KR20160098684A - 혈관 질환 진단용 바이오 마커 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 혈중 인터루킨 12 수용체 β2(interleukin 12 receptor β2) 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 혈관 질환 진단용 조성물 및 이를 포함하는 혈관 질환 진단용 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 혈관 질환 의심 개체의 분리된 혈액 시료로부터 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 혈관 질환 진단을 위한 정보의 제공 방법에 관한 것이다. 아울러, 본 발명은 인터루킨 12 수용체 β2 활성 억제제를 포함하는, 혈관 질환 예방 또는 치료용 조성물과 혈관 질환 치료용 후보물질을 평활근 세포에 처리하고 인터루킨 12 수용체 β2의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 혈관 질환 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라 인터루킨 12 수용체β2를 혈관 질환, 특히 심근 경색 또는 불안정 협심증에 대한 바이오 마커로 이용하게 됨에 따라, 기존에 혈관 조영술로만 진단이 가능하던 혈관 질환에 대하여 혈액을 이용한 비침습적이고 경제적으로 빠른 시간 내에 진단이 가능해진다. 이에 따라, 질병이 악화되어 허혈 증상이 일어나야만 자각 증상을 통해 후 진단을 하던 혈관 질환 분야에 조기 진단이 가능해짐에 따라, 기존에 불가능했던 조기 및 예방 치료를 실현하는 것이 가능해진다.

Description

혈관 질환 진단용 바이오 마커 및 이의 용도{A biomarker for diagnosing vascular diseases and the uses thereof}
본 발명은 혈중 인터루킨 12 수용체 β2(interleukin 12 receptor β2) 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 혈관 질환 진단용 조성물 및 이를 포함하는 혈관 질환 진단용 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 혈관 질환 의심 개체의 분리된 혈액 시료로부터 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 혈관 질환 진단을 위한 정보의 제공 방법에 관한 것이다. 아울러, 본 발명은 인터루킨 12 수용체 β2 활성 억제제를 포함하는, 혈관 질환 예방 또는 치료용 조성물과 혈관 질환 치료용 후보물질을 평활근 세포에 처리하고 인터루킨 12 수용체 β2의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 혈관 질환 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
죽상 경화증은 서양 국가에서 사망율의 약 50%를 차지하고 있는 두 질환인, 관상동맥 질환 및 뇌혈관 질환에 초기 원인이라고 알려져 있다. 죽상 경화증의 초기 병변은 일명 "지방줄 무늬(fatty streak)" 병변으로 대표되는, 내피하 지질-축적 대식세포(거품세포, foam cells)의 축적이 일어난다. 지방줄 무늬는 의학적으로 유해한 것은 아니나, 지질-풍부 회저성 조직 파편 및 평활근(smooth muscle cells, SMCs)의 축적으로 특정되는 진전된 형태인 섬유성 및 플라크-형 병변의 전초가 될 수 있다.
질병이 심화되는 동안, 동맥 혈관벽은 점차 두껍고 단단해져서 죽상 경화성 플라크를 형성하고 이에 따라 동맥 내 면적은 좁아진다. 이러한 동맥 혈관의 내막 비후에 의한 혈관 내경의 협착이 더욱 진행되어 플라크가 부서지기 쉬운 상태가 되면 불안전한 협심증(unstable angina)이 동반된다. 이어 플라크가 갑자기 파열되어 허혈성 증상이나 혈전을 일으킬 수 있고 이에 따라 심근 경색 또는 심장발작을 일으킬 수 있다. 하지만, 죽상 경화증 등으로 인한 혈관 내막 비후 증상은 큰 자각 증상없이 수십년 동안 진행되기 때문에 직접적인 허혈성 증상이 나타나기 전에는 혈관 내막 비후 증상을 진단하는 것은 쉽지 않다.
혈관 내막 비후에 의한 협착부위가 확인되면 혈관 내경의 협착을 제거하고 혈관을 확장하기 위해 스텐트나 경피적 관동맥 형성술을 포함하는 혈관 성형술을 통한 혈관 개입(vascular intervention) 수술을 실시하는 것이 일반적이나, 상기와 같은 수술 후에 혈관 내피 세포가 박리되어, 혈관 평활근 세포의 과증식에 의한 혈관 내막 비후 증상으로 재협착 증상이 다시 발생할 수 있다. 이에 해당 분야에서는 혈관 내막 비후 증상을 비침습적으로 용이하게 진단하는 방법의 개발이 매우 절실한 상황이다.
지금까지 인간 유래 시료 및 동물 모델에서 죽상경화증의 조기 진단 바이오 마커를 동정하기 위한 수많은 시도가 있었다. 프래밍햄 심장 연구에서 7년 이상의 기간 동안 3,209 참여자에 대하여 follow-up 연구한 임상 데이터를 통해서 수 개의 의미있는 바이오 마커[C-반응성 단백(C-reactive protein), BNP(B-type natriuretic peptide), 레닌(renin), 뇨중 알부민(urinary albumin) 및 호모시스테인]를 밝혀내었다. 질병의 진행과 관련을 보이는 순환 바이오 마커를 찾기 위한 혈청 단백질체학 및 대사체학 실험이 수년간 적극적으로 진행되었다. 그럼에도 불구하고, 모두 개인차 및 혈관 비후증을 가진 인간 조직을 얻기 어려운 문제점으로 임상 적용 가능한 바이오 마커, 특히 혈장 유래 바이오 마커는 전혀 없는 실정이다.
상기와 같은 배경 하에, 본 발명자들은 유전자적으로 유사 유전자형의 랫트의 풍선-성형술에 의한 경동맥 손상 혈관에 대한 차등 단백질체 분석을 하고, 인간 대동맥 평활근(human aortic SMCs, HASMCs)를 이용한 in vitro 검증을 통해 평활근 비대증과 무관한 단백질을 필터링하였다. 이 후, in vitro 및 in vivo 검증을 통해 신생 내막 평활근 비대증과 관련성이 알려지지 않았던 후보 단백질을 동정하였다. 그 결과, 혈청에 존재하는 인터루킨 12 수용체 β2 단백질이 혈반(plaque) 불안정성으로부터 연유하는 임상 징후와 관련성이 있음을 발견하고, 혈중 인터루킨 12 수용체 β2 단백질을 혈관 질환에 대한 바이오 마커로 사용할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은, 혈중 인터루킨 12 수용체 β2(interleukin 12 receptor β2) 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 혈관 질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 혈관 질환 진단용 조성물을 포함하는 혈관 질환 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 혈관 질환 의심 개체의 분리된 혈액 시료로부터 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 혈관 질환 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 인터루킨 12 수용체 β2 활성 억제제를 포함하는, 혈관 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 혈관 질환 치료용 후보물질을 평활근 세포에 처리하고 인터루킨 12 수용체 β2의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 혈관 질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 혈중 인터루킨 12 수용체 β2(interleukin 12 receptor β2) 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 혈관 질환 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "혈관 질환"은 혈관 조직의 손상이 일어나고, 이에 의한 혈관 내막이 두꺼워지는 증상을 가지는 질환을 제한없이 포함한다. 본 발명의 혈관 질환에 해당할 경우, 상기한 혈관 내막 비후가 진행됨에 따라 혈관의 협착이 일어날 수 있고, 혈관벽의 탄력이 줄어들어 혈관 파열에 의한 출혈이 발생할 수 있다. 본 발명에서 혈관 질환은 혈관 비후증, 불안정 협심증(unstable angina), 심근 경색(acute myocardial infarction), 죽상 경화증, 혈관재협착 (in-stent restenosis)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서는 혈액 내 인터루킨 12 수용체 β2는 손상되고 혈관 내막의 비후 증상을 나타내는 바이오 마커이고, 이를 통해 불안정 협심증(unstable angina), 심근 경색(acute myocardial infarction) 등의 심장 발작 위험 질환군을 진단할 수 있음을 확인하였다. 이에 따라, 혈중 인터루킨 12 수용체 β2 단백질을 측정하는 것을 통해, 즉 본 발명의 혈관 질환 예측 또는 진단용 조성물을 이용하여 심장 발작의 위험군 여부를 조기 진단할 수 있다.
본 발명에서 용어, "인터루킨 12 수용체 β2(interleukin 12 receptor β2, IL-12Rβ2)"는 인터루킨 12 리간드에 결합하는 수용체 단백질의 subunit β2를 의미한다. 해당 단백질은 JAK2/STAT4 경로에 관여하며, T 세포와 NK 세포의 증식을 촉진하는 기능을 하고, 특히 T 세포를 Th1 세포로의 분화를 촉진하는 것으로 알려져 있다. 본 유전자 또는 단백질에 대한 정보는 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI GenBank일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에서 인터루킨 12 수용체 β2 단백질은 전장(full-length) 인간 인터루킨 12 수용체 β2 단백질일 수 있으며, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다.
본 발명의 혈관 질환 진단용 조성물은 인터루킨 12 수용체 β2 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머를 포함할 수 있다. 특히, 본 발명에서 인터루킨 12 수용체 β2 단백질에 특이적인 항체는 Santa Cruz Biotech. Clone E-20, Catalog # sc-18648 및/또는 Atlas antibodies. Product # HPA024168일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 인터루킨 12 수용체 β2 단백질에 특이적인 항체로 Santa Cruz Biotech. Clone E-20, Catalog # sc-18648 및/또는 Atlas antibodies. Product # HPA024168를 사용하여 인터루킨 12 수용체 β2 단백질 수준을 측정하였다.
한편, 본 발명의 혈관 질환 진단용 조성물은 혈중에서 평활근 또는 혈관 내막세포 유래 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준을 측정하는 것일 수 있다.
인터루킨 12 수용체 β2 단백질은 인터루킨 12 리간드에 결합하는 수용체 단백질의 subunit에 해당한다. 특히, 인터루킨 12 수용체 β2 단백질은 막통과 단백질로 세포막에 존재하는 것이 일반적임에 따라 해당 단백질이 혈액 내에 존재하는지에 대해서는 알려진 바가 없다. 본 발명에서 혈액에서 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준을 측정할 수 있다는 것뿐 아니라, 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 혈관 질환, 예를 들어 불안정 협심증, 심근 경색 등과의 관련성에 대해서는 본 발명자들이 최초로 규명하였다.
본 발명에서 혈액에서 발견되는 인터루킨 12 수용체 β2 단백질은 혈관 비후증에 의해 손상된 혈관 내막세포에서 유래, 즉 평활근(Smooth muscle cells, SMCs) 유래일 수 있다. 즉, 혈관 비후증이 일어나는 손상된 혈관 내막에서 인터루킨 12 수용체 β2 단백질이 과발현되고, 손상된 조직에서 유래하는 세포 외 소포(엑소좀 등)에 막단백질인 인터루킨 12 수용체 β2 단백질이 포함될 수 있으며, 상기 세포 외 소포는 혈액 내에 존재할 수 있음에 따라, 혈액에서 상기 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준을 측정할 수 있다.
본 발명의 혈관 질환 진단용 조성물은 정상 대조군의 혈액 시료 대비 혈관 질환, 예를 들어 심근경색 또는 불안정 협심증을 가지는 개체의 혈액 시료에서 차등적 수준을 갖는 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함함에 따라, 개체의 혈관 질환 여부를 판단할 수 있게 한다. 즉, 본 발명의 조성물을 통해 측정한 개체의 혈중 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준이 정상 대조군의 혈중 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준보다 높은 경우, 해당 개체는 혈관 질환으로 판단할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 정상 대조군, 혈관 내막 비후증이나 심장 발작 위험도가 낮은 안정 협심증(stable angina)과 불안정 협심증 및 심근 경색 환자군의 혈액 시료로부터 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준을 측정하였다. 그 결과 정상인 샘플에 비교하여 환자 샘플에서 IL-12Rβ2 단백질이 현저히 높은 수준으로 발현되는 것을 확인하였다(도 7 및 도 8a).
본 발명에서 상기 평활근 또는 혈관 내막세포 유래 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준을 측정하는 조성물은 i) 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준을 측정하는 제제는 인터루킨 12 수용체 β2 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머; 및 ii) 평활근 마커 또는 혈관 내막세포 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 상기 i)와 ii)에 iii) 세포 외 소포 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로 상기 평활근 마커 또는 혈관 내막세포 마커는 혈소판 유래 성장인자 수용체(platelet-derived growth factor receptor, PDGFR)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 양태로, 혈액에서 평활근 또는 혈관 내막세포 유래 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준을 측정하기 위해서, 먼저 혈액에서 평활근 또는 혈관 내막세포 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 이용하여 해당 마커들을 포함하는 세포 외 소포들을 분리한 다음, 해당 세포 외 소포들에서 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준을 측정할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 대표적으로 평활근 마커, PDGFR에 특이적으로 결합하는 항체(Santa Cruz Biotech. clone P-20. Catalog # sc-339)를 이용하였으며, 이를 이용하여 분리한 엑소좀에서 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준을 측정하였다(도 9c).
본 발명에서 상기 혈중 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준을 측정하는 것은 혈액에 존재하는 세포 외 소포(extracellular vesicle)에서 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준을 측정하는 것일 수 있으며, 상기 세포 외 소포는 특히 엑소좀(exosome)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이를 위해서, 본 발명의 조성물은 세포 외 소포 마커, 특히 엑소좀 마커에 특이적인 항체 또는 앱타머를 포함할 수 있으며, 상기 엑소좀 마커는 CD81, CD9 또는 CD63일 수 있다. 상기 엑소좀 마커에 특이적인 항체로, CD63에 특이적으로 결합하는 항체 System Biosciences Inc. Cat # EXOAB-CD63A-1, CD9에 특이적으로 결합하는 항체 System Biosciences Inc. Cat# EXOAB-CD9A-1 및/또는 CD81에 특이적으로 결합하는 항체 System Biosciences Inc. Cat# EXOAB-CD81A-1를 사용할 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준을 측정하는 세포 외 소포, 엑소좀 등은 혈관 유래일 수 있으며, 특히 손상된 혈관 내막 유래일 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 엑소좀 마커에 특이적인 항체로, CD63에 특이적으로 결합하는 항체 System Biosciences Inc. Cat # EXOAB-CD63A-1, CD9에 특이적으로 결합하는 항체 System Biosciences Inc. Cat# EXOAB-CD9A-1 및/또는 CD81에 특이적으로 결합하는 항체 System Biosciences Inc. Cat# EXOAB-CD81A-1를 사용하였다.
본 발명에서 용어 "마커(marker)"란 혈관 질환을 가진 개체, 특히 심근 경색 또는 불안정 협심증을 가진 개체를 정상군 개체 또는 심장 발작 비위험군 개체와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 본 발명의 혈관 질환을 가지는 개체에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산, 지질, 당지질, 당단백질 또는 당 등과 같은 유기 생체 분자들을 모두 포함한다. 특히 본 발명에서는 본 발명의 혈관 질환을 가지는 개체에서 증가되는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "단백질의 수준을 측정"하는 것은, 본 발명의 혈관 질환 여부를 진단하기 위하여 생물학적 시료(예를 들어, 전혈, 혈장, 혈청, 이들의 분획 등)에서 상기 마커 단백질의 존재 여부와 발현 수준을 확인하는 과정으로, 특히 상기 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 상기 생물학적 시료는 개체로부터 분리된 생물학적 시료일 수 있다.
이를 위한, 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, 엘라이자(ELISA, enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석(Radioimmunoassay, RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(oucherlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역 전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 유세포 분석(Fluorescence Activated cell sorter, FACS), 앱타머 칩(aptamer chip), 마이크로어레이(microassay), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 혈관 질환 의심환자에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 혈관 질환 의심 환자의 실제 혈관 질환 발병 여부를 진단할 수 있다.
본 발명에서의 용어, "항체"란, 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체, 재조합 항체 및 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 모두 포함한다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.
본 발명의 혈관 질환, 특히 심근 경색 또는 불안정 협심증에 대한 마커 단백질인 인터루킨 12 수용체 β2 단백질에 특이적인 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 수행될 수 있다. 다클론 항체는 인터루킨 12 수용체 β2 단백질 항원(전장 또는 단편)을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양,원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다. 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol.,222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다.
또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
본 발명에서 용어, "앱타머(aptamer)"는 단일가닥 올리고 뉴클레오티드로서, 20~60 뉴클레오티드 정도의 크기이며, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가지며,항원-항체 반응처럼 특정 물질과 높은 친화력을 가질 수 있다. 앱타머는 소정의 표적 분자에 대하여 결합함으로써, 소정의 표적 분자를 검출하거나 이의 활성을 저해할 수 있다. 본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 변형된(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 또한 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있다. 바람직하게 상기 앱타머는 인터루킨 12 수용체 β2에 결합하여 인터루킨 12 수용체 β2를 검출하거나 활성을 저해하는 역할을 할 수 있다. 이와 같은 앱타머는 인터루킨 12 수용체 β2의 서열로부터 당업자가 공지의 방법에 의해 제조할 수 있다.
한편, 본 발명에서 용어 항원-항체(또는 앱타머) 복합체란 상기 인터루킨 12 수용체 β2 단백질과 이에 특이적인 항체 또는 앱타머의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.
이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 FITC, RITC, 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN)8 , [Os(bpy) 3 ] 2+ ,[RU(bpy) 3 ] 2+, [MO(CN) 8 ] 4- 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I , 186Re 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다.
단백질 발현수준 측정은 바람직하게는, ELISA법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체 또는 앱타머를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체 또는 앱타머의 복합체에서 포획 항체 또는 앱타머를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체 또는 앱타머와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체 또는 앱타머와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다.
본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 혈관 질환, 특히 심근 경색 또는 불안정 협심증의 발병 여부, 병의 진전 정도, 및 이로 인한 심장 발작의 위험군 여부를 확인하는 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 혈관 질환 진단용 조성물을 포함하는 혈관 질환 진단용 키트을 제공한다.
본 발명의 키트는 혈관 질환, 특히 심근 경색 또는 불안정 협심증의 마커인 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준을 확인함으로써 마커를 검출할 수 있다. 본 발명의 마커 검출용 키트는 인터루킨 12 수용체 β2 단백질을 검출할 수 있는 마이크로어레이, 앱타머 칩 키트, 엘라이자(ELISA, enzyme linked immunosorbent assay) 키트, 블랏팅(blotting) 키트, 면역침전법 키트, 면역형광검사 키트, 단백질 칩 키트 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
본 발명의 마커 검출용 키트는 인터루킨 12 수용체 β2 단백질을 검출하기 위한 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준을 측정하기 위한 앱타머 또는 항체를 포함할 수 있다.
또 다른 구체적인 일례로서, 본 발명에서 인터루킨 12 수용체 β2 단백질 수준을 측정하기 위한 키트는 앱타머 또는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 검출 라벨로 표지된 항체 또는 앱타머 및/또는 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 검출 라벨은 상기 설명한 바와 같다. 상기에서 발색 기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘) 등 검출 라벨에 따라 당업계에서 자명하게 사용하는 기질이 사용될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 혈관 질환 의심 개체의 분리된 혈액 시료로부터 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 혈관 질환 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 (a) 혈관 질환 의심 개체의 분리된 혈액 시료로부터 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 측정된 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준이 정상 대조군 시료의 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준과 비교하는 단계를 포함하는 혈관 질환 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.
본 발명에서 혈관 질환, 진단, 인터루킨 12 수용체 β2 등은 상기 설명한 바와 같다.
본 발명에서 상기 혈액 시료는 혈관 질환 의심 개체의 혈관 질환 여부를 진단하기 위하여 수집한 혈액 시료(예를 들어, 전혈, 혈장, 혈청, 이들의 분획 등)를 의미하며, 특히 혈장 시료 또는 세포 외 소포 분획일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 세포 외 소포는 엑소좀일 수 있다.
본 발명의 혈관 질환 진단을 위한 정보의 제공 방법은 혈관 질환 의심 개체의 분리된 혈액 시료로부터 측정된 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준이 정상 대조군 시료의 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준보다 높을 경우, 혈관 질환으로 진단하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 혈관 질환 진단을 위한 정보의 제공 방법은 특히, 상기 혈관 질환 의심 개체의 분리된 혈액 시료로부터 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준을 측정하는 것은 혈액 시료에 존재하는 혈액 내막 유래, 즉 평활근 유래 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준을 측정하는 것일 수 있으며, 이는 혈액 시료로부터 혈액 내막 유래, 즉 평활근 유래 세포 외 소포(예를 들어, 엑소좀)를 분리 또는 추출하여 이에 존재하는 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준을 측정하는 것을 통해 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 양태로, 혈액에서 평활근 또는 혈관 내막세포 유래 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준을 측정하기 위해서, 먼저 혈액에서 평활근 마커 또는 혈관 내막세포 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 이용하여 해당 마커들을 포함하는 세포 외 소포들을 분리한 다음, 해당 세포 외 소포들에서 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준을 측정할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 대표적으로 평활근 마커, PDGFRβ에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하였으며, 이를 이용하여 분리한 엑소좀에서 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준을 측정하였다(도 9c).
또 하나의 양태로서, 본 발명은 인터루킨 12 수용체 β2 활성 억제제를 포함하는, 혈관 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 혈관 질환, 인터루킨 12 수용체 β2 등은 상기 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "인터루킨 12 수용체 β2 활성 억제제"는 인터루킨 12 수용체 β2의 발현 또는 활성을 감소시키는 제제를 모두 통칭하는 의미로 사용되며, 구체적으로는 인터루킨 12 수용체 β2의 발현을 전사 수준에서 감소시키거나 그 활성을 방해함으로써, 인터루킨 12 수용체 β2의 발현 수준 또는 활성을 감소시키는 모든 제제를 포함할 수 있다.
상기 인터루킨 12 수용체 β2의 활성 억제제는 인터루킨 12 수용체 β2를 표적으로 하여 인터루킨 12 수용체 β2의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 화합물, 핵산, 펩타이드, 바이러스 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터 등 그 형태에 제한 없이 사용 가능하다. 상기 인터루킨 12 수용체 β2 활성 억제제는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 인터루킨 12 수용체 β2 mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드, 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 활성을 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다. 특히, 상기 인터루킨 12 수용체 β2 mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드는 인터루킨 12 수용체 β2에 특이적인 안티센스 올리고 뉴클레오티드, 앱타머(aptamer) 또는 siRNA가 될 수 있다. 즉, 본 발명에서 인터루킨 12 수용체 β2 활성 억제제는 항-인터루킨 12 수용체 β2 단백질 항체, 및 인터루킨 12 수용체 β2 유전자 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 microRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있으며, 상기 인터루킨 12 수용체 β2 유전자 특이적인 siRNA는 인터루킨 12 수용체 β2(interleukin 12 receptor β2)의 염기서열을 참조하여 당업계에 공지된 방법에 따라 제작된 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 4종의 인터루킨 12 수용체 β2 유전자 특이적인 siRNAs를 풍선-성형술에 의한 경동맥 손상 마우스 모델에 처리하여 실질적으로 혈관 내막 비후 증상이 현저히 적어지는 것을 확인하였다.
본 발명에서 용어, "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체로서, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 인터루킨 12 수용체 β2 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미한다. 이는 상기 인터루킨 12 수용체 β2 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이는 6 내지 100 염기, 바람직하게는 8 내지 60 염기, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기일 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 통상의 방법으로 시험관 내에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 합성하는 한가지 예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 다중클로닝부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 상기 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 이용될 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 디자인은 인터루킨 12 수용체 β2(interleukin 12 receptor β2)의 염기서열을 참조하여 당업계에 공지된 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다.
본 발명에서 용어, "siRNA"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개할 수 있는 핵산 분자로서, 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹다운(knockdown) 방법 또는 유전자치료 방법으로 사용된다. 상기 siRNA는 이중가닥의 RNA가 다이서에 의해 절단되어 생성되는 21-25 뉴클레오티드 크기의 작은 RNA 조각으로 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 발현을 억제할 수 있다. 본 발명의 목적상 인터루킨 12 수용체 β2(interleukin 12 receptor β2)에 특이적으로 작용하여 인터루킨 12 수용체 β2(interleukin 12 receptor β2) 분자를 절단하여 RNA 간섭(RNAi, RNA interference) 현상을 유도함으로써, 상기 인터루킨 12 수용체 β2(interleukin 12 receptor β2)를 억제할 수 있다. siRNA는 화학적으로 또는 효소학적으로 합성될 수 있다. siRNA의 제조방법으로는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, siRNA를 직접 화학적으로 합성하는 방법, 시험관 내(in vitro) 전사를 이용한 siRNA의 합성법, 시험관 내(in vitro) 전사에 의해 합성된 긴 이중-가닥 RNA를 효소를 이용하여 절단하는 방법, shRNA 발현 플라스미드나 바이러스성 벡터의 세포내 전달을 통한 발현법 및 PCR(polymerase chain reaction) 유도 siRNA 발현 카세트(cassette)의 세포 내 전달을 통한 발현법 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 GE Dharmacon에서 제조한 인간 인터루킨 12 수용체 β2를 특이적으로 억제하는 Cat # M_007932-00와 랫트 인터루킨 12 수용체 β2를 특이적으로 억제하는 Cat # M_095069-01를 사용하여 효과를 확인하였다.
본 발명에서 용어, "치료"는 치료하고자 하는 개개인 또는 세포의 천연 과정을 변경시키기 위해 임상적으로 개입하는 것을 지칭하고, 이는 임상 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위해 수행할 수 있다. 목적하는 치료 효과에는 질병의 발생 또는 재발을 예방하고, 증상을 완화시키며, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저하시키며, 전이를 예방하고, 질병 진행 속도를 감소시키며, 질병 상태를 경감 또는 일시적 완화시키며, 차도시키거나 예후를 개선시키는 것이 포함된다. 바람직하게 본 발명에서는 인터루킨 12 수용체 β2를 억제하는 물질을 포함하는 조성물의 투여로 혈관 질환, 특히 혈관 비후증, 심근 경색 또는 불안정 협심증의 경과를 호전시키는 모든 행위를 포함한다. 또한, "예방"은 본 발명에 따른 인터루킨 12 수용체 β2 를 억제하는 물질을 포함하는 조성물의 투여로 상기 혈관 질환, 특히 혈관 비후증, 심근 경색 또는 불안정 협심증의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 인터루킨 12 수용체 β2 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 혈관 질환의 치료 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "개체"는 본 발명의 혈관 질환, 특히 혈관 비후증, 심근 경색 또는 불안정 협심증을 보유하거나 또는 발병한, 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 약학적 조성물을 개체에 투여함으로써, 혈관 질환, 특히 혈관 비후증, 심근 경색 또는 불안정 협심증을 완화 또는 치료할 수 있다. 상기 완화는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 혈관 질환, 특히 혈관 비후증, 심근 경색 또는 불안정 협심증이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.
상기 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 대상에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 말하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 목적 또는 필요에 따라 당업계에서 사용되는 통상적인 방법, 투여 경로, 투여량에 따라 적절하게 개체에 투여될 수 있다. 투여 경로의 예로는 경구, 비경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 국소 내 및 비강 내로 투여될 수 있으며, 비경구 주입에는 국소 내(스텐트 이용), 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하투여가 포함된다. 또한 당업계에 공지된 방법에 따라 적절한 투여량 및 투여 횟수가 선택될 수 있으며, 실제로 투여되는 본 발명의 약학적 조성물의 양 및 투여 횟수는 치료하고자 하는 증상의 종류, 투여 경로, 성별, 건강 상태, 식이, 개체의 연령 및 체중, 및 질환의 중증도와 같은 다양한 인자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
본 발명에서의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 용도에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 혈관 투과성 증가를 억제 또는 완화하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 혈관 질환 치료용 후보물질을 인터루킨 12 수용체 β2를 발현하는 평활근 세포에 처리하는 단계; 및 상기 인터루킨 12 수용체 β2의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 혈관 질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
구체적으로 본 발명의 스크리닝 방법은 혈관 질환 치료용 후보물질 처리에 의해 인터루킨 12 수용체 β2의 발현 수준이 낮아질 경우, 혈관 질환 치료제로 판단하는 것일 수 있다.
상기에서 "후보물질(test agent)"은 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함한다. 예컨대, 이들로 한정되지는 않으나, 단백질, 폴리펩티드, 소 유기분자(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함한다. 또한, 천연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 화학 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다. 달리 지시되지 않는 한, 제제, 물질 및 화합물은 호환성 있게(interchangeably) 사용할 수 있다.
본 발명의 방법으로 스크리닝되거나 동정될 수 있는 후보물질은 폴리펩티드, 베타-턴 미메틱(betaturnmimetics), 다당류, 인지질, 호르몬, 프로스타글란딘, 스테로이드, 방향족 화합물, 헤테로사이클릭 화합물, 벤조디아제핀(benzodiazepines), 올리고머릭 N-치환 글리신(oligomeric N-substituted glycines), 올리고카르바메이트(oligocarbamates), 당류(saccharides), 지방산, 퓨린, 피리미딘 또는 이들의 유도체, 구조적 유사체 또는 조합을 포함한다. 상기 시험물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리를 포함하는 광범위하고 다양한 출처로부터 얻어질 수 있다.
본 발명에 따라 인터루킨 12 수용체β2를 혈관 질환, 특히 심근 경색 또는 불안정 협심증에 대한 바이오 마커로 이용하게 됨에 따라, 기존에 혈관 조영술로만 진단이 가능하던 혈관 질환에 대하여 혈액을 이용한 비침습적이고 경제적으로 빠른 시간 내에 진단이 가능해진다. 이에 따라, 질병이 악화되어 허혈 증상이 일어나야만 자각 증상을 통해 후 진단을 하던 혈관 질환 분야에 조기 진단이 가능해짐에 따라, 기존에 불가능했던 조기 및 예방 치료를 실현하는 것이 가능해진다.
도 1은 풍선-성형술에 의해 손상된 경동맥에서 신생 내막 조직을 염색하여 회복 시간대 별로 비후증 동태를 확인한 결과이다.
도 2a는 풍선-성형술을 이용하여 경동맥 손상 모델을 제조 후 수득한 손상된 경동맥 조직으로부터 단백질을 추출하여 2D-차등전기영동(2-dimensional differential gel electrophoresis, 2D-DIGE)를 통해 단백질체 분석을 진행하는 실험 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2b는 풍선-성형술을 이용하여 경동맥 손상 모델을 제조 후 수득한 손상된 경동맥 조직으로부터 세포 소기관 분획한 시료를 마커로 확인한 결과이다.
도 2c는 혈관 손상 후 회복 시간대 별로 수득한 경동맥 조직의 추출액에서 각 동정된 단백질들의 차등적 발현을 각각에 특이적인 항체를 이용한 면역블랏팅으로 확인한 결과이다.
도 3a는 풍선-성형술을 이용하여 경동맥 손상 모델을 제조 후 수득한 손상된 경동맥 조직으로부터 세포질 단백질(S-100 분획)을 추출하여 2D-차등전기영동(2-dimensional differential gel electrophoresis, 2D-DIGE)를 진행한 겔의 대표적인 형광 이미지이다.
도 3b는 풍선-성형술을 이용하여 경동맥 손상 모델을 제조 후 수득한 손상된 경동맥 조직으로부터 단백질을 추출하여 2D-차등전기영동(2-dimensional differential gel electrophoresis, 2D-DIGE)를 통해 단백질체 분석을 진행하여 동정된 단백질 spot 중에서 인터루킨 12 수용체 β2 단백질을 확인한 결과이다. 그래프는 형광 이미지 분석을 통해 정량된 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 발현 증가를 손상 후 회복 시간별로 보여준다.
도 4는 IL-12Rβ2의 넉다운 후 세 가지 SMC 세포 활성(인간 대동맥 평활근 세포의 증식과 주화성 이동, 평활근 세포에 대한 단핵구의 부착)에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 5는 경동맥 혈관벽에 풍선-성형술로 손상을 일으킨 후에 IL-12Rβ2 siRNA를 전달한 후, IL-12Rβ2 발현량을 비교하고(도 5의 A), 신생 내막 조직의 두께를 H&E 조직 염색을 통해 확인하고 그래프화(도 5의 B)한 도이다.
도 6a는 본 발명에서 사용하는 항-IL-12Rβ2 항체의 항원 특이성을 U937 세포주에서 내생적으로 발현된 IL-12Rβ2 단백질을 사용하여 면역 블롯팅으로 확인한 결과이다.
도 6b는 혈장샘플에서 미량의 단백질 검출을 개선하기 위하여, 알부민과 면역글로불린을 포함하는 풍부한 혈장 단백질을 Pierce albumin/IgG removal kit를 이용하여 환자 혈장 샘플로부터 제거하였음을 확인한 도이다. 여과된 분획 2가 도 7에서 사용된 샘플이다.
도 7은 정상군과 안정 협심증 또는 급성 심근 경색을 가진 환자로부터 얻은 혈장 샘플에 대하여 IL-12Rβ2 단백질에 대해 웨스턴 블랏 분석을 수행한 결과(도 7의 A)와 정상군과 안정 협심증 또는 급성 심근 경색을 가진 환자로부터 얻은 혈장 샘플에 대하여 IL-12Rβ2 단백질에 대해 웨스턴 블랏 분석을 수행한 결과이다(도 B). 도 7의 C는 정상군과 불안정 협심증을 가진 환자로부터 얻은 혈장 샘플에 대하여 IL-12Rβ2 단백질에 대해 웨스턴 블랏 분석을 수행한 결과이다. 폰수(Pon S) 염색은 동일한 단백질 양의 사용을 보여준다. 화살표 머리는 IL-12Rβ2 단백질의 위치를 표시한다.
도 8a는 정상군과 안정 협심증(SA), 불안정 협심증(UA) 또는 급성 심근 경색(AMI)을 가진 환자로부터 얻은 혈장 샘플에 대하여 IL-12Rβ2 단백질의 발현 수준을 나타낸 도 7의 IL-12Rβ2 단백질 밴드의 정량 및 통계 분석한 그래프이다.
도 8b는 병적 내막 비후증 인간 환자(n=3)의 경동맥 혈관에서 IL-12Rβ2에 대해 조직 염색한 도이다.
도 9a는 급성 심근 경색 및 불안정 협심증 환자로부터 수득한 혈장 샘플을 초원심분리를 이용해 세포 외 소포 분획을 분리하여 IL-12Rβ2, 엑소좀 마커인 CD9 및 CD81을 웨스턴 블랏으로 확인한 도이다.
도 9b는 급성 심근 경색 및 불안정 협심증 환자로부터 수득한 혈장 샘플을 중합체-기반 침전(polymer-based precipitation)을 이용해 세포 외 소포 분획을 분리하여 IL-12Rβ2, 엑소좀 마커인 CD81 및 평활근 마커인 PDGFRβ를 웨스턴 블랏으로 확인한 도이다.
도 9c는 급성 심근 경색 및 불안정 협심증 환자로부터 수득한 혈장 샘플에서 PDGFRβ를 면역침전(immunoprecipitation)하고 침전물에서 IL-12Rβ2를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 풍선 성형술에 의해 유도된 혈관 손상 마우스 모델 제작
본 발명에서 동물실험은 이화여자대학교의 동물 관리 및 사용 위원회 기관(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 지침을 준수하고, 미국 국립 보건 연구소가 출판한 "실험동물의 관리 및 사용에 대한 안내(The National Academies Press, 8th Edition, 2011)"에 따라 실시하였다.
본 발명에서는 풍선 성형술에 의해 유도된 경동맥 손상 모델에는 10주차 수컷 스프라-돌리(Sprague-Dawley) 랫트를 사용하였고, 랫트는 기존에 설명된 바와 같이(DH Kang, et al., Circulation 2013;128:pp 834-844.) 경동맥 손상 모델을 제조하였으며, 먼저 이소플루란 가스(N2O:O2/70%:30%)의 흡입을 통해 마취시켰다.
프로테오믹스 분석을 위해서, 수술 후에 랫트는 상이한 시점(18시간, 3일, 5일 및 7일)까지 우리 안에서 회복하였다. 각 실험군은 8마리의 랫트를 사용하였으며, sham 실험군을 0-시간 대조군으로 사용하였다.
조직학적 및 면역학적인 분석을 위해, 랫트는 10일 동안 회복하였다. 각 실험군의 크기는 도면 설명에 기재한 바와 같으며, 모든 동물실험은 3번 반복하여 실시하였다.
실시예 2: 카테터-매개 혈관벽 내 전달방법을 통한 경동맥으로의 siRNA 전달
상기 실시예 1에서 제조한 경동맥 손상 동물모델의 손상된 경동맥 조직에 siRNA를 전달하여 분자생물학적 변화를 확인하고자 카테터-매개 혈관벽 내 siRNA 전달 실험을 진행하였다.
구체적으로 랫트-특이적 siRNA SMART 풀(GE Healthcare Dharmacon, Cat # M_095069-01, 200 nM)을 제조업체(Ambion)의 지침에 따라 siPORTTM NeoFXTM 시약과 먼저 혼합하였다. 풍선-성형술에 의한 손상 직후에, 총경동맥(common carotid arteries)을 Opti-MEM으로 씻고 카테터를 통해 상기 미리 혼합해 놓은 형질전환 시약을 투여하였다. 형질전환 효율을 높이기 위해 15 분간 정치시킨 후, 결착시켰다. 혈관벽 내 siRNA 전달을 확인하기 위하여 형광 염료-결합 대조군 siRNA인 siGLO-Red(Dharmacon)을 사용하였다.
실시예 3: 조직학적 분석
조직학적인 분석을 위해서 상기 실시예 1에 개시된 바와 같이 랫트는 이소플루란 가스(N2O : O2 / 70% : 30%)을 이용하여 마취시켰고, 3.7% 포름알데히드 포함 헤파린 식염수로 경심 관류 고정(transcardiac perfusion-fixation)을 한 후, 경동맥을 절제하였다. 절제한 경동맥 혈관은 파라핀 포매(paraffin embedded)하고 회전식 마이크로톰(Leica RM2255)를 이용하여 절단하였다. 총경동맥 가운데 부위로부터 2개의 연속적인 조직 절편(4㎛ 두께)를 얻었고, 헤마톡실린 & 에오신 (H&E)으로 염색하였다. 내강(luminal), 내부탄력층(internal elastic laminal) 및 외부탄력층(external elastic laminal) 면적은 NIH image v1.62를 이용하여 측정하였다. 내막과 내층 면적은 내부탄력층 면적에서부터 내강 면적과 외부탄력층 면적을 제외하는 것을 통해 측정하였다. 각 랫트마다 두 연속적인 조직 절편으로부터 측정된 값의 평균값을 분석에 사용하였다.
실시예 4 : 인간 혈액 표본 분석
본 발명에서 사용되는 혈액 표본은 정상-건강 대조군과 혈관 조영술을 통해 관상동맥질환으로 진단된 환자군으로부터 채취하였다. 이는 이화여자대학교 의료 원(서울, 한국)의 임상 시험 심사위원회로부터 승인을 얻어서 진행하였다.
상기 관상동맥 질환 환자들 가운데 허혈증을 가진 환자들은 임상기준에 따라 안전 협심증(stable angina), 불안정 협심증(unstable angina) 및 급성 심근 경색(acute myocardial infarction)으로 분류하였다. 본 실험에 참가한 모든 지원자들은 그들의 정보 제공에 대한 동의 후 참여하였다.
상기 수득한 전혈액(whole blood) 샘플들은 원심분리하였고, 혈장 샘플은 Pierce albumin/IgG removal kit®를 제조업체의 지침에 따라 이용하여 추가로 분리하였다.
실시예 5: 통계 분석
통계학적 유의성(P value)를 확인하기 위해, Student's t-test를 이용한 두 집단 사이의 비교 또는 다수 집단에 대한 Tukey's '정직하게 유의한 차이'('honestly significant difference') post hoc 테스트(윈도우용 SPSS 12.0K, SPSS, 시카고, IL, USA)를 이용한 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 이용하여 결과를 분석하였다. P value가 0.05 이하일 때(P <0.05), 통계학적으로 유의하다고 보았다. 혈액 표본을 이용한 데이터는 Kruskal-Wallis rank sum test와 Wilcoxon rank sum test)의 두 개의 비모수적 검정(non-parametric test)을 통해 분석하였다.
실험예 1: 랫트 경동맥의 물리적 손상에 의한 단백질체 변화 분석
풍선-성형술에 의해 유도된 랫트 경동맥 손상은 혈전증에 의해 유도된 평활근(SMC, smooth muscle cell) 비대증과 전형적인 신생 내막(neointimal) 비후증을 유도하는 내피 박리 증상을 보인다. 이에 따라, 상기 풍선-성형술에 의해 유도된 랫트 경동맥 손상은 풍선형 색전제거용 카테터를 이용하여 동맥 혈관에 물리적 손상을 준 경우와 유사한 증상을 보인다. 본 in vivo 모델은 SMC 비대증과 관련한 조직학적 및 생화학적 연구에 사용될 수 있다.
먼저, 풍선-성형술에 의해 손상된 경동맥에서 신생 내막 비후증의 동태를 확인하였다. 기존에 알려진 바와 같이, 풍선-성형술에 의한 손상은 손상 부위의 내막 측면(lumen)에서 위내막 두께의 점진적 증가를 유도한다(도 1). 이러한 동태를 기반으로 5개의 순차적인 시점을 선택하여(sham 대조군, 손상 후 18시간, 3일, 5일 및 7일), 2D-차등전기영동(2-dimensional differential gel electrophoresis, 2D-DIGE)를 통해 단백질체 분석을 진행하였다(도 2a).
DIGE 분석에 필요한 충분한 양의 단백질을 수득하기 위하여 각 시점마다 수득된 8개의 손상된 경동맥 조직으로부터 단백질을 추출하였고 초원심세포분획법(subcellular fractionation)을 이용하여 분리하였다(도 2b). 이렇게 나눠진 단백질 분획들은 Cy3/Cy5 형광염색 후 2D-차등전기영동으로 분리되었고 총 2,100 이상의 단백질 spot에 대한 발현 분석을 진행하였다. 내부 표준(Cy2-labeled)에 대하여 각 손상 실험 샘플의 단백질 발현을 플랏팅한 결과, 140개의 단백질 spot들이 시간-의존적으로 발현 변화를 일으키는 것을 확인하였다. 상기 140개의 단백질 spot들 중 질량 분석기를 이용하여 분석 가능한 44개의 단백질을 성공적으로 동정하였다. 동정된 단백질들의 차등적 발현은 각각에 특이적인 항체(IL-12Rβ2 특이적 항체; Santa Cruz Biotech. Clone E-20, Catalog # sc-18648/Atlas antibodies. Product # HPA024168)를 이용한 면역블랏팅으로 확인하였으며, 이를 통해 상기 단백질체 분석을 정량적이고 정확하게 이루어졌음을 확인하였다(도 2c).
실험예 2: 인터루킨 12 수용체 β2의 시험관 내( in vitro ) 및 동물( in vivo )에서 기능확인
상기 실험예 1에서 동정된 44개의 단백질 중 인터루킨 12 수용체 β2의 변화에 주목하여 인간 대동맥 평활근 세포(Human Aortic SMCs, HASMCs)에서의 세포 기능 유효성 검사를 실시하였다.
구체적으로, 인간 대동맥 평활근 세포에 상기 IL-12Rβ2(interleukin 12 receptor β2)에 특이적인 siRNA(small-interference RNAs) 4 종(GE Healthcare Dharmacon, Cat # M_007932-00)을 혼합 처리하여, 넉다운하였다. 혈소판 유래 성장인자(PDGF)와 TNF-α는 풍선-성형술에 의한 손상 환부에 있는 혈소판/대식세포에 의해 생성되는 중요한 인자이기 때문에, 대동맥 평활근 세포의 증식과 주화성 이동은 PDGF-BB가 유도하고, 평활근 세포에 대한 단핵구의 부착은 종양 괴사 인자(TNF-α)가 유도한다.
결과로서 인터루킨 12 수용체 β2의 넉다운은 상기 세 가지 세포 활성을 모두 현저하게 감소시켰다(도 4).
또한, 실시예 2에 서술한 바와 같이 카테터를 통하여 랫트 특이적인 IL-12Rβ2(Interleukin 12 receptor β2) siRNA를 전달하여 풍선-성형술에 의해 손상된 경동맥을 형질전환 하였을 때 IL-12Rβ2의 넉다운이 성공적으로 확립되었고(도 5의 A), 대조군 siRNA에 비해 신생내막 비후증이 현저히 감소하였다(도 5의 B). 이는 IL-12Rβ2가 혈관평활근세포에서 발현되어 평활근 비대증에 주요한 기능을 한다는 것을 입증한다.
실험예 3: 혈관 비후증에 대한 잠재적 바이오 마커 인 IL -12Rβ2
빠르게 성장하거나 손상된 세포들은 세포 단백질 또는 microRNAs를 엑소좀(exosomes) 형태로 방출하기 때문에, 본 발명자들은 상기 검증된 IL-12Rβ2 단백질이 관상동맥질환을 가진 환자, 특히 급성 심근 경색 또는 불안정 협심증과 같은 불안정한 증상이 있는 환자의 혈액에서 높은 발현을 보이는지 확인하였다.
이를 위해서는 세포주에서 내생적으로 발현된 IL-12Rβ2 단백질을 특이적으로 인식하는 항체(Santa Cruz Biotech. Clone E-20, Catalog # sc-18648; Atlas antibodies. Product # HPA024168)를 사용하였다(도 6a). 미량의 단백질 검출을 개선하기 위하여, 알부민과 면역글로불린을 포함하는 풍부한 혈장 단백질을 환자 혈장 샘플로부터 제거하였다(도 6b).
상기 협심증 증상을 가진 관상 동맥 조영술을 시행한 환자로부터 얻은 혈장 샘플의 웨스턴 블랏 분석을 수행하여, 정상인 샘플과 비교하였다. 그 결과, 정상인 샘플에 비교하여 환자 샘플에서 IL-12Rβ2 단백질이 현저히 높은 수준으로 발현되는 것이 확인되었다(도 7).
도 8a에서 확인할 수 있듯이, 정량 및 통계 분석을 통해 혈장에서의 IL-12Rβ2 발현 수준이 인간 환자의 질환 심각도와 밀접한 관계가 있음을 확인하였다(4 집단 간 P=3.448 X 10-6).
또한, 혈장 IL-12Rβ2이 혈관이 좁아지는 증상과 관련이 있다는 것을 확인하기 위해서, 병적 내막 비후증 인간 환자(n=3)의 경동맥 혈관에서 IL-12Rβ2의 발현을 조직 염색을 통해 측정하였다. 그 결과, IL-12Rβ2가 정상적인 동맥 혈관 벽보다 비후된 내막 병변에서 현저히 높게 발현하는 것을 확인하였다(도 8b).
혈장에서 발견되는 IL-12Rβ2 단백질의 분자량은 전장 형태의 분자량에 해당하기 때문에, 단백질 가수분해에 의해 분산되지 않고 엑소좀 형태로 방출된다고 보았다. 이를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 혈장 샘플을 초원심분리 및 중합체-기반 침전(polymer-based precipitation)을 이용해 세포 외 소포들을 분리하였다. 실제로 IL-12Rβ2 는 엑소좀 마커인 CD9 및 CD81와 함께 침전물에 존재하였다(도 9a 및 도 9b). 상기 엑소좀 마커와 관련하여 CD63에 특이적으로 결합하는 항체로는 System Biosciences Inc. Cat # EXOAB-CD63A-1, CD9에 특이적으로 결합하는 항체로는 System Biosciences Inc. Cat# EXOAB-CD9A-1, CD81에 특이적으로 결합하는 항체로는 System Biosciences Inc. Cat# EXOAB-CD81A-1를 사용하였다. 또한, 평활근 마커인 PDGFRβ 또한 엑소좀 분획에서 검출되었으며, 이는 환자 혈청 샘플에 평활근-유래 엑소좀이 존재함을 나타낸다.
마지막으로 IL-12Rβ2과 PDGFRβ이 같은 엑소좀에 존재하는지를 확인하기 위해 환자 혈청으로부터 PDGFRβ를 PDGFRβ에 특이적으로 결합하는 항체(Santa Cruz Biotech. clone P-20. Catalog # sc-339)를 이용하여 면역침전(immunoprecipitation)하고 이에서 IL-12Rβ2를 검출한 결과, 도 9c에서 확인할 수 있듯이 PDGFRβ 면역침전물에서 IL-12Rβ2가 검출되는 것을 확인하였다. 즉, 상기 두 단백질이 엑소좀에 공위치하며, 해당 엑소좀은 평활근 유래임을 확인하였다.
상기와 같은 결과를 종합하면, 비후되어가는 대동맥 혈관에서 IL-12Rβ2의 발현이 유도되고, 이는 혈반(plaque) 불안정성에 의하여 환자의 혈액 속으로 방출되는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명에서는 혈관 질환에 있어서 질환의 심각성을 측정하는 마커로 IL-12Rβ2를 사용할 수 있음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation <120> A biomarker for diagnosing vascular diseases and the uses thereof <130> KPA141136-KR <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 862 <212> PRT <213> Il-12 receptor beta2, Homo sapiens a.a. <400> 1 Met Ala His Thr Phe Arg Gly Cys Ser Leu Ala Phe Met Phe Ile Ile 1 5 10 15 Thr Trp Leu Leu Ile Lys Ala Lys Ile Asp Ala Cys Lys Arg Gly Asp 20 25 30 Val Thr Val Lys Pro Ser His Val Ile Leu Leu Gly Ser Thr Val Asn 35 40 45 Ile Thr Cys Ser Leu Lys Pro Arg Gln Gly Cys Phe His Tyr Ser Arg 50 55 60 Arg Asn Lys Leu Ile Leu Tyr Lys Phe Asp Arg Arg Ile Asn Phe His 65 70 75 80 His Gly His Ser Leu Asn Ser Gln Val Thr Gly Leu Pro Leu Gly Thr 85 90 95 Thr Leu Phe Val Cys Lys Leu Ala Cys Ile Asn Ser Asp Glu Ile Gln 100 105 110 Ile Cys Gly Ala Glu Ile Phe Val Gly Val Ala Pro Glu Gln Pro Gln 115 120 125 Asn Leu Ser Cys Ile Gln Lys Gly Glu Gln Gly Thr Val Ala Cys Thr 130 135 140 Trp Glu Arg Gly Arg Asp Thr His Leu Tyr Thr Glu Tyr Thr Leu Gln 145 150 155 160 Leu Ser Gly Pro Lys Asn Leu Thr Trp Gln Lys Gln Cys Lys Asp Ile 165 170 175 Tyr Cys Asp Tyr Leu Asp Phe Gly Ile Asn Leu Thr Pro Glu Ser Pro 180 185 190 Glu Ser Asn Phe Thr Ala Lys Val Thr Ala Val Asn Ser Leu Gly Ser 195 200 205 Ser Ser Ser Leu Pro Ser Thr Phe Thr Phe Leu Asp Ile Val Arg Pro 210 215 220 Leu Pro Pro Trp Asp Ile Arg Ile Lys Phe Gln Lys Ala Ser Val Ser 225 230 235 240 Arg Cys Thr Leu Tyr Trp Arg Asp Glu Gly Leu Val Leu Leu Asn Arg 245 250 255 Leu Arg Tyr Arg Pro Ser Asn Ser Arg Leu Trp Asn Met Val Asn Val 260 265 270 Thr Lys Ala Lys Gly Arg His Asp Leu Leu Asp Leu Lys Pro Phe Thr 275 280 285 Glu Tyr Glu Phe Gln Ile Ser Ser Lys Leu His Leu Tyr Lys Gly Ser 290 295 300 Trp Ser Asp Trp Ser Glu Ser Leu Arg Ala Gln Thr Pro Glu Glu Glu 305 310 315 320 Pro Thr Gly Met Leu Asp Val Trp Tyr Met Lys Arg His Ile Asp Tyr 325 330 335 Ser Arg Gln Gln Ile Ser Leu Phe Trp Lys Asn Leu Ser Val Ser Glu 340 345 350 Ala Arg Gly Lys Ile Leu His Tyr Gln Val Thr Leu Gln Glu Leu Thr 355 360 365 Gly Gly Lys Ala Met Thr Gln Asn Ile Thr Gly His Thr Ser Trp Thr 370 375 380 Thr Val Ile Pro Arg Thr Gly Asn Trp Ala Val Ala Val Ser Ala Ala 385 390 395 400 Asn Ser Lys Gly Ser Ser Leu Pro Thr Arg Ile Asn Ile Met Asn Leu 405 410 415 Cys Glu Ala Gly Leu Leu Ala Pro Arg Gln Val Ser Ala Asn Ser Glu 420 425 430 Gly Met Asp Asn Ile Leu Val Thr Trp Gln Pro Pro Arg Lys Asp Pro 435 440 445 Ser Ala Val Gln Glu Tyr Val Val Glu Trp Arg Glu Leu His Pro Gly 450 455 460 Gly Asp Thr Gln Val Pro Leu Asn Trp Leu Arg Ser Arg Pro Tyr Asn 465 470 475 480 Val Ser Ala Leu Ile Ser Glu Asn Ile Lys Ser Tyr Ile Cys Tyr Glu 485 490 495 Ile Arg Val Tyr Ala Leu Ser Gly Asp Gln Gly Gly Cys Ser Ser Ile 500 505 510 Leu Gly Asn Ser Lys His Lys Ala Pro Leu Ser Gly Pro His Ile Asn 515 520 525 Ala Ile Thr Glu Glu Lys Gly Ser Ile Leu Ile Ser Trp Asn Ser Ile 530 535 540 Pro Val Gln Glu Gln Met Gly Cys Leu Leu His Tyr Arg Ile Tyr Trp 545 550 555 560 Lys Glu Arg Asp Ser Asn Ser Gln Pro Gln Leu Cys Glu Ile Pro Tyr 565 570 575 Arg Val Ser Gln Asn Ser His Pro Ile Asn Ser Leu Gln Pro Arg Val 580 585 590 Thr Tyr Val Leu Trp Met Thr Ala Leu Thr Ala Ala Gly Glu Ser Ser 595 600 605 His Gly Asn Glu Arg Glu Phe Cys Leu Gln Gly Lys Ala Asn Trp Met 610 615 620 Ala Phe Val Ala Pro Ser Ile Cys Ile Ala Ile Ile Met Val Gly Ile 625 630 635 640 Phe Ser Thr His Tyr Phe Gln Gln Lys Val Phe Val Leu Leu Ala Ala 645 650 655 Leu Arg Pro Gln Trp Cys Ser Arg Glu Ile Pro Asp Pro Ala Asn Ser 660 665 670 Thr Cys Ala Lys Lys Tyr Pro Ile Ala Glu Glu Lys Thr Gln Leu Pro 675 680 685 Leu Asp Arg Leu Leu Ile Asp Trp Pro Thr Pro Glu Asp Pro Glu Pro 690 695 700 Leu Val Ile Ser Glu Val Leu His Gln Val Thr Pro Val Phe Arg His 705 710 715 720 Pro Pro Cys Ser Asn Trp Pro Gln Arg Glu Lys Gly Ile Gln Gly His 725 730 735 Gln Ala Ser Glu Lys Asp Met Met His Ser Ala Ser Ser Pro Pro Pro 740 745 750 Pro Arg Ala Leu Gln Ala Glu Ser Arg Gln Leu Val Asp Leu Tyr Lys 755 760 765 Val Leu Glu Ser Arg Gly Ser Asp Pro Lys Pro Glu Asn Pro Ala Cys 770 775 780 Pro Trp Thr Val Leu Pro Ala Gly Asp Leu Pro Thr His Asp Gly Tyr 785 790 795 800 Leu Pro Ser Asn Ile Asp Asp Leu Pro Ser His Glu Ala Pro Leu Ala 805 810 815 Asp Ser Leu Glu Glu Leu Glu Pro Gln His Ile Ser Leu Ser Val Phe 820 825 830 Pro Ser Ser Ser Leu His Pro Leu Thr Phe Ser Cys Gly Asp Lys Leu 835 840 845 Thr Leu Asp Gln Leu Lys Met Arg Cys Asp Ser Leu Met Leu 850 855 860 <210> 2 <211> 4040 <212> DNA <213> Il-12 receptor beta2, Homo sapiens CDS <400> 2 tgcagagaac agagaaagga catctgcgag gaaagttccc tgatggctgt caacaaagtg 60 ccacgtctct atggctgtgt acgctgagca cacgatttta tcgcgcctat catatcttgg 120 tgcataaacg cacctcacct cggtcaaccc ttgctccgtc ttatgagaca ggctttatta 180 tccgcatttt atatgagggg aatctgacgg tggagagaga attatcttgc tcaaggcgac 240 acagcagagc ccacaggtgg cagaatccca cccgagcccg cttcgacccg cggggtggaa 300 accacgggcg cccgcccggc tgcgcttcca gagctgaact gagaagcgag tcctctccgc 360 cctgcggcca ccgcccagcc ccgacccccg ccccggcccg atcctcactc gccgccagct 420 ccccgcgccc accccggagt tggtggcgca gaggcgggag gcggaggcgg gagggcgggc 480 gctggcaccg ggaacgcccg agcgccggca gagagcgcgg agagcgcgac acgtgcggcc 540 cagagcaccg gggccacccg gtccccgcag gcccgggacc gcgcccgctg gcaggcgaca 600 cgtggaagaa tacggagttc tataccagag ttgattgttg atggcacata cttttagagg 660 atgctcattg gcatttatgt ttataatcac gtggctgttg attaaagcaa aaatagatgc 720 gtgcaagaga ggcgatgtga ctgtgaagcc ttcccatgta attttacttg gatccactgt 780 caatattaca tgctctttga agcccagaca aggctgcttt cactattcca gacgtaacaa 840 gttaatcctg tacaagtttg acagaagaat caattttcac catggccact ccctcaattc 900 tcaagtcaca ggtcttcccc ttggtacaac cttgtttgtc tgcaaactgg cctgtatcaa 960 tagtgatgaa attcaaatat gtggagcaga gatcttcgtt ggtgttgctc cagaacagcc 1020 tcaaaattta tcctgcatac agaagggaga acaggggact gtggcctgca cctgggaaag 1080 aggacgagac acccacttat acactgagta tactctacag ctaagtggac caaaaaattt 1140 aacctggcag aagcaatgta aagacattta ttgtgactat ttggactttg gaatcaacct 1200 cacccctgaa tcacctgaat ccaatttcac agccaaggtt actgctgtca atagtcttgg 1260 aagctcctct tcacttccat ccacattcac attcttggac atagtgaggc ctcttcctcc 1320 gtgggacatt agaatcaaat ttcaaaaggc ttccgtgagc agatgtaccc tttattggag 1380 agatgaggga ctggtactgc ttaatcgact cagatatcgg cccagtaaca gcaggctctg 1440 gaatatggtt aatgttacaa aggccaaagg aagacatgat ttgctggatc tgaaaccatt 1500 tacagaatat gaatttcaga tttcctctaa gctacatctt tataagggaa gttggagtga 1560 ttggagtgaa tcattgagag cacaaacacc agaagaagag cctactggga tgttagatgt 1620 ctggtacatg aaacggcaca ttgactacag tagacaacag atttctcttt tctggaagaa 1680 tctgagtgtc tcagaggcaa gaggaaaaat tctccactat caggtgacct tgcaggagct 1740 gacaggaggg aaagccatga cacagaacat cacaggacac acctcctgga ccacagtcat 1800 tcctagaacc ggaaattggg ctgtggctgt gtctgcagca aattcaaaag gcagttctct 1860 gcccactcgt attaacataa tgaacctgtg tgaggcaggg ttgctggctc ctcgccaggt 1920 ctctgcaaac tcagagggca tggacaacat tctggtgact tggcagcctc ccaggaaaga 1980 tccctctgct gttcaggagt acgtggtgga atggagagag ctccatccag ggggtgacac 2040 acaggtccct ctaaactggc tacggagtcg accctacaat gtgtctgctc tgatttcaga 2100 gaacataaaa tcctacatct gttatgaaat ccgtgtgtat gcactctcag gggatcaagg 2160 aggatgcagc tccatcctgg gtaactctaa gcacaaagca ccactgagtg gcccccacat 2220 taatgccatc acagaggaaa aggggagcat tttaatttca tggaacagca ttccagtcca 2280 ggagcaaatg ggctgcctcc tccattatag gatatactgg aaggaacggg actccaactc 2340 ccagcctcag ctctgtgaaa ttccctacag agtctcccaa aattcacatc caataaacag 2400 cctgcagccc cgagtgacat atgtcctgtg gatgacagct ctgacagctg ctggtgaaag 2460 ttcccacgga aatgagaggg aattttgtct gcaaggtaaa gccaattgga tggcgtttgt 2520 ggcaccaagc atttgcattg ctatcatcat ggtgggcatt ttctcaacgc attacttcca 2580 gcaaaaggtg tttgttctcc tagcagccct cagacctcag tggtgtagca gagaaattcc 2640 agatccagca aatagcactt gcgctaagaa atatcccatt gcagaggaga agacacagct 2700 gcccttggac aggctcctga tagactggcc cacgcctgaa gatcctgaac cgctggtcat 2760 cagtgaagtc cttcatcaag tgaccccagt tttcagacat cccccctgct ccaactggcc 2820 acaaagggaa aaaggaatcc aaggtcatca ggcctctgag aaagacatga tgcacagtgc 2880 ctcaagccca ccacctccaa gagctctcca agctgagagc agacaactgg tggatctgta 2940 caaggtgctg gagagcaggg gctccgaccc aaagccagaa aacccagcct gtccctggac 3000 ggtgctccca gcaggtgacc ttcccaccca tgatggctac ttaccctcca acatagatga 3060 cctcccctca catgaggcac ctctcgctga ctctctggaa gaactggagc ctcagcacat 3120 ctccctttct gttttcccct caagttctct tcacccactc accttctcct gtggtgataa 3180 gctgactctg gatcagttaa agatgaggtg tgactccctc atgctctgag tggtgaggct 3240 tcaagcctta aagtcagtgt gccctcaacc agcacagcct gccccaattc ccccagcccc 3300 tgctccagca gctgtcatct ctgggtgcca ccatcggtct ggctgcagct agaggacagg 3360 caagccagct ctgggggagt cttaggaact gggagttggt cttcactcag atgcctcatc 3420 ttgcctttcc cagggcctta aaattacatc cttcactgtg tggacctaga gactccaact 3480 tgaattccta gtaactttct tggtatgctg gccagaaagg gaaatgagga ggagagtaga 3540 aaccacagct cttagtagta atggcataca gtctagagga ccattcatgc aatgactatt 3600 tctaaagcac ctgctacaca gcaggctgta cacagcagat cagtactgtt caacagaact 3660 tcctgagatg atggaaatgt tctacctctg cactcactgt ccagtacatt agacactagg 3720 cacattggct gttaatcact tggaatgtgt ttagcttgac tgaggaatta aattttgatt 3780 gtaaatttaa atcgccacac atggctagtg gctactgtat tggagtgcac agctctagat 3840 ggctcctaga ttattgagag cctccaaaac aaatcaacct agttctatag atgaagacat 3900 aaaagacact ggtaaacacc aatgtaaaag ggcccccaag gtggtcatga ctggtctcat 3960 ttgcagaagt ctaagaatgt acctttttct ggccgggcgt ggtagctcat gcctgtaatc 4020 ccagcacttt gggaggctga 4040 <210> 3 <211> 2589 <212> DNA <213> Il-12 receptor beta2, Homo sapiens, cDNA sequence from Sino Biologicals Inc <400> 3 atggcacata cttttagagg atgctcattg gcatttatgt ttataatcac gtggctgttg 60 attaaagcaa aaatagatgc gtgcaagaga ggcgatgtga ctgtgaagcc ttcccatgta 120 attttacttg gatccactgt caatattaca tgctctttga agcccagaca aggctgcttt 180 cactattcca gacgtaacaa gttaatcctg tacaagtttg acagaagaat caattttcac 240 catggccact ccctcaattc tcaagtcaca ggtcttcccc ttggtacaac cttgtttgtc 300 tgcaaactgg cctgtatcaa tagtgatgaa attcaaatat gtggagcaga gatcttcgtt 360 ggtgttgctc cagaacagcc tcaaaattta tcctgcatac agaagggaga acaggggact 420 gtggcctgca cctgggaaag aggacgagac acccacttat acactgagta tactctacag 480 ctaagtggac caaaaaattt aacctggcag aagcaatgta aagacattta ttgtgactat 540 ttggactttg gaatcaacct cacccctgaa tcacctgaat ccaatttcac agccaaggtt 600 actgctgtca atagtcttgg aagctcctct tcacttccat ccacattcac attcttggac 660 atagtgaggc ctcttcctcc gtgggacatt agaatcaaat ttcaaaaggc ttccgtgagc 720 agatgtaccc tttattggag agatgaggga ctggtactgc ttaatcgact cagatatcgg 780 cccagtaaca gcaggctctg gaatatggtt aatgttacaa aggccaaagg aagacatgat 840 ttgctggatc tgaaaccatt tacagaatat gaatttcaga tttcctctaa gctacatctt 900 tataagggaa gttggagtga ttggagtgaa tcattgagag cacaaacacc agaagaagag 960 cctactggga tgttagatgt ctggtacatg aaacggcaca ttgactacag tagacaacag 1020 atttctcttt tctggaagaa tctgagtgtc tcagaggcaa gaggaaaaat tctccactat 1080 caggtgacct tgcaggagct gacaggaggg aaagccatga cacagaacat cacaggacac 1140 acctcctgga ccacagtcat tcctagaacc ggaaattggg ctgtggctgt gtctgcagca 1200 aattcaaaag gcagttctct gcccactcgt attaacataa tgaacctgtg tgaggcaggg 1260 ttgctggctc ctcgccaggt ctctgcaaac tcagagggca tggacaacat tctggtgact 1320 tggcagcctc ccaggaaaga tccctctgct gttcaggagt acgtggtgga atggagagag 1380 ctccatccag ggggtgacac acaggtccct ctaaactggc tacggagtcg accctacaat 1440 gtgtctgctc tgatttcaga gaacataaaa tcctacatct gttatgaaat ccgtgtgtat 1500 gcactctcag gggatcaagg aggatgcagc tccatcctgg gtaactctaa gcacaaagca 1560 ccactgagtg gcccccacat taatgccatc acagaggaaa aggggagcat tttaatttca 1620 tggaacagca ttccagtcca ggagcaaatg ggctgcctcc tccattatag gatatactgg 1680 aaggaacggg actccaactc ccagcctcag ctctgtgaaa ttccctacag agtctcccaa 1740 aattcacatc caataaacag cctgcagccc cgagtgacat atgtcctgtg gatgacagct 1800 ctgacagctg ctggtgaaag ttcccacgga aatgagaggg aattttgtct gcaaggtaaa 1860 gccaattgga tggcgtttgt ggcaccaagc atttgcattg ctatcatcat ggtgggcatt 1920 ttctcaacgc attacttcca gcaaaaggtg tttgttctcc tagcagccct cagacctcag 1980 tggtgtagca gagaaattcc agatccagca aatagcactt gcgctaagaa atatcccatt 2040 gcagaggaga agacacagct gcccttggac aggctcctga tagactggcc cacgcctgaa 2100 gatcctgaac cgctggtcat cagtgaagtc cttcatcaag tgaccccagt tttcagacat 2160 cccccctgct ccaactggcc acaaagggaa aaaggaatcc aaggtcatca ggcctctgag 2220 aaagacatga tgcacagtgc ctcaagccca ccacctccaa gagctctcca agctgagagc 2280 agacaactgg tggatctgta caaggtgctg gagagcaggg gctccgaccc aaagcccgaa 2340 aacccagcct gtccctggac ggtgctccca gcaggtgacc ttcccaccca tgatggctac 2400 ttaccctcca acatagatga cctcccctca catgaggcac ctctcgctga ctctctggaa 2460 gaactggagc ctcagcacat ctccctttct gttttcccct caagttctct tcacccactc 2520 accttctcct gtggtgataa gctgactctg gatcagttaa agatgaggtg tgactccctc 2580 atgctctga 2589

Claims (22)

  1. 혈중 인터루킨 12 수용체 β2(interleukin 12 receptor β2) 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 혈관 질환 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 혈중에서 평활근 유래 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준을 측정하는 것인, 혈관 질환 진단용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 평활근 유래 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준을 측정하는 조성물은 i) 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준을 측정하는 제제는 인터루킨 12 수용체 β2 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머; 및 ii) 평활근 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함하는 것인, 혈관 질환 진단용 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 평활근 마커는 혈소판 유래 성장인자 수용체(platelet-derived growth factor receptor, PDGFR) 또는 알파-평활근 액틴(alpha-smooth muscle actin)인 것인, 혈관 질환 진단용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 혈관 질환은 죽상 경화증, 혈관재협착(in-stent restenosis), 심근 경색 또는 불안정 협심증인 것인, 혈관 질환 진단용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 조성물은 심장 발작의 위험군 여부를 조기 진단하는 것인, 혈관 질환 진단용 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준을 측정하는 제제는 인터루킨 12 수용체 β2 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머를 포함하는 것인, 혈관 질환 진단용 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 혈중 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준을 측정하는 것은 혈액에 존재하는 세포 외 소포(extracellular vesicle)에서 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준을 측정하는 것인, 혈관 질환 진단용 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 세포 외 소포는 엑소좀(exosome)인 것인, 혈관 질환 진단용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 조성물은 엑소좀 마커인 CD81, CD9 또는 CD63에 특이적인 항체 또는 앱타머를 포함하는 것인, 혈관 질환 진단용 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 인터루킨 12 수용체 β2 단백질은 전장(full-length) 인터루킨 12 수용체 β2 단백질인 것인, 혈관 질환 진단용 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 혈관 질환 진단용 키트.
  13. 제12항에 있어서, 상기 키트는 마이크로어레이, 앱타머 칩 키트, 엘라이자(ELISA, enzyme linked immunosorbent assay) 키트, 블랏팅(blotting) 키트, 면역침전법 키트, 면역형광검사 키트, 단백질 칩 키트 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는, 혈관 질환 진단용 키트.
  14. (a) 혈관 질환 의심 개체의 분리된 혈액 시료로부터 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계에서 측정된 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준이 정상 대조구 시료의 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준과 비교하는 단계를 포함하는 혈관 질환 진단을 위한 정보의 제공 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 (a) 단계의 혈액 시료는 혈장 시료 또는 세포 외 소포 분획 시료인 것인, 혈관 질환 진단을 위한 정보의 제공 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 세포 외 소포는 엑소좀인 것인, 혈관 질환 진단을 위한 정보의 제공 방법.
  17. 제14항에 있어서, 혈관 질환 의심 개체의 분리된 혈액 시료로부터 측정된 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준이 정상 대조군 시료의 인터루킨 12 수용체 β2 단백질의 수준보다 높을 경우, 혈관 질환으로 판단하는 것을 특징으로 하는, 혈관 질환 진단을 위한 정보의 제공 방법.
  18. 제14항에 있어서, 상기 혈관 질환은 심근 경색 또는 불안정 협심증인 것인, 혈관 질환 진단을 위한 정보의 제공 방법.
  19. 인터루킨 12 수용체 β2 활성 억제제를 포함하는, 혈관 질환 예방 또는 치료용 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 인터루킨 12 수용체 β2 활성 억제제는 항-인터루킨 12 수용체 β2 단백질 항체, 및 인터루킨 12 수용체 β2 유전자 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 microRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 혈관 질환 예방 또는 치료용 조성물.
  21. 혈관 질환 치료용 후보물질을 인터루킨 12 수용체 β2를 발현하는 평활근 세포에 처리하는 단계; 및 상기 인터루킨 12 수용체 β2의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 혈관 질환 치료제의 스크리닝 방법.
  22. 제21항에 있어서, 혈관 질환 치료용 후보물질 처리에 의해 인터루킨 12 수용체 β2의 발현 수준이 낮아질 경우, 혈관 질환 치료제로 판단하는 것인, 혈관 질환 치료제의 스크리닝 방법.
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