CN117795340A - 生物标志物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了通过测量共定位的新型生物标志物来对患有癌症的受试者进行分类、诊断和监测的方法。还提供了试剂盒和阵列，其用于：诊断癌症，特别是侵袭性癌症；鉴别诊断；以及监测癌症的进展。

Description

生物标志物及其用途
技术领域
本发明提供了通过测量共定位的新型生物标志物来对患有癌症的受试者进行分类、诊断和监测的方法。还提供了试剂盒和阵列，其用于：诊断癌症，特别是侵袭性癌症；鉴别诊断；以及监测癌症的进展。
背景技术
转化生长因子β(TGFβ)在多种晚期癌症中过度表达并促进肿瘤进展。癌细胞如何逃避TGFβ诱导的生长抑制并逃避正常的体内平衡尚不清楚。在经典的TGFβ-Smad信号通路中，细胞反应取决于TGFβ受体I(TβRI)的激酶活性，从而导致形成Smad2、Smad3和Smad4复合物，这些复合物调节某些基因的转录，包括SERPINE1、Snail1和金属蛋白酶蛋白2。TβRI在其细胞外结构域被TNF-α转换酶(TACE/ADAM17)裂解，导致Smad蛋白介导的TGFβ介导的生长抑制作用丧失(Liu C等人.Mol Cell 2009；35(1):26-36)。
相反，在非经典的TGFβ诱导的信号通路中，细胞反应通常由E3连接酶肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)调节。该蛋白质与TβRI结合，并在配体与受体结合时被激活，从而促进MAP激酶激酶激酶TGFβ激活的激酶1(TAK1)的激活。响应于胰岛素刺激通过内体蛋白与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)在K160 11,13-15上的K63连接的多泛素化，并且响应于TGFβ刺激通过PI3K复合物中调节亚基p85α的K63连接的多泛素化，TRAF6促进磷脂酰肌醇-3'-激酶(PI3K)-AKT通路的激活(Hamidi A等人.Sci Signal2017；10(486))。TRAF6还激活蛋白水解酶，诸如γ-分泌酶复合物中的ADAM17/TACE和早老素1，以裂解TβRI的细胞内结构域(ICD)，从而使可溶性TβRI-ICD在TRAF6泛素化K178之后进入细胞核，以促进促侵袭基因和TGFBR1的转录。
本发明人最近已经表明，内体衔接蛋白APPL1和APPL2与TβRI-ICD结合，并响应于细胞的TGFβ刺激增强TβRI-ICD的核积累，从而体外促进前列腺癌细胞的侵袭性，并示出与人类前列腺癌的侵袭性的强相关性(Song J、Mu Y、Li C、Bergh A、Miaczynska M、HeldinC-H等人.APPL proteins promote TGFβ-induced nuclear transport of the TGFβtypeI receptor intracellular domain.Oncotarget.2016；7:279–92)。
WO 2012/125623公开了TβRI的裂解抑制剂的用途及其在癌症疗法中的用途，以及诊断方法，其中TβRI-ICD的核定位指示样品中癌细胞的存在和受试者中癌症侵袭性/转移的可能性。
TGFβ信号通路在肿瘤进展中具有双重且关键的作用。在正常细胞中和在肿瘤发生的早期阶段，它通过抑制增殖并诱导分化和细胞凋亡来充当肿瘤抑制因子。TGFβ抑制多种细胞类型的增殖，包括上皮细胞和内皮细胞、角质形成细胞和白细胞。在大多数正常细胞类型中，TGFβ刺激通过下调MYC的表达和上调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(包括p15INK4B和p21)的表达，将细胞周期进展阻滞在G1(Sintich SM、Lamm ML、Sensibar J a、LeeC.Transforming growth factor-β1-induced proliferation of the prostate cancercell line,TSU-Pr1:the role of platelet-derived growthfactor.Endocrinology.1999；140:3411–5)。然而，在晚期癌症中，当癌细胞逃避TGFβ的抑制反应时，细胞因子通过诱导上皮间质转化、促进肿瘤侵袭和转移并抑制免疫系统来成为肿瘤启动子(即TGFβ促进肿瘤发生)(Batlle E、Massague J.Transforming GrowthFactor-βSignaling in Immunity and Cancer.Immunity 2019；50:924-940)。
尽管有这些发现，但对TGFβ在有丝分裂中的作用知之甚少。TGFβ可以促进某些间质细胞和癌细胞的增殖，但其在生长刺激机制中的作用尚不清楚。作为增殖刺激剂，TGFβ诱导人肾成纤维细胞中成纤维细胞生长因子2的表达，以及神经胶质瘤和骨肉瘤细胞中血小板衍生生长因子的表达。在正常前列腺上皮细胞中，TGFβ通过抑制增殖和诱导细胞凋亡来充当生长抑制剂，而在对TGFβ诱导的生长停滞失去敏感性的前列腺癌细胞中，TGFβ可能促进肿瘤细胞生长。例如，TGFβ刺激前列腺癌细胞系TSU-Pr1(SintichSM、Lamm ML、SensibarJ a、Lee C.Transforming growth factor-β1-induced proliferation of the prostatecancer cell line,TSU-Pr1:the role of platelet-derived growthfactor.Endocrinology.1999；140:3411–5)中的细胞增殖，并且仅引起DU145和PC-3细胞系中的短暂增殖抑制，而对LNCaP前列腺癌细胞的增殖没有影响(Wilding G、Zugmeier G、Knabbe C、Flanders K、Gelmann E.Differential effects of transforming growthfactorβon human prostate cancer cells in vitro.Mol Cell Endocrinol.1989；62:79–87)。
极光激酶是细胞增殖所必需的丝氨酸/苏氨酸激酶。它们是磷酸转移酶，其帮助分裂细胞将其遗传物质分配给其子细胞。更具体地，极光激酶通过控制染色单体分离在细胞分裂中发挥关键作用。极光激酶(诸如极光激酶A(AURKA)和极光激酶B(AURKB))在许多肿瘤(包括乳腺癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌和前列腺肿瘤)中过度表达。极光激酶B(AURKB)是染色体乘客复合物(CPC)的组成部分，其包含三个调节成分，即内着丝粒蛋白(INCENP)、生存素和borealin。AURKB与INCENP的保守C末端IN-box区域结合(Adams RR等人.Curr Biol2000；10(17):1075-8)，其中定位Thr-Ser-Ser基序，该基序被AURKB磷酸化(Bishop JD、Schumacher JM.J Biol Chem 2002；277(31):27577-80)，有助于复合物的AURKB激活和稳定。AURKB:INCENP复合物也已经被认为有利于AURKB的反式自磷酸化，因为在对其晶体结构的研究中发现AURKB形成二聚体(Elkins JM等人.J Med Chem 2012；55(17):7841-8)。
在间期中，CPC定位于异染色质中，并且在细胞进入有丝分裂之后，组蛋白H3在Ser10(H3S10)处的AURKB磷酸化有助于将CPC从染色体臂去除到内着丝粒。在后期开始时，CPC从染色体中释放并重新定位到纺锤体中部区域，在此形成AURKB的磷酸化梯度。在胞质分裂期间，CPC靶向卵裂沟和中间体。AURKB通过控制液泡蛋白分选相关蛋白4(VPS4)的定位和功能来调节脱落时间(5)。简而言之，染色质修饰蛋白/带电的多泡体蛋白(Chmp)4c与borealin相互作用，并在C末端的基序中的几个残基处被AURKB磷酸化，而Chmp4a和Chmp4b旁系同源物中缺少该基序。在中间体中，Abscission/NoCut检查点调节因子(ANCHR)与Chmp4c和VPS4相互作用以形成三元复合物。AURKB的激酶活性是维持该复合物所必需的，因为用AURKB激酶抑制剂进行治疗会导致VPS4从Chmp4c解离(5)。VPS4参与转运III介导的收缩和最终分裂所需的内体分选复合物。然而，在脱落中对VPS4的活性的调节仍不清楚。由于极光激酶抑制剂与几种不同的癌症类型相关，因此正在临床试验中对其进行测试(Keen N、Taylor S.Aurora-kinase inhibitors as anticancer agents.Nat Rev Cancer.2004；4:927–36)。
US2016/0153052涉及用于对患者进行分类以选择使用一种或多种极光激酶B抑制剂的癌症疗法(作为单一疗法或作为组合疗法的一部分)并监测患者对此类疗法的反应的诊断测定，并且CN110261612A涉及极光B和Survivin在制备结直肠癌诊断试剂盒中的用途。
前列腺癌是全世界男性中最常见的癌症，尤其是在西方国家，每年与约375,000人死亡相关(Esfahani M、Ataei N、Panjehpour M.Biomarkers for Evaluation ofProstate Cancer Prognosis.2015；16:2601-11和Sung H等人.CA Cancer J Clin 2021；71(3):209-49)。转化生长因子β(TGFβ)是细胞命运的有效决定因素，因为它在胚胎发生期间和多种类型的恶性肿瘤中对细胞体内平衡和分化进行环境调节。
目前，组织或体液(诸如血液或尿液)中没有可用于筛查和检测侵袭性癌症的生物标志物。在前列腺癌中，PSA(前列腺特异性抗原)通常用作标志物，但它对于前列腺癌既不可靠也不具有特异性。前列腺和肾脏(RCC)活检由病理学家进行目视评估，并分配RCC的格里森评分等级(前列腺)或Fuhrman等级。这两种评分都是主观的，并且取决于病理学家的经验。此外，目前没有可用的基于组织的标志物可以区分分类为格里森评分>7和格里森评分<7的前列腺癌。这很重要，因为格里森评分(GS)>7的预后比低于7的预后更差(Zhu等人.Front.Oncol.,2019年7月16日)。需要生物标志物用于患者选择/分类(仅包括能够对特定治疗做出反应的受试者)、验证疗法作用模式和有效性、患者监测以及评估剂量滴定和产品功效。这将加速药物开发进程并减少临床试验所需的患者数量，从而节省成本。
鉴于上述情况，需要用于诊断涉及非经典的TGFβ信号通路的癌症的新型生物标志物，并且从而对将受益于用预防该机制的药剂进行抗癌治疗的患者进行分类。还需要用于在疾病早期预测侵袭性癌症的生物标志物。
发明内容
通过敲低APPL1和APPL2的表达，本发明人令人惊讶地将AURKB鉴定为针对去势抵抗性前列腺癌细胞(CRPC)中APPL1/APPL2调节通路的靶基因。本发明人令人惊讶地发现，TRAF6在有丝分裂进展期间自动被泛素化，并通过AURKB在K85和K87上的K63连接的多泛素化来促进AURKB活性。此外，本发明人惊奇地发现，在CRPC细胞的有丝分裂和胞质分裂期间，AURKB与APPL1、和TβRI的细胞内结构域(TβRI-ICD)形成复合物，并且在神经母细胞瘤细胞中，通过共聚焦成像也观察到AURKB和TβRI的共定位。本发明人惊奇地发现，APPL1和TβRI对于CRPC细胞的增殖是必需的。此外，通过原位PLA技术可视化的AURKB和TβRI-ICD复合物的高表达存在于临床前列腺癌症材料中，并且与不良预后相关。本发明人惊奇地发现，AURKA和AURKB在神经内分泌型CRPC中的表达高于在CRPC腺癌中的表达，这与患有神经内分泌型CRPC的患者的不良预后一致。
本发明提供了用于对受试者的癌症进行分类、诊断和监测治疗的生物标志物。生物标志物还可用于识别和预测侵袭性癌症形式。
转化生长因子β(TGFβ)在多种癌症中经常过度表达，从而导致肿瘤进展。对TβRI在有丝分裂中的功能意义的深入表征证明了在胞质分裂期间新识别到的重要作用。
本发明的第一目的提供一种用于诊断受试者的癌症的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供来自该受试者的生物测试样品；以及
b)确定第一生物标志物、第二生物标志物和第三生物标志物在测试样品中的存在或不存在，其中所述生物标志物为：极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)和TGFβ1型受体(TβR1)；
其中所有三种生物标志物在该生物测试样品中的共定位指示该受试者的癌症。
因此，应当理解，步骤(b)可以包括：确定该第一、第二和第三生物标志物在该测试样品内的共定位。可以用于确定两种蛋白质是否共定位的技术的实例包括本文所述的那些，并且包括免疫组织化学、原位杂交、免疫沉淀、免疫荧光、共焦显微术，其中许多技术在实例中举例说明。
为了避免疑问，生物标志物的共定位并不要求生物标志物彼此处于复合物中，而仅仅要求生物标志物在空间上彼此接近。例如，如果观察到两种蛋白质在空间上彼此接近(例如，通过免疫荧光和使用z堆栈的数字成像)，则它们可能是共定位的，并且生物标志物之间不需要直接相互作用。然而，生物标志物可能是共定位的，因为它们确实直接相互作用，并且因此这两种情况都涵盖在术语“共定位”中。
在本发明所有方法的实施例中，生物标志物到细胞结构的共定位指示受试者的癌症。因此，应当理解，步骤(b)可以包括：确定第一、第二和第三生物标志物在测试样品内的细胞结构中的共定位。
通过“细胞结构”，我们包括细胞(诸如细胞器，包括细胞器的子部分)的任何定义的区室或子区室的含义。细胞结构包括细胞核、核糖体、内质网(ER)、高尔基体、细胞质和线粒体。例如，细胞器可以是细胞核，并且细胞核的子部分可以是中间体。可以用于确定两种蛋白质是否共定位到细胞结构的技术的实例是本领域已知的。例如，使用免疫荧光或免疫组织化学，除了用于特定生物标志物的标志物之外，还可以使用细胞核的标志物，使得技术人员能够评估这些单独的标志物是否全部在细胞核中观察到，并且从而评估这些生物标志物是否共定位到细胞核。类似地，可以对细胞群体进行分级，并且可以进行免疫沉淀以确定生物标志物是否处于例如细胞核级分内的复合物中。
在本发明的所有方法的实施例中，细胞结构为细胞核。在本发明的所有方法的另一实施例中，细胞结构为胞质分裂结构。
在实施例中，本发明提供了一种用于诊断受试者的癌症的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供来自该受试者的生物测试样品；以及
b)确定第一生物标志物、第二生物标志物和第三生物标志物在测试样品中的存在或不存在，其中所述生物标志物为：极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)和TGFβ1型受体(TβR1)；
其中共定位到胞质分裂结构的所有三种生物标志物在该生物测试样品中的存在指示受试者的癌症。
因此，应当理解，步骤(b)可以包括：确定第一、第二和第三生物标志物在测试样品内的胞质分裂结构中的存在或不存在。
因此，三种生物标志物共定位到胞质分裂结构包括以下含义：三种生物标志物中的每种生物标志物在一种或多种胞质分裂结构中是可识别。在特别优选的实施例中，胞质分裂结构为中间体，并且因此三种生物标志物在胞质分裂结构中的共定位是三种生物标志物中的每种生物标志物到中间体的共定位。为了避免疑问，通过将生物标志物共定位到胞质分裂结构，并不要求生物标志物彼此处于复合物中，而仅仅要求这些生物标志物共定位到胞质分裂结构。例如，如果通过免疫荧光和使用z堆栈的数字成像观察到两种蛋白质彼此接近，则它们可能是共定位的。
在实施例中，该方法进一步包括：确定第四生物标志物在生物测试样品中的存在或不存在，其中所述生物标志物为TNF受体相关因子6(TRAF6)，并且其中所有四种生物标志物在该生物测试样品中的共定位指示受试者的癌症。
在本发明方法的实施例中，生物标志物到细胞结构的共定位指示受试者的癌症。因此，应当理解，步骤(b)可以包括：确定第一、第二和第三生物标志物在测试样品内的细胞结构中的共定位。
在实施例中，该方法进一步包括：确定第四生物标志物在生物测试样品中的存在或不存在，其中所述生物标志物为TNF受体相关因子6(TRAF6)，其中共定位到胞质分裂结构的所有四种生物标志物在该生物测试样品中的存在指示受试者的癌症。
因此，四种生物标志物到胞质分裂结构的共定位包括以下含义：四种生物标志物中的每种生物标志物在一种或多种胞质分裂结构中可识别。在特别优选的实施例中，胞质分裂结构为中间体，并且因此四种生物标志物在胞质分裂结构中的共定位是四种生物标志物中的每种生物标志物到中间体的共定位。
在实施例中，TGFβ1型受体(TβR1)是细胞内结构域(TβR1-ICD)。术语“TGFβ1型受体”在本文中可以与“TGFβI型受体”、“TβR1”、“TGFβR1”、“TβRI”和“TGFβRI”互换使用。
用于评估生物标志物的存在和/或细胞内定位的方法是本领域众所周知的，并且可以使用任何合适的方法。例如，可以分离胞质分裂结构并评估生物标志物在胞质分裂结构中的存在，或者可以通过可检测部分来鉴定该胞质分裂结构，并且可以通过评估该生物标志物是否定位到同一可检测部分来评估该生物标志物在该胞质分裂结构内的定位。可以使用的技术的实例包括本文描述的那些，并且包括免疫组织化学、原位杂交、免疫沉淀、免疫荧光、共焦显微术，其中许多技术在实例中举例说明。
在一些实施例中，诊断癌症包括：确定该癌症的恶性程度。在一些实施例中，诊断癌症包括：确定该癌症的阶段。在一些实施例中，诊断癌症包括：评估癌症复发的风险。在一些实施例中，诊断癌症包括：评估该癌症的等级。
本发明还包括一种方法，该方法包括以下步骤：
-提供来自受试者的生物测试样品；
-确定第一生物标志物、第二生物标志物、第三生物标志物和第四生物标志物在测试样品中的存在或不存在，这些生物标志物是：极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)、TGFβ
1型受体(TβR1)和TNF受体相关因子6(TRAF6)；以及
其中所有四种生物标志物在生物测试样品中的共定位指示受试者的癌症。
本发明还包括一种方法，该方法包括以下步骤：
-提供来自受试者的生物测试样品；
-确定第一生物标志物、第二生物标志物、第三生物标志物和第四生物标志物在测试样品中的存在或不存在，这些生物标志物是：极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)、TGFβ1型受体(TβR1)和TNF受体相关因子6(TRAF6)；以及
其中共定位到胞质分裂结构的所有四种生物标志物在该生物测试样品中的存在指示受试者的癌症。
因此，应当理解，第二步骤可以包括：确定生物标志物在测试样品内的共定位。
TβR1的细胞内结构域(ICD)不会从健康细胞中的TβR1上裂解下来，因此在细胞核中不可检测，这意味着在胞质分裂期间共定位的三种或四种生物标志物(AURKB、APPL1、TβR1(或TβR1-ICD)和TRAF6)在健康细胞中是不可检测的。
用于确定生物标志物的存在和/或生物标志物在胞质分裂和/或有丝分裂期间是否共定位的方法是本领域已知的。例如，为了检查每个有丝分裂阶段蛋白质的免疫荧光，可以通过双胸苷阻断和释放来同步细胞(在G1-S转变时)，以便富集细胞因子细胞。分期系统可以用于基于DNA和纺锤体形态以及染色体排列和分离的程度来识别有丝分裂和胞质分裂的不同阶段。哺乳动物细胞在胞质分裂中的同步也可以通过将细胞从中期前阻滞中释放来实现。使用微管聚合/解聚剂(诸如诺考达唑和紫杉醇)以及驱动蛋白抑制剂(诸如莫纳醇(monastrol)和S-三苯甲基-L-半胱氨酸)可以实现中期前同步。
本发明的第二目的是提供一种用于诊断和/或预测受试者的侵袭性癌症的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供来自该受试者的生物测试样品；
b)确定第一生物标志物、第二生物标志物和第三生物标志物在所述测试样品中的存在或不存在，其中所述生物标志物是：极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)和TGFβ1型受体(TβR1)；以及
其中所有三种生物标志物在该生物样品中的共定位指示该受试者的侵袭性癌症。
本发明的另一目的是提供一种用于诊断和/或预测受试者的侵袭性癌症的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供来自该受试者的生物测试样品；
b)确定第一生物标志物、第二生物标志物和第三生物标志物在所述测试样品中的存在或不存在，其中所述生物标志物是：极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)和TGFβ1型受体(TβR1)；以及
其中共定位到胞质分裂结构的所有三种生物标志物在该生物样品中的存在指示该受试者的侵袭性癌症。
侵袭性癌症形式包括高转移风险的含义。通过侵袭性癌症，我们包括了包括这样的癌症，其包含III期和/或IV期癌症或由III期和/或IV期癌症组成的癌症，例如，如由美国癌症联合委员会(AJCC)的TNM系统和国际抗癌联盟确定。
优选地，胞质分裂结构是细胞的中间体或中区。
在实施例中，TGFβ1型受体(TβR1)是细胞内结构域(TβR1-ICD)。
可以通过使用与中间体结合的分子(诸如与已知定位到中间体的蛋白质(例如，与中间体多肽或其抗原片段特异性结合的抗体，例如，有丝分裂驱动蛋白样蛋白-1(MKLP-1)、驱动蛋白家族成员4(KIF4)和/或β-微管蛋白)结合的分子)来检测中间体。MKLP-1定位到纺锤体赤道并且据信通过在纺锤体中区处交联反平行微管来在有丝分裂后期B期间参与纺锤体极的分离。适用于本文所述方法的许多抗体是本领域已知的和/或可商购获得的。例如，抗MKLP1可从BD Biosciences(San Jose,CA)和Santa Cruz Biotechnology Inc.(SantaCruz,CA)获得。用于分离中间体的方法是本领域已知的(Science.2004年7月2日；305(5680):61–66)。然后可以通过串联液相色谱法和串联质谱法来识别存在于中间体制剂中的蛋白质。
在实施例中，该方法进一步包括：确定第四生物标志物在生物测试样品中的存在或不存在，其中所述生物标志物是TNF受体相关因子6(TRAF6)，并且其中所有四种生物标志物在该生物测试样品中的共定位指示受试者的侵袭性癌症。
在实施例中，该方法进一步包括：确定第四生物标志物在生物测试样品中的存在或不存在，其中所述生物标志物是TNF受体相关因子6(TRAF6)，其中共定位到胞质分裂结构的所有四种生物标志物在生物测试样品中的存在指示受试者的侵袭性癌症。
此外，本发明提供了一种用于诊断和/或预测受试者的侵袭性癌症的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供来自该受试者的生物测试样品；
b)确定第一生物标志物、第二生物标志物、第三生物标志物和第四生物标志物在测试样品中的存在或不存在，其中所述生物标志物是：极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)、以及TGFβ1型受体(TβR1)和TNF受体相关因子6(TRAF6)；以及
其中所有四种生物标志物在该生物样品中的共定位指示该受试者的侵袭性癌症。
此外，本发明提供了一种用于诊断和/或预测受试者的侵袭性癌症的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供来自该受试者的生物测试样品；
b)确定第一生物标志物、第二生物标志物、第三生物标志物和第四生物标志物在测试样品中的存在或不存在，其中所述生物标志物是：极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)、以及TGFβ1型受体(TβR1)和TNF受体相关因子6(TRAF6)；以及
其中共定位到胞质分裂结构的所有四种生物标志物在该生物样品中的存在指示该受试者的侵袭性癌症。
优选地，AURKB被泛素化。在实施例中，本发明的方法包括：检测被泛素化的AURKB在生物测试样品中的存在。用于检测被泛素化的AURKB的存在的方法是本领域已知的并且在本文中公开。
蛋白质泛素化是由一系列涉及泛素(Ub)激活酶(E1)、Ub结合酶(E2)和Ub连接酶(E3)的酶促反应催化的翻译后修饰。通过在Ub的C末端甘氨酸残基的羧基和底物中赖氨酸残基的∈-氨基之间形成异肽键，将Ub结合到蛋白质底物上。此外，通过将Ub的C末端甘氨酸残基的羧基与前面Ub中的七个内部赖氨酸中的一个赖氨酸的∈-氨基结合，形成多聚泛素(polyUb)链。
换句话说，polyUb通过前面Ub的Lys-48和/或Lys-63残基的∈-氨基连接。在实施例中，AURKB包含共有序列-(疏水性)-K-(疏水性)-K-X-(疏水性)-(极性)-(疏水性)-(极性)-(疏水性)，其中至少一个K被泛素化。如图3I所示，该基序在人、猪、牛、狗、小鼠和大鼠AURKB中是保守的。在实施例中，AURKB包含*K*KX*&*&*共有序列，其中*＝疏水性、&＝极性、X＝任何氨基酸、K＝受体赖氨酸并且其中赖氨酸残基中的至少一个赖氨酸残基被泛素化。在实施例中，AURKB包含GKGKFGNVYL(SEQ ID NO:23)共有序列，并且其中赖氨酸残基中的至少一个赖氨酸残基被泛素化。换句话说，在实施例中，AURKB在对应于人AURKB(SEQ ID NO:1)的赖氨酸85(K85)和/或赖氨酸87(K87)的一个或两个赖氨酸残基处被泛素化。在实施例中，AURKB在对应于人AURKB(SEQ ID NO:1)的赖氨酸85(K85)的赖氨酸残基处被泛素化。在实施例中，AURKB在对应于人AURKB(SEQ ID NO:1)的赖氨酸87(K87)的赖氨酸残基处被泛素化。在实施例中，AURKB在对应于人AURKB(SEQ ID NO:1)的赖氨酸85(K85)和赖氨酸87(K87)的两个赖氨酸残基处被泛素化。
通过“对应于”，我们包括以下含义：当比较人AURKB的序列和不同AURKB的序列时另一AURKB(诸如人AURKB的直系同源物或变体)中的赖氨酸残基(其与人AURKB(SEQ ID NO:1)中的K85比对和/或与人AURKB(SEQ ID NO:1)中的K87比对)，诸如使用MacVector、ClustalOmega或ClustalW2进行比对，或者如通过引用并入的Brown等人.EvolutionaryBiology 4卷,文章编号:39(2004)的图1所示进行比对。
在实施例中，AURKB是Lys48连接的和/或Lys63连接的多泛素化的。
在所附实例中，本发明人惊奇地发现，AURKB含有至少一个受体赖氨酸残基，其充当用于TRAF6泛素化的识别位点，并且AURKB在共有序列中的K85和/或K87上的TRAF6介导的泛素化有助于其活性并控制在细胞分裂期间TβRI在中间体的定位。用于确定蛋白质是否被泛素化的方法是本领域已知的，并且包括体内泛素化测定或使用两种抗体(AURKB和K63抗体)的原位PLA测定，如实例中所述。
本说明书中公开的方法适合于与转化生长因子βI型受体(TβRI)的蛋白水解裂解相关和/或由其介导的癌症类型。
通过“与转化生长因子βI型受体(TβRI)的蛋白水解裂解相关和/或由其介导”癌症我们包括以下含义：癌症，其中TβRI的细胞内结构域(ICD)已经被蛋白水解裂解并进入细胞核以促进促侵袭基因的转录。本文描述了检测TβRI和TβRI-ICD的定位的方法。
癌症例如是实体瘤。肿瘤可选自由以下组成的组：前列腺癌、肾细胞癌、肺癌、肾癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌和结直肠癌。
优选地，癌症是前列腺癌。在另一实施例中，前列腺癌是去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。通过“去势抵抗性前列腺癌(CRPC)”，我们包括以下含义：一种形式的前列腺癌，其中低睾酮水平(低于50ng/mL)不再阻止癌症。去势抵抗性前列腺癌通过PSA水平升高和/或症状恶化和/或扫描证实的癌症生长来定义。在实施例中，CRPC具有神经内分泌类型。在实施例中，生物测试样品包含CRPC细胞。如所附实施例所示，本发明人惊奇地发现，在有丝分裂和胞质分裂期间，在CRPC细胞和神经母细胞瘤KELLY细胞的中间体中形成TβRI-AURKB复合物。
优选地，生物测试样品是组织样品，诸如来自肿瘤的活检切片。
“待测试样品”、“生物测试样品”、“测试样品”或“对照样品”可以是取自或源自受试者的组织或流体样品。
优选地，测试样品由哺乳动物提供。哺乳动物可以是任何家畜或农场动物。优选地，哺乳动物是大鼠、小鼠、豚鼠、猫、狗、马或灵长类动物。最优选地，哺乳动物是人。
如本文所用的样品包括可以用于分子谱分析的任何相关生物样品，例如，组织切片(诸如活检组织切片或在手术或其他过程期间去除的组织)、体液(例如，液体活检切片)、尸检样品和出于组织学目的采集的冷冻切片、包含细胞的样品。此类样品包括血液或血液级分或产品(例如，血清、血沉棕黄层、血浆、血小板、红细胞等)、痰、恶性渗出液、颊细胞组织、培养细胞(例如，原代培养物、外植体和转化细胞)、粪便、尿液、其他生物或体液(例如，前列腺液、胃液、肠液、肾液、肺液、脑脊液等)等。样品可以包含生物材料，其为新鲜冷冻和福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)块、福尔马林固定石蜡包埋或位于RNA防腐剂和福尔马林固定剂内。多于一种类型的多于一个样品可以用于每个受试者。优选地，样品是细胞或组织样品(或其衍生物)，例如，包含癌细胞或由癌细胞组成的样品。在优选的实施例中，样品包括固定的肿瘤样品。本文所述方法中使用的样品可以是福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品。FFPE样品可以是固定组织、未染色的载玻片、骨髓核心或凝块、空芯针活检切片、恶性液体和细针抽吸物(FNA)中的一者或多者。在实施例中，固定的组织包括含有来自手术或活检切片的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)块的肿瘤。
可以根据本领域技术人员理解的技术来处理样品。样品可以是但不限于新鲜的、冷冻的或固定的细胞或组织。在一些实施例中，样品包含福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织、新鲜组织或新鲜冷冻(FF)组织。样品可以包含培养的细胞，包括源自受试者样品的原代或永生化细胞系。样品还可以指来自受试者的样品的提取物。例如，样品可以包含从组织或体液中提取的DNA、RNA或蛋白质。许多技术和商业试剂盒可用于此类目的。来自受试者的新鲜样品可以在进一步处理(例如，细胞裂解和提取)之前用试剂处理以保存RNA。样品可以包括为其他目的收集的冷冻样品。样品可以与以下相关信息相关：诸如受试者的年龄、性别和临床症状；样品来源；以及收集和储存样品的方法。
活检切片包括去除用于诊断或预后评估的组织样品以及到组织样本本身的过程。本领域已知的任何活检切片技术可以应用于本发明的方法。所应用的活检切片技术可以取决于待评估的组织类型(例如，结肠、前列腺、肾脏、膀胱、淋巴结、肝脏、骨髓、血细胞、肺、乳房等)、肿瘤的大小和类型(例如，实体或悬浮，血液或腹水)等因素。代表性的活检切片技术包括但不限于切除活检切片、切割活检切片、穿刺活检切片、手术活检切片和骨髓活检切片。“切除活检切片”是指去除整个肿瘤块及其周围正常组织的小边缘。“切割活检切片”是指去除包括肿瘤横截面直径的楔形组织。该方法可以使用肿瘤块的“空芯针活检切片”或通常从肿瘤块内获得细胞悬浮液的“细针抽吸活检切片”。例如，在哈里森的Principles ofInternal Medicine(Kasper等人编辑,第16版,2005年)第70章以及整个第五部分中讨论了活检切片技术。
优选地，测试样品和对照样品源自相同物种。优选地，测试样品和对照样品的年龄、性别和/或生活方式相匹配。
在实施例中，组织样品是肿瘤组织，诸如活检切片。在实施例中，细胞样品是癌细胞的样品。
优选地，该方法进一步包括以下步骤：
c)提供来自以下的一个或多个对照样品：
i.未患有癌症的个体；和/或
ii.患有癌症的个体，其中该对照样品具有与该测试样品的癌症阶段不同的癌症阶段，或者其中该对照样品源自患有癌症的个体的健康组织；
d)确定第一生物标志物、第二生物标志物和第三生物标志物在该对照样品中的存在或不存在，其中所述生物标志物为：极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)、和TGFβ1型受体(TβR1)；
其中如果步骤(b)中测量的所有三种生物标志物共定位于该测试样品中并且并非步骤(d)中测量的所有三种生物标志物共定位于该对照样品中，则诊断出癌症。
优选地，该方法进一步包括以下步骤：
c)提供来自以下的一个或多个对照样品：
i.未患有癌症的个体；和/或
ii.患有癌症的个体，其中该对照样品具有与该测试样品不同的癌症阶段，或者其中该对照样品源自患有癌症的个体的健康组织；
d)确定第一生物标志物、第二生物标志物和第三生物标志物在该对照样品中的存在或不存在，其中所述生物标志物为：极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)、和TGFβ1型受体(TβR1)；
其中如果步骤(b)中测量的所有三种生物标志物在该测试样品中共定位于胞质分裂结构并且并非步骤(d)中测量的所有三种生物标志物在该对照样品中共定位于胞质分裂结构，则诊断出癌症。
例如，如果癌症严格定位于前列腺的一个叶，则可以使用来自同一个体的另一叶中的健康(即非癌)组织作为对照。
在实施例中，该方法进一步包括：(d)确定第四生物标志物在对照样品中的存在或不存在，其中所述生物标志物是TNF受体相关因子6(TRAF6)，其中如果步骤(b)中测量的所有四种生物标志物在测试样品中共定位并且并非步骤(d)中测量的所有四种生物标志物在对照样品中共定位，则诊断出癌症。
在实施例中，该方法进一步包括：(d)确定第四生物标志物在对照样品中的存在或不存在，其中所述生物标志物是TNF受体相关因子6(TRAF6)，其中如果步骤(b)中测量的所有四种生物标志物在测试样品中共定位于胞质分裂结构并且并非步骤(d)中测量的所有四种生物标志物在对照样品中共定位于胞质分裂结构，则诊断出癌症。
因此，优选地，该方法进一步包括以下步骤：
c)提供来自以下的一个或多个对照样品：
i.未患有癌症的个体；和/或
ii.患有癌症的个体，其中对照样品具有与测试样品的癌症阶段不同的癌症阶段；
d)确定第一生物标志物、第二生物标志物、第三生物标志物和第四生物标志物在对照样品中的存在或不存在，其中所述生物标志物是：极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)、TGFβ1型受体(TβR1)和TNF受体相关因子6(TRAF6)；
其中如果步骤(b)中测量的所有四种生物标志物共定位于该测试样品中并且并非步骤(d)中测量的所有四种生物标志物共定位于该对照样品中，则诊断出癌症。
因此，优选地，该方法进一步包括以下步骤：
c)提供来自以下的一个或多个对照样品：
i.未患有癌症的个体；和/或
ii.患有癌症的个体，其中对照样品具有与测试样品的癌症阶段不同的癌症阶段；
d)确定第一生物标志物、第二生物标志物、第三生物标志物和第四生物标志物在对照样品中的存在或不存在，其中所述生物标志物是：极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)、TGFβ1型受体(TβR1)和TNF受体相关因子6(TRAF6)；
其中如果步骤(b)中测量的所有四种生物标志物在该测试样品中共定位于胞质分裂结构并且并非步骤(d)中测量的所有四种生物标志物在该对照样品中共定位于胞质分裂结构，则诊断出癌症。
优选地，AURKB被泛素化。
通过“其中对照样品具有与测试样品的癌症阶段不同的癌症阶段”，我们包括以下含义：对照样品源自患有癌症的个体，但对照样品内包含的癌症比测试样品中的癌症进展得慢(即更低的等级或评分)。可以使用本领域已知的常规临床方法在患有癌症的个体中诊断癌症。
通过“其中对照样品源自患有癌症的个体的健康组织”，我们包括以下含义：对照样品可以源自与癌组织相邻的健康的非癌组织。
如所附实例中所举例说明的，极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)、TGFβ1型受体(TβR1)和TNF受体相关因子6(TRAF6)在胞质分裂结构中的存在指示受试者的癌症。
优选地，未患有癌症的个体在获得样品时未患有任何疾病或病症。优选地，未患有癌症的个体是健康个体。
优选地，生物标志物极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)、TGFβ1型受体(TβR1)和/或TNF受体相关因子6(TRAF6)的存在或不存在(优选地与细胞结构诸如胞质分裂结构共定位)通过以下来确定：检测生物标志物蛋白；且/或检测生物标志物蛋白的生物活性。
在实施例中，TGFβ1型受体(TβR1)是细胞内结构域(TβR1-ICD)。
通过检测生物标志物蛋白，我们包括以下含义：检测生物标志物蛋白是否直接存在，例如通过使用与生物标志物蛋白特异性结合的结合配偶体。通过检测生物标志物蛋白的生物活性，我们包括以下含义：测定生物标志物蛋白的生物活性，例如，酶活性。应当理解，检测生物标志物蛋白质的生物活性可以用于间接确定生物标志物的存在或不存在。
优选共定位于细胞结构诸如胞质分裂结构的所述生物标志物的存在和/或不存在可以通过免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀(IP)、ELISA技术(单一或多重)、放射免疫测定(RIA)、免疫放射测定(IRMA)和免疫酶测定(IEMA)(包括使用单克隆和/或多克隆抗体的夹心测定)、原位邻近连接测定(PLA)、酶催法、图像分析、质谱、适体、生物层干涉测量(BLI)、表面等离子共振(SPR)、多重测定(MSD，Mesoscalediscovery)、或通过与极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)、TGFβ1型受体细胞内结构域(TβR1-ICD)和TNF受体相关因子6(TRAF6)结合的指示物质来确定。
免疫组织化学(IHC)是在组织的细胞中定位抗原(例如，蛋白质)的过程，其将抗体特异性结合至组织中的抗原。抗原结合抗体可以结合或融合至允许其检测的标签，例如经由可视化。在一些实施例中，标签是可以催化生色反应的酶，诸如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。酶可以与抗体融合或非共价结合，例如，使用生物素-亲和素系统。或者，抗体可以用荧光团标记，诸如荧光素、罗丹明、DyLight Fluor或Alexa Fluor。抗原结合抗体可以直接被标记，或者其本身可以被携带标签的检测抗体识别。使用IHC，可以检测一种或多种蛋白质。基因产物的表达可以与其对照水平相比的染色强度有关。在一些实施例中，如果基因产物的染色在样品中与对照相比变化至少1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.2、2.5、2.7、3.0、4、5、6、7、8、9或10倍，则认为该基因产物被差异表达。
IHC包括抗原抗体相互作用在组织化学技术中的应用。在例示性实例中，将组织切片安装在载玻片上并与对抗原具有特异性的抗体(多克隆或单克隆)一起孵育(初级反应)。然后使用与过氧化物酶抗过氧化物酶(PAP)、抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶(ABC)或抗生物素蛋白-生物素碱性磷酸酶的复合物结合的第二抗体来放大抗原-抗体信号。在底物和色原存在的情况下，酶在抗体-抗原结合位点处形成有色沉积物。
免疫荧光是可视化靶蛋白的另一方法。在该技术中，使用与荧光染料结合的第二抗体来放大主要靶抗体信号。在吸收UV时，荧光染料发出较长波长的光(荧光)，从而允许抗体-抗原复合物的定位。
用于检测生物标志物的存在和/或量的基于蛋白质的技术还包括基于对编码生物标志物的蛋白质选择性免疫反应性的抗体的免疫亲和测定。这些技术包括但不限于免疫沉淀、蛋白质印迹分析、分子结合测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶联免疫过滤测定(ELIFA)、荧光激活细胞分选(FACS)等。例如，检测样品中生物标志物在样品中的存在和/或不存在的任选方法包括：在足以形成抗体-生物标志物复合物的条件下，使该样品与针对该生物标志物的抗体、或其抗体的免疫反应性片段、或含有针对该生物标志物的抗体的抗原结合区的重组蛋白接触；以及然后检测所述复合物。用于产生此类抗体的方法是本领域已知的。ELISA方法是本领域众所周知的，例如，参见The ELISA Guidebook(Methods inMolecular Biology),2000,Crowther,Humana Press,ISBN-13:978-0896037281(其公开内容通过引用并入)。使用这种测定形式的多种免疫测定技术是可用的，参见，例如，美国专利号4,016,043、4,424,279和4,018,653。这些包括非竞争性类型的单位点和双位点或“夹心”测定，以及传统的竞争性结合测定。这些测定还包括标记抗体与靶生物标志物的直接结合。合适的结合剂(也称为结合分子)可以基于其结合给定蛋白质的能力从文库中选择。
抗体可以用于从溶液样品中免疫沉淀特异性蛋白质或免疫印迹通过例如聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质。
优选地，步骤(b)和/或(d)通过用可检测部分标记(一个或多个)测试样品中的一种或多种生物标志物来执行。
优选地，步骤(b)和/或(d)通过用可检测部分标记(一个或多个)对照样品中的一种或多种生物标志物来执行。
通过“可检测部分”我们包括以下含义：部分是可以被检测到(诸如被可视化、被限定为存在或不存在和/或被定量)的部分。通过部分是可以检测的，可以确定该部分的相对量和/或位置。合适的可检测部分是本领域熟知的。
因此，可检测部分可以是荧光部分和/或发光部分和/或化学发光部分，当暴露于具体条件下时，其可以被检测。例如，荧光部分可能需要暴露于特定波长和强度下的辐射(即，光)以引起该荧光部分的激发，从而使该荧光部分能够发射可以检测到的特定波长下的可检测荧光。
或者，可检测部分可以是能够将(优选不可检测的)底物转化为可以可视化和/或检测的可检测产物的酶。合适的酶的实例在下文中关于例如ELISA测定更详细地讨论。
或者，可检测部分可以是用于成像的放射性原子。适合的放射性原子包括用于闪烁照相研究的99mTc和123I。其他容易可检测的部分包括例如用于磁共振成像(MRI)的自旋标记，又诸如123I、131I、111In、19F、13C、15N、17O、钆、锰或铁。清楚的是，待检测的药剂(诸如，例如，本文所述的测试样品和/或对照样品中的生物标志物和/或用于检测所选择的蛋白质的抗体分子)必须具有足够的适当的原子同位素，以便使可检测部分是容易可检测的。
放射性标记或其他标记可以以已知的方式掺入到本发明的试剂(即，本发明的方法的样品中存在的蛋白质和/或本发明的结合剂)中。例如，如果结合部分是多肽，则其可以被生物合成或者可以通过使用合适的氨基酸前体(包括，例如，氟-19代替氢)的化学氨基酸合成被合成。例如，诸如99mTc、123I、186Rh、188Rh和111In的标记可以经由结合部分中的半胱氨酸残基连接。Yttrium-90可以经由赖氨酸残基连接。IODOGEN方法(Fraker等人(1978)Biochem.Biophys.Res.Comm.80,49-57)可以用于掺入123I。参考文献(“MonoclonalAntibodies in Immunoscintigraphy”,J-F Chatal,CRC Press,1989)详细描述了其他方法。用于将其他可检测部分(诸如酶促部分、荧光部分、发光部分、化学发光部分或放射性部分)结合至蛋白质的方法是本领域众所周知的。
优选地，使用一种或多种能够结合至所述生物标志物的第一结合剂来执行步骤(b)和/或(d)。本领域技术人员应当理解，第一结合剂可以包含对生物标志物中的一种生物标志物具有特异性的单一物质或多种不同物质(每种物质对不同的蛋白质生物标志物具有特异性)或由其组成。
优选地，使用包含能够结合至所述第一结合剂的第二结合剂的测定来执行步骤(b)和/或(d)，该第二结合剂包含可检测部分。
至少一种类型的结合剂，并且更典型地所有类型的结合剂，可以包括抗体或其抗原结合片段或它们的变体或由抗体或其抗原结合片段或它们的变体组成。
优选地，第一结合剂和/或第二结合剂包括抗体或其抗原结合片段或由抗体或其抗原结合片段组成。
抗体或其抗原结合片段可以是scFv；Fab；或免疫球蛋白分子的结合结构域。
优选地，可检测部分选自以下组成的组：荧光部分；发光部分；化学发光部分；放射性部分；酶促部分。
在另一实施例中，极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)、TGFβ1型受体(TβR1)和/或TNF受体相关因子6(TRAF6)的存在和/或不存在通过测量编码生物标志物的核酸分子的存在和/或表达来确定。
优选地，核酸分子是cDNA分子或mRNA分子。
原则上可以使用检测和/或定量编码生物标志物的核酸分子的任何方法来确定该生物标志物的存在和/或不存在。编码生物标志物的核酸分子可以直接检测和/或定量(诸如，通过RNA测序)，或者可以被复制和/或扩增以允许检测编码该生物标志物或其互补物的核酸分子的扩增拷贝。
优选地，使用选自由Southern杂交、Northern杂交、聚合酶链式反应(PCR)、逆转录酶PCR(RT PCR)、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、纳米阵列、微阵列、宏阵列、放射自显影和原位杂交组成的组的方法来执行步骤(b)、(d)和/或(f)中确定生物标志物的存在和/或不存在。
逆转录可以通过本领域已知的任何方法执行。例如，可以使用Omniscript试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)、Superscript III试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)针对RT-PCR执行逆转录。可以执行靶标特异性引发，以便提高靶序列检测的灵敏度并生成靶标特异性cDNA。RT-PCR可以使用例如Applied Biosystems Prism(ABI)7900HT仪器、Thermo FisherQuantStudio实时PCR仪器或任何其他具有扩增荧光实时检测功能的热循环仪在具有靶序列特异性cDNA或者相当于1ng总RNA或更多的信使RNA的体积中执行。添加用于分析的引物和探针浓度，以使用PCR循环条件(诸如95℃，持续10分钟，1个循环；95℃，持续20秒；以及60℃，持续45秒，40个循环)扩增荧光扩增子。扩增反应还可以使用一种能够执行逆转录和DNA聚合两者的单一热稳定DNA聚合酶(诸如最初从嗜热栖热菌中分离出来的Tth聚合酶)作为一步qRT-PCR执行。使用逆转录酶和热稳定DNA聚合酶的混合物执行一步qPCR也是可行的。PCR产物也可以用荧光染料标记，诸如SYBR Green或仪器检测到的任何其他荧光染料。
扩增可以被设计为在步骤(b)、(d)和/或(f)中确定所有生物标志物的存在和/或不存在，这些生物标志物作为单个实体或组合，诸如在多重PCR或数字PCR(dPCR)中。可以测定参照样品以确保试剂和过程稳定性。参照样品可以从表达靶信使RNA的细胞系获得或者作为合成的信使RNA获得。可以测定参照样品以确保试剂和过程稳定性。应当测定阴性对照(例如，无模板)以监测任何外源核酸污染。
原位杂交测定是众所周知的并且一般描述于Angerer等人.MethodsEnzymol.152:649-660(1987)。在原位杂交测定中，例如来自活检切片的细胞被固定到固相支持物上，通常是载玻片。如果要探测DNA，需要用热或碱使细胞变性。然后使细胞与杂交溶液在中等温度下接触，以允许标记的特异性探针退火。探针优选地例如用放射性同位素或荧光报告基团标记或者通过酶促标记。FISH(荧光原位杂交)使用荧光探针，其仅与序列中与其表现出高度序列相似性的那些部分结合。CISH(显色原位杂交)使用在标准明场显微镜下可视化的传统过氧化物酶或碱性磷酸酶反应。
原位杂交可以用于通过将核苷酸探针的互补链与感兴趣的序列杂交来检测组织切片或细胞制剂中的特异性基因序列。荧光原位杂交(FISH)使用荧光探针来提高原位杂交的灵敏度。
FISH是一种细胞遗传学技术，其用于检测和定位细胞中的特异性多核苷酸序列。例如，FISH可以用于检测染色体上的DNA序列。FISH还可以用于检测和定位组织样品内的特异性RNA，例如，mRNA。FISH使用与特异性核苷酸序列结合的荧光探针，这些探针与特异性核苷酸序列表现出高度的序列相似性。荧光显微镜可以用于查明荧光探针是否结合以及结合位置。除了检测特异性核苷酸序列(例如，易位、融合、断裂、重复和其他染色体异常)之外，FISH还可以帮助定义细胞和组织内特异性基因拷贝数和/或基因表达的时空模式。
在实施例中，使用一个或多个结合部分来执行在步骤(b)和/或(d)中确定生物标志物的存在和/或不存在，每个结合部分单独地能够与编码生物标志物中的一种生物标志物的核酸分子选择性结合。优选地，一个或多个结合部分各自包含核酸分子或由核酸分子组成。
优选地，一个或多个结合部分各自包含DNA、RNA、PNA、LNA、GNA、TNA或PMO或者由DNA、RNA、PNA、LNA、GNA、TNA或PMO组成。
优选地，一个或多个结合部分包含可检测部分。优选地，可检测部分选自以下组成的组：荧光部分；发光部分；化学发光部分；放射性部分(例如，放射性原子)；或酶部分。
放射性原子可以是锝-99m、碘-123、碘125、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、磷-32、硫-35、氘、氚、铼-186、铼-188和钇-90。
优选地，结合部分的可检测部分是荧光部分
本发明的另一目的是提供一种用于诊断受试者的癌症的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供来自受试者的生物测试样品；以及
b)确定第一生物标志物、第二生物标志物和第三生物标志物的存在和/或量，其中所述生物标志物是：极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)、和TGFβ1型受体(TβR1)；
c)提供来自以下的一个或多个对照样品：
i.未患有癌症的个体；和/或
ii.患有癌症的个体，其中该对照样品具有与该测试样品的癌症阶段不同的癌症阶段，或者其中该对照样品源自患有癌症的个体的健康组织；
d)确定第一生物标志物、第二生物标志物和第三生物标志物在该对照样品中的存在和/或量，其中所述生物标志物是：极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)、和TGFβ1型受体(TβR1)；
其中如果所有三种生物标志物都存在于该测试样品中，并且并非所有三种生物标志物都存在于该对照样品中，则诊断出癌症；且/或其中如果步骤(b)中的该测试样品中的三种生物标志物的量相对于步骤(d)中测量的对照样品中的三种生物标志物的量增加，则诊断出癌症。
本发明的另一目的是提供一种用于诊断受试者的癌症的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供来自受试者的生物测试样品；以及
b)确定第一生物标志物、第二生物标志物、第三生物标志物和第四生物标志物的存在和/或量，其中所述生物标志物是：极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)、TGFβ1型受体(TβR1)和TNF受体相关因子6(TRAF6)；
c)提供来自以下的一个或多个对照样品：
i.未患有癌症的个体；和/或
ii.患有癌症的个体，其中该对照样品具有与该测试样品的癌症阶段不同的癌症阶段，或者其中该对照样品源自患有癌症的个体的健康组织；
d)确定第一生物标志物、第二生物标志物、第三生物标志物和第四生物标志物在该对照样品中的存在和/或量，其中所述生物标志物是：极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)、TGFβ1型受体(TβR1)和TNF受体相关因子6(TRAF6)；
其中如果所有四种生物标志物都存在于该测试样品中，并且并非所有四种生物标志物都存在于该对照样品中，则诊断出癌症；且/或其中如果步骤(b)中的该测试样品中的四种生物标志物的量相对于步骤(d)中测量的对照样品中的四种生物标志物的量增加，则诊断出癌症。
优选地，癌症是前列腺癌。在另一实施例中，前列腺癌是去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。在实施例中，CRPC具有神经内分泌类型。
本发明的该方法包括表达谱分析，其包括：评估本文公开的生物标志物的差异表达。差异表达可以包括与对照(或参照)相比生物产品例如基因、mRNA或蛋白质的过表达和/或低表达。可以通过本文所述的任何基于蛋白质或核酸的技术来执行确定所述生物标志物的存在和/或量。对照样品可以包括与测试样品相似的细胞，但没有疾病(例如，从健康个体的样品获得的表达谱)。对照可以是先前确定的水平，其指示与特定疾病和特定药物靶标相关的药物靶标功效。对照可以源自同一受试者，例如，与患病细胞相同的器官的正常相邻部分，对照可以源自其他个体的健康组织(即非癌性组织)或者先前确定的指示疾病对特定药物靶标有反应或无反应的阈值。对照也可以是在同一样品中发现的对照，例如管家基因或其产物(例如，mRNA或蛋白质)。例如，对照核酸可以是已知不随细胞的癌性或非癌性状态而变化的核酸。对照核酸的表达水平可以用于归一化测试群体和参考群体中的信号水平。例示性对照基因包括但不限于例如β-肌动蛋白、甘油醛3-磷酸脱氢酶和核糖体蛋白P1。可以使用多个对照或多种类型的对照。差异表达的来源可能有所不同。例如，可以增加细胞中的基因拷贝数，从而导致基因的表达增加。或者，可以例如通过染色质重塑、差异甲基化、启动子或增强子区域的改变、转录因子的差异表达或活性等来修饰基因的转录。还可以例如通过降解mRNA、翻译mRNA的因子或沉默翻译的差异表达来修饰翻译，例如，microRNA或siRNA或由于选择性剪接而发生的变化。在一些实施例中，差异表达包括差异活性。例如，蛋白质可以携带增加蛋白质活性的突变(诸如组成型激活)，从而导致患病状态。揭示活性的变化的分子分析可以用于指导治疗选择。
极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)、TGFβ1型受体(TβR1)和/或TNF受体相关因子6(TRAF6)的表达水平可以通过测量编码所述相应生物标志物(极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)、TGFβ1型受体细胞内结构域(TβR1-ICD)和TNF受体相关因子6(TRAF6))和/或它们的片段的DNA、mRNA或cDNA来确定。
在本发明的上下文中，与对照样品中的生物标志物的水平相比，测试样品中的所述以下生物标志物的水平增加：极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)、TGFβ1型受体(TβR1)和TNF受体相关因子6(TRAF6)，指示受试者的癌症。例如，当测试样品中极光激酶B(AURKB)的水平相对于对照样品中极光激酶B(AURKB)的水平增加时，当测试样品中与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)的水平相对于对照样品中与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)的水平增加时，当测试样品中TGFβ1型受体(TβR1)的水平相对于对照样品中TGFβ1型受体(TβR1)的水平增加时，以及当测试样品中TNF受体相关因子6(TRAF6)的水平相对于对照样品中TNF受体相关因子6(TRAF6)的水平增加时，测试样品指示受试者的癌症。
通过“相对于对照样品中的量增加”，我们包括以下含义：测试样品中生物标志物的量比一个或多个对照样品中生物标志物的量增加(或增加至表示相同的预定义参考值)。优选地，测试样品中的量相对于一个或多个对照样品中的量(或对照样品的平均值)增加一个或多个对照样品(例如，阴性对照样品)的至少5％，例如，至少6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、41％、42％、43％、44％、55％、60％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、350％、400％、500％或至少1000％。
测试样品中的量可以相对于对照样品中的量以统计显著的方式增加。可以使用本领域技术人员已知的用于确定p值的任何合适的方法，包括z检验、t检验、学生t检验、f检验、曼-惠特尼U检验、威尔科克森符号秩检验和皮尔森卡方检验。优选地，未患有癌症的个体在获得样品时未患有任何疾病或病症。优选地，未患有癌症的个体是健康个体。
另选地或另外，本发明的方法进一步包括以下步骤或由以下步骤组成：
提供来自以下的一个或多个对照样品：
(e)患有癌症的个体(即阳性对照)；和/或
(f)患有癌症的个体，其中样品具有与测试样品的阶段相同的阶段，或其中对照样品源自患有癌症的个体的健康组织；
通过测量在步骤(b)中测量的所有三种生物标志物在对照样品中的存在和/或量来确定该对照样品的生物标志物特征；其中如果在步骤(b)中测量的生物标志物在测试样品中的存在和/或量对应于在步骤(f)中测量的所有三种生物标志物在阳性对照样品中的存在和/或量，则诊断出或检测到癌症。
在实施例中，另选地或另外，本发明的方法进一步包括以下步骤或由以下步骤组成：
提供来自以下的一个或多个对照样品：
(e)患有癌症的个体(即阳性对照)；和/或
(f)患有癌症的个体，其中样品具有与测试样品的阶段相同的阶段；
通过测量在步骤(b)中测量的所有四种生物标志物在对照样品中的存在和/或量来确定该对照样品的生物标志物特征；其中如果在步骤(b)中测量的生物标志物在测试样品中的存在和/或量对应于在步骤(f)中测量的所有四种生物标志物在阳性对照样品中的存在和/或量，则诊断出或检测到癌症。
另选地或另外，步骤(a)、(c)和/或(e)中提供的(一个或多个)样品在癌症治疗(例如，切除、化疗、放疗)之前提供。通过“对应于阳性对照样品中的存在和/或量”，我们意指或包括：存在和/或量与阳性对照样品的存在和/或量相同；或与一个或多个阴性对照样品(或表示其的预定义参考值)相比更接近一个或多个阳性对照样品的存在和/或量。优选地，存在和/或量在一个或多个对照样品(或对照样品平均值)的存在和/或量的±40％内，例如，在一个或多个对照样品(例如，阳性对照样品)的±39％、±38％、±37％、±36％、±35％、±34％、±33％、±32％、±31％、±30％、±29％、±28％、±27％、±26％、±25％、±24％、±23％、±22％、±21％、±20％、±19％、±18％、±17％、±16％、±15％、±14％、±13％、±12％、±11％、±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％、±1％、±0.05％内或0％内。
相对于对照样品中的平均存在或量，测试样品中的存在或量的差异≤5个标准偏差，例如，相对于对照样品中的平均存在或量，≤4.5个、≤4个、≤3.5个、≤3个、≤2.5个、≤2个、≤1.5个、≤1.4个、≤1.3个、≤1.2个、≤1.1个、≤1个、≤0.9个、≤0.8个、≤0.7个、≤0.6个、≤0.5个、≤0.4个、≤0.3个、≤0.2个、≤0.1或0个标准偏差，条件是不同和对应的生物标志物表达的标准偏差范围不重叠(例如，邻接，但不重叠)。
通过“对应于阳性对照样品中的存在和/或量”，我们包括以下含义：测试样品中的存在或量与对照样品中的量以统计学显著的方式相关。例如，测试样品中的存在或量可以与对照样品的存在或量以≤0.05的p值相关，例如，≤0.04、≤0.03、≤0.02、≤0.01、≤0.005、≤0.004、≤0.003、≤0.002、≤0.001、≤0.0005或≤0.0001。
生物标志物的差异表达(上调或下调)或其缺乏，可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法来确定。差异表达式被确定为p值至少小于0.05(p＝≤0.05)，例如，至少≤0.04、≤0.03、≤0.02、≤0.01、≤0.009、≤0.005、≤0.001、≤0.0001、≤0.00001或至少≤0.000001。另选地或另外，使用支持向量机(SVM)来确定差异表达。
在实施例中，将在步骤(b)中测量的一种或多种生物标志物在测试样品中的存在和/或量与表示步骤(d)和/或(f)中的测量的预定参考值进行比较。
一个或多个患有癌症的个体可以是患有选自由以下组成的组的癌症的个体：前列腺癌(例如，去势抵抗性前列腺癌)、肾细胞癌、肺癌、肾癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌和结直肠癌。优选地，患有癌症的个体是已知患有与待诊断或检测的癌症相同类型的癌症的个体。患有癌症的一个或多个个体可能患有与转化生长因子βI型受体(TβRI)的蛋白水解裂解相关和/或由其介导的癌症。
在实施例中，如果受试者被诊断患有癌症，则该方法进一步包括以下步骤：
-为受试者提供癌症疗法。
优选地，癌症疗法选自由手术、化疗、免疫疗法、化学免疫疗法和热化疗组成的组。因此，在一个实施例中，当指示存在癌症时，该方法包括：根据当前建议(例如，手术去除癌细胞、放疗和/或化疗)针对癌症治疗受试者。
在实施例中，癌症疗法选自由以下组成的组：手术、化疗、免疫疗法、化学免疫疗法和热化疗(例如，AC化疗；卡培他滨和多西他赛化疗CMF化疗；环磷酰胺；EC化疗；ECF化疗；E-CMF化疗(Epi-CMF)；艾日布林/>FEC化疗；FEC-T化疗；氟尿嘧啶(5FU)；GemCarbo化疗；吉西他滨/>吉西他滨和顺铂化疗(GemCis或GemCisplat)；GemTaxol化疗；伊达比星/>脂质体多柔比星/>丝裂霉素(Mitomycin C/>)；米托蒽醌；MM化疗；MMM化疗；紫杉醇/>TAC化疗；泰素帝和环磷酰胺(TC)化疗；长春花碱/>长春新碱/>长春地辛/>和长春瑞滨/>)。
在实施例中，抗癌剂是防止TβRI裂解优选地使得细胞内结构域不能易位至细胞核的试剂(诸如抗体或其抗原结合片段)或防止TβRI裂解的小分子。
另选地或另外，重复该方法。
另选地或另外，重复该方法，其中，在步骤(a)中，待测试的样品是在与先前方法重复中的样品不同的时间从受试者获得的样品。
应当理解，使用在与所使用的先前测试样品不同的时间段采集的(一个或多个)测试样品来重复方法。
另选地或另外，使用在1天至104周之间(例如，在1周至100周之间、1周至90周之间、1周至80周之间、1周至70周之间、1周至60周之间、1周至50周之间、1周至40周之间、1周至30周之间、1周至20周之间、1周至10周之间、1周至9周之间、1周至8周之间、1周至7周之间、1周至6周之间、1周至5周之间、1周至4周之间、1周至3周之间或1周至2周之间)采集的测试样品与所使用的先前(一个或多个)测试样品来重复方法。
另选地或另外，使用从由以下组成的组中的每个周期采集的测试样品来重复方法：1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、15周、20周、25周、30周、35周、40周、45周、50周、55周、60周、65周、70周、75周、80周、85周、90周、95周、100周、104周、105周、110周、115周、120周、125周和130周。
另选地或另外，该方法重复至少一次，例如，2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次、20次、21次、22次、23次、24次或25次。
在另一目的中，本发明提供了一种用于确定患有或疑似患有前列腺癌的受试者的格里森评分(GS)为(i)GS≤6或7(3+4)；或(ii)GS 7(4+3)或≥8的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供来自该受试者的生物测试样品；
b)评估包含极光激酶B(AURKB)和TGFβ1型受体(TβR1)的复合物的量；
c)将(b)中复合物的量与包含来自已知具有GS为(i)GS≤6或7(3+4)；或(ii)GS 7(4+3)或≥8的参照样品的极光激酶B(AURKB)和TGFβ1型受体(TβR1)的复合物的量进行比较；
其中比较允许将受试者的GS确定为(i)GS≤6或7(3+4)；或(ii)GS 7(4+3)或≥8。
通过“包含极光激酶B(AURKB)和TGFβ1型受体(TβR1)的复合物”，我们包括以下含义：两种或多种蛋白质的集合，这些蛋白质相互作用，以在同一位置处形成多蛋白质结构，其中两种或多种蛋白质包含极光激酶B(AURKB)和TGFβ1型受体(TβR1)。优选地，复合物中的蛋白质通过非共价相互作用的方式彼此相互作用。检测蛋白质复合物的方法是本领域众所周知的，并且包括但不限于免疫沉淀和原位邻近连接测定(PLA)、免疫荧光和共聚焦显微术。然后可以使用本领域已知的方法和所附实例所述的方法对此类蛋白质复合物进行定量。
在本文所述的方法中的任何方法的实施例中，TGFβ1型受体(TβR1)是细胞内结构域(TβR1-ICD)。
目前，前列腺癌最常见的分级系统是格里森分级系统，该系统用于基于肿瘤的微观外观来指示肿瘤将扩散的可能性(Gleason和Mellinger,1974,Iczkowski KA.Gleasongrading.PathologyOutlines.com网站.https://www.pathologyoutlines.com/topic/prostategrading.html.)。可以使用针对α-甲基酰基-CoA消旋酶(AMACR)、p63和细胞角蛋白(CK)5的抗体对组织进行染色，并使用光学显微镜进行研究。该系统使用从1到5的等级，其中5表示更具侵袭性的肿瘤模式。给出两个等级，一个等级和另一个等级分别针对最常见的区域和第二个最常见的区域。然后病理学家将两个等级相加以获得“格里森评分”(GS)。GS在2至10的范围并且作为前列腺癌死亡的预测因子具有非常强的预后价值。GS高(8-10)的患者具有较差的存活结果。
由于格里森模式3和格里森模式4的不同比例导致不同预后，2014年提出了新的分级系统，将7级的GS分成两个不同的组：GS 3+4＝7(预后分级组II)和GS 4+3＝7(预后等级组III)(Pierorazio PM等人.BJU Int.(2013)111:753–60)。能够区分GS 3+4＝7和GS 4+3＝7非常重要，因为针对GS 3+4＝7(分级组II)与4+3＝7(分级组III)存在不同的放射治疗方法)(朱等人.Front.Oncol.,2019年7月16日)。
在实施例中，该方法能够区分来自具有格里森评分≤6或7(3+4)的受试者的测试样品与来自具有格里森评分7(4+3)或≥8的受试者的测试样品。如所附实施例所示，本发明人惊奇地发现，与具有较低格里森评分(7＝(3+4)或≤6)的前列腺癌患者的临床材料相比，在具有高格里森评分(7＝(4+3)或≥8)的前列腺癌患者的临床材料中发现了大量AURKB-TβRI-ICD复合物(图5B)。
在实施例中，复合物进一步包含与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)。
在实施例中，复合物进一步包含TNF受体相关因子6(TRAF6)。
在实施例中，复合物定位于细胞结构，诸如胞质分裂结构。
优选地，AURKB被泛素化。
在实施例中，极光激酶B(AURKB)在对应于人AURKB(SEQ ID NO:1)的赖氨酸85(K85)和/或赖氨酸87(K87)的一个或两个赖氨酸残基处被泛素化。
在实施例中，前列腺癌是去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。
在另一方面，本发明提供了用于确定受试者中癌症的存在的阵列，该阵列包括：
(i)能够与如本文所述的极光激酶B(AURKB)结合的结合剂和/或能够与能够与如本文所述的极光激酶B(AURKB)结合的核酸分子编码选择性结合的结合部分；
(ii)能够与如本文所述的与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)结合的结合剂和/或能够与能够与如本文所述的与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)结合的核酸分子编码选择性结合的结合部分；以及
(iii)能够与如本文所述的TGFβ1型受体(TβR1)结合的结合剂和/或能够与能够与如本文所述的TGFβ1型受体(TβR1)结合的核酸分子编码选择性结合的结合部分。
在实施例中，阵列进一步包括：(iv)能够与如本文所述的TNF受体相关因子6(TRAF6)结合的结合剂和/或能够与能够与TNF受体相关因子6(TRAF6)结合的核酸分子编码选择性结合的结合部分。
在另一方面，本发明提供了用于确定受试者中癌症的存在的阵列，该阵列包括：
(i)能够与如本文所述的极光激酶B(AURKB)结合的结合剂和/或能够与能够与如本文所述的极光激酶B(AURKB)结合的核酸分子编码选择性结合的结合部分；
(ii)能够与如本文所述的与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)结合的结合剂和/或能够与能够与如本文所述的与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)结合的核酸分子编码选择性结合的结合部分；
(iii)能够与如本文所述的TGFβ1型受体(TβR1)结合的结合剂和/或能够与能够与如本文所述的TGFβ1型受体(TβR1)结合的核酸分子编码选择性结合的结合部分；以及
(iv)能够与如本文所述的TNF受体相关因子6(TRAF6)结合的结合剂和/或能够与能够与TNF受体相关因子6(TRAF6)结合的核酸分子编码选择性结合的结合部分。
癌症可以是侵袭性癌症。
优选地，结合剂能够与TGFβ1型受体细胞内结构域(TβR1-ICD)结合。
在实施例中，(i)中的结合剂能够与如本文所述的被泛素化极光激酶B(AURKB)结合。在实施例中，(i)中的结合剂能够区分被泛素化的极光激酶B(AURKB)与非泛素化的AURKB。
一旦合适的结合分子(如上文所讨论的)已经被鉴定和分离，本领域技术人员就可以使用分子生物学领域熟知的方法来制造阵列。阵列通常由线性或二维结构形成，该结构具有间隔开的(即离散的)区域(“点”)，每个区域具有有限的面积，形成在固体支持物的表面上。阵列还可以是珠结构，其中每个珠可以通过分子代码或颜色代码来鉴定或在连续流中鉴定。分析也可以依次执行，其中样品经过一系列点，该一系列点各自从溶液中吸附这类分子。固相载体典型地是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固相载体可以呈以下形式：管、珠、盘、硅芯片、微孔板、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜、其他多孔膜、非多孔膜(例如其中包括，塑料、聚合物、有机玻璃、硅)、多个聚合物针或多个微量滴定孔或适用于固定蛋白质、多核苷酸和其他合适分子和/或进行免疫测定的任何其他表面。结合方法是本领域熟知的，并且通常由将蛋白质分子、多核苷酸等共价结合或物理吸附到固相载体的交联组成。通过使用熟知的技术，诸如接触或非接触印刷、掩模或光刻，可以定义每个点的位置。对于综述，请参见Jenkins,R.E.、Pennington,S.R.(2001,Proteomics,2,13-29)和Lal等人(2002,Drug Discov Today15；7(18增刊):S143-9)。
典型地，阵列是微阵列。通过“微阵列”，我们包括以下含义：具有至少约100/cm2、优选至少约1000/cm2的离散区域密度的区域阵列。微阵列中的区域具有典型的尺寸，例如，直径，在介于约10-250μm之间的范围内，并且与阵列中的其他区域相隔约同一距离。阵列还可以是宏阵列或纳米阵列。
一旦合适的结合分子(如上文所讨论的)已经被鉴定和分离，本领域技术人员就可以使用分子生物学领域熟知的方法来制造阵列。
在实施例中，阵列包括一种或多种抗体或其抗原结合片段，其能够(单独地或共同地)在蛋白质水平与所述生物标志物极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)、TGFβ1型受体(TβR1)或其细胞内结构域(TβR1-ICD)以及TNF受体相关因子6(TRAF6)结合。例如，阵列可以包括scFv分子，其能够(共同地)在蛋白质水平与所有生物标志物极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)、TGFβ1型受体(TβR1)或其细胞内结构域(TβR1-ICD)和TNF受体相关因子6(TRAF6)结合。
应当理解，阵列可以包括一种或多种阳性和/或阴性对照样品，诸如本文所述述的对照样品。
另一目的是提供用于在受试者中进行诊断和/或预后的试剂盒，所述试剂盒包括：
(i)能够与如本文所述的极光激酶B(AURKB)结合的结合剂和/或能够与编码如本文所述的极光激酶B(AURKB)的核酸分子选择性结合的结合部分；
(ii)能够与如本文所述的与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)结合的结合剂和/或能够与编码如本文所述的与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)的核酸分子选择性结合的结合部分；以及
(iii)能够与如本文所述的TGFβ1型受体(TβR1)或其细胞内结构域(ICD)结合的结合剂和/或能够与编码如本文所述的TGFβ1型受体(TβR1)或其细胞内结构域(ICD)的核酸分子选择性结合的结合部分。
在实施例中，试剂盒进一步包括：(iv)能够与如本文所述的TNF受体相关因子6(TRAF6)结合的结合剂和/或能够与核酸分子编码选择性结合的结合部分，该核酸分子编码能够与如本文所述的TNF受体相关因子6(TRAF6)结合。
另一目的是提供用于在受试者中进行诊断和/或预后的试剂盒，所述试剂盒包括：
(i)能够与极光激酶B(AURKB)结合的结合剂和/或能够与编码如本文所述的极光激酶B(AURKB)的核酸分子选择性结合的结合部分；
(ii)能够与与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)结合的结合剂和/或能够与编码如本文所述的与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)的核酸分子选择性结合的结合部分；
(iii)能够与TGFβ1型受体(TβR1)结合的结合剂和/或能够与编码如本文所述的TGFβ1型受体(TβR1)的核酸分子选择性结合的结合部分；以及
(iv)能够与TNF受体相关因子6(TRAF6)结合的结合剂和/或能够与编码如本文所述的TNF受体相关因子6(TRAF6)的核酸分子选择性结合的结合部分。
任选地，试剂盒进一步包括使用说明书。
试剂盒例如适合于对癌症的进行诊断和/或预后。癌症可以是实体瘤。肿瘤可以例如选自由以下组成的组：前列腺癌、肾细胞癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌和结直肠癌。癌症可以是侵袭性癌症。
在实施例中，TGFβ1型受体(TβR1)是细胞内结构域(TβR1-ICD)。
在实施例中，(i)中的结合剂能够与如本文所述的被泛素化极光激酶B(AURKB)结合。在实施例中，(i)中的结合剂能够区分被泛素化的极光激酶B(AURKB)与非泛素化的AURKB。
与阵列一样，应当理解，试剂盒可以包括一种或多种阳性和/或阴性对照样品，例如，如本文所述。
另一目的是提供极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)和TGFβ1型受体(TβR1)，其在对涉及TGFβ1型受体的蛋白水解裂解的疾病或病症进行诊断和/或预后中用作生物标志物，其中所有三种标志物在细胞中共定位于胞质分裂结构指示所述疾病或病症。
在实施例中，用作生物标志物的极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)和TGFβ1型受体(TβR1)进一步包含TNF受体相关因子6(TRAF6)以供在对涉及TGFβ1型受体的蛋白水解裂解的疾病或病症进行诊断和/或预后中用作生物标志物，其中所有四种生物标志物在细胞中共定位于胞质分裂结构指示所述疾病或病症。
另一目的是提供极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)、TGFβ1型受体(TβR1)和TNF受体相关因子6(TRAF6)，其在对涉及TGFβ1型受体蛋白水解裂解的疾病或病症进行诊断中用作生物标志物，其中所有四种标志物在细胞中共定位于胞质分裂结构指示所述疾病或病症。
在实施例中，涉及TGFβ1型受体的蛋白水解裂解的疾病或病症是癌症。在实施例中，癌症是本文所述癌症中的任何癌症。优选地，AURKB被泛素化。在实施例中，TGFβ1型受体(TβR1)是细胞内结构域(TβR1-ICD)。
另一目的是提供将极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)和TGFβ1型受体(TβR1)作为用于对涉及TGFβ1型受体蛋白水解裂解的疾病或病症进行诊断和/或预后的生物标志物的用途。
在实施例中，用途进一步包括：使用TNF受体相关因子6(TRAF6)作为生物标志物，用于对涉及TGFβ1型受体蛋白水解裂解的疾病或病症进行诊断和/或预后。
另一目的是提供极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)、TGFβ1型受体(TβR1)和TNF受体相关因子6(TRAF6)作为用于确定癌症在受试者中存在的生物标志物。
在实施例中，用途包括：提供来自待测试受试者的生物测试样品以及任选的对照样品，如本文所述。
另一目的是提供一种复合物，其包含极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)、以及TGFβ1型受体(TβR1)，其中AURKB被泛素化。在实施例中，复合物进一步包含TNF受体相关因子6(TRAF6)。
另一目的是提供一种复合物，其包含极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)、TGFβ1型受体(TβR1)和TNF受体相关因子6(TRAF6)，其中AURKB被泛素化。
在实施例中，TGFβ1型受体(TβR1)是细胞内结构域(TβR1-ICD)。优选地，AURKB被泛素化。
在实施例中，其中如果受试者被诊断患有癌症和/或侵袭性癌症，该方法进一步包括以下步骤：
-对该受试者使用癌症疗法。
另一目的是提供一种用于治疗受试者的癌症的方法，该受试者已经根据本文所述的方法被诊断出患有癌症，该方法包括：向该受试者施用癌症疗法。合适的癌症疗法是本领域已知的并且在本文中进行了讨论。在实施例中，抗癌剂是抗体或其抗原结合片段或防止TβRI裂解的小分子。
优选地，该方法包括以下步骤：
(a)使用本发明的方法诊断受试者患有癌症；以及
(b)用癌症疗法来治疗如此诊断的受试者。
在实施例中，抗癌剂与另一种癌症疗法同时或依次联合施用。
在实施例中，可以向受试者施用有效量的癌症疗法和/或抗癌剂。通过“有效量”，我们包括以下含义：有效实现受试者的改善的药物化合物或组合物的量，该改善包括但不限于提高的存活率、更快的恢复或症状的改善或消除和/或本领域技术人员选择的其他指标。
此外，提供了一种用于监测对患有癌症的受试者的治疗的方法。该方法适用于由转化生长因子βI型受体(TβRI)蛋白水解裂解介导的癌症。该方法包括以下步骤：
-提供来自待测试受试者的第一生物样品s1；
-确定表示第一生物标志物、第二生物标志物和第三生物标志物的表达水平的第一值v1，其中所述生物标志物是：在治疗的第一时间点t1处第一生物样品中的极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)、和TGFβ1型受体(TβR1)；
-开始或继续治疗；
-在治疗的预定时间t2之后从所述受试者获得第二生物样品s2；以及
-确定表示第一生物标志物、第二生物标志物和第三生物标志物的表达水平的第二值v2，其中所述生物标志物是：在治疗的时间t2处第二生物样品中的极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)、和TGFβ1型受体(TβR1)；以及
-如果水平为v1>v2，则该受试者对治疗有反应，如果v1<v2，则该受试者对治疗没有反应。
此外，提供了一种用于监测对患有癌症的受试者的治疗的方法。该方法适用于由转化生长因子βI型受体(TβRI)蛋白水解裂解介导的癌症。该方法包括以下步骤：
-提供来自待测试受试者的第一生物样品s1；
-确定表示第一生物标志物、第二生物标志物、第三生物标志物和第四生物标志物的表达水平的第一值v1，所述生物标志物是：在治疗的第一时间点t1处第一生物样品中的极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)、TGFβ1型受体(TβR1)和TNF受体相关因子6(TRAF6)；
-开始或继续治疗；
-在治疗的预定时间t2之后从所述受试者获得第二生物样品s2；以及
-确定表示第一生物标志物、第二生物标志物、第三生物标志物和第四生物标志物的表达水平的第二值v2，所述生物标志物是：在治疗的时间t2处第二生物样品中的极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)、TGFβ1型受体(TβR1)和TNF受体相关因子6(TRAF6)；以及
-如果水平为v1>v2，则该受试者对治疗有反应，如果v1<v2，则该受试者对治疗没有反应。
与参考值相比，所述生物标志物的表达水平降低指示癌细胞数量减少。
此外，提供了一种用于监测对患有癌症的受试者的治疗的方法。该方法适用于由转化生长因子βI型受体(TβRI)蛋白水解裂解介导的癌症。该方法包括以下步骤：
-提供来自待测试受试者的第一生物样品s1；
-确定表示第一生物标志物、第二生物标志物和第三生物标志物的共定位的第一值v1，其中所述生物标志物是：在治疗的第一时间点t1处第一生物样品中的极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)、和TGFβ1型受体(TβR1)；
-开始或继续治疗；
-在治疗的预定时间t2之后从所述受试者获得第二生物样品s2；以及
-确定表示第一生物标志物、第二生物标志物和第三生物标志物的共定位的第二值v2，其中所述生物标志物是：在治疗的时间t2处第二生物样品中的极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)、和TGFβ1型受体(TβR1)；以及
-如果水平为v1>v2，则该受试者对治疗有反应，如果v1<v2，则该受试者对治疗没有反应。
此外，提供了一种用于监测对患有癌症的受试者的治疗的方法。该方法适用于由转化生长因子βI型受体(TβRI)蛋白水解裂解介导的癌症。该方法包括以下步骤：
-提供来自待测试受试者的第一生物样品s1；
-确定表示第一生物标志物、第二生物标志物、第三生物标志物和第四生物标志物的共定位的第一值v1，所述生物标志物是：在治疗的第一时间点t1处第一生物样品中的极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)、TGFβ1型受体(TβR1)和TNF受体相关因子6(TRAF6)；
-开始或继续治疗；
-在治疗的预定时间t2之后从所述受试者获得第二生物样品s2；以及
-确定表示第一生物标志物、第二生物标志物、第三生物标志物和第四生物标志物的共定位的第二值v2，所述生物标志物是：在治疗的时间t2处第二生物样品中的极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)、TGFβ1型受体(TβR1)和TNF受体相关因子6(TRAF6)；以及
-如果水平为v1>v2，则该受试者对治疗有反应，如果v1<v2，则该受试者对治疗没有反应。
与参考值相比，所述生物标志物的共定位水平降低指示癌细胞数量减少。
参考值可以是例如在治疗开始之前、在治疗改变或可能有兴趣监测的任何改变之后，即开始值t0。
第二、第三、第四、第五等值可以设置在开始点t0或治疗改变之后的预定时间点、治疗或要监测的其他感兴趣事件期间的预定时间点。
上述方法和试剂盒不限于仅针对癌症疾病使用，该方法和试剂盒可以用于与转化生长因子βI型受体(TβRI)的蛋白水解裂解相关和/或由其介导的任何其他疾病或病症。
现在将参考以下附图和实例描述本发明。
附图说明
图1APPL1和2促进AURKB、BIRC5、CDCA8和KIF2C表达。
(A)用对照或No.1APPL1和APPL2 siRNA转染人前列腺癌PC-3U细胞。从细胞中提取RNA，并执行微阵列分析。(B(i)和(ii))对用或不用No.1APPL1和APPL2 siRNA处理的细胞组a中显示的基因进行qRT-PCR分析。通过表达siRNA抗性构建体克服了siRNA的抑制；N＝4，数据表示为平均值±SEM[学生t检验，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001]。(B(iii)和(iv))使用第二对siRNA(No.2；N＝3)执行qRT-PCR以验证图1b的微阵列结果。数据表示为平均值±SD[学生t检验，***P＜0.001]。(C(i))通过免疫印迹评价生存素和AURKB在用或未用No.1APPL1/2siRNA和TGFβ处理的PC-3U细胞中的表达。(C(ii))PC-3U细胞与双胸苷阻断同步并用No.1APPL1和APPL2 siRNA处理。在不同时间释放细胞并制备细胞裂解物，并进行免疫印迹。(D)用或不用No.1APPL1和APPL2 siRNA转染PC-3U细胞，与诺考达唑一起孵育12h，并通过免疫印迹进行分析。(E)免疫荧光和共聚焦成像显示AURKB(绿色)和APPL1(红色)在末期和胞质分裂期间的共定位。(F-K)组e的两个Z堆栈图像的正交视图(XY、XZ和YZ)。(F,I)XY视图(z投影)。(G,J)XZ视图。(H,K)YZ视图。比例尺，20μm。(L)PC-3U细胞用TGFβ处理达不同时间段；然后使用抗生存素抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀，并使用针对APPL1和TβRI的抗体进行免疫印迹。IB，免疫印迹；TCL，总细胞裂解物。(M)PC-3U细胞用全长GFP-APPL1、黄色荧光蛋白(YFP)-APPL1-ΔN或GFP-APPL1-ΔC转染，并且然后用AURKB(红色)染色。选择绿色通道来显示GFP和YFP两者。比例尺，20μm。包括APPL1蛋白和突变体的示意图。(N)APPL1蛋白质和突变体的示意图。(O)用HA-AURKB和所示的不同APPL1结构域瞬时转染的PC-3U细胞被同步化，并且然后用针对HA的抗体进行免疫沉淀，并使用GFP抗体进行免疫印迹。未转染(NT)。
图2.TβRI在有丝分裂期间与AURKB共定位。
(A、B和D)免疫荧光实验显示在人前列腺癌(PC-3U)(A)细胞和人神经母细胞瘤(KELLY)(B)细胞中有丝分裂期间AURKB(绿色)和TβRI(V22，红色)的共定位，以及TβRI(V22，绿色)和β-微管蛋白(红色)在整个PC-3U有丝分裂过程中的共定位(D)。比例尺，20μm。(C)生存素(绿色)和TβRI(V22，红色)在整个有丝分裂过程中在PC-3U细胞中的定位；(E)在冰上处理PC-3U细胞30min之后，TβRI和AURKB的共定位减少。比例尺，20μm。(F)代表性共聚焦图像，其示出用或未用siRNA敲低TβRI或用或未用TβRI激酶抑制剂SB505124处理的绿色荧光蛋白(GFP)-VPS4A(绿色)和β-微管蛋白(红色)的定位。比例尺，5μm。(G)敲低TGFBR1之后对多核细胞进行计数。数据表示为平均值±SEM，N＝3[学生t检验，*P<0.05]。比例尺，20μm。(H)按照与TGFBR1表达的相关性对基因进行排序的基因集富集分析(GSEA)，产生了34个显著富集的基因集(经调整的p值≤0.05，并且使用Benjamini-Hochberg程序调整p值)。脊线图示出了核心富集基因的相关系数的分布，即对基因集的富集贡献最大的基因。基因集按照归一化的富集评分排序。颜色表示经调整的p值。(I)标志性有丝分裂纺锤体(左)和G2/M检查点(右)基因集的GSEA图示出了它们与TGFBR1相关基因有很强的相关性。上图示出了基因集基因在所有基因的排序列表中的相关系数和位置，并且下图示出了连续的富集评分。(J)PC-3U细胞用或不用SB505124和TGFβ处理30分钟，然后通过免疫印迹分析细胞裂解物。(K)示出AURKB可以磷酸化TβRI的体外激酶测定。(L)PC-3U细胞用针对p-Smad2(红色)和AURKB(绿色)的抗体染色。红色和绿色比例尺，5μm；白色比例尺，20μm。
图3.TRAF6介导AURKB的K63连接的多泛素化，并且AURKB与TβRI之间的共定位取决于TRAF6、和突变体AURKB的特征。
(A-B)PC-3U细胞用或不用TRAF6 siRNA处理，与双胸苷阻断同步，并在不同时间段之后通过免疫印迹(IB)进行分析(A)，用或不用诺考达唑孵育12h(B)。(C)用AURKB抗体对同步的PC-3U细胞的裂解物进行免疫沉淀(IP)，然后用针对TβRI、APPL1和TRAF6的抗体进行免疫印迹。(D(i)和D(ii))使用Flag抗体对用Flag-AURKB和HA标记的野生型(WT)或突变泛素转染的同步的PC-3U细胞的裂解物进行免疫沉淀，然后使用HA抗体进行免疫印迹。箭头指向重免疫球蛋白链。(E)PC-3U细胞与双胸苷阻断同步，释放到含有10％FBS的新鲜培养基中，在指定时间收获，并且然后进行体内泛素化测定。S是饥饿的缩写。(F)使用Flag抗体对用或不用TRAF6 siRNA处理的同步的PC-3U细胞的裂解物进行免疫沉淀，然后使用HA抗体进行免疫印迹。箭头指向重免疫球蛋白链。数据表示为平均值±SEM，N＝3[学生t检验，**P＜0.01]；(G-H)免疫荧光，其示出了当PC-3U和MEF细胞中TRAF6表达减少时，AURKB和TβRI在有丝分裂期间的共定位减少。(I)TRAF6泛素化的共有基序存在于多个物种的AURKB中。相同类型的氨基酸标记为(*)疏水性、(&)极性、(X)任何氨基酸残基。(K)是受体赖氨酸残基。(J((i)和(ii))使用Flag抗体对用HA标记的WT泛素和Flag标记的WT或突变体AURKB转染的同步的PC-3U细胞的裂解物进行免疫沉淀，然后使用HA兔抗体进行免疫印迹。数据表示为平均值±SEM，N＝3[学生t检验，*P＜0.05]。(K)用Flag抗体对用Flag标记的WT和突变体AURKB转染的PC-3U细胞的裂解物进行免疫沉淀，然后用TRAF6抗体进行免疫印迹，如图所示。(L(i)和(ii))用WT或突变型GFP-AURKB转染PC-3U细胞，并且然后用针对H3pS10的抗体进行免疫印迹。数据表示为平均值±SEM，N＝3[学生t检验，**P＜0.01]。(M(i)和(ii))对免疫沉淀的Flag-AURKB或其突变体进行体外激酶测定。如图所示，Flag-AURKB及其突变体的表达和等量负荷是通过Flag免疫沉淀物或总细胞裂解物(TCL)的免疫印迹等分试样来控制的。通过磷光成像仪检测掺入的放射性。用考马斯亮蓝对凝胶进行染色之后检测到的磷酸化蛋白质和总蛋白质的迁移位置如箭头所示(M(i))。使用组蛋白H3作为底物并通过免疫印迹检测H3pS10(M(ii))。(N)PC-3U细胞用WT或突变型GFP-AURKB转染，然后用TβRI(红色)染色。n＝20，N＝3，数据表示为平均值±SEM[学生t检验，**P＜0.01，***P＜0.001]。(O)PC-3U细胞用WT或突变型GFP-AURKB转染，然后用Hoechst 33342染色。N＝3[学生t检验，*P＜0.05]。
图4.AURKB的表达与下列相关：不同癌症的不良预后，和前列腺癌中RB1与AURKB表达之间的关系以及CRPC中APPL1、AURKA与TGFBR1表达之间的相关性，并且AURKB在不同癌症中被泛素化并在前列腺癌中与TβRI形成复合物。
(A(i))在TMA上执行原位PLA，以示出AURKB和Lys63连接的多聚泛素(棕色点)的共定位。(A(ii))在TMA上执行原位PLA，以研究AURKB和K63连接的泛素(棕色点)的共定位。正常前列腺、肾脏和肺的数量分别为22、24和23。前列腺癌、ccRCC和肺腺癌的数量分别为41、38和32。定量示出了平均值±SEM[学生t检验，**P<0.01，***P<0.001]；(B)通过原位PLA确定患者材料(棕色点)的前列腺癌TMA中AURKB与TβRI之间的关联。总共纳入了29名格里森评分的患者和28名高格里森评分的患者。正常前列腺的数量为23。量化示出了平均±值SEM[学生t检验，*P＜0.05，***P＜0.001]。比例尺，50μm。(C)如通过原位PLA测定的正常前列腺组织(棕色点)中AURKB与TβRI之间缺乏关联，作为阴性对照(未添加一抗)。比例尺，50μm。(D(i)和(ii))49个CRPC样品中八个感兴趣基因的表达，其中15个CRPC-NE样品和34个CPPC-Adeno样品，包括原发肿瘤和转移瘤。样品首先按照其亚型进行分组，并且然后按照肿瘤位置进行分组。(D(iii))CRPC-NE和CRPC-Adeno[曼-惠特尼U检验中AURKA和AURKB的表达，***P＜0.001]。(D(iv))AURKB和TGFBR1的表达在CRPC-NE和CRPC-Adeno中均相关。使用皮尔逊相关分析进行数据分析。(D(v))CRPC-NE和CRPC-Adeno中APPL1、AURKA和TGFBR1表达的相关性。使用皮尔逊相关分析进行数据分析。(E)前列腺癌中的RB1突变。(F)针对AURKB和RB1的mRNA在前列腺癌中的表达之间的负相关；呈现了皮尔逊相关系数(r)。数据从cBioPortalTCGA PanCancer Atlas数据库获得。(G)TCGA中AURKB在原发性前列腺肿瘤中的表达在格里森组之间存在差异，[学生t检验，***P＜0.001]。肿瘤基于格里森评分进行分组。(H-J)Kaplan-Meier图示出了AURKB低表达与高表达在前列腺癌、ccRCC或肺腺癌中对患者存活的影响。代表性图像基于TCGA Pan Cancer Atlas数据库的数据从人类蛋白质图谱获得。
图5.APPL1/2、TGFBR1和TRAF6对细胞增殖和存活的影响。
(A)用对照(ctrl)siRNA或No.1APPL1/2siRNA处理PC-3U细胞，并在培养不同天数之后进行MTT测定。(B)对用不同siRNA转染的细胞中的凋亡细胞进行计数。(C-D)PC-3U细胞中沉默APPL1/2基因对EGF刺激的细胞生长的影响(C)，以及用siRNA沉默TRAF6或TGFBR1基因对10％FBS刺激的细胞数量的影响(D)。N＝3，定量示出了平均值±SEM[学生t检验，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001]。
图6.TβRI-ICD信号通路及其参与有丝分裂进展的示意图。
其中TβRI在激活的γ-分泌酶复合物中经历TACE/ADAM17和早老素1进行的蛋白水解裂解的非经典的通路产生细胞内结构域(TβRI-ICD)。TβRI-ICD的核转位需要内体蛋白APPL1/2和完整的微管。在细胞核中，TβRI-ICD与转录共激活因子p300形成复合物，并促进促侵袭基因TGFBR1以及AURKB和BIRC5(编码生存素)的表达。在细胞分裂期间，TβRI-ICD和APPL1与AURKB形成复合物。TRAF6在有丝分裂期间促进AURKB在K85和K87上的K63连接的多泛素化，这与TβRI-ICD一起是正确胞质分裂所必需的。
应当理解，本发明不限于所述特定材料和方法或设备，因为这些可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅仅是为了描述特定的实施例，而不是为了限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求来限定。
应当注意，如本文和所附权利要求中所用，单数形式“一个(a、an和the)”包括复数指代，除非上下文另有明确指示。因此，例如，提及“抗体”是指本领域技术人员已知的一种或多种抗体及其衍生物等。通过“生物标志物”，我们包括以下含义：天然存在的生物分子或其组分或片段，其测量可以提供对癌症的预后和/或诊断有用的信息。例如，生物标志物可以是天然存在的蛋白质或碳水化合物部分或它们的抗原组分或片段。
通过“诊断”，我们包括以下含义：确定疾病状态在个体中的存在或不存在(例如，确定个体是否患有癌症，包括侵袭性癌症)。
术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中的生理病症，其典型特征在于不经调节的细胞生长。癌症的实例包括但不限于癌、前列腺癌、小细胞肺癌、肾癌、子宫内膜癌、卵巢癌、皮肤癌和结直肠癌。等级评分(数字：G1至G4)随着细胞分化的缺乏而增加，它反映了肿瘤细胞与其来源于的正常组织的细胞的差异程度。根据机构和肿瘤类型，肿瘤可以分级为四级、三级或两级。组织学肿瘤分级评分以及转移(全身水平癌症扩散)分期用于评估每个特定的癌症受试者，制定其个体治疗策略并预测其预后。最常用的分级系统是根据美国癌症联合委员会的指南的。根据他们的标准，分级类别如下：GX等级无法评估；G1分化良好(低等级)；G2中分化(中级)；G3低分化(高等级)和G4未分化(高等级)。
术语“赘生物”或“肿瘤”可以互换使用，并且是指异常的组织块，其中该块的生长超过正常组织的生长且与正常组织的生长不协调。赘生物或肿瘤可以根据以下特征被定义为“良性”或“恶性”：细胞分化程度(包括形态和功能)、生长速率、局部侵袭和转移。“良性”肿瘤通常分化良好，特征上比恶性肿瘤生长慢并且仍然局限于起源位点。此外，良性肿瘤不具有浸润、侵入或转移至远处位点的能力。
“恶性”肿瘤通常分化不良(退行性变)，其特征在于快速生长，伴有周围组织的进行性浸润、侵袭和破坏。此外，恶性肿瘤具有转移到远处位点的能力。
术语“前列腺癌”是指给定受试者内的前列腺恶性肿瘤，其中该肿瘤具有上皮起源并且也称为前列腺癌。前列腺癌可以根据其类型、阶段和/或等级来定义。典型的分期系统包括Jewett-Whitmore系统和TNM系统(美国癌症联合委员会和国际抗癌联盟采用的系统)。典型的分级系统是格里森评分，它是基于组织活检切片的病理检查的对肿瘤侵袭性的量度。
格里森系统用于对前列腺癌中的腺癌细胞进行分级。该系统使用范围为2至10的分级评分，但很少使用低于6的评分。前列腺癌的格里森评分是根据其微观外观给出的。格里森评分较高的癌症更具侵袭性，并且预后较差。由于前列腺癌通常具有不同等级的区域，因此将等级分配给构成大部分癌症的两个区域。格里森评分基于两个数字的总和：第一数字是最常见肿瘤模式的等级；第二数字是第二最常见模式的等级。病理学家检查活检切片标本并尝试对这两种模式给出最终的格里森评分。格里森评分为6或更低的癌症可以称为高分化或低等级癌症。格里森评分为7的癌症可以称为中分化或中间等级。格里森评分为8至10的癌症可以称为低分化或高等级癌症。
术语“前列腺癌”当无限定地使用时，包括局部前列腺癌和转移性前列腺癌。术语“前列腺癌”可以用术语“局部”或“转移”来限定，以区分不同类型的肿瘤，如这些词在本文中所定义的。术语“前列腺癌”和“前列腺恶性疾病”在本文中可互换使用。
术语“分化”是指实质细胞在形态上和功能上类似于可比较的正常细胞的程度。
术语“转移”是指癌细胞从原发性(原始)肿瘤扩散或迁移至另一器官或组织，并且通常可通过原发性(原始)肿瘤组织类型的“继发性肿瘤”或“继发性细胞团”而不是继发性(转移性)肿瘤所在的器官或组织的“继发性肿瘤”或“继发性细胞团”的存在来识别。例如，已经迁移到骨的前列腺癌所述被称为转移性前列腺癌，并且由前列腺中的癌性前列腺癌细胞以及骨组织中生长的癌性前列腺癌细胞组成。
术语“前列腺非恶性疾病”、“非前列腺癌状态”和“良性前列腺疾病”可以互换使用，并且是指根据具体诊断方法尚未被分类为前列腺癌的前列腺疾病状态，该诊断方法包括但不限于直肠心悸、PSA评分、经直肠超声检查和组织活检切片。此类疾病包括但不限于前列腺组织炎症(即慢性细菌性前列腺炎、急性细菌性前列腺炎、慢性非细菌性前列腺炎)和良性前列腺增生。
术语“健康”是指不存在任何恶性或非恶性疾病；因此，“健康个体”可能患有正常情况下不被视为“健康”的其他疾病或病症。“健康”个体表现出不存在任何恶性或非恶性疾病。
在前列腺癌的上下文中，术语“健康”是指不存在任何恶性或非恶性前列腺疾病；因此，“健康个体”可能患有正常情况下不被视为“健康”的其他疾病或病症。“健康”个体表现出不存在任何恶性或非恶性前列腺疾病。
“细胞分裂”包括细胞分裂的物理过程的含义，在该过程期间亲本真核细胞的细胞质分裂成两个子细胞。它与动物细胞中发生的两种类型的核分裂(称为有丝分裂和减数分裂)同时发生。有丝分裂导致单个细胞内包含两个独立的细胞核。胞质分裂执行将细胞分成两半并确保每个子细胞中都有一个细胞核的重要过程。胞质分裂在称为后期的核分裂阶段期间开始，并持续到末期。细胞赤道周围质膜正下方形成一圈称为收缩环的蛋白质丝环。收缩环在细胞赤道处收缩，从而向内挤压质膜，并形成所谓的卵裂沟。最终，收缩环收缩到存在两个独立细胞的点，每个细胞都被自己的质膜结合在一起。脱落，即连接两个新生成的细胞的膜被切断，导致兄弟姐妹物理分离的过程，得出胞质分裂的结论。
通过“中间体”，我们包括以下含义：在胞质分裂结束时连接两个子细胞的瞬时结构，其中主要功能是定位分离的位点，该位点在物理上分离两个子细胞。中间体由中间区形成，中间区是双极微管阵列，在后期期间在分离的姐妹染色单体之间组装。卵裂沟形成之后，中央纺锤体中区重建以形成中间体。中间体提供了用于招募和组织调节两个子细胞分离的关键蛋白质的重要平台。中区向中间体的转化与沟侵入呈正相关。
术语“共定位”包括以下含义：两个或更多个分子/蛋白质/化合物/生物标志物在同一细胞位置(例如，中间体)处存在。如本文所使用的术语“相关”和“共定位”包括以下含义：这些分子/化合物/蛋白质/生物标志物化合物在空间上和时间上定位于细胞的相同区域，但不一定处于其中每个组分直接相互作用的复合物中。
生物标志物在胞质分裂结构中的共定位可以通过本领域已知的方法确定，并且包括本文所述的那些。
术语“存在”、“表达”、“水平”、“量”和“表达水平”可以涉及核酸分子(诸如DNA和mRNA)和/或确定的生物分子的蛋白质(诸如，例如，APPL1、AURKB、TβRI、TβRI-ICD和TRAF6)的量。AURKB也可以被泛素化。每个生物分子的水平在细胞中的特定和预定位点(诸如，例如，细胞核、细胞质、细胞膜、胞质分裂结构等)处确定。
AURKB可以是不被泛素化、被泛素化、被多泛素化。
术语“事件”是指治疗方法的任何变化，诸如开始、改变药物和完成治疗。生物标志物(即共定位于胞质分裂结构中的极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)、TGFβ1型受体(TβR1)和TNF受体相关因子6(TRAF6))的水平的变化提供关于涉及转化生长因子βI型受体(TβRI)异常裂解的疾病或病症或对所述相关疾病或病症的治疗的信息。
在本说明书中，使用与TGFβ1型受体(TβR1-ICD)的细胞内结构域结合(用于检测和/或可视化)的抗体(V22)。然而，即使在样品中检测到并可视化TβR1-ICD(约34kDa)，这并不意味着仅存在该结构域，其可，但V22也可以与完整的全长蛋白质(55.96kDa)结合，因此也被V22识别。为了评估是否仅存在ICD或例如全长蛋白质，可以例如确定相应的分子量。
这意味着作为生物标志物的术语“TGFβ1型受体(TβR1)”在一些实施例中可以指细胞内结构域(TβR1-ICD)。
参考值是指表示各个生物标志物(诸如APPL1、AURKB、TβRI、TβRI-ICD和TRAF6)在生物样品中的表达水平(诸如量(例如mRNA或蛋白质)或强度(例如免疫荧光和其他成像方法、蛋白质印迹))的值。样品可以是取自良性或恶性实体瘤的活检切片，用于定义用作参考点的起始/参考值t0，并检测时间和/或例如药物、剂量、时间、药物添加(和组合)等的变化如何正向或负向影响参考值t1、2、3等。非癌组织的参考值为0，即标志物(APPL1、AURKB、TβRI和TRAF6)在胞质分裂期间不共定位。术语抑制剂或阻断剂是指与蛋白质/酶结合并因此降低蛋白质/酶活性或物理阻断蛋白质、膜、细胞等上的位点从而在空间上阻碍其他试剂到达该位点的试剂或化合物。
本发明提供了可靠的生物标志物，用于选择/分类患有与非经典的TGFβ诱导的信号通路(该信号通路涉及转化生长因子βI型受体(TβRI)的裂解)相关的癌症的受试者、预测对治疗的反应、监测用TβRI裂解抑制剂/阻断剂进行治疗的结果，为成功的癌症治疗提供了宝贵的工具。
此外，本发明还响应了未满足的针对识别侵袭性癌症生长并从而在疾病的早期阶段预防转移的高医疗需求。
材料和方法
细胞培养
购自Sigma(RRID:CVCL_2092)的人前列腺癌细胞系PC-3U(RRID:CVCL_0482)和人神经母细胞瘤细胞系KELLY在补充有10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺和100单位/ml青霉素以及0.1mg/ml链霉素的RPMI-1640中生长。永生化野生型小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)或缺乏TRAF6的MEF(来自Jun-ichiro Inoue)在含有10％FBS、4mM L-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基中生长。对于TGFβ刺激实验，在含有1％FBS的培养基中制备TGFβ(5ng/mL)，并将其添加到在补充有1％FBS的RPMI培养基中已经饥饿18h的细胞中。根据制造商的说明，用FuGENE HD(Roche)进行瞬时转染。细胞系已经通过IDEXX BioAnalytics验证。
用于免疫印迹的抗体和实际
针对以下蛋白质的抗体用于免疫印迹：APPL1(Cell Signaling Technology目录号3858，RRID：AB_2056989)、p-极光激酶(AURKA中的Thr288；AURKB中的Thr232；AURKC中的Thr198；蛋白质的分子量分别为48kDa、40kDa和35kDa)(Cell Signaling Technology目录号2914，RRID：AB_2061631)、细胞周期蛋白B1(Cell Signaling Technology目录号4135，RRID：AB_2233956)、HA(Cell Signaling Technology目录号3724，RRID：AB_1549585和CellSignaling Technology目录号2367，RRID：AB_10691311)、GFP(Cell SignalingTechnology目录号2956，RRID：AB_1196615)、GAPDH(Cell Signaling Technology目录号5174，RRID：AB_10622025)、p38(Cell Signaling Technology目录号8690，RRID：AB_10999090)、生存素(Cell Signaling Technology目录号2808，RRID：AB_2063948)、APPL2(Santa Cruz Biotechnology目录号sc-67403，RRID：AB_2056383)、AURKB(Abcam目录号ab2254，RRID：AB_302923)、TRAF6(Abcam目录号ab40675，RRID：AB_778573)、Flag(Sigma-Aldrich目录号F9291，RRID：AB_439698)、β-肌动蛋白(Sigma-Aldrich目录号A5441，RRID：AB_476744)、β-微管蛋白(Sigma-Aldrich目录号T0198，RRID：AB_477556和Cell SignalingTechnology目录号2146，RRID：AB_2210545)、H3pS10(Millipore目录号06-570，RRID：AB_310177)和TβRI(V22；Santa Cruz Biotechnology目录号sc-398，RRID：AB_632493；该抗体特异性识别TβRI的ICD，如前13所述)。辣根过氧化物酶偶联二抗购自Dako，并且蛋白质G琼脂糖和ECL免疫印迹检测试剂购自GE Healthcare。Pefabloc购自Roche，PageRuler预染蛋白梯购自Thermo Fisher Scientific。
蛋白质分析
细胞用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次，并在冰冷的裂解缓冲液[150mMNaCl、50mM Tris、pH 8.0、0.5％(v/v)脱氧胆酸盐、1％(v/v)NP40、10％(v/v)甘油和蛋白酶抑制剂]中裂解。离心之后，收集上清液，并使用BCA蛋白质测定试剂盒(ThermoFisherScientific)测定蛋白质浓度。来自每个总细胞裂解物的等量蛋白质用于免疫沉淀。免疫沉淀蛋白通过十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺电泳(PAGE)在Mini-PROTEAN TGX凝胶(Bio-Rad)上印迹到硝酸纤维素膜上进行解析，并如先前所述进行免疫印迹(Song J、Mu Y、Li C、Bergh A、Miaczynska M、Heldin C-H等人.APPL proteins promote TGFβ-inducednuclear transport of the TGFβtype I receptor intracellulardomain.Oncotarget.2016；7:279–92)。
体内泛素化检测
PC-3U细胞在冰冷的PBS中洗涤一次，在1ml冰冷的PBS中进行收集，并且然后在4℃以300×g离心5min。在新鲜制备的1％SDS的PBS中并通过煮沸10min使非共价蛋白质相互作用解离。将样品在1.5ml裂解缓冲液中稀释，该缓冲液含有0.5％NP-40和蛋白酶抑制剂的PBS溶液。如先前所述，对样品进行免疫沉淀，然后进行免疫印迹(Hamidi A、Song J、ThakurN等人.TGF-βpromotes PI3K-AKT signaling and prostate cancer cell migrationthrough the TRAF6-mediated ubiquitylation of p85α.Sci Signal 2017；10:eaal4186)。
免疫荧光和显微镜图像采集
针对以下蛋白质的其他一抗用于免疫荧光实验：AURKB(Novus，目录号NBP2-50039，RRID：AB_2895237)和p-Smad2(Cell Signaling Technology目录号3108，RRID：AB_490941)。二抗是：驴抗兔Alexa Fluor 555(Thermo Fisher Scientific目录号A-31572，RRID：AB_162543)、驴抗小鼠Alexa Fluor 555(Thermo Fisher Scientific目录号A-31570，RID：AB_2536180)和山羊抗小鼠Alexa Fluor 488(Thermo Fisher Scientific目录号A-11029，RRID：AB_2534088)和山羊抗兔Alexa Fluor 488(Thermo Fisher Scientific目录号A32731，RRID：AB_2633280)。如先前所述进行免疫荧光测定(Song J等人.Oncotarget2016:7:279-292)。简而言之，将细胞铺在盖玻片上，在4％多聚甲醛中固定30min，并且然后用0.2％Triton X-100的PBS溶液处理5min，并用10mM甘氨酸封闭。在室温下与一抗孵育1h，然后在PBS中洗涤并与二抗孵育。使用具有63×/1.4NA物镜(Carl Zeiss)的共焦显微镜LSM 710(Carl Zeiss)获得显微照片。使用Zen 2011软件在室温油浸下获取图像。
质粒和定点诱变
pCR3-Flag-AURKB K106R激酶死亡(KD)是来自Susanne Lens(Addgene质粒#108488；http://n2t.net/addgene:108488；RRID：Addgene_108488)44的善意礼物，并且用于上下文优化并生成通过QuickChange Lightning多位点定点诱变试剂盒(AgilentTechnologies)表达Flag标记的野生型AURKB蛋白的构建体。用于诱变的引物是oJS5、oJS8、oJS17和oJS18(表2)。分别使用oligo oJS9、oJS10和oJS11通过PCR诱变产生表达改变的Flag-AURKB(即K85R、K87R和K85R/K87R双突变体)的质粒。使用pEGFP-AURKB K106R(KD)作为模板用于诱变，采用类似的方法构建表达与野生型AURKB融合的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)以及K85R、K87R和K85R/K87R突变体的质粒(Addgene质粒#108493；http://n2t.net/addgene:108493；RRID：Addgene_108493)。44通过各个质粒的DNA测序证实了标签的整合和AURKB序列的改变。
携带6His-APPL1和6His-APPL2(购自Thermo Fisher Scientific)的质粒被用作模板用于诱变，以生成产生能够耐受siRNA诱导的基因沉默的转录物的构建体。APPL1的siRNA抗性构建体的序列是5'-AGAGAGATGGATTCAGACATA-3'(SEQ ID NO:3)，并且APPL2的siRNA抗性构建体的序列是5'-CAGATTTATCTCACAGATAAC-3'(SEQ ID NO:4)。通过DNA测序证实了APPL1和APPL2序列的改变。YFP-APPL1-ΔN和GFP-APPL1-ΔC是来自MartaMiaczynska45的善意礼物。pEGFPC1-人APPL1是来自Pietro De Camilli(Addgene质粒#22198；http://n2t.net/addgene:22198；RRID：Addgene_22198)46的礼物，并且用于通过QuickChange Lightning多位点定点诱变试剂盒(Agilent Technologies)生成分别包含BAR结构域、PH结构域和PTB结构域的构建体。用于诱变的引物是oYZ86、oYZ87、oYZ88、oYZ91和oYZ92(表2)。APPL1序列的改变通过单个质粒的DNA测序得到证实。
表2.示出了本研究中用于生成AURKB和APPL1质粒的引物。
siRNA转染
在TARGET上加上APPL1(No.1：靶序列，5′-GGAAAUGGACAGUGAUAUA-3′(SEQ ID NO:17)；No.2：靶序列，5′-GAUCUGAGUCUACAAAUUU-3′)(SEQ ID NO:18)、APPL2(No.1：靶序列，5′-AGAUCUACCUGACCGACAA-3′(SEQ ID NO:19)；No.2：靶序列，5′-GCGGAAAAGAUGCGGGUGU-3′)(SEQ ID NO:20)，TβRI siRNA(靶序列，5'-CAUAUUGCUGCAACCAGGA-3'(SEQ ID NO:21))、SMART pool TRAF6 siRNA和siGENOME非靶向对照siRNA#1(靶序列，5′-UAGCGACUAAACACAUCAA-3'(SEQ ID NO:22))从Dharmacon Research获得。根据制造商的方案，使用Oligofectamine转染试剂(ThermoFisher Scientific)将siRNA转染至细胞中。
总RNA提取和微阵列测定
敲低APPL1和APPL2之后，使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)从PC-3U细胞中提取总RNA。RNA纯度和完整性用Agilent RNA 6000纳米试剂盒和Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies)进行评估。总RNA(500ng)用于使用针对Illumina表达谱微珠芯片(Epicenter)的TargetAmpTM纳米标记试剂盒按照制造商的方案来生成生物素标记的反义RNA靶标。RNA(750ng)与Illumina人HT-12微珠芯片阵列杂交17h。根据制造商的说明清洗芯片并用Cy3-链霉亲和素染色。使用iScan系统(Illumina)获取图像数据。使用GenomeStudio和DAVID生物信息资源6.7分析微阵列数据，并通过qRT-PCR进行验证。
体外激酶测定
对于体外激酶测定，使用HD(Promega)用Flag标记的AURKB或其突变体K85R、K87R和K85/87R的载体或对照空pcDNA3载体转染HEK293T细胞。在RIPA裂解缓冲液(150mM NaCl、0.1％Triton X-100、0.5％脱氧胆酸钠、0.1％SDS、50mM Tris-HCl、pH 8.0、蛋白酶抑制剂(Roche))中提取蛋白质，并用抗Flag抗体进行免疫沉淀(Sigma-Aldrich目录号F1804，RRID：AB_262044)和蛋白G琼脂糖凝胶(Invitrogen)。将珠子在RIPA缓冲液中洗涤四次，并在激酶缓冲液(15mM MOPS、pH 7.2、7.5mM 2-磷酸甘油、15mM MgCl2、3mM EGTA、0.15mM二硫苏糖醇)中平衡。
通过添加底物、组蛋白H3(1μg)和ATP来引发磷酸化反应。在非放射性激酶测定中，ATP浓度为0.5mM，而在用0.5μCi[γ-32P]ATP(Perkin Elmer)的测定中，ATP浓度为5 μM。对于SDS-PAGE上的分析，通过添加五分之一体积的6x SDS样品缓冲液来停止反应，在96℃加热5min，并应用于SDS-PAGE上。
用抗磷酸组蛋白H3(Ser10)抗体(Millipore目录号06-570，RRID：AB_310177)通过免疫印迹检测组蛋白H3的磷酸化。通过用抗组蛋白H3抗体(Cell Signaling Technology目录号4499，RRID：AB_10544537)和抗Flag抗体(Sigma-Aldrich目录号F1804，RRID：AB_262044)对膜进行免疫印迹来控制等量表达和负荷。
对细胞数量和死亡的评估
使用来自Roche的细胞增殖试剂盒I(MTT)或来自Thermo Fisher Scientific的自动细胞计数器CountessTM测量细胞数。在用TaliTM细胞凋亡试剂盒(ThermoFisherScientific)进行染色之后，使用ArthurTM分析细胞凋亡。
原位邻近连接分析(PLA)
对于PLA明场，首先将前列腺癌组织微阵列(TMA；BioCat)脱蜡，并且然后进行抗原修复和透化。使用针对AURKB的抗体(Novus Biologicals目录号NBP2-50039，RRID：AB_2895237)、K63连接的多聚泛素(Abcam目录号ab179434，RRID：AB_2895239)和TβRI(V22，Santa Cruz Biotechnology目录号sc-398，RRID：AB_632493)与用于明场的Duolink检测(Sigma)进行PLA。用Pannoramic 250Flash采集图像，并使用Duolink图像工具软件分析PLA信号。
生物信息学
通过使用TCGA PRAD队列的log2 CPM归一化表达数据计算皮尔森相关系数来识别前列腺癌中与TGFβR1相关的基因。所有基因均按其与TGFBR1的相关性进行排序，并且使用具有分子特征数据库(MSigDB)的Hallmark基因集的R包clusterProfiler47进行基因集富集分析(GSEA)48。34个基因集以经调整的p值为0.05或以下进行富集。
使用Genomic Data Commons49和R包TCGAbiolinks50 v.2.16.4下载来自癌症基因组图谱的RNA-seq表达数据和临床元数据。每个前列腺肿瘤的初级和次级格里森等级均从文件PRAD_clindata.xls中获得。肿瘤基于格里森评分进行分组。使用R包ggpubr51绘制每个格里森组的每个感兴趣基因的log2 CPM(每百万计数)归一化表达值。使用t检验计算表达差异的统计显著性。
针对来自已发表研究中49个去势抵抗性前列腺癌(CRPC)样品的样品的RNA-seq表达数据和拷贝数数据52从cBio癌症基因组学门户网站(http://cbioportal.org)下载。临床数据从文件data_clinical_sample.txt获得，并且表达数据从data_RNA_Seq_expression_median.txt获得，以及拷贝数数据从data_log2CNA.txt获得。使用R,v.4.0.253读取数据并进行所有进一步分析。对表达数据进行log2转换，并绘制行归一化热图，其中样品按亚型和肿瘤位置进行排序，基因按其表达谱分层聚类。RB1拷贝数状态被定义为0.4或以上的RB1log2拷贝数值的增益，为-0.4或以下的值的损失，否则为拷贝中性。针对三个腺癌样品，拷贝数数据不可用。神经内分泌与腺癌CRPC组中感兴趣基因的表达差异以及曼-惠特尼U检验p值用通过R包ggpubr51的ggboxplot函数生成的箱线图进行可视化。在神经内分泌CRPC样品和腺癌CRPC样品内计算TGFBR1与其他基因表达之间的皮尔森相关性。
统计分析
学生t检验或曼-惠特尼U检验用于分析两个独立组之间的差异，如图例所示。值表示为至少三个独立实验的平均值±平均值的标准误差(SEM)或±标准偏差(SD)。P值小于0.05被认为在统计学上是显著的。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
实例
实例1.APPL蛋白质调节参与增殖和细胞凋亡的基因
本发明人发现，内体衔接蛋白与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)和APPL2是TβRI-ICD响应细胞的TGFβ刺激而进行核积累所必需的16。为了研究核TβRI-ICD-APPL1复合物的靶基因，本发明人执行了微阵列分析以评估敲低APPL1/2对基因表达的影响(表1和图1a)。
在APPL1/2敲低细胞中的受影响基因中，观察到编码参与细胞增殖和细胞凋亡的蛋白质的基因表达降低，即CPC的成分[AURKB、生存素(由BIRC5编码)和borealin(由CDCA8编码)]以及它们的下游底物、有丝分裂着丝粒相关驱动蛋白(由KIF2C编码)(表1和图1a)33,34,54。没有观察到对INCENP表达的影响。
表1.siControl与siAPPL1+2中的经调节的基因
本发明人使用定量实时PCR(qRT-PCR)验证了微阵列数据。具体地，证实了转染两种不同APPL1/2小干扰(si)RNA的细胞中AURKB、BIRC5、CDCA8和KIF2C的表达降低(图1B(i)、图1B(ii)、图1B(iii)和图1B(iv))。来自siRNA抗性构建体的野生型APPL1/2蛋白的重新表达在显著的程度上克服了APPL1/2siRNA的抑制(图1B)。
由于AURKB在CPC复合物中发挥作用，我们测定了在10％FBS中生长的或如下所述的细胞的有丝分裂期间蛋白质水平和蛋白质与蛋白质相互作用。使用免疫印迹，观察到APPL1/2敲低细胞中AURKB和生存素蛋白水平降低(图1C(i))。为了检查AURKB表达水平是否与APPL1/2蛋白相关，使用双胸苷阻断同步PC-3U细胞，并且然后将其释放到含有10％FBS的正常培养基中以跟踪细胞周期进展。当用APPL1/2siRNA处理细胞时，AURKB的表达和其底物组蛋白H3在Ser10(H3pS10)处的的磷酸化在细胞周期中明显降低(图1C(ii))。沉默APPL1/2的表达之后，细胞周期蛋白B1和TβRI的表达明显降低(图1C(ii))。用APPL1/2siRNA处理的细胞中TβRI表达减少与之前的报道(即核TβRI-ICD促进其自身表达)一致14,55。为了证实这些发现，通过诺考达唑处理而停滞在G2/M期的细胞也显示出AURKB和H3pS10的水平降低(图1F)。有趣的是，使用免疫荧光显微镜和z堆栈成像分析，观察到APPL1与AURKB在细胞因子结构(例如，中间体)中共定位(图1E至图1K)。此外，免疫共沉淀测定显示APPL1以TGFβ依赖性方式与生存素形成复合物，在48h达到峰值(图1L)。
本发明人先前报道APPL1是TβRI-ICD进行核积累所必需的并且APPL1的C末端部分与TβRI结合16。基于这些发现，本发明人研究了APPL1的N末端和C末端缺失对AURKB的水平的影响。事实上，C末端缺失APPL1突变体的表达抑制了AURKB的水平，而N末端缺失突变体则没有这种效果(图1M)。此外，通过免疫共沉淀实验，我们发现AURKB与APPL1的所有三个结构域相关，包括BAR结构域、PH结构域和PTB结构域(图1N至图1O)。45,56总而言之，这些数据支持这样的观点：APPL1与AURKB的表达相关并调节AURKB的表达，并且依赖于核TβRI-ICD的TGFBR1的表达14,55具有细胞周期依赖性。
实例2.TβRI在有丝分裂期间的细胞分裂结构中与AURKB相关
本发明人观察到APPL1与AURKB相互作用(图1E至图1K和图1O)并与TβRI形成复合物。由于TβRI的表达具有细胞周期依赖性，因此研究了TβRI是否也与有丝分裂和胞质分裂期间的CPC相关。在PC-3U前列腺癌细胞和KELLY神经母细胞瘤细胞中执行的免疫染色实验表明，TβRI与AURKB在细胞因子结构(中区以及中间体)中共定位(图2A和图2B)。在末期期间在TβRI和生存素之间检测到部分共定位(图2C)，并且TβRI和β-微管蛋白在细胞因子结构(中间体)中明显共定位(图2D)。
据报道，APPL1经由微管将TβRI-ICD从核内体转运至细胞核。因此，研究了完整的微管对于TβRI定位是否重要；当微管通过冷处理解聚时，在细胞因子结构中没有看到AURKB和TβRI之间的相互作用(图2E)。动态微管对于AURKB在后期期间的定位也很重要，这与先前的报告一致58。值得注意的是，沉默TβRI的表达导致约42％的胞质分裂细胞异常脱落，但SB505124对TβRI的激酶活性的抑制并不影响脱落(图2F)。此外，敲低TβRI导致多核化(图2G)，进一步支持TβRI在细胞分裂期间发挥重要功能的可能性。此外，TβRI(TGFBR1的表达)与前列腺癌中的有丝分裂纺锤体和G2/M检查点基因集密切相关(图2H、图2I)。
没有发现p-Smad2定位于中间体(图2L)，表明经典的TGFβ信号通路在那里不活跃。总而言之，这些结果表明TβRI和AURKB在中间体中共定位，并且这种共定位依赖于完整的微管细胞骨架。
还观察到SB505124对TβRI的激酶活性的抑制抑制了AURKB磷酸化(图2L、图2J)，表明TβRI激酶活性对于AURKB活性很重要。相反，在体外激酶测定中观察到His-AURKB磷酸化谷胱甘肽-S-转移酶(GST)-TβRI(图2K)。在细胞因子结构(例如，中间体)中没有发现任何pSmad2定位(图2L)，表明经典的TGFβ信号通路在那里不活跃。总而言之，这些结果表明TβRI和AURKB在细胞因子结构(例如，中间体)中共定位，并且这种共定位取决于完整的微管细胞骨架。
实例3.TRAF6促进AURKB在Lys85和Lys87上的多泛素化
接下来，研究了泛素E3连接酶TRAF6对AURKB表达的作用。观察到通过siRNA敲除TRAF6导致H3pS10和AURKB两者在细胞周期期间的表达降低，如免疫印迹所证明(图3A、图3B)。通过免疫共沉淀测定，发现AURKB与TβRI、APPL1和TRAF6相关(沉淀)(图3C)。
据报道，AURKB经历了泛素化，这对于其从着丝粒到微管的重新定位59以及参与染色质解凝和核膜形成60非常重要。本发明人发现，当PC-3U细胞在有丝分裂中停滞时，AURKB经历Lys48连接(K48连接)和Lys63连接(K63连接)的多泛素化(图3D(i)和3D(ii))两者。本发明人还研究了TRAF6在从双胸苷阻断释放之后在有丝分裂进展期间是否可以被自动泛素化和激活。在PC-3U细胞从双胸苷阻断释放之后10-12h，即AURKB活跃时，内源TRAF6被自动泛素化(图3E)，这与TRAF6的自动泛素化使其催化活性得以实现的当前知识一致62。PC-3U细胞中siRNA对TRAF6的敲低抑制了AURKB的多泛素化(图3F)。免疫染色还显示，在PC-3U和MEF细胞系两者中，内源TβRI以TRAF6依赖性方式与AURKB共定位(图3G、图3H)。
TRAF6泛素化的共有模式，即-(疏水性)-K-(疏水性)-X-X-(疏水性)-(极性)-(疏水性)-(极性)-(疏水性)，其中K是被泛素化位点，并且X是在AURKB(84GKGKFGNVYL)(SEQ IDNO:23)中发现的任何其他氨基酸63，并且在不同物种之间是保守的(图3I)。为了研究AURKB中的K85和/或K87是否被泛素化以及其(一个或多个)功能后果(如果被泛素化)，本发明人产生了突变体，其中Lys85和/或Lys87突变为精氨酸残基，本发明人能够表明在这些突变体中，AURKB的泛素化确实降低了(图3J(i)和图3J(ii))。如通过免疫共沉淀测定确定，和与野生型AURKB的相互作用相比，TRAF6与AURKB突变体K85、K85/K87以及至较小程度的K87之间的相互作用也有所减少(图3K)。此外，在过表达AURKB K85/87R双突变体的细胞中，AURKB对H3在S10处的磷酸化降低(图3L(i)和3L(ii))，表明AURKB的泛素化影响其激酶活性。由于K85和K87位于AURKB的结合ATP的富含甘氨酸的环中，所以本发明人在体外激酶测定中研究了AURKB突变体。发现单突变体和双K85/87R突变体都掺入了放射性磷酸盐(图2M(i))，证明了这些突变不会干扰ATP的结合。为了研究AURKB突变体是否在激酶活性方面存在内在缺陷，使用重组组蛋白H3作为底物进行了体外激酶测定。所有AURKB野生型和突变体，除了作为实验对照的激酶死亡K106R之外，都可以在Ser10处磷酸化组蛋白H3，从而证明了AURKB突变体的保守的内在活性(图3M(ii))。
有趣的是，当细胞过表达AURKB突变体时，TβRI并未定位到细胞因子结构(图3N)，表明AURKB的泛素化对于在细胞因子结构(中间体)中招募TβRI是必需的。与野生型相比，双AURKB突变体(K85/87R)表达细胞显示出较少的4N DNA含量，从而支持AURKB在细胞的复制期间在K85和K87上多泛素化的生物学相关性(图3O)。总体而言，这些结果支持这样的观点：TRAF6在有丝分裂期间被自动泛素化，并且AURKB的在K85/K87上由TRAF6介导的泛素化有助于其活性并控制细胞分裂期间TβRI在细胞因子结构中的定位。
实例4.AURKB的表达和AURKB-TβRI复合物的形成与多种肿瘤类型的不良预后相关
值得注意的是，AURKB mRNA的高表达还与前列腺癌、ccRCC和肺腺癌的不良预后相关(图4H、图4I、图4J)。AURKB表达与前列腺癌的恶性程度相关，如基于前列腺癌样品的组织病理学评分通过格里森评分确定(较高的格里森评分表明更具侵袭性的疾病)(图4G)。
为了研究AURKB和TβRI对癌症进展的重要性，本发明人接下来确定了它们在临床来源的样品中的活性、表达和复合物形成。通过使用原位邻近连接测定(PLA)，研究了AURKB的Lys63连接的K63连接的多聚泛素化是否可以在来自患有前列腺癌、透明细胞肾癌(ccRCC)或肺癌(腺癌)患者的组织中被可视化。与相应的正常组织相比，他们在所有三种癌症类型中观察到大量Lys63连接的多聚泛素化AURKB分子(图4A(i)和图4A(ii))。此外，通过原位PLA，与来自患有较低侵袭性疾病的患者的切片相比，他们还在来自患有侵袭性前列腺癌的患者的切片中发现了显著更高数量的AURKB和TβRI复合物(图4B)，而在正常前列腺组织中几乎没有观察到任何信号(图4C)。
为了进一步研究不同前列腺癌类型中感兴趣基因的表达，使用公共数据库进行生物信息学分析(图4D(i)至图4D(v))。AURKA和AURKB两者在CRPC-神经内分泌(CRPC-NE)中的表达高于在CRPC-腺癌(CRPC-Adeno)中的表达，这与CRPC-NE患者具有不良预后的观察结果一致(图4D(iii))。此外，AURKB的表达与TGFBR1在CRPC-NE和CRPC-Adeno两者中的表达相关(图4D(iv))。还示出了TGFBR1、AURKA、AURKB、TRAF6、VPS4A/B和APPL1/2在CRPC-NE和CRPC-Adeno(包括原发肿瘤和转移瘤)两者中的相对表达(图4D(i)和图4D(ii))。有趣的是，APPL1和AURKA的表达在CRPC-NE中与TGFBR1相关，但在CRPC-Adeno中不相关(图S4D(v))。
据报道，在几种肺癌和乳腺癌细胞系中，RB1的缺失使细胞过度依赖AURKB来存活65。因此，本发明人研究了RB1和AURKB在前列腺癌组织中的表达。本发明人发现，RB1在10％的前列腺癌中缺失(图4E)，并且有趣的是，AURKB的表达在前列腺癌中与RB1呈负相关(图4F)，包括在神经内分泌前列腺癌中(图4D(iv))。AURKA和AURKB两者在CRPC-神经内分泌(CRPC-NE)中的表达高于在CRPC-腺癌(CRPC-Adeno)中的表达，这与CRPC-NE患者具有不良预后的观察结果一致(图4D(iii))。此外，AURKB的表达与TGFBR1在CRPC-NE和CRPC-Adeno两者中的表达相关(图4D(iii))。还示出了TGFBR1、AURKA、AURKB、TRAF6、VPS4A/B和APPL1/2在CRPC-NE和CRPC-Adeno(包括原发肿瘤和转移瘤)两者中的相对表达(图D(i)和图D(ii))。有趣的是，APPL1和AURKA的表达在CRPC-NE中与TGFBR1相关，但在CRPC-Adeno中不相关(图4D(v))。
实例5.APPL蛋白质、TβRI和TRAF6影响细胞生长和存活
TβRI与在细胞增殖和存活中发挥作用的内吞衔接蛋白APPL1相关。由于APPL1和TβRI之间的相互作用在癌症进展期间很重要，因此研究了APPL蛋白质是否影响PC-3U细胞的增殖或存活。出于这个目的，使用了测量相对细胞数量的MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑)测定。结果显示APPL1/2的敲低导致细胞数量减少，表明APPL1/2是细胞增殖或存活(活力)所必需的(图5A)。
为了进一步研究APPL1/2在细胞存活中的可能作用，对凋亡细胞进行了定量，发现TβRI和APPL1/2敲低细胞培养物中的凋亡细胞多于对照组(图5B)。为了进行比较，研究了APPL1/2在对表皮生长因子(EGF)的细胞反应中的作用，该表皮生长因子促进细胞增殖并促进APPL蛋白质的核转位45。与用EGF处理的PC-3U对照细胞相比，用siRNA敲低APPL1/2导致细胞数量减少(图5C)，表明APPL蛋白质对于EGF刺激的细胞的增殖或存活很重要，这与在前列腺癌的发生和进展期间APPL1基因表达和蛋白质表达增加的观察结果一致。还观察到PC-3U细胞的TRAF6和TβRI敲低培养物中细胞数量减少，表明TRAF6和TβRI是细胞增殖或存活所必需的(图5D)。
总之，本发明人提供了一种用于识别患有与非经典的TGFβ诱导的信号通路相关的癌症类型的患者的方法，该信号通路涉及转化生长因子βI型受体(TβRI)的裂解。
讨论
本发明人先前已经识别了一种癌症特异性信号通路，其中TβRI以TRAF6依赖性方式经历蛋白水解裂解，产生TβRI-ICD，当TβRI在残基K178上被TRAF6多泛素化时，该TβRI-ICD进入细胞核13-15。他们还报道称，APPL1通过经由C末端与TβRI-ICD相互作用，并且复合物以TRAF6依赖性方式经由微管运输至细胞核16。一旦进入细胞核，TβRI-ICD通过与TRI和其他基因的启动子区域结合来诱导TβRI和其他基因的表达14。
在此，AURKB被识别为体外CRPC细胞中针对APPL1/APPL2依赖性通路的靶基因。发现TRAF6在有丝分裂进展期间在CRPC细胞中被自动泛素化，并通过AURKB的保守的富含甘氨酸部分中K85/K87上的K63连接的多泛素化来促进AURKB激酶活性。此外，本发明人惊奇地发现，APPL1和TβRI-ICD在有丝分裂和胞质分裂期间在CRPC细胞中与AURKB形成复合物。此外，敲低APPL1、TRAF6或TGFBR1抑制CRPC细胞的增殖或存活，表明它们是CRPC体外生长所必需的。
有丝分裂是极其复杂且高度受控的生物过程，其中极光激酶家族的成员已经被证明是染色体分离所必需的41,75,76。不受理论的束缚，本发明人假设TβRI-ICD与AURKB一起作用以TRAF6依赖性方式参与有丝分裂和胞质分裂的调节，涉及AURKB在K85和K87上的多泛素化。K85和K87的双重突变抑制了AURKB的激酶活性，表明这些残基的泛素化有助于其激酶活性。然而，两个赖氨酸残基的突变并不能阻止AURKB的自身磷酸化。这些赖氨酸残基位于AURKB激酶的子结构域I中的保守的富含甘氨酸的基序G-X-G-X-X-X-G中，K85位于第一甘氨酸残基之后，并且K87位于第二甘氨酸残基之后77。重要的是，发现TRAF6被自动泛素化，这与它在有丝分裂进展期间的激活一致，同时AURKB处于活跃状态，这与我们的假设一致，即活跃的TRAF6对AURKB有影响以调节癌细胞的增殖。
通过共聚焦成像，我们发现APPL1和AURKB以及AURKB和TβRI在有丝分裂和胞质分裂期间共定位于中间体中。AURKB和TβRI的共定位依赖于TRAF6。此外，通过免疫共沉淀，AURKB显示出与APPL1、TβRI和TRAF6相互作用(图3C)。发现AURKB与APPL1的所有三个结构域结合(图1O)，而TβRI与APPL1的PTB结构域结合。这些相互作用可能在有丝分裂进展和胞质分裂期间是动态的，并且这些复合物随时间的精确构成仍有待确定。然而，我们的数据表明，AURKB和TRAF6在有丝分裂进展期间相关以有助于AURKB活性，并且在末期晚期和胞质分裂期间APPL1、AURKB和TβRI定位于中间体中。此外，TβRI到中间体的定位依赖于AURKB在K85和K87上的K63连接的多聚泛素化，表明TβRI与被泛素化AURKB相关(图6)。
早期的研究已经表明，在人类雄激素依赖性前列腺癌细胞系LnCaP中敲除AURKB不会影响肿瘤细胞的存活。相比之下，在更具侵袭性的、雄激素非依赖性PC3细胞中敲低AURKB会导致体外细胞凋亡，并在体内异种移植裸鼠模型中减少肿瘤生长81，表明AURKB在雄激素非依赖性前列腺癌细胞中发挥重要作用。先前的研究描述了CPRC中AURKB相关的肿瘤促进和促存活作用82。根据该结果以及TβR1-APPL1通路控制AURKB表达以及TβRI与AURKB相互作用的当前发现，本发明人假设TβRI部分通过其在胞质分裂和细胞分裂期间的作用促进细胞增殖。因此，如本文所报道，在正常上皮细胞中由经典的TβRI-Smad信号通路转导的生长抑制作用不同于TβRI-ICD在有丝分裂进展和胞质分裂期间与AURKB复合物的作用。TβRI的敲低导致癌细胞的多核化的观察结果强调了TβRI在癌细胞的胞质分裂中的功能作用。
AURKB在各种癌症(包括前列腺癌)中经常过度表达。有丝分裂中的错误可能导致基因组不稳定，这是肿瘤发生的一个重要标志83。如上所述，极光激酶参与有丝分裂的多个步骤，包括中心体成熟、双极纺锤体组装、染色体浓缩、排列和胞质分裂。由于它们在调节有丝分裂方面的特殊作用，它们是癌症治疗的靶候选者，其中抑制剂正在临床试验中进行测试30,31,41。AURKB的较高表达也表明前列腺癌更具侵袭性和较差的患者存活(图4)。尽管TGFβ抑制细胞增殖并诱导正常上皮细胞凋亡，但它通常促进晚期癌症的生长，并且已经发现TβRI激酶抑制剂可以阻止不同癌细胞系的生长。此外，在前列腺癌患者中，TGFβRI表达与有丝分裂纺锤体和G2/M检查点高度相关(图2)。此外，AURKA和AURKB在神经内分泌型CRPC中的表达高于在CRPC腺癌中的表达，这与患有神经内分泌型CRPC的患者的不良预后一致(图4)。TβRI和AURKB复合物的量在来自具有较高格里森评分的前列腺癌患者的切片中更常观察到，这表明更具侵袭性的疾病(图4)。总之，目前的数据支持以下假设：AURKB和TβRI在细胞有丝分裂和胞质分裂期间形成功能复合物以参与细胞增殖，并且AURKB的TRAF6诱导的泛素化发挥着重要作用，因为AURKB K85和K87R突变体没有将TβRI招募到中间体(图3)。
总而言之，本文呈现的研究结果证明了TβRI在调节癌细胞增殖方面具有先前未知的功能，即当细胞进入有丝分裂时通过与AURKB相互作用。这一功能与TβRI的众所周知的以下功能明显不同：TβRI作为转录反应的上游调节剂经由经典的TGFβ-Smad信号通路来响应TGFβ。与TβRI结合的TRAF6导致AURKB在特定残基(Lys85和Lys87)(K85和K87)上的多泛素化，从而促进如H3pS10测量的AURKB活性(图6)。对TβRI-TRAF6-APPL1-AURKB复合物在癌细胞的胞质分裂中的关键作用的识别为开发依赖于该通路的侵袭性癌症的新型生物标志物和治疗策略奠定了基础。
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Claims (29)

1.一种用于诊断受试者的癌症的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供来自所述受试者的生物测试样品；以及
b)确定第一生物标志物、第二生物标志物和第三生物标志物在所述生物测试样品中的存在或不存在，其中所述生物标志物是：极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)和TGFβ1型受体(TβR1)；
其中所有三种生物标志物在所述生物测试样品中的共定位指示所述受试者的癌症。
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：确定第四生物标志物在所述生物测试样品中的存在或不存在，其中所述生物标志物是TNF受体相关因子6(TRAF6)，其中所有四种生物标志物在所述生物样品中的共定位指示所述受试者的癌症。
3.一种用于诊断和/或预测受试者的侵袭性癌症的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供来自所述受试者的生物测试样品；
b)确定第一生物标志物、第二生物标志物和第三生物标志物在所述测试样品中的存在或不存在，其中所述生物标志物是：极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)和TGFβ1型受体(TβR1)；以及
其中所有三种生物标志物在所述生物样品中的共定位指示所述受试者的侵袭性癌症。
4.根据权利要求3所述的方法，其进一步包括：确定第四生物标志物在所述生物测试样品中的存在或不存在，其中所述生物标志物是TNF受体相关因子6(TRAF6)，其中所有四种生物标志物在所述生物测试样品中的共定位指示所述受试者的侵袭性癌症。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中极光激酶B(AURKB)被泛素化。
6.根据权利要求4所述的方法，其中AURKB在对应于人AURKB(SEQ ID NO:1)的赖氨酸85(K85)和/或赖氨酸87(K87)的一个或两个赖氨酸残基处被泛素化。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述癌症与转化生长因子βI型受体(TβRI)的蛋白水解裂解相关和/或由其介导。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述癌症是实体瘤。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述实体瘤选自由前列腺癌、肾细胞癌、肺癌、肾癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌和结直肠癌组成的组。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述前列腺癌是去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述测试样品是组织样品，诸如来自肿瘤的活检切片。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)、TGFβ1型受体(TβR1)和/或TNF受体相关因子6(TRAF6)的存在或不存在通过以下来确定：检测生物标志物蛋白；且/或检测所述生物标志物蛋白的生物活性。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用选自由免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀(IP)、ELISA技术(单一或多重)、放射免疫测定(RIA)、包括使用单克隆和/或多克隆抗体的夹心测定的免疫放射测定(IRMA)和免疫酶测定(IEMA)、原位邻近连接测定(PLA)、酶法、图像分析、质谱法、适体、生物层干涉测量(BLI)、表面等离子共振(SPR)、多重测定(MSD，Mesoscalediscovery)组成的组的方法或通过与极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)、TGFβ1型受体(TβR1)、任选的TGFβ1型受体细胞内结构域(TβR1-ICD)和TNF受体相关因子6(TRAF6)结合的指示物质来执行在步骤(b)中确定所述生物标志物的所述存在和/或不存在。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中如果所述受试者被诊断患有癌症和/或侵袭性癌症，则所述方法进一步包括以下步骤：
-向所述受试者施用癌症疗法，任选地，其中所述癌症疗法包括手术、化疗、免疫疗法、化学免疫疗法和热化疗中的一者或多者。
15.一种用于确定患有或疑似患有前列腺癌的受试者的格里森评分(GS)为(i)GS≤6或7(3+4)；或(ii)GS 7(4+3)或≥8的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供来自所述受试者的生物测试样品；
b)评估包含极光激酶B(AURKB)和TGFβ1型受体(TβR1)的复合物的量；
c)将(b)中的所述复合物的所述量与包含来自已知具有GS为(i)GS≤6或7(3+4)；或(ii)GS 7(4+3)或≥8的参照样品的极光激酶B(AURKB)和TGFβ1型受体(TβR1)的复合物的量进行比较；
其中所述比较允许将所述受试者的所述GS确定为(i)GS≤6或7(3+4)或(ii)GS 7(4+3)或≥8。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述复合物进一步包含与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述复合物进一步包含TNF受体相关因子6(TRAF6)。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中所述复合物定位于细胞结构，诸如胞质分裂结构。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的方法，其中AURKB在对应于人AURKB(SEQ IDNO:1)的赖氨酸85(K85)和赖氨酸87(K87)的一个或两个赖氨酸残基处被泛素化。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述TGFβ1型受体(TβR1)是细胞内结构域(TβR1-ICD)。
21.一种用于确定个体的癌症的存在的阵列，其包括：
(i)能够与极光激酶B(AURKB)结合的结合剂和/或能够与编码极光激酶B(AURKB)的核酸分子选择性结合的结合部分；
(ii)能够与与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)
结合的结合剂和/或能够与编码与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)的核酸分子选择性结合的结合部分；
(iii)能够与TGFβ1型受体(TβR1)结合的结合剂和/或能够与编码TGFβ1型受体(TβR1)的核酸分子选择性结合的结合部分；以及
(iv)能够与TNF受体相关因子6(TRAF6)结合的结合剂和/或能够与编码TNF受体相关因子6(TRAF6)的核酸分子选择性结合的结合部分。
22.一种用于对受试者的癌症进行诊断和/或预后的试剂盒，所述试剂盒包括：
(i)能够与极光激酶B(AURKB)结合的结合剂和/或能够与编码极光激酶B(AURKB)的核酸分子选择性结合的结合部分；
(ii)能够与与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)
结合的结合剂和/或能够与编码与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)的核酸分子选择性结合的结合部分；
(iii)能够与TGFβ1型受体(TβR1)结合的结合剂和/或能够与编码TGFβ1型受体(TβR1)的核酸分子选择性结合的结合部分；以及
(iv)能够与TNF受体相关因子6(TRAF6)结合的结合剂和/或能够与编码TNF受体相关因子6(TRAF6)的核酸分子选择性结合的结合部分；以及
任选地用于执行权利要求1至20中任一项所定义的方法的说明。
23.极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)和TGFβ1型受体(TβR1)用作生物标志物对涉及TGFβ1型受体的蛋白水解裂解的疾病或病症进行诊断和/或预后，其中所有三种生物标志物在细胞中共定位于胞质分裂结构指示所述疾病或病症。
24.根据权利要求22所述使用的极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)和TGFβ1型受体(TβR1)，其进一步包含TNF受体相关因子6(TRAF6)用作生物标志物对涉及TGFβ1型受体的蛋白水解裂解的疾病或病症进行诊断和/或预后，其中所有四种生物标志物在细胞中共定位于胞质分裂结构指示所述疾病或病症。
25.极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)和TGFβ1型受体(TβR1)作为生物标志物对涉及TGFβ1型受体的蛋白水解裂解的疾病或病症进行诊断和/或预后的用途。
26.根据权利要求25所述的用途，其中所述用途进一步包括TNF受体相关因子6(TRAF6)作为生物标志物对涉及TGFβ1型受体的蛋白水解裂解的疾病或病症进行诊断。
27.一种复合物，其包含极光激酶B(AURKB)、与PH结构域和亮氨酸拉链1相互作用的磷酸酪氨酸衔接蛋白(APPL1)和TGFβ1型受体(TβR1)，其中AURKB被泛素化。
28.根据权利要求27的复合物，其进一步包含TNF受体相关因子6(TRAF6)。
29.根据权利要求27或28所述的复合物，其中极光激酶B(AURKB)在对应于人AURKB(SEQID NO:1)的赖氨酸85(K85)和/或赖氨酸87(K87)的一个或两个赖氨酸残基处被泛素化。
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