长度为180bp的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.9为扩增该区域片段的探针；
序列SEQ ID No.11和SEQ ID No.12分别为扩增AID基因启动子区域片段长度为145bp的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.13为扩增该区域片段的探针；SEQ ID No.14和SEQ ID No.15分别为扩增AID基因外显子3区域片段长度为169bp的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.16为扩增该区域片段的探针；序列SEQ ID No.17和SEQ ID No.18分别为扩增APOBEC3B/C基因启动子区域片段长度为135bp的上游引物和下游引物，序列SEQ IDNo.19为扩增该区域片段的探针；序列SEQ ID No.20和SEQ ID No.21分别为扩增YB1基因启动子区域片段长度为102bp的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.22为扩增该区域片段的探针；序列SEQ ID No.23和SEQ ID No.24分别为扩增MLH1基因外显子1区域片段长度为169bp的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.25为扩增该区域片段的探针。
本发明的有益效果如下：
本发明探索了DNA表观遗传学修饰对低温变性条件下PCR扩增效率的影响，建立了PCR扩增效率差异与DNA表观遗传学修饰差异对应的量化关系。这样通过对具有表观遗传学修饰差异的靶基因检测，可溯源不同组别(来源)的靶基因，其对在外周血游离DNA中鉴别其肿瘤的来源具有重要的参考价值。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出在低温变性条件下DNA修饰差异与扩增效率的关系(示意图)。
图2示出针对P53基因的正常人与肿瘤患者中△Ct加权值分布范围。
图3示出针对P53基因检测结果的ROC曲线分析，其中AUC为曲线下面积。
图4示出针对胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因的正常人与肿瘤患者中△Ct加权值分布范围。
图5示出针对胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因检测结果的ROC曲线分析，其中AUC为曲线下面积。
图6示出针对P53基因和胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因的正常人与肿瘤患者中△Ct加权值分布范围。
图7示出针对P53基因和胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因检测结果的ROC曲线分析，其中AUC为曲线下面积。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
发明人研究发现，在高的变性温度(94℃)下，表观遗传学修饰对DNA的解链没有明显的影响，表现为完全解链，该条件下定量PCR扩增的Ct值标记为Ct HT；但在低温变性条件(实验条件需要摸索，原则是能够扩增出目的片段的最低变性温度)下，表观遗传学修饰则对DNA的解链有较大的影响，表现为解链程度的不同，进而影响PCR扩增的效率，该条件下定量PCR扩增的Ct值标记为CtLT，△Ct＝|Ct HT–Ct LT|。在对靶基因不同靶区的定量PCR扩增过程中，发明人发现低温变性条件和高温变性条件对一些区域的扩增效率的影响显著不同。即如图1所示在低温条件下，相对于正常人，在肿瘤患者来源的DNA中靶基因中的一些区域更难以解链，表现为ΔCt值增大；为进一步证明这种差异来自于与表观遗传学修饰的不同，发明人以稀释后的PCR产物为模板进行再次扩增(该PCR产物为没有任何修饰的裸露DNA)，发现其ΔCt值显著不同于正常人以及肿瘤来源的DNA样本，表明靶基因在两种来源的样本中均存在表观遗传学修饰，并且其表观遗传学修饰具有差异性。这样针对靶基因中可能存在表观遗传学修饰的区域设计PCR引物，进行不同变性温度下的定量PCR检测，通过多靶区ΔCt值的加权分析，可溯源靶基因所在的组别(来源)。
基于对不同靶区片段的大量筛选实验，发明人获得了扩增区域含有DNA表观遗传学修饰的特异引物对组，并进一步对不同靶区的ΔCt进行了联合分析，获得ΔCt加权值，基于该ΔCt加权值的阈值(Cut Off值)对已知组别(来源)DNA样本分析显示，该检测方法具有很高的敏感性与特异性。另外，随着靶区数目的增多，ΔCt加权值及对应的阈值(Cut Off值)得到的优化，检测的敏感性与特异性得到进一步提高。
实施例1在外周血游离DNA中检测P53基因不同区域表观遗传学修饰差异的引物对组
基于P53基因的不同区域序列，设计PCR引物以外周血游离DNA为模板进行大量的筛选实验，最终得到了一组检测P53基因表观遗传学修饰差异的引物对组，该引物对组由序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示的核苷酸序列组成；
其中，序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2分别为扩增P53基因外显子3区域片段长度为140bp(P53-E3-140)的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.3为扩增该区域片段的探针；SEQ ID No.4和SEQ ID No.5分别为扩增P53基因外显子3区域片段长度为204bp(P53-E3-204)的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.6为扩增该区域片段的探针；序列SEQ IDNo.7和SEQ ID No.8分别为扩增P53基因外显子4区域片段长度为153bp(P53-E4-153)的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.9为扩增该区域片段的探针；序列SEQ IDNo.10和SEQID No.8分别为扩增P53基因外显子4区域片段长度为180bp(P53-E4-180)的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.9为扩增该区域片段的探针；具体序列如下：
P53-E3-140(x1)扩增引物与探针
上游引物(P53-E3-140-U)
5'-CTCCCAGAATGCCAGAGGCTG-3' (SEQ ID NO.1)
下游引物(P53-E3-140-D)
5'-GAAACCGTAGCTGCCCTGGTAG-3' (SEQ ID NO.2)
探针序列(P53-E3-140-Taqman)
5'-FAM-CCCCCCGTGGCCCCTGCACCAGC-BHQ1-3' (SEQ ID NO.3)
P53-E3-204(x2)扩增引物与探针
上游引物(P53-E3-204-U)：
5'-GTTCACTGAAGACCCAGGTCCAGATG-3' (SEQ ID NO.4)
下游引物(P53-E3-204-D)：
5'-GACTTGGCTGTCCCAGAATGCAAG-3' (SEQ ID NO.5)
探针序列(P53-E3-204-Taqman)：
5'-FAM-CTCCCAGAATGCCAGAGGCTGCTCC–BHQ1-3' (SEQ ID NO.6)
P53-E4-153(x3)扩增引物与探针
上游引物(P53-E4-153-U)
5'-CTCCTTCCTCTTCCTACAG-3' (SEQ ID NO.7)
下游引物(P53-E4-180/153-D)：
5'-GTCATGTGCTGTGACTGCTTG-3' (SEQ ID NO.8)
探针序列(P53-E4-180/153-Taqman)：
5'-FAM-GATGGCCATGGCGCGGACGCGGGTG–BHQ1-3' (SEQ ID NO.9)
P53-E4-180(x4)扩增引物与探针
上游引物(P53-E4-180-U)：
5'-CACTTGTGCCCTGACTTTCAAC-3' (SEQ ID NO.10)
下游引物(P53-E4-180/153-D)：
5'-GTCATGTGCTGTGACTGCTTG-3' (SEQ ID NO.8)
探针序列(P53-E4-180/153-Taqman)：
5'-FAM-GATGGCCATGGCGCGGACGCGGGTG–BHQ1-3' (SEQ ID NO.9)。
实施例2在外周血游离DNA中检测胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因不同区域表观遗传学修饰差异的引物对组
针对胞嘧啶脱氨酶及相关分子的基因不同区域片段，设计PCR引物并以外周血游离DNA为模板进行扩增，经过大量的筛选实验，最终得到了一组检测胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因的引物对组，实验显示在不同组别(来源)的外周血游离DNA中，用该引物对组扩增的靶区具有显著的表观遗传学修饰差异，该引物对组由序列表SEQ ID No.11至SEQ ID No.25所示的核苷酸序列组成；
其中，序列SEQ ID No.11和SEQ ID No.12分别为扩增AID基因启动子区域片段长度为145bp(AID-P-145)的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.13为扩增该区域片段的探针；SEQ ID No.14和SEQ ID No.15分别为扩增AID基因外显子3区域片段长度为169bp(AID-E3-169)的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.16为扩增该区域片段的探针；序列SEQ IDNo.17和SEQ ID No.18分别为扩增APOBEC3B/C基因启动子区域片段长度为135bp(Apobec3B/C-P-135)的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.19为扩增该区域片段的探针；序列SEQ ID No.20和SEQ ID No.21分别为扩增YB1基因启动子区域片段长度为102bp(YB1-P-102)的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.22为扩增该区域片段的探针；序列SEQ ID No.23和SEQ ID No.24分别为扩增MLH1基因外显子1区域片段长度为169bp(MLH1-E1-169)的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.25为扩增该区域片段的探针；具体序列如下：
AID-P-145(x5)扩增引物与探针
上游引物(AID-P-145-U)：
5'-TTGAAGTGTCTACTGTTACTGCC-3' (SEQ ID NO.11)
下游引物(AID-P-145-D)：
5'-CTGTCATAGGCAGAGTCACACA-3' (SEQ ID NO.12)
探针(AID-P-145-Taqman)
5'-FAM-CTAGCTATGGAGCATGGACTGGGC-BHQ1-3' (SEQ ID NO.13)
AID-E3-169(x6)扩增引物与探针
上游引物(AID-E3-169-U)
5'-TGGTCCTCTCTGTCTCTCCAGAAC-3' (SEQ ID NO.14)
下游引物(AID-E3-169-D)
5'-GGTTCCCTCGCAGAAAGTCGG-3' (SEQ ID NO.15)
探针(AID-E3-169-Taqman)
5'-FAM-CGGCTGCCACGTGGAATTGCTCTTCC-BHQ1-3' (SEQ ID NO.16)
Apobec3B/C-P-135(x7)扩增引物与探针
上游引物(APOBEC3B/C-P-135-U)
5'-GCCAGAGCCAGAGAAACATGAAG-3' (SEQ ID NO.17)
下游引物(APOBEC3B/C-P-135-D)
5'-TGCTTACAGCGTCCTTGCAGTTG-3' (SEQ ID NO.18)
探针(APOBEC3B/C-P-135-Taqman)
5'-FAM-CCGGGGCCTCCCACACCAATG-BHQ1-3' (SEQ ID NO.19)
YB1-P-102(x8)扩增引物与探针
上游引物(YB1-P-102-U)
5'-CGTCCTCTCGGGTACTCTATGG-3' (SEQ ID NO.20)
下游引物(YB1-P-102-D)
5'-TCAGTCGACCTACAACCGTTCCTG-3' (SEQ ID NO.21)
探针(YB1-P-102-Taqman)
5'-FAM-CTCCGCCGGCCGCCATAGAGACC-BHQ1-3' (SEQ ID NO.22)
MLH1-E1-169(x9)扩增引物与探针
上游引物(MLH1-E1-169-U)
5'-GAGAACTGGTACGGAGGGAGTC-3' (SEQ ID NO.23)
下游引物(MLH1-E1-169-D)
5'-AGAAGGCCTGACTGGCACGTC-3' (SEQ ID NO.24)
探针(MLH1-E1-169-Taqman)
5'-FAM-CCGGGCTCACTTAAGGGCTACGAC-BHQ1-3' (SEQ ID NO.25)
实施例3基于表观遗传学修饰差异的靶基因的检测方法
基于表观遗传学修饰差异的靶基因的检测方法，包括：
1)抽提不同组别(来源)样本的外周血游离DNA，其中肿瘤患者组(见表9)，正常人组(见表8)；
2)基于选择的P53基因和胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因的不同区域片段分别设计并合成引物对组，其中，实施例1用于检测P53基因不同区域的引物对组，实施例2用于检测胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因的引物对组；
3)利用引物对组分别对不同组别(来源)的外周血游离DNA样本在高温变性条件下和低温变性条件下进行实时荧光定量PCR扩增；
其中，qPCR反应体系如表1所示：
表1qPCR反应体系
反应条件为：
1、高温变性(High Temperature,HT)：
预变性95℃5min；94℃5s，60℃(x1,x3,x5,x6,x7,x9)/58℃(x2,x4,x8)15秒，72℃30s，50个循环；
2、低温变性(Low Temperature,LT)：
预变性95℃5min；88℃(x1,x2,x3,x4,x6,x9)/86℃(x8)/85℃(x5,x7)15s，60℃(x1,x3,x5,x6,x7,x9)/58℃(x2,x4,x8)15秒，72℃30s，50个循环。
P53基因和胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因不同区域片段xn的△Ct xn；其中，△Ctxn＝|Ct xn-HT–Ct xn-LT|，P53基因和胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因不同区域片段xn在高温变性条件下的Ct值标记为Ct xn-HT，P53基因和胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因不同区域片段xn在低温变性条件下的Ct值标记为Ct xn-LT；
在本发明中，△Ct xn可以为△Ctx1、△Ctx2、△Ctx3、△Ctx4、△Ctx5、△Ctx6、△Ctx7、△Ctx8、△Ctx9；△Ctx1代表P53基因外显子3区域片段长度为140bp的△Ct值，△Ctx2代表P53基因外显子3区域片段长度为204bp的△Ct，△Ctx3代表P53基因外显子4区域片段长度为153bp的△Ct值，△Ctx4代表P53基因外显子4区域片段长度为180bp的△Ct值，△Ctx5代表AID基因启动子区域片段长度为145bp的△Ct值，△Ctx6代表AID基因外显子3区域片段长度为169bp的△Ct值，△Ctx7代表APOBEC3B/C基因启动子区域片段长度为135bp的△Ct，△Ctx8代表YB1基因启动子区域片段长度为102bp的△Ct值，Ctx9代表MLH1基因外显子1区域片段长度为169bp的△Ct值；
4)利用回归分析对靶基因(区域)的△Ctxn(P53基因的不同区域片段和/或胞嘧啶脱氨酶及相关分子的基因的不同区域片段)进行加权计算，具体公式为：
△Ct加权值＝a1*△Ct x1+a2*△Ct x2+……+an*△Ct xn；
其中，△Ct x1，△Ct x2，……，△Ct xn为不同待测靶基因和/或同一靶基因不同待测区域片段的△Ct值；a,a2,……,an为回归分析对不同靶基因和/或同一靶基因的不同区域片段对应的△Ct值给出的加权系数；
5)根据△Ct加权值得到的阈值鉴别或溯源表观遗传学修饰差异的靶基因的组别(来源)。
不同靶基因(区域)组合的具体方案如下：
靶基因(区域)组合1：基于P53基因的不同区域片段分析结果如下：
(1)样本组别(来源)：正常人32例(表8)以及肿瘤患者32例(表9)
(2)P53基因不同区域片段的△Ct xn的加权计算(SPSS软件分析)，所得公式如下：
△Ct加权值(4)＝0.117*△Ctx1+0.215*△Ctx2+0.461*△Ctx3+1.051*△Ctx4；
其中，△Ct加权值(4)代表P53基因4个区域片段的加权值，x1代表P53基因外显子3区域片段长度为140bp的片段，x2代表P53基因外显子3区域片段长度为204bp的片段，x3代表P53基因外显子4区域片段长度为153bp的片段，x4代表P53基因外显子4区域片段长度为180bp的片段。
根据统计分析，设定阈值(Cut off值)为5.919。
△Ct加权值(4)在不同组别中分布范围如图2所示，其ROC曲线如图3所示，其中曲线下面积为90.3％。
不同组别(来源)样本检测的阳性与阴性例数及统计学分析见表2和表3。如表2、8和9所示，在32例正常人中有7例为阳性；在32例肿瘤患者中有5例为阴性(其中1例肝癌患者，1例为舌癌患者，其余3例均为胃癌术后患者)。统计分析显示：本检测方法的敏感性为84.4％，特异性为78.1％，符合率为81.3％。
不同组别(来源)的差异分析如表3所示，显示其统计学差异非常显著。
表2检测结果分析
表3检测结果的统计学分析
靶基因组合2：基于胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因不同区域片段检测结果如下：
(1)样本组别(来源)：正常人40例(表8)以及肿瘤患者40例(表9)
(2)胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因不同区域片段的△Ct xn的加权计算(SPSS软件分析)，所得公式如下：
△Ct加权值(5)＝1.841*△Ctx5+0.058*△Ctx6+0.445*△Cx7+1.624*△Ctx8+0.180*△Ctx9；
其中，△Ct加权值(5)代表胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因5个区域片段的加权值，x5代表AID基因启动子区域片段长度为145bp的片段，x6代表AID基因外显子3区域片段长度为169bp的片段，x7代表APOBEC3B/C基因启动子区域片段长度为135bp的片段，x8代表YB1基因启动子区域片段长度为102bp的片段、x9代表MLH1基因外显子1区域片段长度为169bp的片段。
根据统计分析，设定阈值(Cut off值)为8.214。
△Ct加权值(5)在不同组别(来源)样本中的分布范围如图4所示，其ROC曲线分布如图5所示，曲线下覆盖面积(AUC)高达94.8％。
在不同组别(来源)样本的检测中，阳性与阴性例数及统计学分析见表4和表5。如表4、8和9所示，在40例正常人中有4例为阳性；在40例肿瘤患者中有5例为阴性(其中1例肝癌患者，1例为舌癌患者，2例均为胃癌术后，1例为肾癌术后)。统计分析显示：本检测方法的敏感性为89.7％，特异性为87.2％，符合率为88.5％。表5所示为不同组别检测结果的统计学分析，表明其差异非常显著。
表4检测例数分析
表5检测结果的统计学分析
靶基因组合3：基于P53基因联合胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因不同区域片段检测结果如下：
(1)样本组别(来源)：正常人32例(表8)以及肿瘤患者32例(表9)
(2)P53基因和胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因不同区域片段的△Ct xn的加权计算(SPSS软件分析)，所得公式如下：
△Ct加权值(9)＝0.017*△Ctx1+0.472*△Ctx2+0.213*△Ctx3+0.576*△Ctx4+1.461*△Ctx5+0.409*△Ctx6+0.503*△Ctx7+1.079*△Ctx8+0.095*△Ctx9。
其中，△Ct加权值(9)代表靶基因9个区域片段的加权分析值，
根据统计分析，设定阈值(Cut off值)为6.704。
所述检测结果在不同组别(来源)样本中△Ct加权值(9)分布如图6所示，其ROC曲线分布如图7所示，其中曲线下覆盖面积(AUC)高达94.9％。
不同组别(来源)样本检测中，阳性与阴性例数及统计学分析见表6和表7。如表6、8和9所示，在32例正常人中有2例为阳性；在32例肿瘤患者中有3例为阴性(其中1例肝癌患者，1例为胃癌术后，1例为肾癌术后)。统计分析显示：本检测方法的敏感性为90.6％，特异性为93.75％，符合率为92.18％。表7表明不同组别检测结果的差异非常显著。
表6检测例数分析
表7检测结果的统计学分析
表8正常人组的△Ct加权值结果
注：加粗标示为高于阈值的样本
表9肿瘤患者组△Ct加权值结果
注：加粗标示为低于阈值的样本
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的常识，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
序列表
<110> 朱运峰
<120> 一种基于表观遗传学修饰差异的靶基因的检测方法
<130> JLC18I0387E
<160> 25
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctcccagaat gccagaggct g 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaaaccgtag ctgccctggt ag 22
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccccccgtgg cccctgcacc agc 23
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gttcactgaa gacccaggtc cagatg 26
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gacttggctg tcccagaatg caag 24
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctcccagaat gccagaggct gctcc 25
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctccttcctc ttcctacag 19
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtcatgtgct gtgactgctt g 21
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gatggccatg gcgcggacgc gggtg 25
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cacttgtgcc ctgactttca ac 22
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ttgaagtgtc tactgttact gcc 23
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctgtcatagg cagagtcaca ca 22
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ctagctatgg agcatggact gggc 24
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tggtcctctc tgtctctcca gaac 24
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggttccctcg cagaaagtcg g 21
<210> 16
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cggctgccac gtggaattgc tcttcc 26
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gccagagcca gagaaacatg aag 23
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tgcttacagc gtccttgcag ttg 23
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ccggggcctc ccacaccaat g 21
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cgtcctctcg ggtactctat gg 22
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tcagtcgacc tacaaccgtt cctg 24
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ctccgccggc cgccatagag acc 23
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gagaactggt acggagggag tc 22
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
agaaggcctg actggcacgt c 21
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ccgggctcac ttaagggcta cgac 24

Claims (4)

1.一种基于表观遗传学修饰差异的靶基因的检测方法，其特征在于，所述方法包括：
抽提不同组别样本的外周血游离DNA；
针对不同待测靶基因和/或同一靶基因的不同待测区域片段设计引物对组；
利用引物对组分别对不同组别样本的外周血游离DNA在高温变性条件下和低温变性条件下进行实时荧光定量PCR扩增，得到待测靶基因xn和/或同一靶基因待测区域片段xn的△Ctxn；其中，△Ctxn＝|Ctxn-HT–Ctxn-LT|，待测靶基因xn和/或同一靶基因待测区域片段xn在高温变性条件下的Ct值标记为Ctxn-HT，待测靶基因xn和/或同一靶基因待测区域片段xn在低温变性条件下的Ct值标记为Ctxn-LT；
利用回归分析对不同待测靶基因和/或同一靶基因不同待测区域片段的△Ctxn进行加权计算，具体公式为：
△Ct加权值＝a1*△Ctx1+a2*△Ctx2+……+an*△Ctxn；
其中，△Ctx1，△Ctx2，……，△Ctxn为不同待测靶基因和/或同一靶基因不同待测区域片段的△Ct值；a,a2,……,an为回归分析对不同靶基因和/或同一靶基因的不同区域片段对应的△Ct值给出的加权系数；
根据△Ct加权值得到的阈值鉴别或溯源表观遗传学修饰差异的靶基因所在的组别。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述靶基因为P53基因和/或胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因；其中，所述胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因包括AID基因、APOBEC3B/C基因、YB1基因以及MLH1基因。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述P53基因的待测区域片段选自外显子3区域片段长度为204bp的片段、外显子3区域片段长度为140bp的片段、外显子4区域片段长度为180bp的片段、外显子4区域片段长度为153bp的片段；所述AID基因的待测区域片段选自启动子区域片段长度为145bp的片段、外显子3区域片段长度为169bp的片段；所述APOBEC3B/C基因的待测区域片段选自启动子区域片段长度为135bp的片段；所述YB1基因的待测区域片段选自启动子区域片段长度为102bp的片段；所述MLH1基因的待测区域片段选自外显子1区域片段长度为169bp的片段。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述检测引物对组由序列表SEQ IDNo.1至SEQ ID No.25所示的核苷酸序列组成的引物对组；
其中，序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2分别为扩增P53基因外显子3区域片段长度为140bp的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.3为扩增该区域片段的探针；SEQ ID No.4和SEQ ID No.5分别为扩增P53基因外显子3区域片段长度为204bp的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.6为扩增该区域片段的探针；序列SEQ ID No.7和SEQ ID No.8分别为扩增P53基因外显子4区域片段长度为153bp的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.9为扩增该区域片段的探针；序列SEQ ID No.10和SEQ ID No.8分别为扩增P53基因外显子4区域片段长度为180bp的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.9为扩增该区域片段的探针；
序列SEQ ID No.11和SEQ ID No.12分别为扩增AID基因启动子区域片段长度为145bp的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.13为扩增该区域片段的探针；SEQ ID No.14和SEQID No.15分别为扩增AID基因外显子3区域片段长度为169的上游引物和下游引物，序列SEQID No.16为扩增该区域片段的探针；序列SEQ ID No.17和SEQ ID No.18分别为扩增APOBEC3B/C基因启动子区域片段长度为135的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.19为扩增该区域片段的探针；序列SEQ ID No.20和SEQ ID No.21分别为扩增YB1基因启动子区域片段长度为102的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.22为扩增该区域片段的探针；序列SEQ ID No.23和SEQ ID No.24分别为扩增MLH1基因外显子1区域片段长度为169的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.25为扩增该区域片段的探针。
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