KR102503115B1 - 체액 시료 전처리 방법 및 전처리된 체액 시료를 이용한 환자 맞춤형 항암제 정보 제공 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항암제 스크리닝에 적합하도록 3D 배양하기 위한 암 환자의 체액 시료 전처리 방법 및 상기 전처리된 체액 시료를 필라 플레이트에 3D 배양하고 환자 맞춤형 항암제를 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 종래 암 진단을 위해 수집되어 암 진단 후 폐기되던 체액을 이용하여 저렴한 비용으로 항암제 스크리닝이 가능하다는 장점이 있다. 또한, 본 발명은 암 환자로부터 분리된 체액을 필터링, 원심분리, 적혈구 제거와 같은 단순 공정으로 전처리한 후 분리된 소량의 세포만을 분주하여도, 필라 구조의 배양 플레이트에 3D 배양물이 균일하게 형성되고, 계대 배양 없이 P0 세포를 이용하여 항암제를 스크리닝 하기 때문에 개별 환자에 적합한 항암제를 신속하고 정확하게 스크리닝 가능한 장점이 있다.

Description

체액 시료 전처리 방법 및 전처리된 체액 시료를 이용한 환자 맞춤형 항암제 정보 제공 방법 {Method of pre-processing body fluid sample and method of providing patient-specific anticancer drug information using the pre-processed body fluid sample}
본 발명은 체액 시료 전처리 방법 및 전처리된 체액 시료를 이용한 환자 맞춤형 항암제 정보 제공 방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 항암제 스크리닝에 적합하도록 암 환자의 체액 시료를 전처리하는 방법 및 상기 전처린된 체액 시료를 3D 배양하고 이를 이용하여 항암제를 스크리닝하여 환자 개인별 맞춤형 항암제에 대한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
종래 항암제 감수성 검사는 환자로부터 수술 또는 내시경 시술 단계에서 조직을 채취하고 이 조직으로부터 세포를 분리하여야 하기 때문에, 검사자의 숙련도가 요구되며, 시간 및 비용 또한 많이 소요된다. 또한, 종양 조직을 채취한 후 육안 및 현미경으로 암세포 유무 및 비율을 판별하는 것이 현재까지는 불가능하다.
암환자의 체액은 대부분 복강 내 장기에 생긴 암종에서 유래하여 생성된다. 체액이 빈번히 발생하는 암종으로는 위암, 대장암, 췌장암, 부인암 등이 있으며, 예를 들어, 난소암 환자는 2/3 이상의 케이스에서 복수 및 흉수가 발생하는데, 난소암 환자의 복수나 흉수에는 악성 종양세포의 비율이 높고, 암세포의 성장을 촉진하는 인자들 (factors) 및 다양한 종양미세환경세포들 (tumor microenvironment cells)이 함께 존재한다.
특히, 체액이 많이 생성되는 부인암 환자는 난치성 부인암 또는 재발성 부인암 환자가 대부분이고, 기존에 항암 치료에 대한 반응성이 낮거나, 항암제 저항성을 가지는 경우가 많다. 따라서, 체액 시료를 활용하여 빠른 시일 내에 다양한 항암제를 스크리닝 하는 경우, 난치성 부인암 환자의 항암제 처방을 위한 중요한 참고자료가 될 수 있다.
그러나, 체액을 이용하여 해당 환자에게 적합한 항암제 검사하는 기술은 체액으로부터 세포를 분리하여 일정 시간 배양한 후 검사를 진행하는 것으로 많은 시간이 소요되는 단점이 있다. 예컨대 종래 체액을 이용하여 항암제를 검사하는 기술로, 체액으로부터 세포를 2D 배양하여 항암제 감수성을 검사하는 경우에는 계대 배양이 필요하고 (대한민국 공개특허 10-2018-0000991), 3D 배양하여 항암제 감수성을 검사하는 경우에는 비-겔화(de-gelation) 과정을 거치고 다시 3D 배양하는 것과 같이 검사에 많은 시간이 소요되게 된다 (Clin Cancer Res; 23(22); 6934-45; Gynecol Oncol/2020 Jun;157(3):783-792; J Cancer Res Clin Oncol. 2019 Nov;145(11):2637-2647; Sci Rep. 2020 Jul 28;10(1):12581). 또한, 뭉쳐 자라는 악성 스페로이드 자체를 웰에 분주하여 사용하는 경우, 웰 간 편차가 커서 항암제 감수성을 검사하는 경우 그 신뢰도가 떨어진다는 문제점이 있었다.
이와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명에서는 암 환자의 체액 시료를 전처리하는 공정을 개발하였으며, 본 발명에 따라 암 환자의 체액 시료를 전처리하는 경우 소량의 세포만으로도 균일하게 세포의 3D 배양물이 형성되어, 계대 배양 없이 환자 맞춤형 항암제를 높은 정확도로 신속하게 선별할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
대한민국 공개특허 제10-2018-0000991호
Personalized Medicine-Based Approach to Model Patterns of Chemoresistance and Tumor Recurrence Using Ovarian Cancer Stem Cell Spheroids. Clin Cancer Res; 23(22); 6934-45. Short-term organoid culture for drug sensitivity testing of high-grade serous carcinoma. Gynecol Oncol/ 2020 Jun;157(3):783-792. Malignant ascites-derived organoid (MADO) cultures for gastric cancer in vitro modelling and drug screening. J Cancer Res Clin Oncol. 2019 Nov;145(11):2637-2647. Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing. Sci Rep. 2020 Jul 28;10(1):12581.
본 발명은 체액 시료 전처리 방법 및 이를 이용하여 환자에게 적합한 항암제를 스크리닝 하고 환자 개인별 맞춤형 항암제에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 암 환자로부터 분리된 체액 시료의 전처리 방법을 제공한다:
(a) 암 환자로부터 분리된 체액 시료를 90 내지 110 μm 세포 스트레이너(cell strainer)로 필터링하여 세포 스트레이너를 통과한 세포를 수집하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 수집된 세포로부터 적혈구를 용해하고 원심분리하는 단계; 및
(c) 상기 원심분리된 세포 펠렛을 60 내지 80 μm 세포 스트레이너로 필터링하고 세포 스트레이너를 통과한 세포를 수집하는 단계.
상기 전처리 방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 체액 시료는 악성 스페로이드를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 전처리 방법에 있어서, 상기 (a) 단계는 선별된 체액 시료로부터 필터링 전 또는 필터링 중 세포 스크래퍼를 이용하여 악성 스페로이드를 그라인딩(grinding)하는 과정을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 전처리 방법에 있어서, 상기 (a) 및/또는 (c) 단계의 세포를 수집하는 단계는 원심분리하여 세포를 수집하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 전처리 방법에 있어서, 상기 체액은 복수 또는 흉수인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 전처리 방법에 있어서, 상기 암은 난소암, 유방암, 편평상피세포암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 신장암, 방광암, 담관암 및 담낭암로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 전처리 방법에 있어서, 상기 암은 암은 진행성, 수술 불가 또는 전이성 암인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 환자 맞춤형 항암제 정보 제공 방법을 제공한다:
(a) 암 환자로부터 분리된 체액 시료를 상기 전처리 방법으로 전처리하는 단계:
(b) 상기 전처리한 시료를 3D 배양하는 단계; 및
(c) 상기 배양된 3D 배양물에 항암제 후보군을 처리하여 3D 배양물의 세포 사멸을 유도하는 항암제를 환자 맞춤형 항암제로 선별하는 단계.
상기 정보 제공 방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 체액 시료는 악성 스페로이드를 포함하고, 상기 체액 시료로부터 분리된 세포의 세포 생존율이 60% 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 정보 제공 방법에 있어서, 상기 (c) 단계는 P0 세포에 항암제 후보군을 처리하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 정보 제공 방법에 있어서, 상기 항암제 후보군은 파클리탁셀, 텍소티어, 아드리아마이신, 엔도스타틴, 앤지오스타틴, 미토마이신, 블레오마이신, 시스플레틴, 카보플레틴, 다우노루비신, 이다루비신, 5-플로로우라실, 메토트렉세이트, 엑티노마이신-D, 니라파립, PLD, 카보플라틴, 젬시타빈, 토포테칸 및 베바시주맙로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 정보 제공 방법에 있어서, 상기 (b) 단계에서 전처리한 시료는
세포 배양액이 수용될 수 있는 수용 공간이 형성되어 있고, 배양 대상체인 세포가 놓여지는 부분으로, 평평한 바닥으로부터 일정높이를 갖도록 기둥 형태로 돌출된 복수의 필라부들; 및
수용 공간에 놓여진 배양액이 평평한 바닥에 흩어져 잔류하지 않고 한쪽에 모여 있을 수 있도록, 평평한 바닥에 대해 볼록하게 형성된 필라부들과는 반대로 오목하게 형성되는 트렌치홈부;를 포함하는 필라 플레이트에서 3D 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 정보 제공 방법에 있어서, 상기 (b) 단계는 하나의 필라당 1000 내지 10000 개의 세포를 분주하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 정보 제공 방법에 있어서, 상기 (c) 단계는 약물 반응 인자 및/또는 세포 성장 인자에 기초하여 항암제를 선별하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 정보 제공 방법에 있어서, 상기 (c) 단계는 약물 반응 인자의 Z-score (Za) 및 세포 성장 인자의 Z-score (Zb)를 통합하여 하기 CODRP index를 산출하고, CODRP index가 -0.5 이하인 경우 적합한 항암제로 선별하는 것을 특징으로 할 수 있다:
Figure 112022101529422-pat00001
.
상기 정보 제공 방법에 있어서, 상기 약물 반응 인자는 IC50 또는 약물반응곡선의 면적(AUC)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 상기 전처리 방법에 따라 체액 시료를 전처리하는 단계;
(b) 상기 전처리하여 수집된 세포를 3D 배양하는 단계; 및
(c) 상기 배양된 3D 배양물에 항암제 후보군을 처리하여 3D 배양물의 세포 사멸을 유도하는 항암제를 선별하는 단계.
본 발명은 종래 암 진단을 위해 수집되어 암 진단 후 폐기되던 체액을 이용하여 저렴한 비용으로 항암제 스크리닝이 가능하다는 장점이 있다. 또한, 본 발명은 암 환자로부터 분리된 체액을 필터링, 원심분리, 적혈구 제거와 같은 단순 공정으로 전처리한 후 분리된 소량의 세포만을 분주하여도, 필라 구조의 배양 플레이트에 3D 배양물이 균일하게 형성되고, 계대 배양 없이 P0 세포를 이용하여 항암제를 스크리닝 하기 때문에 개별 환자에 적합한 항암제를 신속하고 정확하게 스크리닝 가능한 장점이 있다.
도 1은 항암제 검사에서 조직 시료를 이용하는 경우와 체액 시료를 이용하는 경우의 특징을 비교한 것이다.
도 2는 암 환자로부터 채취한 체액 샘플 내 악성 스페로이드 포함 유무에 따라 본 발명에 따른 전처리 공정 후 필라 플레이트에서 3일간 3D 배양시 오가노이드 형성 여부를 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 체액 시료를 이용하여 항암제를 선별하기 위한 전처리 공정을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 전처리된 체액 시료를 필라 플레이트에 분주하고 3D 배양하는 방법을 보여주는 모식도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 부인암 환자의 복수 시료를 전처리 공정 후 필라 플레이트에서 3D 배양한 배양물의 세포 이미지를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 다양한 부인암 환자의 복수 또는 흉수 시료를 전처리 공정 후 수집된 세포를 필라 플레이트에서 3D 배양한 오가노이드를 염색하여 원발암 조직과의 유사도를 확인한 결과이다. (A2, A7, A9, P6; 난소암(High grade serous carcinoma), A3; 자궁경부암, A5; 난소암(endometrioid carcinoma), P4; 자궁내막암)
도 7은 난소암 환자 (A5)에서 분리된 복수 시료를 본 발명의 일실시예에 따라 전처리 공정 후 필라 플레이트에서 3D 배양한 오가노이드를 이용하여 다양한 약물을 스크리닝하고 Bevacizumab과 Topotecan의 병용치료 효과를 예측한 후, 임상에서 병용 치료 효과를 검증한 결과이다.
도 8은 난소암 환자 (A10)에서 분리된 복수 시료를 본 발명의 일실시예에 따라 전처리 공정 후 필라 플레이트에서 3D 배양한 오가노이드를 이용하여 다양한 약물을 스크리닝하고 Paclitaxel과 Carboplatin의 병용치료 효과를 예측한 후, 임상에서 병용 치료 효과를 검증한 결과이다.
도 9는 난소암 환자 (A9)에서 분리된 복수 시료를 본 발명의 일실시예에 따라 전처리 공정 후 필라 플레이트에서 3D 배양한 오가노이드를 이용하여 다양한 약물을 스크리닝한 결과 Carboplatin + Paclitaxel, Carboplatin + PLD 조합에서 약물에 반응하지 않음을 확인한 결과이다.
도 10은 동일한 환자로부터 수득된 복수(A7) 및 흉수(P5) 시료를 이용하여 본 발명의 일실시예에 따라 전처리 공정 후 필라 플레이트에서 3D 배양한 오가노이드를 이용하여 항암제 검사한 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 명세서 및 특허청구범위에서 사용된 특징부의 크기, 양 및 물리적 특성을 표현하는 모든 수는 모든 경우 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대로 나타내지 않는 한, 명세서 및 특허청구범위에 개시된 수치 파라미터는 본 명세서에 개시된 교시 내용을 이용하여 당업자가 얻고자 하는 원하는 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치이다.
종래 항암제 감수성 검사는 일반적으로 환자로부터 조직을 채취하여 진행되었으나, 본 발명에서는 체액을 사용하는 경우의 다양한 이로운 점에 착안하여 체액을 이용하여 항암제 검사하는 방법을 개발하고자 하였으며, 체액을 전처리하여 필라 구조의 배양 플라에트에서 배양하는 경우 조직을 분리(dissociation) 시키는 과정이나 별도의 계대배양 없이도 소량의 암 세포로부터 균일하게 3D 배양물이 형성되어, 신속하고 정확한 환자 맞춤형 항암제 선별이 가능함을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 다음 단계를 포함하는 암 환자로부터 분리된 체액 시료의 전처리 방법에 관한 것이다:
(a) 암 환자로부터 분리된 체액 시료를 90 내지 110 μm 세포 스트레이너(cell strainer)로 필터링하여 세포 스트레이너를 통과한 세포를 수집하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 수집된 세포로부터 적혈구를 용해하고 원심분리하는 단계; 및
(c) 상기 원심분리된 세포 펠렛을 60 내지 80 μm 세포 스트레이너로 필터링하고 세포 스트레이너를 통과한 세포를 수집하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 체액 시료는 악성 스페로이드를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 선별된 체액 시료로부터 필터링 전 또는 필터링 중 세포 스크래퍼를 이용하여 악성 스페로이드를 그라인딩(grinding)하는 과정을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 및/또는 (c) 단계의 세포를 수집하는 단계는 원심분리하여 세포를 수집하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 체액은 복수 또는 흉수인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 난소암, 유방암, 편평상피세포암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 신장암, 방광암, 담관암 및 담낭암로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 체액을 발생시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 진행성, 수술 불가 또는 전이성 암인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 다른 관점에서, 다음 단계를 포함하는 환자 맞춤형 항암제 정보 제공 방법에 관한 것이다:
(a) 암 환자로부터 분리된 체액 시료를 상기 전처리 방법으로 전처리하는 단계:
(b) 상기 전처리한 시료를 3D 배양하는 단계; 및
(c) 상기 배양된 3D 배양물에 항암제 후보군을 처리하여 3D 배양물의 세포 사멸을 유도하는 항암제를 환자 맞춤형 항암제로 선별하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 체액 시료는 악성 스페로이드를 포함하고, 상기 체액 시료로부터 분리된 세포의 세포 생존율이 60% 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 생존율 또는 세포 성장률은 세포활성 염색, 세포 면역화학염색, 칼라매트릭 활성도 측정 및 형광발광으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 정량적으로 측정하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
예컨대, 상기 세포 생존율 또는 세포 성장률은 세포의 활성도로 측정할 수 있으며, 세포 활성도를 측정하는 방법으로는 일반 세포활성 염색으로 Calcein AM 염색, 세포 면역화학염색으로 F-action 등 세포활성 관련 마커 염색, 칼라매트릭 활성도 측정으로 MTS, MTT, CCK-8등, 형광발광으로 Cell titer glo 등의 Luminescent 등을 이용하여 정량값으로 측정할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계는 P0 세포에 항암제 후보군을 처리하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 항암제 후보군은 파클리탁셀, 텍소티어, 아드리아마이신, 엔도스타틴, 앤지오스타틴, 미토마이신, 블레오마이신, 시스플레틴, 카보플레틴, 다우노루비신, 이다루비신, 5-플로로우라실, 메토트렉세이트, 엑티노마이신-D, 니라파립, PLD, 카보플라틴, 젬시타빈, 토포테칸 및 베바시주맙로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계에서 전처리한 시료는
세포 배양액이 수용될 수 있는 수용 공간이 형성되어 있고, 배양 대상체인 세포가 놓여지는 부분으로, 평평한 바닥으로부터 일정높이를 갖도록 기둥 형태로 돌출된 복수의 필라부들; 및
수용 공간에 놓여진 배양액이 평평한 바닥에 흩어져 잔류하지 않고 한쪽에 모여 있을 수 있도록, 평평한 바닥에 대해 볼록하게 형성된 필라부들과는 반대로 오목하게 형성되는 트렌치홈부;를 포함하는 필라 플레이트에서 3D 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 하나의 필라당 1000 내지 10000 개의 세포를 분주하여 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
이 경우, 상기 세포는 상기 전처리 공정으로 수집된 세포인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계는 약물 반응 인자 및/또는 세포 성장 인자에 기초하여 항암제를 선별하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
이 경우, 세포 성장 인자는 세포 성장률 등 세포 증식을 나타낼 수 있는 인자의 Z-score (통계지표)를 모두 포괄하는 개념이고, 약물 반응 인자는 IC50, %IC50, AUC (약물반응곡석의 면적), %AUC, 세포 활성도 등 항암제 효능을 나타낼 수 있는 인자의 Z-score (통계지표)를 모두 포괄하는 개념이다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계는 약물 반응 인자의 Z-score (Za) 및 세포 성장 인자의 Z-score (Zb)를 통합하여 하기 CODRP index를 산출하고, CODRP index가 -0.5 이하인 경우 적합한 항암제로 선별하는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되지는 않는다:
Figure 112022101529422-pat00002
.
본 발명에 있어서, 상기 약물 반응 인자는 IC50 또는 약물반응곡선의 면적(AUC)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
특히, 본 발명에서 상기 약물 반응 인자를 약물반응곡선의 면적(AUC)으로 하는 경우, 모든 농도에서 실질적인 실험 결과에 따른 약물의 반응을 반영하기 때문에 정확한 약물 반응 평가가 이루어지기 때문이고, IC50은 세포 생존율이 50%가 되는 구간이 반드시 실험 결과에 있어야 산출할 수 있어 AUC로 하는 것이 약물에 대한 암 세포의 반응도를 더 효율적으로 반영할 수 있다. 약물 농도에 따라 완벽한 직선형 구간이 나타나지 않는 경우 대략적인 추세선에 의존하여 IC50을 구할 수밖에 없기 때문에 정확한 약물 반응 평가가 이루어지지 않을 수 있다. 반면, AUC는 모든 농도에서 실질적인 실험 결과에 따른 약물의 반응을 반영하여 정확한 약물반응 평가가 이루어진다.
따라서, 본 발명에 있어서 상기 약물 반응 인자는 IC50 또는 약물반응곡선의 면적(AUC)일 수 있으나, IC50 보다 약물반응곡선의 면적(AUC)을 적용하는경우, 더 정확한 항암제 감수성 검사가 가능하다.
본 발명에서, 상기 (c) 단계는 검사 대상체(예컨대, 환자)의 항암제에 대한 감수성 정도를 상, 중 또는 하, 또는 치료 반응 양성 또는 음성으로 표시하여 제공할 수 있으며, 항암제의 효능 평가 도표 등을 통하여 항암제에 대한 감수성을 표시하여 제공할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 다음 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법에 관한 것이다:
(a) 상기 전처리 방법에 따라 체액 시료를 전처리하는 단계;
(b) 상기 전처리하여 수집된 세포를 3D 배양하는 단계; 및
(c) 상기 배양된 3D 배양물에 항암제 후보군을 처리하여 3D 배양물의 세포 사멸을 유도하는 항암제를 선별하는 단계.
본 발명에서 상기 항암제 스크리닝 방법은 상기 환자 맞춤형 항암제 정보 제공 방법에서의 각 단계와 모순되지 않는 범위 내에서, 상기 환자 맞춤형 항암제 정보 제공 방법의 하나 이상의 단계가 항암제 스크리닝 방법을 실시하기 위한 일부 단계로 적용될 수 있다.
본 명세서의 해석의 명확함을 위해, 이하에서는 본 명세서에서 사용되는 용어들을 정의하기로 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "대상체(subject)"는 항암제 감수성을 검사하고자 하는 모든 대상을 의미할 수 있다. 예를 들어, 대상체는, 난소암, 유방암, 편평상피세포암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 신장암, 방광암, 담관암 및 담낭암 중 적어도 하나의 암종에서 발병된 개체일 수 있다. 바람직하게, 상기 대상체는 항암제에 대한 감수성을 검사하고자 하는 개체, 예컨대, 부인암, 예를 들어, 난소암, 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암이 발병된 개체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 나아가, 본 명세서 내에 개시된 대상체는, 포유 동물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "항암제"는, 암 세포의 증식을 억제하기 위한 화학 요법 치료제로서, 화학 항암제 및 표적 항암제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항암제는, 독소루비신을 포함한 파클리탁셀, 텍소티어, 아드리아마이신, 엔도스타틴, 앤지오스타틴, 미토마이신, 블레오마이신, 시스플레틴, 카보플레틴, 다우노루비신, 이다루비신, 5-플로로우라실, 메토트렉세이트, 엑티노마이신-D 또는 이들의 혼합물일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "항암제 감수성"은, 항암제에 대한 민감도 또는 반응성을 의미할 수 있으며, 표적 항암제의 처치에 따라 치료 반응을 나타내는지 여부를 예측하기 위한 척도일 수 있다. 이때, 본원 명세서 내에서, 항암제 감수성은, 항암제의 치료 반응성, 약물 반응성 등과 상호 교환적으로 이용될수 있다. 이에, 항암제의 감수성 검사 결과에 따라, 대상체는 특정 항암제에 대한 치료 반응 양성 개체(항암제 반응성 개체) 또는 치료 반응 음성 개체(항암제 저항성 개체)로 결정될 수 있다. 보다 구체적으로 표적 항암제에 대하여 항암제 감수성이 상대적으로 높은 개체는 치료 반응 양성인 개체로, 표적 항암제에 대한 항암제 감수성이 상대적으로 낮은 개체는 치료 반응 음성으로 결정될 수 있다.
이때, 항암제 감수성은, 대상체로부터 분리된 암 세포에 대한 약물 반응 인자인 IC50 또는 AUC와 함께 암 세포의 성장률과 연관이 있을 수 있다. 보다 구체적으로, 암 세포의 약물 반응 정도(약물 효능 정도)는, 암 세포의 성장률에 반비례할 수 있다. 즉, 효능 평가 정량 지표인 세포 실험 기반의 약물 반응 인자와 암 세포의 성장률을 항암제 감수성을 예측하는데 반영할 경우, 단일 인자만을 고려했을 때보다 항암제 감수성 예측의 정확도 및 민감도가 높을 수 있다. 특히, 약물반응 인자와 세포 성장 인자 등의 다중 인자에 기초한 항암에 감수성 예측 결과는, 개체의 임상 결과와 매칭될 수 있을 정도로 정확도가 높을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "약물 반응 인자”는 세포를 기반으로 하는 약물의 반응을 정량 측정하는 척도로 약물에 따른 세포의 활성도를 포함한다. 본 발명에 있어서, 상기 약물은 항암제일 수 있다.
예를 들어, 세포의 활성도는 살아있는 세포를 염색하여 형광물질의 전체 강도/크기, 선별된 강도/크기 등을 측정하여 세포 활성도를 측정하거나, 죽은 세포를 염색하여 세포사멸을 구하고 역으로 세포 활성도를 측정할 수 있다.
또한, MTT 또는 ATP 등의 화학요소를 사용하여 세포 또는 세포를 포함하는 용액의 형질변화를 측정하여 세포 활성을 측정하는 것을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "세포 성장 인자"는 세포의 시간에 따른 성장을 측정하는 정량 지표를 포함한다. 일 예로, 시간에 따라서 세포의 활성도를 측정하여 세포의 성장인자를 구할 수 있다.
이때 세포 성장 인자는, 세포 활성 증가율, 세포 성장률, 세포 크기 증가율, 콜로니 생성율일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어, "세포 성장률"은 정해진 시간 동안의 세포 부피, 크기, 개수의 변화를 의미할 수 있다.
이때 세포 성장률은, 특정 세포에 국한해서 계산이 될 수 있다. 여러 세포 중에서 세포 분열 또는 성장이 활발한 세포군을 국한하여 세포의 성장 인자를 산출할 수 있다.
"개체 (individual)", "환자 (patient)" 및 "대상체 (subject)"는 본 명세서에서 상호 교환 적으로 사용되며 포유류, 예를 들어 마우스, 쥐, 기타 설치류, 토끼, 개, 고양이, 돼지, 소, 양, 말, 또는 인간을 포함한 영장류를 포함하여 임의의 동물을 포함한다.
본 발명에 있어서, 용어 "그라인딩"이란 세포 덩어리를 더 작은 세포 집단으로 풀어주는 작업을 의미하며 악성 스페로이드와 같은 세포 덩어리를, 세포 스크래퍼로 눌러 주거나 주사기 내부에 넣고 피스톤을 왕복 이동시키는 과정에서 세포 덩어리는 물리적인 힘에 의해 더 작은 세포 집단으로 분리된다.
본 발명에서 용어 "필라 플레이트"란 판상 구조를 가지는 기판부; 상기 기판부와 일체로 형성되고 상기 기판부의 하부면에서 하방으로 돌출되어 웰에 삽입되는 삽입 필라부; 및 상기 기판부와 일체로 형성되고 상기 삽입 필라부에 대응하여 상기 기판부의 상부면에서 상방으로 돌출되는 보상 필라부를 포함하는 세포 배양용 플레이트를 의미한다.
본 발명에 따른 필라 플레이트로는 일 양태로서 대한민국 등록특허 10-1632426에 기재된 바이오 칩용 필라 구조체를 적절히 변형하여 사용할 수 있고, 따라서 대한민국 등록특허 10-1632426에 기재된 전문이 본 발명을 실시하기 위한 하나의 양태로서 본 발명에 통합된다.
본 발명에서는 체액에서 분리한 세포가 원발암 기원인지 용이하게 확인하고, 별도의 배양 단계 없이 간단한 전처리 공정 만으로 필라 플라이트에서 효과적으로 3D 배양하여 환자 맞춤형 항암제를 정확하고 신속하게 스크리닝 할 수 있는 장점이 있다.
본 발명은 또한, 필라 플레이트를 이용하여 1 필라당, 5000 cells/1.5 uL의 작은 스케일로, 다량의 항암제 검사를 수행할 수 있다는 장점이 있고, 환자 유래 세포를 3D 배양하여 동물실험의 비용적, 시간적 한계를 극복하면서, 체내 종양 환경을 최대한 대변할 수 있는 항암제 감수성 검사라는 장점이 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 시료 준비
자궁경부암 또는 난소암 환자로부터 분리된 체액 (복수 또는 흉수) 시료로 실험을 진행하였다. 환자의 임상 반응 평가는 임상의의 판단 결과에 따라 항암제의 민감군과 저항군으로 나누었다 (임상 결과 기준데이터). 본 발명은 연구목적의 IRB 승인을 획득하여 실험을 진행하였으며, 환자들로부터 서면 동의를 받아 실험에 사용되었다.
실시예 2. 체액 시료 품질 관리
맞춤형 항암제 선별 공정에서, 환자에게 효과적인 항암제를 선별하기 위해서는 암 환자로부터 채취한 체액 시료 내 암 세포를 포함하여야 한다. 암 환자로부터 채취한 체액 시료 내 암 세포는 악성 스페로이드 (malignant spheroid) 라고 불리는 세포 덩어리로 뭉쳐서 존재하기 때문에, 악성 스페로이드를 포함하는 체액 시료를 이용하여 이후 절차를 진행하는 것이 바람직하다.
이를 확인하기 위하여, 부인암 환자로부터 분리된 악성 스페로이드가 포함되지 않는 복수 시료 (A1)와 악성 스페로이드가 포함된 복수 시료 (A2)를 각각 이하 실시예 3 내지 실시예 4에 기재된 방법에 따라 전처리하고 필라 플레이트에서 3D 배양하였다.
그 결과, 도 2에서와 같이 A1에서 분리된 세포는 주로 혈액 세포에 해당하여 필라 플레이트에서 배양시 세포가 거의 생존하지 못하는 반면, A2에서 분리된 세포는 암 세포로 필라 플레이트에서 배양시 세포가 오가노이드를 형성하며 성장하는 것으로 확인되었다.
실시예 3. 체액 시료 전처리
체액 시료 전처리 과정은 도 3과 같다.
부인암 환자의 복수로부터 분리된 체액 시료의 품질을 확인하고, 세포는 100 μm 세포 스트레이너(cell strainer) (SPL)를 이용하여 액상 시료를 1차 필터링 하면서 동시에 세포 스크래퍼 (Cell scraper, SPL)를 이용하여 스트레이너 위쪽에 걸러진 덩어리들을 그라인딩(grinding) 하여 내려주었다. 50 ml 코니칼 튜브(conical tube)에 스트레이너(strainer)를 빠져나온 세포를 수집하였다.
1차 필터링이 완료된 후, 원심분리기를 이용하여 세포 펠렛을 모으고 (500 g, 5 min) 상등액을 제거한 후, HBSS 버퍼(Gibco)를 이용하여 세포 펠렛을 세척하고, 다시 원심분리하였다 (500 g, 5 min).
세포 펠렛에 RBC 용해 버퍼(lysis buffer) (Roche)를 첨가하여 반응시키고, 원심분리하였다(300 g, 3 min). 상등액을 제거한 후, 70 μm 세포 스트레이너 (SPL)를 이용하여 세포를 2차 필터링하였다.
Advanced DMEM/F12 (Gibco) 배양액을 넣고, 원심분리 (원심분리기, 300 g, 3 min) 하여 세척하였다. 상등액을 제거하고, Advanced DMEM/F12 배양액을 이용하여 세포를 재현탁시킨 후 세포를 계수하였다.
실시예 4. 분리된 세포의 3D 배양
체액 시료를 전처리하여 분리된 세포를 3D 배양하는 과정은 도 4와 같다.
부인암 환자로부터 채취된 채액을 전처리하여 분리된 세포를 5000 cells/1.5 ul/pillar (1.5 ul of organoid media including 70% Matrigel (Corning))으로 384 필라 플레이트(MBD)의 각 필라 위에 분주하고, 필라 플레이트에서 약 3일 동안 3D 배양하였다.
4 well plate의 1 well에 배양한 오가노이드를 기준으로, 배양액을 제거하고, 차가운 PBS를 첨가하여 피펫팅 (blunt-end tip)으로 마트리겔을 깨주었다. 이를 에펜도르프 튜브에 넣은 후 500 g로 5 min 동안 4 ℃에서 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 필요에 따라 차가운 PBS로 잔여 오가노이드를 추가로 수확하여 상기 과정을 반복하였다. 1ml의 Cell Recovery solution (Corning®ice-chilled)을 넣어 4℃에서 1-5분간 반응시켜 마트리겔을 제거하고 500 g로 5 min 동안 4 ℃에서 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 1ml의 4% PFA를 첨가하고, 5 - 10분간 상온에서 인큐베이션 하였다. 뭉친 펠릿은 탭핑으로 풀어주었다. 300 g로 5 min 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. 1ml의 PBS로 세척하고 300 g로 5 min 원심분리하여 상층액을 제거하였다. Erythrosin B (1x)를 100 ul 첨가하고, 상온에서 5 분간 인큐베이션 하였다. PBS를 900 ul 첨가하고 300 g x 5 min 원심분리하여 가능한 모든 상층액을 제거하였다. 오가노이드가 빨갛게 염색되어 육안으로 확인이 가능하였으며, 슬라이드 섹션 후 H&E 염색하여 관찰하였다.
오가노이드 배양에 사용된 세포 배양액 조성은 표 1과 같다.
성분명 제조사 최종 농도
R-Spondin 1 peprotech 1ug/ml
Noggin peprotech 100 ng/ml
Y-27632 stemcell 10 uM
A-83-01 tocris 500 nM
B-27 supplement (50x) gibco 1x
N-acetyl-L-cystein sigma 1.25 mM
Leu15-Gastrin 1 sigma 10 nM
Recombinant Human IGF-1 (Insulin) welgene 100 ng/ml
Recombinant Human FGF-2 peprotech 50 ng/ml
Afamin/Wnt3a CM MBL 10%
그 결과, 필라 위에서 암 세포가 성장하여 오가노이드를 형성하는 것을 확인할 수 있었다(도 5 및 도 6).
실시예 5. 항암제 검사
난소암 환자로부터 채취한 복수 시료를 상기 실시예 3 내지 실시예 4에 기재된 바와 같이 전처리하고, 분리된 세포를 필라 플레이트에 3D 배양하였다.
5-1. 항암제 후보군 처리
37℃의 CO2 인큐베이터에서 3일간 배양하여 안정화시킨 후, 항암제 또는 PBS or DMSO(대조군)가 처리된 배양액이 분주되어 있는 well plate로 pillar plate를 옮겨 세포에 항암제 후보군이 노출되도록 하여 37℃의 CO2 인큐베이터에서 3일간 배양하였다. 사용된 항암제 후보군과 그 사용 농도는 표 2와 같다.
Drug 제조사 Catalog No. Final Concentration
(Max. dose, uM)
1 Paclitaxel Selleckchem S1150 10
2 Niraparib Selleckchem S2741 10
3 PLD Tribi Science F30204B-D 35
4 Carboplatin AdooQ A10182 100
5 Gemcitabine Selleckchem S1714 100
6 Topotecan Selleckchem S9321 10
7 Cisplatin Selleckchem S1166 100
8 Bevacizumab Selleckchem A2006 500
5-2. 세포 사멸도(활성도) 산출
384 well plate에 50% ATP 시약 (CellTiter Glo 3D 시약, Promega)을 40uL/웰 분주하였다. 50% ATP 시약이 분주되어 있는 well plate에 실시예 5-1에 따른 세포가 있는 pillar plate를 결합시켰다. 5분간 흔들어 잘 섞이게 한 뒤, 25 분간 상온에서 반응시켜 주었다. SPARK (TECAN)를 사용하여 발광도를 측정하였다. 측정된 발광도에서 약물이 처리되지 않은 값을 100으로 환산하여 약물 처리된 시료 에서 세포 사멸도(활성도)를 계산하였다.
Cell Viability (%)=(T/C)x100
T : Drug 을 처리한 well 의 세포 활성도 (ATP 발광량)
C : Control well 의 세포 활성도 (ATP 발광량)
약물의 농도에 따른 암세포의 사멸 정도를 DRC(Dose Response Curve)로 그리고, DRC를 기반으로 하여 산출한 는 AUC(Area Under Curve) 면적(약물 처리하지 않은 세포 활성도(cell viability)가 100% 유지되었을 때 면적 대비 백분율)을 계산하였다. AUC(Area Under Curve)는 세포 활성도가 100%일 때 전체면적 대비 DRC 커브의 아래 면적의 비를 나타낸다. 약물이 처리된 시료에서 세포 사멸도(활성도)가 50% 이하인 경우, 항암제에 반응하는 반응군으로 구분하였다.
5-3. 세포 성장율 (Cell growth rate) 산출
384 well plate에 50% ATP 시약 (CellTiter Glo 3D 시약)을 40uL/웰 분주하였다. 50% ATP 시약이 분주되어 있는 well plate에 실시예 5-1에 따른 항암제를 처리하지 않은 대조군 세포가 있는 pillar plate를 결합시켰다. 5분간 흔들어 잘 섞이게 한 뒤, 25분간 상온에서 반응시켜 주었다. SPARK (TECAN)를 사용하여 발광도를 측정하였다. 약물처리 시작일(3일)과 약물처리 종료일(6일)의 측정값을 비교하여 세포 성장률을 산출하였다.
세포 성장율 (%) = (A/B)x100
A : 약물처리 시작일의 약물 처리하지 않은 세포 활성도
B : 약물처리 종료일의 약물 처리하지 않은 세포 활성도
5-4. 항암제 감수성 지수에 따른 항암제 감수성 예측
암 환자마다 차이가 나는 세포 성장률을 고려하여 항암제 감수성 예측의 정확도를 높이고자 하였다. 이에 5-2에서 산출된 세포 사멸도를 기초로 약물 반응 인자의 Z-score를 산출하였으며, 5-3에서 산출된 세포 성장률을 기초로 세포 성장 인자의 Z-score를 산출하였다.
Z-score 산출 공식
Figure 112022101529422-pat00003
Ζ: 표준점수 Z-score(standard score)
Ⅹ: 원점수(raw score)
μ: 모집단 평균(population mean)
σ: 모집단 표준편차(population standard deviation)
모집단은 시험하고자 하는 시료와 동일한 암종, 동일한 약물의 항암제 감수성 데이터를 기초로 최소 50례 이상의 시험 데이터를 수집하였다.
시료에서 약물 반응 인자의 Z-score (Za) 값과 세포 성장 인자의 Z-score(Zb) 값을 산출하고, 항암제 감수성 지수인 CODRP Index(Cancer Organoid-based Diagnosis Reactivity Prediction index, 암 오가노이드 세포 배양 기반의 개인 맞춤형 암 치료 반응성 예측 지수)로 항암제 감수성을 예측하였다.
Figure 112022101529422-pat00004
CODRP index가 낮을수록 항암제 반응성이 좋음을 의미하며, CODRP index가 높을수록 항암제에 대하여 저항성이 높음을 나타낸다. 본 발명에서는 CODRP index가 -0.5 보다 작은 경우 항암제에 대해 저항성이 낮아, 치료가 권장되는 항암제로 선별하였다.
5-5. 예측 결과 검증
난소암 환자인 A5 실험군 환자는 (i) Paclitaxel + Carboplatin (총 6 cycles), (ii) PLD + Carboplatin (총 6 cycles) (iii) Topotecan + Bevacizumab (총 1 cycle)의 순서대로 약물 치료 이력이 있는 환자이나, 치료 경과가 좋지 않았다.
이에, A5 환자로부터 분리된 복수 시료를 상기 실시예에 따라 전처리하고 이를 3D 배양한 후 항암제를 선별한 결과, Bevacizumab과 Topotecan을 병용처리하는 경우 CODRP index가 낮게 확인되었다. 상기 결과에 기인하여, Bevacizumab과 Topotecan을 병용 치료한 결과, 3회의 병용 치료 후부터 부분 응답(partial response)을 나타내었다.
CT 결과를 확인하면, Bevacizumab과 Topotecan을 병용치료 하기 전 양측 폐와 늑막(pleurae)의 전이성 병변이 진행되었고 양측 늑막 삼출(bilateral pleural effusion)이 증가하였으나, Bevacizumab과 Topotecan의 3차 병용 치료 후 복막 암종증(peritoneal carcinomatosis) 및 전이성 림프절(metastatic lymph node )의 부분 응답이 확인되었고, Bevacizumab과 Topotecan의 4차 병용 치료 후에는 폐 전이가 치료되고 병변이 안정되어, 본 발명에 따른 항암제 효과 예측과 정확히 일치되는 결과를 확인하였다 (도 7).
한편, 다른 난소암 환자인 A10 실험군 환자는 Paclitaxel과 Carboplatin을 1회 병용 투여한 약물 치료 이력이 있는 환자이다.
Paclitaxel과 Carboplatin의 병용 치료에 따른 효과를 예측하고자, A10 환자로부터 분리된 복수 시료를 상기 실시예에 따라 전처리하고 이를 3D 배양한 후 항암제를 선별한 결과, Paclitaxel과 Carboplatin을 병용처리하는 경우 CODRP index가 낮게 확인되었다. 상기 결과에 기인하여, 지속적으로 Paclitaxel과 Carboplatin을 사용하여 병용 치료한 결과, 3회의 병용 치료 후 유의한 치료 효과가 확인되었다. 즉, CT 촬영 결과, Paclitaxel과 Carboplatin로 1회 치료한 직후에는, 기원을 알 수 없는 확산성 복막암종증 (diffuse peritoneal carcinomatosis)이 관찰되고, 간 우측 후단부에는 복막 파종과 관련될 수 있는 중심 스캡럽(focal scalloping)이 의심되며, 양쪽 간엽에는 3개의 혈관종 가능성이 확인되었으나, 3회의 Paclitaxel과 Carboplatin 병용 치료 후 복막암종증이 일부 남아 있으나 현저히 감소하였음을 확인하였다 (도 8).
또 다른 난소암 환자인 A9 실험군 환자는 외과적 수술 후 (i) Paclitaxel + Carboplatin (총 6 cycles), (ii) Pegylated liposomal doxorubicin + Carboplatin (총 6 cycles), (iii) Weekly paclitaxel + Durvalumab (총 5 cycles), (iv) Etoposide + Ifosfamide (총 10 cycles), (v) Belotecan + carboplatin (총 2 cycles, 2021-09-29 투여), (vi) Cyclophosphamide + Cisplatin (총 3 cycles, 2022-01-03 투여)의 치료 이력이 있는 환자이다.
A9 환자로부터 분리된 복수 시료를 상기 실시예에 따라 전처리하고 이를 3D 배양한 후 다양한 항암제를 테스트해 본 결과, 테스트한 모든 항암제에 저항성을 나타내었으며, 특히, 항암제 테스트 결과 중 Carboplatin + Paclitaxel, Carboplatin + PLD 조합은 임상에서 실제로 약물에 반응하지 않았던 치료 이력의 결과와 일치하였다 (도 9).
한편, 동일한 환자로부터 수득된 복수(A7) 및 흉수(P5) 시료를 이용하여 상기 실시예에 따라 전처리 및 3D 배양하고 항암제 감수성을 확인해 본 결과, 도 10에서와 같이 동일한 항암제에 대해 동일한 항암제 감수성을 보여, 본 발명이 암 환자로부터 분리된 다양한 체액 시료에서 환자에게 적합한 항암제를 선별하는 검사가 가능하다는 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (17)

  1. 다음 단계를 포함하는 암 환자로부터 분리된 체액 시료의 전처리 방법:
    (a) 암 환자로부터 분리된 체액 시료를 90 내지 110 μm 세포 스트레이너(cell strainer)로 필터링하여 세포 스트레이너를 통과한 세포를 수집하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 수집된 세포로부터 적혈구를 용해하고 원심분리하는 단계; 및
    (c) 상기 원심분리된 세포 펠렛을 60 내지 80 μm 세포 스트레이너로 필터링하고 세포 스트레이너를 통과한 세포를 수집하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 체액 시료는 악성 스페로이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 (a) 단계는 선별된 체액 시료로부터 필터링 전 또는 필터링 중 세포 스크래퍼를 이용하여 악성 스페로이드를 그라인딩(grinding)하는 과정을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (a) 및/또는 (c) 단계의 세포를 수집하는 단계는 원심분리하여 세포를 수집하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 체액은 복수 또는 흉수인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 암은 난소암, 유방암, 편평상피세포암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 신장암, 방광암, 담관암 및 담낭암로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 암은 진행성, 수술 불가 또는 전이성 암인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 다음 단계를 포함하는 환자 맞춤형 항암제 정보 제공 방법:
    (a) 암 환자로부터 분리된 체액 시료를 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법으로 전처리하는 단계:
    (b) 상기 전처리한 시료를 3D 배양하는 단계; 및
    (c) 상기 배양된 3D 배양물에 항암제 후보군을 처리하여 3D 배양물의 세포 사멸을 유도하는 항암제를 환자 맞춤형 항암제로 선별하는 단계.
  9. 제8항에 있어서, 상기 (a) 단계의 체액 시료는 악성 스페로이드를 포함하고, 상기 체액 시료로부터 분리된 세포의 세포 생존율이 60% 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 (c) 단계는 P0 세포에 항암제 후보군을 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 항암제 후보군은 파클리탁셀, 텍소티어, 아드리아마이신, 엔도스타틴, 앤지오스타틴, 미토마이신, 블레오마이신, 시스플레틴, 카보플레틴, 다우노루비신, 이다루비신, 5-플로로우라실, 메토트렉세이트, 엑티노마이신-D, 니라파립, PLD, 카보플라틴, 젬시타빈, 토포테칸 및 베바시주맙로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제8항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 전처리한 시료는
    세포 배양액이 수용될 수 있는 수용 공간이 형성되어 있고, 배양 대상체인 세포가 놓여지는 부분으로, 평평한 바닥으로부터 일정높이를 갖도록 기둥 형태로 돌출된 복수의 필라부들; 및
    수용 공간에 놓여진 배양액이 평평한 바닥에 흩어져 잔류하지 않고 한쪽에 모여 있을 수 있도록, 평평한 바닥에 대해 볼록하게 형성된 필라부들과는 반대로 오목하게 형성되는 트렌치홈부;를 포함하는 필라 플레이트에서 3D 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 (b) 단계는 하나의 필라당 1000 내지 10000 개의 세포를 분주하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제8항에 있어서, 상기 (c) 단계는 약물 반응 인자 및/또는 세포 성장 인자에 기초하여 항암제를 선별하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 (c) 단계는 약물 반응 인자의 Z-score (Za) 및 세포 성장 인자의 Z-score (Zb)를 통합하여 하기 CODRP index를 산출하고, CODRP index가 -0.5 이하인 경우 적합한 항암제로 선별하는 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure 112022101529422-pat00005

  16. 제14항에 있어서, 상기 약물 반응 인자는 IC50 또는 약물반응곡선의 면적(AUC)인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 다음 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법:
    (a) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따라 체액 시료를 전처리하는 단계;
    (b) 상기 전처리하여 수집된 세포를 3D 배양하는 단계; 및
    (c) 상기 배양된 3D 배양물에 항암제 후보군을 처리하여 3D 배양물의 세포 사멸을 유도하는 항암제를 선별하는 단계.

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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101632426B1 (ko) * 2015-12-11 2016-06-21 이돈정 바이오 칩용 필라 구조체
KR20180000991A (ko) 2016-06-24 2018-01-04 사회복지법인 삼성생명공익재단 환자특이적 환자 유래 세포의 제조방법 및 이의 이용
KR20200081296A (ko) * 2018-12-26 2020-07-07 주식회사 넥스트앤바이오 암을 가진 대상체의 항암제 및/또는 방사선 내성 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법
KR20210108865A (ko) * 2020-02-25 2021-09-03 고려대학교 산학협력단 환자 맞춤형 약물 선택을 위한 정보 제공 방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101632426B1 (ko) * 2015-12-11 2016-06-21 이돈정 바이오 칩용 필라 구조체
KR20180000991A (ko) 2016-06-24 2018-01-04 사회복지법인 삼성생명공익재단 환자특이적 환자 유래 세포의 제조방법 및 이의 이용
KR20200081296A (ko) * 2018-12-26 2020-07-07 주식회사 넥스트앤바이오 암을 가진 대상체의 항암제 및/또는 방사선 내성 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법
KR20210108865A (ko) * 2020-02-25 2021-09-03 고려대학교 산학협력단 환자 맞춤형 약물 선택을 위한 정보 제공 방법

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Malignant ascites-derived organoid (MADO) cultures for gastric cancer in vitro modelling and drug screening. J Cancer Res Clin Oncol. 2019 Nov;145(11):2637-2647.
Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing. Sci Rep. 2020 Jul 28;10(1):12581.
Personalized Medicine-Based Approach to Model Patterns of Chemoresistance and Tumor Recurrence Using Ovarian Cancer Stem Cell Spheroids. Clin Cancer Res; 23(22); 6934-45.
Short-term organoid culture for drug sensitivity testing of high-grade serous carcinoma. Gynecol Oncol/ 2020 Jun;157(3):783-792.

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