CN114032277A - 一种基于染色法的肿瘤类器官药物敏感性检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于染色法的肿瘤类器官药物敏感性检测方法，该方法包括：将肿瘤类器官与抗肿瘤药物混合后在药敏培养基中培养一段时间，再采用细胞荧光染色剂对肿瘤类器官进行染色，之后将染色类器官处理为单细胞后进行活性检测以及药敏分析评估。本发明的肿瘤类器官药物敏感性检测方法是基于细胞染色，使用肿瘤患者源的类器官，直接计算活死细胞数量，进行活力分析，从而判断样本对药物的敏感性。相较于PDX建模后进行药敏检测的方法，本发明的方法通量更高，时间更短。相较于ATP法类器官药敏，本发明直接对细胞活率进行检测，而不是检测ATP，能够更准确的评估药物接触后细胞活性，判断药物敏感性。
Description
技术领域
本发明涉及药物敏感性检测技术领域，具体涉及一种基于染色法的肿瘤类器官药物敏感性检测方法。
背景技术
近年肿瘤靶向药加速研发上市，但靶向药抗肿瘤机制极其复杂，患者个体差异很大，面对大量的抗肿瘤新药，如何选择用药方案成为新的挑战，许多在我国高发但欧美发病率较低的恶性肿瘤，如肝癌、鼻咽癌、胃癌、食管癌等，缺乏临床数据，临床用药盲目性随意性极大，疗效差，费用高，距离真正意义上的精准个体化治疗还很遥远。肿瘤药物敏感性检测技术，正是提高肿瘤研究与精准治疗效率的有效方法。不但能在最大程度上模拟人体内肿瘤微环境，还可以保持肿瘤的异质性，更加客观准确的反应药物疗效和安全性。
类器官(organoids)是一种利用成体干细胞体外培养出的具有3D结构的细胞培养物，与对应的人类器官拥有高度相似的组织学特征，并能重现该器官的生理功能。肿瘤类器官(tumoroids)则是利用患者肿瘤组织体外培养的，与患者肿瘤的结构、生理等高度一致的“微肿瘤”。类器官可作为多种疾病的体外模型，在干细胞与发育、再生医学、疾病研究、药物开发和精准医疗等多个方面拥有广泛的应用前景。类器官模型可以复制肿瘤的组织复杂性与遗传异质性，与诸多临床前模型如2D细胞系、PDX模型等相比，类器官在成功率、维护难度、筛选难度上均表现出了良好的潜力，为从基因或蛋白水平研究类器官致癌或癌症相关机制的研究提供宝贵的模型。
肿瘤类器官药物敏感性检测，是通过采集患者手术、穿刺或恶性积液等活性肿瘤样本，体外进行要类器官培养后，进行药物敏感性检测。现有肿瘤类器官药物敏感性检测技术，多采用ATP发光法检测药物处理后类器官细胞中的ATP量，间接反应细胞的活力，因而当样本含有较多非肿瘤细胞时，如淋巴细胞等，会受到非肿瘤细胞的干扰，影响最终结果。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种基于染色法的肿瘤类器官药物敏感性检测方法。本发明的技术方案为：
一种基于染色法的肿瘤类器官药物敏感性检测方法，包括：将肿瘤类器官与抗肿瘤药物混合后在药敏培养基中培养一段时间，再采用细胞荧光染色剂对肿瘤类器官进行染色，之后将染色类器官处理为单细胞后进行活性检测以及药敏分析评估。
进一步地，所述检测方法具体包括以下步骤：
步骤1，将获得的癌症组织细胞进行培养至肿瘤类器官形成；
步骤2，将肿瘤类器官与基质胶等量混匀后，传代至96孔板，设置用药组、对照组和空白组，采用药敏培养基培养3天后用药组加入肿瘤药物，之后所有组别的类器官继续培养4-14天；
步骤3，采用细胞荧光染色剂对所有组别的肿瘤类器官进行染色，染色完成后，置换染液为药敏培养基并于37℃放置一段时间，之后重复多次更换药敏培养基并放置的过程，直到洗去多余的染料；
步骤4，将所有组别的肿瘤类器官的药敏培养基移除，加入细胞消化液将肿瘤类器官消化为单细胞；
步骤5，测试每个组别的单细胞活性，并根据活性检测结果分析评估药物敏感性。
进一步地，所述药敏培养基按照终浓度的组成包括：不含维生素A的B27，1-5×；N-acetylcysteine，1-10mM；L-WRN细胞上清液，5％～30％；IGF，50-500ng/ml；EGF，10-100ng/ml；Y27632，1-10uM；8-bromo-cAMP，10-100nM；Primocin，50-250ug/ml；硫酸庆大霉素，10-100μg/mL；以上成分溶于基础培养基，前述的百分浓度表示体积浓度。
进一步地，所述药敏培养基还包括：CHIR99021，1-10uM；gastrin I，1-10nM。
可选地，所述基础培养基为advanced DMEM/F12、DMEM、F12、DMEM/F12中的一种。
进一步地，所述步骤3中染色过程的控制参数为：37℃染色不低于60min。
进一步地，所述细胞荧光染色剂：Hoechst 33342、Calcein Am(钙黄绿素-AM)、PI(碘化丙啶)、DAPI中的至少两种。
前述的几种荧光染色剂中，Hoechst 33342显示蓝色荧光，用来标记活细胞；Calcein Am(钙黄绿素-AM)显示绿色荧光，用来标记活细胞；PI(碘化丙啶)显示红色荧光，用来标记死细胞；DAPI显示蓝色荧光，用来标记细胞核。
进一步地，所述步骤5中测试每个组别的单细胞活性是采用Cytation5图像采集设备进行荧光拍照，并统计每个组别的单细胞各孔红、绿、蓝三色通道的总面积，计算得到细胞活率，细胞活率＝活细胞染色面积/(活细胞染色面积+死细胞染色面积)。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的肿瘤类器官药物敏感性检测方法是基于细胞染色，使用肿瘤患者源的类器官，直接计算活死细胞数量，进行活力分析，从而判断样本对药物的敏感性。相较于PDX建模后进行药敏检测的方法，本发明的方法通量更高，时间更短。相较于ATP法测试的类器官药敏性，本发明直接对细胞活率进行检测，而不是检测ATP，能够更准确的评估药物接触类器官后的细胞活性，判断药物敏感性。此外，本发明的检测方法可以采用加药前后自身对照，减少阴性对照孔，节约类器官，提高筛药通量。
附图说明
图1为本发明实施例1的肠癌类器官Calcein Am荧光染色结果图。
图2为本发明实施例1的荧光染色法与对比例1的ATP法对肿瘤药物敏感性检测对比。
图3为本发明实施例2的荧光染色法与对比例2的ATP法对肿瘤药物敏感性检测对比。
图4为本发明实施例3的荧光染色法与对比例3的ATP法对肿瘤药物敏感性检测对比。
图5为本发明实施例4的荧光染色法与对比例4的ATP法肿瘤药物敏感性检测对比。
图6为本发明实施例5在不同细胞量梯度下药敏结果的变化情况。
具体实施方式
在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
本实施例提供一种基于染色法的肠癌类器官药物敏感性检测方法，包括以下步骤：
步骤1，将获得的肠癌组织细胞进行培养至肿瘤类器官形成。
步骤2，将上述类器官与基质胶等量混匀后传代至96孔板，设置用药组、对照组和空白组，每孔8000细胞，采用药敏培养基培养3天后用药组加入肿瘤药物(氟尿嘧啶或者奥沙利铂)，之后所有组别的类器官继续培养4天；所述药敏培养基按照终浓度的组成包括：不含维生素A的B27，3×；N-acetylcysteine，5mM；L-WRN细胞上清液，20％；IGF，200ng/ml；EGF，50ng/ml；Y27632，5uM；8-bromo-cAMP，50nM；Primocin，150ug/ml；硫酸庆大霉素，55μg/mL；CHIR99021，4uM；gastrin I，6nM；以上成分溶于基础培养基advanced DMEM/F12，前述的百分浓度表示体积浓度。
步骤3，类器官荧光染色：添加Calcein Am、PI荧光染色剂，37℃孵育染色60min。染色完成后，置换染液为药敏培养基，37℃放置3分钟，重复多次更换新的药敏培养基并于37℃放置3分钟，充分洗去多余的染料。
步骤4，使用药敏培养液清洗几遍后，移除培养基，加入100μl TrypLE溶液，常温下消化2-3分钟，期间观察细胞状态，当大部分细胞消化为单细胞时，加入100μl药敏培养基终止消化。
步骤5，将消化后获得的细胞液于37℃静置5min使细胞自然沉降。使用Cytation5图像采集设备进行荧光拍照，并统计各孔红、绿、蓝三色通道的总面积，计算细胞活率，细胞活率＝绿色荧光面积/(绿色荧光面积+红色荧光面积)；根据三组(用药组、对照组、空白组)活性检测结果，分析不同药物的敏感程度。图1为肠癌类器官Calcein Am荧光染色结果图，图2为荧光染色法与ATP法检测的肠癌类器官细胞活率对比结果，荧光染色法的检测结果与ATP法基本一致。
实施例2
本实施例提供一种基于染色法的肺癌类器官药物敏感性检测方法，包括以下步骤：
步骤1，将获得的肺癌组织细胞进行培养至肿瘤类器官形成。
步骤2，将上述类器官与基质胶等量混匀后传代至96孔板，设置用药组、对照组和空白组，每孔8000细胞，采用药敏培养基培养3天后用药组加入肿瘤药物(奥西替尼或者吉西他滨)，之后所有组别的类器官继续培养4天；所述药敏培养基按照终浓度的组成包括：不含维生素A的B27，1×；N-acetylcysteine，10mM；L-WRN细胞上清液，10％；IGF，50ng/ml；EGF，100ng/ml；Y27632，10uM；8-bromo-cAMP，80nM；Primocin，100ug/ml；硫酸庆大霉素，100μg/mL；CHIR99021，2uM；gastrin I，10nM；以上成分溶于基础培养基advanced DMEM/F12，前述的百分浓度表示体积浓度。
步骤3，类器官荧光染色：添加Hoechst 33342、PI荧光染色剂，37℃孵育染色60min。染色完成后，置换染液为药敏培养基，37℃放置3分钟，重复多次更换新的药敏培养基并于37℃放置3分钟，充分洗去多余的染料。
步骤4，使用药敏培养液清洗几遍后，移除培养基，加入100μl TrypLE溶液，常温下消化2-3分钟，期间观察细胞状态，当大部分细胞消化为单细胞时，加入100μl药敏培养基终止消化。
步骤5，将消化后获得的细胞液于37℃静置5min使细胞自然沉降。使用Cytation5图像采集设备进行荧光拍照，并统计各孔红、绿、蓝三色通道的总面积，计算细胞活率，图3为荧光染色法与ATP法检测的肺癌类器官细胞活率对比结果，荧光染色法的检测结果与ATP法基本一致。
实施例3
本实施例提供一种基于染色法的卵巢癌类器官药物敏感性检测方法，包括以下步骤：
步骤1，将获得的卵巢癌组织细胞进行培养至肿瘤类器官形成。
步骤2，将上述类器官与基质胶等量混匀后传代至96孔板，设置用药组、对照组和空白组，每孔8000细胞，采用药敏培养基培养3天后用药组加入肿瘤药物(卡铂或者紫杉醇)，之后所有组别的类器官继续培养4天；所述药敏培养基按照终浓度的组成包括：不含维生素A的B27，5×；N-acetylcysteine，2mM；L-WRN细胞上清液，30％；IGF，500ng/ml；EGF，10ng/ml；Y27632，3uM；8-bromo-cAMP，30nM；Primocin，50ug/ml；硫酸庆大霉素，20μg/mL；以上成分溶于基础培养基DMEM，前述的百分浓度表示体积浓度。
步骤3，类器官荧光染色：添加Hoechst 33342、PI荧光染色剂，37℃孵育染色60min。染色完成后，置换染液为药敏培养基，37℃放置3分钟，重复多次更换新的药敏培养基并于37℃放置3分钟，充分洗去多余的染料。
步骤4，使用药敏培养液清洗几遍后，移除培养基，加入100μl TrypLE溶液，常温下消化2-3分钟，期间观察细胞状态，当大部分细胞消化为单细胞时，加入100μl药敏培养基终止消化。
步骤5，将消化后获得的细胞液于37℃静置5min使细胞自然沉降。使用Cytation5图像采集设备进行荧光拍照，并统计各孔红、绿、蓝三色通道的总面积，计算细胞活率，图4为荧光染色法与ATP法检测的卵巢癌类器官细胞活率对比结果，荧光染色法的检测结果与ATP法基本一致。
实施例4
本实施例提供一种基于染色法的肺癌胸水样本来源的类器官药物敏感性检测方法，包括以下步骤：
步骤1，将获得的肺癌胸水样本细胞进行培养至肿瘤类器官形成。
步骤2，将上述类器官与基质胶等量混匀后传代至96孔板，设置用药组、对照组和空白组，每孔8000细胞，采用药敏培养基培养3天后用药组加入肿瘤药物(奥西替尼或者吉西他滨)，之后所有组别的类器官继续培养4天；所述药敏培养基按照终浓度的组成包括：不含维生素A的B27，4×；N-acetylcysteine，1mM；L-WRN细胞上清液，25％；IGF，400ng/ml；EGF，80ng/ml；Y27632，1uM；8-bromo-cAMP，10nM；Primocin，200ug/ml；硫酸庆大霉素，10μg/mL；以上成分溶于基础培养基DMEM/F12，前述的百分浓度表示体积浓度。
步骤3，类器官荧光染色：添加Calcein Am、PI荧光染色剂，37℃孵育染色60min。染色完成后，置换染液为药敏培养基，37℃放置3分钟，重复多次更换新的药敏培养基并于37℃放置3分钟，充分洗去多余的染料。
步骤4，使用药敏培养液清洗几遍后，移除培养基，加入100μl TrypLE溶液，常温下消化2-3分钟，期间观察细胞状态，当大部分细胞消化为单细胞时，加入100μl药敏培养基终止消化。
步骤5，将消化后获得的细胞液于37℃静置5min使细胞自然沉降。使用Cytation5图像采集设备进行荧光拍照，并统计各孔红、绿、蓝三色通道的总面积，计算细胞活率，图5为荧光染色法与ATP法检测的肺癌类器官细胞活率对比结果，实施例4细胞活率更低，药敏结果更为敏感，而对比例4药敏结果为耐药。原因是实施例4染色法在分析过程中，可以设置通过细胞直径阈值，排除10um以下的细胞(多为淋巴细胞等正常细胞)，减少正常细胞对药敏检测干扰，结果更准确。
实施例5
本实施例提供一种基于染色法的肠癌类器官药物敏感性检测方法，包括以下步骤：
步骤1，将获得的肠癌组织细胞进行培养至肿瘤类器官形成。
步骤2，将上述类器官与基质胶等量混匀后传代至96孔板，分别按每孔2000、4000、8000、16000细胞每孔铺板，各自设置用药组、对照组和空白组，每孔2000cell，采用药敏培养基培养3天后用药组加入肿瘤药物(奥西替尼或者吉西他滨)，之后所有组别的类器官继续培养4天；采用的药敏培养基同实施例1。
步骤3，类器官荧光染色：添加Calcein Am、PI荧光染色剂，37℃孵育染色60min。染色完成后，置换染液为药敏培养基，37℃放置3分钟，重复多次更换新的药敏培养基并于37℃放置3分钟，充分洗去多余的染料。
步骤4，使用药敏培养液清洗几遍后，移除培养基，加入100μl TrypLE溶液，常温下消化2-3分钟，期间观察细胞状态，当大部分细胞消化为单细胞时，加入100μl药敏培养基终止消化。
步骤5，将消化后获得的细胞液于37℃静置5min使细胞自然沉降。使用Cytation5图像采集设备进行荧光拍照，并统计各孔红、绿、蓝三色通道的总面积，计算细胞活率，图6为肠癌类器官在不同细胞起始量情况下细胞活率结果，使用96孔板，每孔细胞量达到4000时，药敏结果趋于稳定，故每孔细胞量应不低于4000。
对比例1
本对比例提供一种基于ATP法的肠癌类器官药物敏感性检测方法，和实施例1形成对比。具体包括以下步骤：
步骤1，将获得的肠癌组织细胞进行培养至肿瘤类器官形成。
步骤2，将上述类器官与基质胶等量混匀后传代至96孔板，设置用药组、对照组和空白组，采用药敏培养基培养3天后用药组加入肿瘤药物，之后所有组别的类器官继续培养4天；药敏培养基同实施例1。
步骤3，ATP检测：将40uL发光试剂加入细胞培养板空白孔、对照孔、药物测试孔中，室温(约25℃)震荡2min，以促进细胞的裂解，孵育8min，使用具有检测化学发光功能的多功能酶标仪进行化学发光检测。
步骤4，待检测完成后，导出数据，计算细胞活率。结果如图2所示，ATP法与染色法结果基本一致。
对比例2
本对比例提供一种基于ATP法的肺癌类器官药物敏感性检测方法，和实施例2形成对比。具体包括以下步骤：
步骤1，将获得的肺癌组织细胞进行培养至肿瘤类器官形成；
步骤2，将上述类器官与基质胶等量混匀后传代至96孔板，设置用药组、对照组和空白组，采用药敏培养基培养3天后用药组加入肿瘤药物，之后所有组别的类器官继续培养4天；药敏培养基同实施例2。
步骤3，ATP检测：将40uL发光试剂加入细胞培养板空白孔、对照孔、药物测试孔中，室温(约25℃)震荡2min，以促进细胞的裂解，孵育8min，使用具有检测化学发光功能的多功能酶标仪进行化学发光检测；
步骤4，待检测完成后，导出数据，计算细胞活率。结果如图3所示，ATP法与染色法结果基本一致。
对比例3
本对比例提供一种基于ATP法的卵巢癌类器官药物敏感性检测方法，和实施例3形成对比。具体包括以下步骤：
步骤1，将获得的卵巢癌组织细胞进行培养至肿瘤类器官形成；
步骤2，将上述类器官与基质胶等量混匀后传代至96孔板，设置用药组、对照组和空白组，采用药敏培养基培养3天后用药组加入肿瘤药物，之后所有组别的类器官继续培养4天；药敏培养基同实施例3。
步骤3，ATP检测：将40uL发光试剂加入细胞培养板空白孔、对照孔、药物测试孔中，室温(约25℃)震荡2min，以促进细胞的裂解，孵育8min，使用具有检测化学发光功能的多功能酶标仪进行化学发光检测；
步骤4，待检测完成后，导出数据，计算细胞活率。结果如图4所示，ATP法与染色法结果基本一致。
对比例4
本对比例提供一种基于ATP法的肺癌胸水样本来源的类器官药物敏感性检测方法，和实施例4形成对比。具体包括以下步骤：
步骤1，将获得的肺癌恶性积液细胞进行培养至肿瘤类器官形成；
步骤2，将上述类器官与基质胶等量混匀后传代至96孔板，设置用药组、对照组和空白组，采用药敏培养基培养3天后用药组加入肿瘤药物，之后所有组别的类器官继续培养4天；药敏培养基同实施例4。
步骤3，ATP检测：将40uL发光试剂加入细胞培养板空白孔、对照孔、药物测试孔中，室温(约25℃)震荡2min，以促进细胞的裂解，孵育8min，使用具有检测化学发光功能的多功能酶标仪进行化学发光检测；
步骤4，待检测完成后，导出数据，计算细胞活率。结果如图5所示，实施例4细胞活率更低，药敏结果更为敏感，而对比例4药敏结果为耐药。原因是实施例4染色法在分析过程中，可以设置通过细胞直径阈值，排除10um以下的细胞(多为淋巴细胞等正常细胞)，减少正常细胞对药敏检测干扰，结果更准确。
对比例5
本对比例提供一种基于ATP法的肠癌类器官药物敏感性检测方法，除了药敏培养基更换为现有进行类器官培养常规采用的advanced DMEM/F12培养基外，其他同实施例1。
结果显示，所有检测孔发光值整体过低，抑制率不明显，说明所有检测孔内细胞均出现死亡，无法很好的区分药物敏感性。
还有一种现有PDX建模方法可以进行药物敏感性检测，这种方法目前已经被大多数研究者放弃，因为建模的过程非常复杂，成功率低，很考验建模人员的手法和耐心，在药敏上无法推广使用。
综上所述，本发明的肿瘤类器官药物敏感性检测方法是基于细胞染色，使用肿瘤患者源的类器官，直接计算活死细胞数量，进行活力分析，从而判断样本对药物的敏感性。具有通量更高、时间更短的优点，并且能够更准确的评估药物接触类器官后的细胞活性，判断药物敏感性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (8)
1.一种基于染色法的肿瘤类器官药物敏感性检测方法，其特征在于：包括：将肿瘤类器官与抗肿瘤药物混合后在药敏培养基中培养一段时间，再采用细胞荧光染色剂对肿瘤类器官进行染色，之后将染色类器官处理为单细胞后进行活性检测以及药敏分析评估。
2.根据权利要求1所述的一种基于染色法的肿瘤类器官药物敏感性检测方法，其特征在于：所述检测方法具体包括以下步骤：
步骤1，将获得的癌症组织细胞进行培养至肿瘤类器官形成；
步骤2，将肿瘤类器官与基质胶等量混匀后，传代至96孔板，设置用药组、对照组和空白组，采用药敏培养基培养3天后用药组加入肿瘤药物，之后所有组别的类器官继续培养4-14天；
步骤3，采用细胞荧光染色剂对所有组别的肿瘤类器官进行染色，染色完成后，置换染液为药敏培养基并于37℃放置一段时间，之后重复多次更换药敏培养基并放置的过程，直到洗去多余的染料；
步骤4，将所有组别的肿瘤类器官的药敏培养基移除，加入细胞消化液将肿瘤类器官消化为单细胞；
步骤5，测试每个组别的单细胞活性，并根据活性检测结果分析评估药物敏感性。
3.根据权利要求1或2所述的一种基于染色法的肿瘤类器官药物敏感性检测方法，其特征在于：所述药敏培养基按照终浓度的组成包括：不含维生素A的B27，1-5×；N-acetylcysteine，1-10mM；L-WRN细胞上清液，5％～30％；IGF，50-500ng/ml；EGF，10-100ng/ml；Y27632，1-10uM；8-bromo-cAMP，10-100nM；Primocin，50-250ug/ml；硫酸庆大霉素，10-100μg/mL；以上成分溶于基础培养基，前述的百分浓度表示体积浓度。
4.根据权利要求3所述的一种基于染色法的肿瘤类器官药物敏感性检测方法，其特征在于：所述药敏培养基还包括：CHIR99021，1-10uM；gastrin I，1-10nM。
5.根据权利要求3或4所述的一种基于染色法的肿瘤类器官药物敏感性检测方法，其特征在于：所述基础培养基为advanced DMEM/F12、DMEM、F12、DMEM/F12中的一种。
6.根据权利要求1或2所述的一种基于染色法的肿瘤类器官药物敏感性检测方法，其特征在于：所述步骤3中染色过程的控制参数为：37℃染色不低于60min。
7.根据权利要求1或2所述的一种基于染色法的肿瘤类器官药物敏感性检测方法，其特征在于：所述细胞荧光染色剂：Hoechst 33342、Calcein Am(钙黄绿素-AM)、PI(碘化丙啶)、DAPI中的至少两种。
8.根据权利要求2所述的一种基于染色法的肿瘤类器官药物敏感性检测方法，其特征在于：所述步骤5中测试每个组别的单细胞活性是采用Cytation5图像采集设备进行荧光拍照，并统计每个组别的单细胞各孔红、绿、蓝三色通道的总面积，计算得到细胞活率，细胞活率＝活细胞染色面积/(活细胞染色面积+死细胞染色面积)。
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