CN1384359A - 一种检测人血液中Klotho蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测人血液中Klotho(KL)蛋白的方法,是利用KL蛋白抗体来检测人血液中的KL蛋白。KL蛋白抗体的制备方法为:利用RT－PCR技术,从人肾脏组织的RNA中扩增出KL基因的部分cDNA序列,将该片段cDNA克隆到pET质粒,构建成KL蛋白片段的表达载体;将表达载体转化E.coli细菌株BL21/DE3,通过IPTG的诱导,使转化菌表达外源蛋白;将培养诱导的细胞收集,破碎,用Ni－NTA结合分离的方法,获得纯化的KL蛋白片段;用获得的纯化的KL重组蛋白片段注射兔子,从兔子身上收集血清,经饱和硫酸铵纯化得到抗KL蛋白抗体。然后利用KL蛋白抗体采用Westem方法或者ELISA方法检测人血液中的KL蛋白。本发明利用特异地KL蛋白片段制备的抗体,可以特异地识别KL蛋白。利用制备的抗体可以在人的血液中检测到KL蛋白,用于临床和研究中。

Description

一种检测人血液中Klotho蛋白的方法

技术领域：

本发明涉及一种免疫检测方法，特别是涉及利用Klotho抗体检测人血液中Klotho蛋白的方法。

背景技术：

日本科学家首次发现并报道了Klotho(KL)基因(Kuro-o M.，et al.1997 Nature390，45-51)。研究表明KL基因与人类的一些衰老表型与疾病有关，如：动脉硬化、肺气肿、骨质疏松、高血压、皮肤萎缩、不育和生命周期短等(Teruhito Y.，etal.2000 Endocrinology 141，438-445，Den E.A.，et al.2002 PNAS 99，856-861，Yoshio O.，et al.1998 BBRC 251，15 920-925，Kiyoshi M.，et al.2000 BBRC 278，665-670，Noritoshi K.，et al.2001 BBRC 280，1015-1020，Yuichiro S.，et al.1998 BBRC248，324-329)，1998年日本科学家克隆了人KL基因。人KL基因位于第13号染色体上，全长约50kb，由5个外显子组成。由于KL以及RNA前体的不同剪接方式，KL基因的表达产生两个转录本，分别编码膜蛋白和分泌蛋白二种型式。分泌型蛋白的表达量高于膜蛋白(Yutaka M.，et al.1998 BBRC 242，626-630)。2000年，科学家用腺病毒介导的方式将KL基因转化动脉粥样硬化大鼠，大鼠病症得到明显缓解(Yuichiro S.，et al.2000 BBRC 276，767-772)。现有的研究显示，KL基因与抗衰老和衰老性相关的疾病有关。分泌型KL蛋白很可能是生物体内一种抗衰老的荷尔蒙。

KL分泌型蛋白可以分泌到细胞外，然而在动物体内和人体内，KL分泌蛋白存在于哪种循环系统，还不清楚。在人的血液中存在KL蛋白尚未见过报导。

发明内容：

本发明的目的是提供一种利用KL的抗体检测人体血液中KL蛋白的方法，用于临床和研究的检测。

本发明的检测方法如下：

1.制备KL蛋白抗体

(1)获得KL蛋白片段

利用RT-PCR技术，从人的肾脏组织的RNA中扩增出KL基因的部分cDNA序列，将该片段cDNA克隆到pET质粒，构建成KL蛋白片段的表达载体。

(2)人重组KL蛋白片段的表达和纯化。

将上述构建的表达载体转化E.coli细菌株BL21/DE3，通过IPTG的诱导，使转化菌表达外源蛋白。将培养诱导的细胞收集，破碎，用Ni-NTA结合分离的方法，获得纯化的KL蛋白片段。

(3)KL蛋白抗体的获得。

用上述获得的纯化的KL重组蛋白片段注射兔子，从兔子身上收集血清，经饱和硫酸铵纯化后，得到抗KL蛋白的抗体。

2.利用制得的KL蛋白抗体检测人血液中的KL蛋白。

可以采用如下两种方法进行检测：

(1)用Westem方法检测人血液中的KL蛋白。

将人血清稀释10倍，进行电泳后，转入膜上，用上述抗体与膜进行保温培育，然后进行信号显示。利用该方法可以检测到人血液中分子量为62.2kD的KL蛋白。

(2)用ELISA方法检测人血液中的KL蛋白

将人血清稀释10倍后，包埋在96孔板内，用上述抗体进行保温培育，然后进行信号检测。利用该方法可以检测到人血液中的KL蛋白。

本发明的优点和积极效果：

1.本发明利用特异地KL蛋白片段制备的抗体，可以特异地识别KL蛋白。

2.本发明利用制备的抗体可以在人的血液中检测到KL蛋白，用于临床和研究中。

实施例：

一、人Klotho蛋白表达载体的构建

1.人Klotho分泌型蛋白C末端基因的克隆

以Human Klotho cDNA序列设计了一对引物：

Sense primer：5′＞GTC CCC GTG TCC ATT GCC CTA A＜3′Anti-sense primer：5′＞ACT AGC

ATC TCC AGA GCC GAA A＜3′

利用引物从人的肾组织RNA中扩增出1.5kb片段cDNA.

2.表达载体的构建

将上述扩增的DNA片段克隆到pMD18-T vector上，经测序验证属于Klotho分泌型蛋白C末端形式(简称KLSC)，然后从pMDl8-T-KLSC质粒上用双酶切(BamHI和HindIII)，切下1.2kb片断，并将酶切片段克隆到pET-30a和pET28a载体上形成了KLSC的表达载体。再将这些载体转化E.coli BL21菌株，制备出KLSC的表达系统。

二、6×His重组KLSC蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

1.6×His重组KLSC蛋白的原核表达、亲和层析纯化

将上述表达细菌在37℃培养，当OD₆₀₀＝0.8时加IPTG(终浓度为1mM)分别诱导2、4、6小时。取诱导培养后的菌体离心，将收集的菌体重悬在Binding Buffer(NaH₂PO₄50mM，NaCl 300mM，咪唑10mM，pH8.0)，超声，破碎。

2.6×His重组KLSC蛋白的纯化

将上述超声破碎的菌体在室温下10000g离心20-30分钟，取上清与Ni-NTA胶结合2小时(30℃200rpm)，用过柱进行分离，再用Buffer MCAC-2洗柱，然后分段洗脱(MCAC-20，40，60，80，100，200；)，分段收集，用12％SDS-PAGE检测，银染鉴定。

MCAC-0：Tris-HCl 20mmol/L，NaCl 0.5mol/L，甘油10％(v/v)，PMSFlmmol/L，尿素8mol/L；MCAC-2，20，40，60，80，100，200即在MCAC-0中分别添加0.02，0.2，0.4，0.6，0.8，1，2mol/L咪唑。

三、6×His重组KLSC蛋白多克隆抗体的制备

制备材料：青紫蓝大灰兔、佛式完全佐剂与佛式不完全佐剂。

方法：第一周取佛式完全佐剂与1mg/mL 30a-KLSC抗原等体积混合乳化，每只兔子注射2mL乳化抗原；10天后第二次注射将佛式不完全佐剂与1mg/mL 30a-KLSC抗原等体积混合乳化，每只兔子注射1mL乳化抗原，以后每10天注射一次，一共注射4次(日期分别是3月11日，3月21日，4月1日，4月11日)，最后一次注射抗原后7天(即4月18日)取少量血清进行ELISA检测，然后放血，取血清，用饱和硫酸铵沉淀法纯化IgG。

四、利用rabbit anti-KLSC检测人血清中klotho蛋白的存在及形式

1.用Western方法检测人血清中klotho蛋白

将人血清稀释10倍，KLSC抗体稀释度为10^-4，抗原28a-KLSC为阳性对照，拟南芥叶子总蛋白，人HUVEC细胞和小鼠RAW细胞总蛋白为对照。被测的血清都有数量不等的klotho蛋白存在，分子量为62.2kD。

2.用ELISA方法检测人血液中的KL蛋白

将人血清稀释10倍后，包埋在96孔板内，用上述抗体(稀释度为10^-4)进行保温培育，然后进行信号检测。利用该方法可以检测到人血液中的KL蛋白。

Claims (4)

1、一种检测人血液中的Klotho蛋白的方法，其特征在于是利用Klotho蛋白抗体来检测人血液中的Klotho蛋白。

2.如权利要求1所述的检测人血液中的Klotho蛋白的方法，其特征在于Klotho蛋白抗体的制备方法如下：

(1)获得KL蛋白片段：利用RT-PCR技术，从人的肾脏组织的RNA中扩增出KL基因的部分cDNA序列，将该片段cDNA克隆到pET质粒，构建成KL蛋白片段的表达载体；

(2)人重组KL蛋白片段的表达和纯化：将上述构建的表达载体转化E.coli细菌株BL21/DE3，通过IPTG的诱导，使转化菌表达外源蛋白；将培养诱导的细胞收集，破碎，用Ni-NTA结合分离的方法，获得纯化的KL蛋白片段；

(3)KL蛋白抗体的获得：用上述获得的纯化的KL重组蛋白片段注射兔子，从兔子身上收集血清，经饱和硫酸铵纯化后，得到抗KL蛋白的抗体。

3.如权利要求1或2所述的检测人血液中的Klotho蛋白的方法，其特征在于是采用Westem方法检测人血液中的KL蛋白。

4.如权利要求1或2所述的检测人血液中的Klotho蛋白的方法，其特征在于是用ELISA方法检测人血液中的KL蛋白。