KR101810395B1 - 모야모야병 진단용 바이오마커 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본원은 모야모야병 진단에 사용되는 RALDH2 바이오마커 및 그 용도를 개시한다. 본원에 따른 바이오마커는 모야모야질병을 조기에 진단할 수 있음은 물론 기존에 사용되는 뇌자기공명 영상촬영, 뇌혈류 검사 다이아목스를 이용한 뇌스캔, 및 뇌혈관 조영술 등과 비교하여 소요 시간 및 경제성에 있어서 월등히 뛰어나며, 단독으로 또는 기존의 방법과 함께 사용될 수 있다. 또한 본원에 따른 RALDH2는 모야모야질병 치료제 개발의 표적으로, 그리고 상기 단백질, 그 활성화제 또는 발현 조절제를 이용한 치료용 조성물로도 유용하게 사용될 수 있다.

Description

모야모야병 진단용 바이오마커 및 그 용도 {Diagnostic biomarker for Moyamoya disease and use thereof}

본원은 모야모야병 진단 및 치료에 관련된 기술이다.

모야모야병(Moyamoya disease (MMD))은, 양측 두개내 동맥에 특발성으로 진행성 폐쇄가 일어나는 뇌혈관 장애로서, 특별한 원인 없이 대뇌에 혈액을 공급하는 내경동맥의 말단부나 그 분지부위에 협착과 폐색이 일어나고 뇌기저부에 이상 혈관들이 관찰되는 만성 뇌혈관 질환을 말한다. 어린이의 경우 주로 반복적인 일과성 뇌허혈 발작의 형태로 나타나고, 성인에서는 뇌출혈이 흔히 나타난다. 모야모야병은 대부분 소아기에 발생하여 발달 과정에 있는 소아의 뇌에 지속적이며 심각한 손상을 야기하여, 지능저하, 인지기능저하 및 정서적 발달에 악영향을 미친다. 따라서 장기적인 학업과 사회생활에 장애를 초래한다.

현재 모야모야병 진단에 사용되고 있는 방법인 뇌혈관 조영술은 침습적인 진단방법으로 반복적으로 행해지는 검사로는 부적절하다. 또한, MRI(Magnetic Resonance Imaging)/MRA(Magnetic Resonance Angiography)는 비침습 진단 방법이기는 하나, 고가의 장비를 사용하므로 스크리닝의 목적으로 사용하기에는 경제성이 떨어지는 단점이 있다.

대한민국 등록특허 제1493044호에는 NUPR1 유전자 프로모터의 CpG 메틸화 변화를 검출하는 모야모야병 진단용 조성물, 이를 이용한 방법 및 키트가 개시되어 있다.

미국 공개특허 제2011-0028331호는 acta2 및 myh11 유전자의 돌연변이를 검출하여 모야모야병을 포함하는 과다형성 혈관병증 발병 위험을 탐지하는 기술이 기재되어 있다.

하지만 보다 간편하고 정확하며 안정적으로 모야모야병을 진단할 수 있는 다양한 기술의 개발이 필요하다.

본원은 모야모야질병의 진단 마커 및 치료제 발굴을 위한 표적 및 그 용도를 제공하고자 한다.

일 구현예에서 본원은 RALDH2 (retinaldehyde dehydrogenase 2) 마커의 검출 시약을 포함하는 모야모야병(Moyamoya disease) 진단용 또는 검출용 조성물을 제공한다.

본원에 따른 조성물에 포함되는 검출 시약은 상기 마커를 단백질 또는 핵산 수준에서 정량 또는 정성적으로 검출할 수 있는 시약으로, 예를 들면 본원에 따른 마커의 단백질 수준에서의 검출 시약은 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석, 또는 단백질 마이크로어레이용에 사용되는 시약을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. 이러한 시약은 예를 들면 본원에 따른 단백질 마커의 전장 또는 그 단편을 특이적으로 인식하는 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)를 포함하는 것이나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 마커의 핵산 수준에서의 검출 시약은 중합효소연쇄반응, 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, 핵산 마이크로어레이 또는 노던블랏에 사용되는 시약을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. 이러한 시약은 예를 들면 본원에 따른 단백질 마커를 코딩하는 핵산서열, 상기 핵산서열에 상보적인 핵산서열, 상기 핵산서열 및 상보적인 서열의 단편을 특이적으로 인식하는 폴리뉴클레오타이드로서, 예를 들면 포워드 및 리버스 프라미어 쌍, 또는 프로브, 또는 프라이머 쌍과 상기 프라이머 쌍에 포함되는 각 프라이머가 인식하는 서열 사이에 결합할 수 있는 프로브를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

다른 양태에서 본원은 RALDH2 (retinaldehyde dehydrogenase 2) 마커의 검출 시약을 포함하는 모야모야병(Moyamoya disease) 진단용 키트를 제공한다. 본원에 따른 진단용 키트는 검출하는 방식에 따라 추가의 성분 및/또는 사용안내서를 포함할 수 있다.

다른 양태에서 본원은 또한 모야모야병의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 검사 대상체 유래의 생물학적 시료로부터 RALDH2 바이오마커의 핵산 및/또는 단백질의 존재 여부 및/또는 농도를 검출하는 단계; 상기 핵산 또는 단백질의 농도 또는 존재에 대한 검출 결과를 정상 대조군 시료의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계; 및 상기 정상 대조군 시료와 비교하여, 상기 대상체 유래 시료의 핵산 또는 단백질 농도의 변화가 있거나, 또는 상기 핵산 또는 단백질이 존재여부에 변화가 있는 경우, 이를 모야모야병으로 판정하는 단계를 포함하는, 모야모야병 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 RALDH2 바이오마커를 검출하는 방법을 제공한다.

또 다른 양태에서 본원은 또한 인비트로에서 RALDH2 바이오마커를 검출하는 방법을 제공한다.

본원에 따른 방법에 사용되는 생물학적 시료는 예를 들면 말초혈액 유래의 ECFC 또는 이의 인비트로 배양물을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 말초혈액에서 ECFC 세포를 분리하고, 이를 배양하는 방법은 본원 실시예에 기재된 방법을 참고할 수 있다.

본원에 따른 방법에서 비교하는 단계에서 상기 검사 대상체의 비마커 임상 정보가 추가로 사용될 수 있으며, 이는 예를 들면 검사 대상체의 비마커 임상정보는 상기 대상체의 나이, 성별, 체중, 기저질환, 뇌자기공명 영상촬영(MRI & MRA) 및 뇌혈류 검사 다이아목스를 이용한 뇌스캔, 또는 뇌혈관 조영술을 통해 수득한 정보를 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다.

다른 측면에서 본원은 또한 RALDH2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 제공하는 단계; 상기 단백질 또는 핵산과 시험물질을 접촉시키는 단계; 상기 단백질의 활성 또는 상기 핵산의 발현정도를 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정하는 단계; 및상기 측정 결과, 시험물질이 처리되지 않은 대조군과 비교하여 시험물질이 처리된 세포에서 상기 단백질의 활성 또는 상기 핵산 서열의 발현량이 증가한 경우, 이를 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, 모야모야병 치료용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본원에 따른 방법은 상기 RALDH2 단백질 또는 핵산은 이를 포함하는 이를 발현하는 세포 또는 동물모델의 형태로 제공될 수 있으며, 이러한 세포는 예를 들면 내피 군집 형성 세포(endothelial colony forming cell)를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

또 다른 측면에서 본원은 또한 RALDH2 단백질 또는 그 유전자, RALDH2 단백질 활성화제, 또는 RALDH2 유전자 발현 활성화제를 유효성분으로 포함하는 모야모야병 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또 다른 측면에서는 레티노산(retinoic acid), 올트랜스 레티노산(all-trans retinoic acid)을 포함하는 모야모야병 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본원에 따른 바이오마커인 RALDH2는 모야모야질병을 조기에 진단할 수 있는 마커로서 유용하게 사용될 수 있으며 또한 치료제 발굴을 위한 스크리닝의 표적으로 사용될 수 있다. 본원에 따른 바이오마커는 기존에 사용되는 뇌자기공명 영상촬영(MRI 또는 MRA)과 뇌혈류 검사 다이아목스를 이용한 뇌스캔, 및 뇌혈관 조영 등과 비교하여 소요 시간 및 경제성에 있어서 월등히 뛰어나다. 또한 가족성 발병이 알려져 있어 환자의 형제를 포함하는 가족들에서 모야모야병 발병여부를 스크리닝하기 위한 진단법으로도 매우 유용하게 쓰일 수 있다.

또한 본원에 따른 RALDH2 유전자 또는 단백질의 투여, 또는 단백질의 활성화제 또는 상기 유전자의 프로모터 활성화를 통해 단백질 발현을 증가시키는 방법에 기반한 치료제의 개발이 가능하다.

도 1은 모야모야병(MMD)을 앓는 환자에게서 얻은 ECFC (endothelial colonyforming cells)에서 차별적으로 발현되는 유전자를 나타낸 것으로, A는 상향조절 또는 하향조절된 상위 20개 유전자의 발현 프로파일 및 변화를 나타낸 것으로 RALDH2(retinaldehyde dehydrogenase)는 정상 ECFC와 비교하여 MMD ECFC에서 가장 많이 하향조절이 되는 유전자를 나타내고, B는 RALDH2의 mRNA 발현이 MMD ECFC에서 상당히 감소되었음을 나타내는 결과 (4.2배 감소; *P<0.05 by rank test)이고, C는 MMD ECFC에서 상응하는 RALDH2의 단백질 농도의 감소(2.8 배, *P<0.05 by rank test를 나타내는 결과이다.
도 2는 ATRA(All-trans retinoid acid) 처리로 인해 MMD ECFC에서 혈관생성 기능이 회복되었음을 보여주는 결과로, A는 마트리겔(Matrigel)에서 정상 및 MMD ECFC를 배양하여 수행한 혈관 형성 분석결과로 혈관 가지 뿐만 아니라 형성된 혈관 수를 대조군과 비교하여 확인하였으며 인비트로에서 혈관을 형성하는 MMD ECFC의 활성이 ATRA 처리 후에 극적으로 향상되었음을 나타내고(*P<0.05 by rank test), C 및 D는 세포 생존력, 증식 및 세포주기 프로파일에서는 ATRA 처리 전후에 차이가 없음을 나타내는 결과이고, E는 이동(Migration) 분석에서는 ATRA 처리 효과가 없었음을 나타낸다. 약어는 다음과 같다: DMSO는 디메틸 설폭사이드를; G1, 갭 1 세포주기; G2, 갭 2 세포 주기; 및 S, 합성기.
도 3은 RALDH2이 녹다운(knockdown)되면 정상 ECFC에서 혈관 형성이 저해되는 것을 나타내는 결과로, A는 정상 ECFC의 인비트로 혈관 형성 능력이 RALDH2 siRNA 트랜스팩션후에 저해되었음을 나타내는 결과이고, B는 혈관 가지의 수 및 형성된 혈관의 수 또한 정상 ECFC에서 RALDH2 녹다운 후에 감소(*P<0.05 by rank test)하였음을 나타내고, C는 생존능력, 증식 및 세포주기 프로파일은 RALDH2 siRNA와의 트랜스팩션에 의해 영향을 받지 않음을 나타내는 결과이다. 약어는 위에 정의한 바와 같다.
도 4는 ATRA로 처리하면, RALDH2이 녹다운된 정상 ECFC의 혈관 형성 능력이 회복되는 것을 보여주는 결과로 A는 정상 ECFC에서 RALDH2 녹다운 후 저해되었던 혈관 형성 능력이, ATRA 처리 후에 부분적으로 회복되었음을 보여주는 결과이고, B는 ATRA 처리 전후를 비교하여 가지(branch)의 수 뿐만 아니라 형성된 혈관의 수로 확인한 결과이다(*P<0.05 by rank test).
도 5는 ATRA가 인 비보에서 MMD ECFC에 의한 혈관 신생 (angiogenesis)을 증가시킨다는 것을 보여주는 결과로 A는 RA (Retinoic Acid) 처리를 하거나 또는 처리를 하지 않은 정상 또는 MMD ECFC의 혼합물을 함유하는 마트리겔 플러그의 초냉동 절편을 항-인체 핵(녹색), 항-인체 CD31(적색), 및 DAPI(파란색)으로 염색한 후 공초점 현미경으로 촬영한 결과이고, B 및 C는 상기 염색 결과를 정량하여 인간 핵 및 CD31 이중-양성 구역(area)의 백분율로 나타낸 결과이고, 정량 결과, CD31-양성 세포의 농도는 MMD ECFC에서 상당히 감소한 것으로 나타났고 (***P<0.001 by rank test), MMD ECFC에서 혈관 신생이 ATRA 처리 후에 상당히 증가(***P<0.001) 한 것으로 나타났으나, 정상 ECFC의 혈관 신생은 ATAR 처리 후에 변하지 않았다.
도 6은 낮은 RALDH2의 발현이 프로모터 부위에서의 아세틸-히스톤 H3 결합(association) 결함에 기인함을 분석한 결과로, A는 정상(N) 또는 모야모야병(MMD) ECFC에 대하여 항아세틸-히스톤 H3 항체를 사용하여 ChIP(Chromatin immunoprecipitation)를 수행하고, RALDH2 프로모터 및 아세틸-H3의 결합 및 활성 프로모터 지역을 타겟으로하는 2개의 프라이머 세트로 PCR을 수행한 결과로, 음성 대조군 및 양성대조군으로 각각 제1 인트로 및 GAPDH 프로모터를 표적으로 사용하였다. B는 RALDH2 프로모터와 아세틸-H3 연합을 ChIP DNA에 대해 정량적 PCR로 분석한 결과로, Y축은 ChIP 샘플에서 차감된 인풋 Ct 값의 차이를 나타낸다. 정상 및 MMD 샘플에서의 차이는 RALDH2 프로모터 부위에 대해 통계적으로 유의한 것으로 나타났으며, 결과는 2회의 독립적인 실험 결과이다. P 값은 랭크 테스트에 의한 것이고 약어는 다음과 같다: N1: 정상 샘플 no.1, N2: 정상 샘플 no. 2, MMD1: MMD 샘플 no. 1, MMD2: MMD 샘플 no. 2.
도 7은 ECFC 표현형의 특징을 분석한 것을 나타낸 것이다. A. ECFC가 시간이 지남에 따라 형태 변화를 나타내고 군집(colony)은 조약돌 형태를 나타낸다. B. CD34, KDR, CD133, CD31 및 CD45의 FACS 분석. C. ECFC에 의해 섭취(uptake)된 DiI-labeled Ac-LDL. D. CD31 및 vWF에 대한 항체로 라벨된 ECFC의 면역형광 염색.
도 8은 정상 ECFC에서 siRNA로 녹다운된 RALDH2를 나타낸 것이다. A. 정상 ECFC로의 siRNA 의 효율적 트랜스팩션을 녹색 세포로 가시화한 것이다. A. RT-PCR을 통해 두 가지 타입의 siRNA를 사용하여 RALDH2가 효율적으로 녹다운된 것을 나타낸 것이다. C. 실시간 정량적 PCR에서도 유사한 결과를 얻었는데, 이는 RALDH2 mRNA의 발현이 siRNA 트랜스팩션 후에 감소하였다는 것을 입증한다. 유전자 녹다운을 단백질 수준에서 확인한 것이다(N1: 정상 샘플 #1, N2: 정상 샘플 #2, N3: 정상 샘플 #3, N4: 정상 샘플 #4).
도 9는 RALDH2의 효율적 녹다운 및 인체 탯줄정맥 혈관내피세포(HUVEC)에서의 혈관 형성에 대한 ATRA 처리의 효과를 나타낸 것이다. A. RALDH2 siRNA가 트랜스팩션된 후 인 비트로에서 HUVEC의 정상 혈관 형성 능력이 저해되었다. RALDH2 녹다운 후 HUVEC의 혈관 형성 능력이 저해된 것이 ATRA 처리 후에 부분적으로 회복되었다. B. NUVEC에서 2 가지 타입의 siRNA를 사용하여 RALDH2가 효율적으로 녹다운되었다는 것을 RT-PCR에서 알 수 있다. RALDH2 mRNA가 siRNA로 트랜스팩션된 후 감소하였다는 것을 실시간 정량적 PCR에서 역시 확인하였다. C. 생존능력 및 증식은 RALDH2 siRNA와의 트랜스팩션에 의해 영향을 받지 않는 것으로 나타났다.

본원은 모야모야병(Moyamoya disease, MMD) 환자와 정상 대조군에서 얻은 혈관내피 군집 형성 세포(endothelial colony forming cell, ECFC)에서 mRNA 발현을 비교하여 537개의 차별적으로 발현되는 유전자를 발굴하고, RALDH2 (Retinaldehyde dehydrogenase 2)가 MMD ECFC에서 매우 적게 발현되며, 나아가 MMD ECFC 또는 RALDH2-녹다운된 정상 ECFC에서 RA 특히 ATRA (all-trans RA)가 혈관 신생 결함을 회복시키는 것을 규명한 것에 근거한 것이다.

따라서 한 양태에서 본원은 RALDH2을 모야모야병의 진단용 마커로 사용하는 용도와 관련된 것으로, RALDH2 검출 시약을 포함하는 검체의 모야모야병(Moyamoya disease) 진단용 조성물에 관한 것이다.

본원에서 모야모야병(Moyamoya disease, MMD)은, 양측 두개내 동맥에 특발성으로 진행성 폐쇄가 일어나는 뇌혈관 장애로서, 특별한 원인 없이 대뇌에 혈액을 공급하는 내경동맥의 말단부나 그 분지부위에 협착과 폐색이 일어나고 뇌기저부에 이상 혈관들이 관찰되는 만성 뇌혈관 질환을 말한다. 어린이의 경우 주로 반복적인 일과성 뇌허혈 발작의 형태로 나타나고, 성인에서는 뇌출혈이 흔히 나타난다. 모야모야병은 대부분 소아기에 발생하여 발달 과정에 있는 소아의 뇌에 지속적이며 심각한 손상을 야기하여, 지능저하, 인지기능저하 및 정서적 발달에 악영향을 미친다. 따라서 장기적인 학업과 사회생활에 장애를 초래한다. 모야모야병이 발생하여 진행이 되면 치료가 어렵지만 조기 진단을 통한 적절한 조치를 통해 완치에 가까운 치료 효과가 가능하므로 조기 진단이 무엇보다 중요하다.

모야모야병의 진단에 사용되는 본원에 따른 바이오마커인 RALDH2는 인간의 경우 ALDH1A2 유전자에 의해 코딩되는 효소로서, 레틴알데하이드(retinaldehyde)로부터 레티노산(retinoic acid, RA)으로의 합성을 촉매하는 효소로, 그 서열은 공지되어 있고, 예를 들면 핵산서열은 서열번호 1, 단백질 서열은 서열번호 2와 같이 표시될 수 있으나, 이의 단편 또는 이의 핵산 또는 단백질 수준에서의 변이체로서, 기능적 변이가 있거나 또는 없는 변이체를 모두 포함하는 것이다. 이는 후술하는 바와 같이 다양한 방법을 통해 검출될 수 있으며, 당업자라면 검출을 위해 적절한 방법 및 이에 따른 검출 시약 또는 물질을 선택할 수 있을 것이다.

본원에서 용어 진단은 특정 질병 또는 질환에 대하여 검사 대상체의 질환에 대한 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상체의 예후(prognosis)(예컨대 질환의 단계 또는 진행상태 판별 또는 치료에 대한 질환의 반응성 결정)를 판정하는 것 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

본원에서 용어 진단용 바이오마커, 마커 또는 진단 마커란 질환이 발생한 대상체 유래의 시료 예를 들면 세포 또는 조직을 정상 세포 또는 질환의 치료를 위해 적절한 치료를 받은 대상체의 조직 또는 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 시료에 비하여 질환이 발생한 대상체 유래의 시료에서 감소 양상을 보이는 단백질 또는 핵산을 일컫는 것으로, 본원에 따른 일 구현예에서는 RALDH2 단백질 또는 유전자 또는 그 단편으로, 그 발현이 모야모야병에 걸린 대상체 유래의 시료에서 감소한다.

본원에서 생물학적 시료란 바이오마커 검출이 가능한 하나 이상의 성분을 포함하는 물질 또는 물질의 혼합물을 일컫는 것으로 생물체, 특히 인간 유래의 세포, 조직 또는 체액, 예를 들면 전혈, 뇨, 혈장, 및 혈청을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 또한 생물체에서 직접적으로 유래된 것은 물론 인비트로에서 배양된 세포 또는 조직을 포함한다. 본원에 따른 마커의 검출을 위해 다양한 시료가 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 한 구현예에서는 전혈, 혈청 및/또는 혈장이 사용될 수 있다. 다른 구현예에서는 질환이 발생한 또는 발생이 의심되는 또는 발생가능성이 있는 생물체에서 수득한 조직 또는 세포 또는 인비트로 세포 배양물이 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 또한 상기 혈액, 세포 또는 조직의 분획 또는 유도물을 포함하는 것이다. 세포 또는 조직을 이용하는 경우, 세포 자체 또는 세포 또는 조직의 융해물이 사용될 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서는 대상체의 말초혈액으로부터 분리한 ECFC (endothelial colonyforming cells)의 인비트로 배양물이 사용된다.

본원에서 검출이란, 정량 및/또는 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재, 부존재의 검출 및 발현량 검출을 포함하는 것으로 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.

본원에 따른 마커는 정량적 또는 정성적 분석을 통해 핵산, 특히 mRNA 및/또는 단백질의 존재 여부의 검출 및/또는 이의 발현량 자체, 발현량의 변화, 발현량 차이의 수준에서 검출될 수 있다.

이러한 본원에 따른 바이오마커의 검출은 마커의 기능적 특징 및/또는 항원적 특징에 기반을 둔 것일 수 있다. 본원에 따른 마커는 마커의 활성 또는 기능의 검출, 또는 단백질을 코딩하는 핵산, 특히 mRNA 수준 및/또는 단백질 수준에서 특이적으로 상호작용하는 물질을 사용하여 검출될 수 있다.

이런 측면에서 본원에 따른 검출시약은 본원에 따른 마커를 단백질 또는 핵산 수준에서 다양한 방식으로 정량적 또는 정석적 분석을 통해 검출할 수 있는 시약이다.

본원에 따른 마커의 정량적 및 정성적 분석에는 공지된 핵산 및 단백질을 정성 또는 정량적으로 검출하는 다양한 방법이 사용될 수 있다.

단백질 수준에서의 정성적 또는 정량적 검출 방법으로는 예를 들면 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 용액/현탁액 중에서 표지된 항체와의 결합 및 유세포 분석기를 통한 검출, 질량분석기 또는 항체와 같은 단백질 어레이 등을 이용한 방법이 사용될 수 있다.

또는 핵산 수준에서의 정성적 또는 정략적 검출 방법으로는 핵산 전사 및 증폭 시스템, eTag 시스템, 표지된 비드를 기본으로 하는 시스템, 핵산 어레이와 같은 어레이 시스템 등을 이용한 방법이 사용될 수 있다.

이러한 방법은 공지된 것으로 예를 들면 chip-based capillary electrophoresis: Colyer et al. 1997. J Chromatogr A. 781(1-2):271-6; mass spectroscopy: Petricoin et al. 2002. Lancet 359: 572-77; eTag systems: Chan-Hui et al. 2004. Clinical Immunology 111:162-174; microparticle-enhanced nephelometric immunoassay: Montagne et al. 1992. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 30:217-22 등을 참조할 수 있다.

일 구현예에서는 ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), RIA (Radio Immuno Assay) 등과 같은 샌드위치 방식의 면역분석법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 고상의 기질 예를 들면 글라스, 플라스틱 (예를 들면 폴리스티렌), 폴리사카라이드, 나일론 또는 나이트로셀룰로스로 제작된 비드, 막, 슬라이드 또는 마이크로타이터플레이트에 결합된 제1 항체에 생물학적 시료를 추가한 후, 직접 또는 간접 검출이 가능한 표지물질 예를 들면 ³H 또는 ¹²⁵I와 같은 방사선 물질, 형광물질, 화학발광물질, 햅텐, 바이오틴, 디그옥시제닌 등으로 표지되거나 또는 기질과의 작용을 통해 발색 또는 발광이 가능한 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, 말레이트 데하이드로게나아제와 같은 효소와 컨쥬게이션된 항체와의 결합을 통해 단백질은 정성 또는 정량적으로 검출 할 수 있다.

다른 구현예에서는 항원 항체 결합을 통해 마커를 간단하게 검출할 수 있는 Ouchterlony 플레이트, 웨스턴블랏, Crossed IE, Rocket IE, Fused Rocket IE, Affinity IE와 같은 면역 전기영동 (Immuno Electrophoresis)이 사용될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984 등에 기재되어 있다. 상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석하여 즉, 정상 시료와의 시그널 대조를 수행함으로써, 질환 발생 여부를 진단할 수 있다.

이러한 방법에 사용되는 시약 또는 물질은 공지된 것으로서, 예를 들면 상기 마커에 특이적으로 결합하는 항체, 기질, 핵산 또는 펩타이드 앱타머, 또는 상기 마커와 특이적으로 상호작용하는 수용체 또는 리간드 또는 보조인자 등이 사용될 수 있다. 상기 본원의 마커와 특이적으로 상호작용 또는 결합하는 시약 또는 물질은 칩 방식 또는 나노입자(nanoparticle)와 함께 사용될 수 있다.

본원의 마커는 또한 핵산 수준 특히 mRNA 수준에서의 공지된 다양한 방법을 사용하여 정량적 및/또는 정성적으로 검출될 수 있다.

핵산 수준에서의 정성적 또는 정량적 검출 방법으로는 예를 들면 mRNA 수준에서의 검출, 발현량 또는 패턴의 검출을 위해 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)/중합효소연쇄반응, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, Nuclease 보호 분석(NPA) 예를 들면 RNase, S1 nuclease 분석, in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 또는 칩 또는 노던블랏 등을 이용한 방식이 사용될 수 있으며, 이러한 분석법은 공지된 것이며, 또한 시중의 키트를 사용하여 수행될 수 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다. 예를 들면 노던블랏은 세포에 존재하는 전사체의 크기를 알 수 있으며, 다양한 프로브를 사용할 수 있는 장점이 있으며, NPA는 다중 마커 분석에 유용하며, in situ 교잡법은 mRNA와 같은 전사체의 세포 또는 조직내 위치 파악에 용이하며, 역전사 중합효소연쇄반응은 적은 량의 시료 검출에 유용하다. 또한 본원에 따른 바이오마커 단백질을 코딩하는 유전자 유래의 mRNA 또는 cRNA와 같은 핵산과 특이적으로 결합하는 결합제제 또는 결합제제를 포함하는 어레이가 사용될 수 있다.

상기 핵산 수준에서의 바이오마커의 검출 방법에 사용되는 시약 또는 물질은 공지된 것으로서, 예를 들면 mRNA의 존재 여부와 그 양을 RT-PCR로 측정하기 위한 방법에서 검출시약으로는 예를 들면 중합효소, 본원 마커의 mRNA에 특이적인 프로브 및/또는 프라이머쌍를 포함한다. “프라이머”또는 “프로브”는 주형과 상보적으로 결합할 수 있고 역전사효소 또는 DNA 중합효소가 주형의 복제를 개시할 수 있도록 하는 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열을 의미한다. 본원에 사용되는 상기 검출 시약은 신호검출을 위해 상술한 바와 같은 발색, 발광 또는 형광물질과 같은 것으로 표지될 수 있다. 일구현예에서는 mRNA 검출을 위해 노던블랏 또는 역전사 PCR (중합효소연쇄반응)이 사용된다. 후자의 경우 검체의 RNA를 특히 mRNA를 분리한 후, 이로부터 cDNA를 합성한 후, 특정 프라이머, 또는 프라이머 및 프로브의 조합을 사용하여, 검체 중의 특정 유전자를 검출하는 것으로, 특정 유전자의 존재/부존재 또는 발현량을 결정할 수 있는 방법이다. 이러한 방법은 예를 들면 (Han, H. et al, 2002. Cancer Res. 62: 2890-6)에 기재되어 있다.

다른 양태에서 본원은 또한 RALDH2 마커의 검출 시약을 포함하는 검체의 모야모야병(Moyamoya disease) 진단용 키트에 관한 것이다.

본원에 따른 키트에 포함되는 검출시약은 앞서 언급한 바를 참고 할 수 있으며, 키트는 사용안내서를 추가로 포함할 수 있다.

또다른 양태에서 본원은 모야모야병의 진단 또는 예후 판단을 위해 인비트로에서 대상체 유래의 생물학적 시료에서 RALDH2 바이오마커를 핵산 및/또는 단백질 수준에서 정량 및/또는 정성적으로 검출하는 방법에 관한 것이다.

일 구현예 본원은 모야모야병의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여, RALDH2 바이오마커를 검출하는 방법으로 상기 방법은 검사 대상자 유래의 생물학적 시료로부터 RALDH2 바이오마커의 핵산 및/또는 단백질의 존재 여부 및/또는 농도를 검출하는 단계; 상기 핵산 또는 단백질의 농도 또는 존재에 대한 검출 결과를 정상 대조군 시료의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계; 및 상기 정상 대조군 시료와 비교하여, 상기 대상자 유래 시료의 핵산 또는 단백질 농도의 변화가 있거나, 또는 상기 핵산 또는 단백질이 존재여부에 변화가 있는 경우, 이를 모야모야병으로 판정하는 단계를 포함한다.

본원의 방법에서 마커의 존재/부존재 또는 발현양의 검출은 단백질 및/또는 핵산수준에서 결정될 수 있으며, 이에 관해서는 앞서 언급한 바와 같다.

본원에 따른 방법에 사용되는 생물학적 시료는 앞서 언급한 바와 같다.

본원의 방법에 따른 모야모야병 진단용 마커의 검출은 정성적, 및 정량적 검출을 모두 포함하는 것으로, 본 질환의 발병 및 진행에 대한 지표가 될 수 있으며, 본 질환의 발병, 질환의 진행, 질환의 진단 또는 예후에 이용될 수 있다.

본원의 방법은 모야모야질병의 진단 또는 예후에 관한 정보를 제공하기 위해, 마커 분석 결과에 추가하여, 환자의 비단백질 임상정보 즉, 마커이외의 임상정보를 추가로 사용할 수 있다. 이러한 비단백질 임상정보란, 예를 들면 환자의 나이, 성별, 체중, 식습관, 체질량, 기저질환, 뇌자기공명 영상촬영(MRI 또는 MRA)과 뇌혈류 검사 다이아목스(Diamox)를 이용한 뇌스캔, 뇌혈관 조영술 중 하나 이상을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본원 방법은 마커의 검출 결과를 모야모야병의 진단 또는 예후와 연관시키는 단계를 포함하며, 상기 연관시키는 단계는 결정된 마커의 단백질 양 또는 존재여부, 또는 핵산의 양 또는 존재여부를 정상 대조군에서 결정된 상기 마커의 검출결과와 비교하여 이를 근거로 진단하는 것이다. 본원에서 RALDH2 단백질은 모야모야질병이 발생한 조직에서 대조군과 비교하여 차별적으로 발현되며, 대조군의 검출 결과와 비교하여 RALDH2의 양이 유의하게 감소되거나 없는 경우, 대상체에서 상기 질환이 발생한 것으로 진단하는 정보를 제공할 수 있다. 본원 일 구현예에 따르면 상기 연관시키는 단계는 정상 대조군과 대상체의 시료를 비교한 후, 상기 각 마커에 대하여 발병여부를 진단할 수 있는 임계값을 설정한 후, 대상체의 검출 결과를 상기 임계값과 비교할 수 있다.

본원에서는 모야모야병 환자의 ECFC에서 RALDH2는 상당히 하향 발현되어 있음을 발견하였으며, 정상 ECFC에서 RALDH2를 녹다운시키면 혈관 신생 기능이 저해되었고, 여기에 RA 특히 ATRA(all-trans retinoic acid)를 처리하면 혈관신생 능력이 회복되는 것을 발견하였다. 또한 MMD ECFC에 ATRA를 처치하면 혈관 신생 기능이 회복되는것을 확인 하였다.

따라서 다른 양태에서 본원은 또한 RALDH2 단백질 또는 이의 활성화제 또는 발현 조절제를 포함하는 모야모야병 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본원에서 사용된 용어 "치료" 란 질환, 또는 질환으로 인한 증상 또는 상태의 억제, 제거, 경감, 완화, 개선, 및/또는 예방을 포함하는 개념이다.

본원에서는 모야모야병 환자에게서 상기 RALDH2 단백질의 발현이 낮은 것은 프로모터 부위에서의 아세틸-히스톤 H3 결합(association)에 결함이 이유인 것을 규명하였다.

따라서 RALDH2 단백질은 물론, 이의 활성 또는 발현을 조절하는 다양한 물질이 치료제로서 사용될 수 있다. 여기에서 발현은 mRNA로의 전사 및 단백질로의 번역 수준에서의 조절을 포함하는 것이며, 활성의 조절은 발현된 단백질이 세포내에서 제 기능할 수 있도록 하는 생물학적 작용을 의미한다.

본원은 RALDH2 발현 조절제란 RALDH2 단백질 또는 이의 프로모터 및 mRNA를 포함하는 핵산과 결합 또는 상호작용하여 이들 단백질의 발현 (전사 및 번역) 및/또는 활성을 조절할 수 있는 물질이다. 이러한 물질은 예를 들면 저분자 화합물, 항체 및 폴리펩타이드를 포함하는 단백질, 및 RNA와 DNA를 포함하는 핵산분자 또는 이들의 임의의 조합을 모두 포함하는 것이다.

본원에서 RALDH2 활성화제란 예를 들면 RALDH2에 결합하거나 또는 이와 상호작용하여 이의 적어도 한가지의 생물학적 특징 및/또는 활성을 변경하는 물질을 의미한다.

RALDH2 단백질 발현 조절제 또는 활성화제로서 사용될 수 있는 물질은 이에 제한하는 것은 아니나 저분자화합물, 폴리펩타이드, 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것이나 이로 제한하는 것은 아니다. 원에서 사용된 용어 폴리펩타이드는 천연 또는 합성의 아미노산의 중합체를 일컫는 것으로 이러한 작용을 갖는 한 특정 길이를 지칭하는 것은 아니며, 펩타이드, 올리고펩타이드를 포함한다. 폴리펩타이드는 자연적 또는 인위적으로 변형된 것 예를 들면 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등으로 변형된 것도 포함한다.

본원에 따른 일 구현예에서 RA, ATRA(all-trans retinoic acid)가 사용되나, 이로 제한되는 것은 아니다.

본원의 치료제는 상기 언급한 RALDH2 , 그 발현 조절제 또는 활성화제 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 또는 유효성분의 용해성 및/또는 흡수성을 유지/증가시키는 화합물을 추가로 함유할 수 있다. 또한 본원의 치료제는 모야모야병의 치료 또는 예방을 위하여 단독으로, 또는 수술, 약물치료 및 생물학적반응조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본원의 치료제는 상기 언급한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제형화할 수 있다.

본원의 치료제의 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니며, 공지된 투여방법을 적용할 수 있으며, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우 피부에 붙이는 패치형, 코/호흡기를 통해 투여할 수 있으며, 신속한 치료효과를 얻기 위해서는 정맥내 주사에 의한 투여가 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여 시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 매우 다양할 수 있다. 전형적인 약물의 경우 투약단위체는, 예를 들어 약 0.01 mg 내지 100 mg를 포함하나 상기 범위의 이하 및 이상의 범위를 배제하는 것은 아니다. 일일 투여량은 약 1μg 내지 10g 일 수 있으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.

나아가 본원은 모야모야병에서 차별적으로 발현되는 RALDH2 단백질에 근거한 것으로, 한 양태에서 RALDH2를 표적으로 하는 모야모야병 치료용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 본 방법에 의해 선별된 물질은 특히 모야모야질병 치료제로서 유용하다.

본원에 따른 방법은 RALDH2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 제공하는 단계; 상기 단백질 또는 핵산과 시험물질을 접촉시키는 단계; 상기 단백질의 활성 또는 상기 핵산의 발현정도를 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정하는 단계; 및 상기 측정 결과, 시험물질이 처리되지 않은 대조군과 비교하여 시험물질이 처리된 세포에서 상기 단백질의 활성 또는 상기 핵산 서열의 발현량이 증가한 경우, 이를 후보물질로 선별하는 단계를 포함한다.

본원의 방법에 사용되는 시험물질은 RALDH2 단백질의 발현 및/또는 활성을 조절할 것으로 기대되는 물질로, 예를 들면 약물의 스크리닝 목적을 위해서는 화합물은 저분자량의 치료효과를 갖는 것이 사용될 수 있다. 예를 들면 중량이 400 Da, 600 Da 또는 800 Da과 같은 약 1000 Da 내외의 화합물이 사용될 수 있다. 목적에 따라 이러한 화합물은 화합물 라이브러리의 일부를 구성할 수 있으며, 라이브러리를 구성하는 화합물의 숫자도 수십개부터 수백만개까지 다양하다. 이러한 화합물 라이브러리는 펩타이드, 펩토이드 및 기타 환형 또는 선형의 올리고머성 화합물, 및 주형을 기본으로 하는 저분자 화합물, 예컨대 벤조디아제핀, 하이단토인, 바이아릴, 카보사이클 및 폴리사이클 화합물 (예컨대 나프탈렌, 페노티아진, 아크리딘, 스테로이드 등), 카보하이드레이트 및 아미노산 유도체, 디하이드로피리딘, 벤즈하이드릴 및 헤테로사이클 (예컨대 트리아진, 인돌, 티아졸리딘 등)을 포함하는 것일 수 있으나, 이는 단지 예시적인 것으로 이로 한정되는 것은 아니다.

본원의 스크리닝 방법에 사용될 수 있는 RALDH2는 앞서 언급한 바와 같으며, RALDH2 단백질을 스크리닝을 하는 구체적 방법에 따라 다양한 숙주 유래의 것이 본 방법에 사용될 수 있으며, 전장 또는 잘린 형태의 것이 모두 포함된다. 또한 동일한 숙주, 예를 들면 인간에서 유래된 것이라도 특정 개인, 지역, 환경 등에 따라 서열변이가 있을 수 있으며, 이러한 것은 물론 일부 서열이 변형(결실, 치환, 부가)되었으나, 기능적으로 동등한 변이체가 모두 본 발명에 사용될 수 있다. 한 구현예에서는 인간 유래의 것으로 이에 관하여는 앞서 언급한 바와 같다.

본원의 방법에는 RALDH2 단백질을 발현하는 세포가 사용될 수 있다.

RALDH2 단백질을 발현하는 세포 및 동물모델은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 전자의 경우 일 구현예에서 유전자 재조합 기술을 이용하여 스크리닝에 사용되는 단백질을 암호화하는 DNA 또는 RNA 서열을 적당한 숙주 세포에서 발현시켜 사용하는 것이다. 예를 들면 상기 단백질을 코딩하는 상응하는 유전자를 포함하는 플라스미드를 진핵세포 세포 예를 들면 곤충세포, 포유류 세포에 전달한 후 (stable 또는 transient) 사용하는 것이다. 상기 세포를 세포의 성장 유지가 가능한 조건에서 시험물질과 접촉한 후에 RALDH2 발현을 RNA 및 단백질 수준에서 조사하는 것이다. RALDH2의 발현 RNA 및 단백질 수준에서의 검출방법은 앞서 언급한 바와 같다.

본원에 따른 일 구현예에서, RALDH2 단백질을 발현하는 세포는 예를 들면 상기 단백질의 전부 또는 일부를 발현 (Transient 또는 Stable 전달이입 또는 내인성 발현)하는 포유류 세포, 예를 들면 이로 제한하는 것은 아니나, 혈관내피 군집 형성 세포를 세포배양 플레이트에 배양한 후, 여기에 시험물질을 첨가한 후, 일정 시간 후에 세포로부터, 총 단백질을 추출한 웨스턴블랏을 수행하여, 대조군(시험물질을 처리하지 않은 경우)와 비교하여, 발현이 상향조절된 것을 모야모야질병의 치료용 후보물질로 선별할 수 있다.

본 방법에서 사용되는 단백질의 양, 세포의 종류 및 시험물질의 양 및 종류 등은 사용하는 구체적인 실험방법 및 시험물질의 종류에 따라 달라지며, 당업자라면 적절한 양을 선택할 수 있을 것이다. 실험결과 시험물질과 접촉되지 않은 대조군과 비교하여 시험물질의 존재하에서 단백질 발현 또는 활성의 증가를 가져오는 물질을 후보 물질로 선별한다. 대조군과 비교 약 99% 이상 증가, 약 95% 이상 증가, 약 90% 이상 증가, 약 85% 이상 증가, 약 80% 이상 증가, 약 75% 이상 증가, 약 70% 이상 증가, 약 65% 이상 증가, 약 60% 이상 증가, 약 55% 이상 증가, 약 50% 이상 증가, 약 45% 이상 증가, 약 40% 이상 증가, 약 30% 이상 증가, 약 20% 이상 증가를 의미하나, 이를 벗어나는 범위를 제외하는 것은 아니다.

또한 이런 치료제를 스크리닝하는 방법으로는, 본원의 마커를 친화성 칼럼에고정시키고 이를 시료와 접촉시켜 정제하는 방법 [Pandya et al, Virus Res 87: 135-143, 2002] 및 대용량스크리닝 방법 [Aviezer et al, J Biomol Screen 6: 171-7, 2001] 등 을 비롯한 다수의 공지의 방법을 사용할 수 있으며, 당업자라면 구체적인 실시양태에 따라 적절한 방법을 선택할 수 있다. 스크리닝에 사용하기 위한 시험물질을 포함하는 시료로서는 조직 추출액, 유전자 라이브러리의 발현산물, 합성화합물, 합성 펩티드, 천연 화합물 등이 있으나 이에 제한되지는 않는다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실험 방법

환자

혈액은 서울대학교 Institutional review board approval (SNUH IRB 1404-006-567) 승인하에 서울대학교 어린이병원에서 모야모야병으로 진단되어 수술받은 환자 및 정상대조군에서 고지된 동의를 받고 수득하였다. 대조군으로는 뇌졸중, 고혈압, 또는 흡연력이 없는 젊은 성인의 시료를 사용하였다.

마이크로어레이 mRNA 실험을 위해, MMD 환자로부터 7개의 시료 (1개 남성 시료/6개 여성시료, Mean 나이: 18살)를 수득하고, 4개의 정상 대조군 시료 (2개 남성 시료/2개 여성 시료, Mean 나이: 23살). 인비트로 실험의 경우, 6개의 MMD 환자 시료 (3 개 남성 시료/3개 여성 시료, Mean 나이; 11살) 및 4개의 정상 대조군 시료 (2개 남성 시료/2개 여성 시료, Mean 나이: 23살)를 사용하였다. 인비보 실험의 경우 3개의 MMD 시료 (1개의 남성 시료/2개의 여성 시료, Mean 나이; 11살) 및 3개의 정상 대조군 시료 (2개의 남성 시료/1개의 여성 시료, 평균 나이: 23살)을 사용하였다(표 1).

[표 1] 모야모야질병 환자 및 정상 대조군의 특징

혈관내피 군집 형성 세포( ECFC )의 분리 및 특징분석

ECFC 계통 분리를 위한 연층(buffy coat) 제조 및 단핵세포(MNC) 배양 절차는 문헌(Kim JH, et al., J Neurosci Res. 2010;88:510-518.)에 기재한 바와 같다. 요약하면 수집 후 2시간 이내에 모든 혈액 샘플(40 ml)을 처리하였다. 10% 우태아혈청을 가진 혈관내피세포 성장 배지(EGM-2; Clonetics, USA) 내에 콜라겐 타입 I(BD BioCoat; BD Biosciences, USA)으로 코팅한 배양 접시에 MNC를 접종하였다. 인체 탯줄정맥 혈관내피 세포(Human umbilical vein endothelial cells = HUVEC: Catalog number CRL-1730; ATCC, USA)를 EGM-2 배지에서 성장시켰다. 모든 세포 배양은 5% CO₂의 습한 공기에서 37℃를 유지하였다. 모든 실험은 6번빼 세포 패시지(passage)전에 수행하였다.

ECFC는 FACS(fluorescence-activated cell sorting) 분석 및 CD34, KDR, CD133, CD31, CD45 및 vWF에 대한 항체를 사용한 면역형광염색으로 표면 마커를 분석하였다. 유세포분석기로 분석하기 위하여, 1 X 10⁶ 세포를 배양하여, 항인체 CD34 (BD Biosciences: Catalog # 555822), KDR (R&D: Catalog # FAB357P), CD133 (Miltenyi biotec: Catalog # 130-080-801), CD31 (BD Biosciences: Catalog # 560983) 및 CD45 (BD Biosciences: Catalog # 560975)가 접합된 각각 10㎕의 PE (phycoerythrin)로 염색하였다. FACScan 유세포분석기(Becton Dickinson) 및 CellQuest 소프트웨어(Becton Dickinson)를 사용하여 상기 데이터를 분석하였다. 항-CD31 (Santa Cruz Biotechnology: Catalog # sc-1506) 및 항-vWF (DAKO: Catalog # M0616) 항체를 사용하여 면역형광염색을 수행하였다.

유전자 발현 분석

TRIzol 시약(Invitrogen, USA)을 제조자의 방법대로 사용하여 총 RNA를 추출하여 RNeasy 미니 킷트(Qiagen,USA)를 사용하여 정제하였다. NanoDrop 분광광도계(NanoDrop Technologies, USA) 및 Agilent Bioanalyzer (Agilent Technologies, USA)를 사용하여 상기 RNA의 순도 및 농도를 측정하였다. 상기 RNA를 증폭시켜 문헌(Park WY, et al., Oncogene. 2002;21:8521-8528.)에 기재한 바와 같이 Affymetrix Human Gene 1.0 ST 어레이에 혼성화시켰다. 스캔되어 얻은 원발현수치(raw expression value)는 RMA 방법(robust multi-array average approach)을 사용하여 배경-수정하고, 정규화하여 요약하였다. 로그 2로 변환된 데이터를 얻어 다음 분석에 사용하였다. SAM(Significance analysis of microarray)를 사용하여 천개의 순열(permutation)을 수행하여 예측 점수 및 FDR(False Discovery Rate)을 계산하였다. DEGs를 확인하기 위한 통계 기준은 절대 배수-변화(≥ 2.0) 및 p-수치(< 0.01)로 정의되었다. 다수 비교를 조정하기 위하여, BH FDR(Benjamini-Hochberg false discovery rate)-조정된 p-수치를 계산하였다. DAVID 유전정보학(bioinformatics) 자원 (http://david.abcc.ncifcrf.gov)을 사용하여 차별 상향 또는 하향 조절된 유전자 중에서 과-표현된 유전자 온톨로지, 생물학적 과정(GO_BP) 카테고리, 및 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 경로를 탐지하였다.

RT-PCR을 위하여 유전자 특이적 프라이머 세트(RALDH2: 센스 5’-AGGCCCTCCTCGCTCAC, 안티센스 5’-TGCCCCAGAATGAGCTCA 및 GAPDH: 센스 5’-CAGCCACTTTGTCAAGCTCA, 안티센스 5’-AGGGGTCTACATGGCAACTG)로 AccuPower PCR premix (Bioneer, Korea)를 사용하였다. PCR 생성물을 1.5% 아가로즈 겔에 용해시켜 SYBR®Safe DNA 겔 염색 (Invitrogen)으로 염색시켜 UV 트랜스일루미네이터(transilluminator)를 사용하여 가시화하였다. 실시간 정량적 RT-PCR(qRT-PCR) 또한 수행하여 SYBR®green master mix (Applied Biosystems)를 지닌 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA)에서 RALDH2 전사 양을 측정하였다. 글리세알데히드 3-포스페이트 데하이드로게나아제(GAPDH)를 표준(reference)로 사용하였다. 상대적 유전자 발현은 2^{- ΔΔCt}방법을 사용하여 얻은 Ct 수치로 결정하였다.

RALDH2 단백질 레벨은 항-인체 RALDH2(Santa Cruz Biotechnology: Catalog # sc-22593) 항체를 사용하여 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 화학발광은 Fluorchem HD2 (Alpha Innotech/Hns Bio, San Leandro, CA)를 사용하여 분석하였다.

siRNA 트랜스팩션을 하기 위하여 aRNAiMAX transfection kit (Invitrogen)를 사용하여 정상 ECFC를 서로 다른 서열의 2개의 RALDH2(RALDH2 (A) : 센스 5’-CUCAGACUUUGGACUCGUA, 안티센스 5’-UACGAGUCCAAAGUCUGAG 및 RALDH2 (B) : 센스 5’-GACAUGAACCCAUUGGAGU, 안티센스 5’-ACUCCAAUGGGUUCAUGUC) 및 비특이적 대조군 siRNA(Bioneer) 로 트랜스팩션하였다.

ATRA (all-trans retinoic acid) 제조 및 처리

ATRA (Sigma, Deisenhofen, Germany)를 디메틸설폭시드(DMSO)에 용해시켜 지정된 농도로 세포 배양 배지의 ECFC에 투여하였다. 각 실험에서 대조군으로는 동량의 DMSO를 사용하였다.

모세혈관-형성 분석

상기 세포(2×10⁴ 세포/웰)를 마트리겔(BD Biosciences)-코팅된 48-웰 플레이트에 플레이팅하여 ATRA 존재 또는 부존재하에 18시간동안 배양하였다. 상기 실험은 세 배수로 수행하였다. 2명의 독립적 관측자가 4개의 무작위의 현미경 필드에서 혈관 및 가지 수를 세고, 혈관 길이를 측정하였다(X 40 배율).

세포 생존능력, 증식 및 세포 주기 분석

Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)를 제조자의 방법대로 사용하여 세포 생존능력을 측정하였다. 즉, 상기 세포를 96-웰 플레이트(1×10⁴ 세포/웰)에 씨딩하였다. 18시간동안 배양한 후, 상기 세포의 생존능력을 마이크로플레이트 리더를 사용하여 측정하여 5 웰의 평균 농도로 표현하였다. 상기 실험은 세 배수로 수행하였다.

BrdU-ELISA (Colorimetric Cell Proliferation ELISA; Roche applied science, Mannheim, Germany)를 제조자의 방법대로 사용하여 세포 증식 분석을 수행하였다. 상기 세포(1×10⁴ 세포/웰)를 96-웰 플레이트의 웰에 씨딩하여 100㎕의 배양 배지에서 배양하였다. 18시간 배양한 후, BrdU로 상기 세포를 12시간동안 라벨시켜 흡광도를 측정하였다. 5웰 각 세트의 평균 농도를 측정하였다. 상기 실험은 세배수로 수행하였다.

세포 주기 프로파일을 프로피디움 아이오다이드(PI) 염색 및 유세포 측정기로 분석하였다. 세포(1×10⁶ 세포/웰)를 각각 ATRA로 처리하거나 또는 RALDH2 siRNA로 트랜스팩션한 후 18시간동안 배양하였다. 상기 세포를 하베스트하여 70% 차가운 에탄올로 고정시켰다. 상기 고정된 세포는 50 μg/ml PI 용액, 0.1 mg/ml RNase A 및 0.05 % triton X-100와 함께 37℃에서 배양하였다. FACScan flow cytometer (Becton Dickinson)를 사용하여 유세포 분석을 수행하여, 3개의 독립적 실험을 통해 세포주기 상 서로 다른 주기에 있는 세포의 백분율을 계산하였다.

이동 분석

단층 스크랫치 운드 분석(monolayer scratched wound assay)를 사용하여 ECFC의 이동을 측정하였다. 세포(6 웰 플레이트에 5 X 10⁵ 세포, n=3)를 6-웰 플레이트 내에 씨딩하여 세포 단층을 스크랩하였다. 나머지 세포를 PBS로 조심히 씻어 ATRA 존재 또는 부존재하에 배양하였다. computer-assisted microscope를 사용하여 24시간 후, 이동 지역을 측정하였다. 상기 실험은 3배수로 수행하였다.

인 비보 마트리겔 혈관신생 분석

6-7-주령 BALB/c-nude 마우스(Orient Bio Inc, Sung-nam, Korea)를 사용하여 문헌(Fraineau S, et al., Blood. 2012;120:5073-5083 ; Kim KL, et al., CardiovascRes. 2011;92:132-140 ; Liu Z, et al., J Cell Sci. 2009;122:3294-3302)에 기재된 바와 같이 마트리겔 플러그 분석을 수행하였다. 모든 동물실험 절차는 서울대학교 병원의 동물실험 윤리위원회(IACUC number: 12-0383-C2A3)의 승인을 받았다. 4% 이소플루오란으로 마취를 유도하고 1-3% 산소를 유지하였다. 상기 마우스를 무작위로 4 그룹(n = 8)으로 나누고 마트리겔 플러그를 실험조건하에 제조하였다; 10μM의 ATRA 존재 또는 부존재하의 정상 ECFC(1X10⁶ ECFC) 혼합물, 또는 10μM의 ATRA 존재 또는 부존재하의 MMD ECFC(1X10⁶ ECFC) 혼합물을 함유하는 마트리겔(200㎕, BD Biosciences). 성장 인자는 첨가되지 않았다. 마트리겔 혼합물을 피하 주사하였다. 7일째에, 상기 마우스를 희생시켜 상기 마트리겔 플러그를 피부에서 절제해냈다.

인체 혈관내피세포의 혈관신생을 확인하기 위하여, 이중 면역형광 염색을 수행하였다. 조직 슬라이드를 탈파라핀화하고, 재수화하여 항원 회복용액(antigen retrieval solution)(Invitrogen)에서 배양하고, 30분 동안 0.2% Triton-X100 in PBS로 투과하여, PBS 내의 1% BSA 및 10% 정상 염소 혈청(Jackson Immunoresearch Laboratories)로 실온에서 1시간동안 블락하였다. 섹션을 항-인체 핵(1:200, Millipore, Temecula, CA) 및 항-인체 CD31 (1:400, Millipore, Temecula, CA, USA)으로 4℃에서 밤새, 이어 Alexa-488 및 Alexa-594 (1:600, Invitrogen)에 접합된 항-염소 IgG로 1시간동안 면역염색하였다. 세척 후에, 4’디아미디노-2-페닐인돌(DAPI; Vector Laboratories, Burlingame, CA)을 함유하는 페이딩방지 용액(anti-fading solution)으로 조직 세션을 마운트하였다. 상기 섹션을 공초점 현미경(Zeiss)으로 분석하였다. 고출력장(high-power field) 당 인체 핵 및 CD31 이중-양성으로 염색된 이미지 픽셀 수로 종양 혈관 지역 백분율을 계산하였다. 8개의 독립된 실험에서 얻은 마트리겔 플러그로 정량화를 수행하였다. 2개의 독립된 관측자에 의한 각 플러그의 세 개의 무작위 섹션에서 수치를 얻었다.

본 마트리겔 플러그 분석이 ‘인 비보’조건임에도 불구하고 MMD의 실제 환경 세팅을 재현한 것은 아니라는 것을 주목하여야 한다. 또한, ‘RA에 의한 성장 인자 및 싸이토카인의 저해’가 MMD에서의 ECFC의 병인적 역할에 대한 본 발명자의 주요 가정의 하나이기 때문에 성장 인자는 의도적으로 제외되었다.

ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)

시중의 멀티플렉스 샌드위치 ELISA 분석(VersaMAP Development System; R&D Systems, USA)를 사용하여 염기성 섬유모세포 성장인자(basic fibroblast growth factor = bFGF), 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor = HGF), 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor = VEGF), 매트릭스 메탈로프로테이나아제-3(matrix metalloproteinase-3 = MMP-3), MMP-9, MCP-1(monocyte chemoattractant protein-1), 세포간 응집 분자-1(intercellular adhesion molecule-1 = ICAM-1), 혈관 세포 응집 분자(vascular cell adhesion molecule-1 = VCAM-1), E-셀릭틴, 및 인터루킨-1(IL-1)의 농도를 측정하였다. ATRA를 처리한 또는 처리하지 않은 MMD ECFC에서 얻은 조절된(Conditioned) 배지 샘플을 LX200 instrument (Millipore, Billerica, MA)로 3회 판독하였다.

크로마틴 면역침강 (Chromatin immunoprecipitation , ChIP ) 분석

배양한 ECFC를 1% 포름알데히드로 처리하여 세포 용해물을 하베스트하여 Bioruptor (Diagenode, Liege, Belgium)를 사용하여 소니케이션하였다. 상청액을 ChIP 희석 버퍼로 10배 희석하여 10% 샘플을 인풋(input)에 장착하였다. 상기 상청액을 Salmon Sperm DNA/단백질 아가로스로 프리-클리어(pre-clear)하여 항-아세틸 H3 항체와 함께 배양하였다. NucleoSpin column (Macherey-Nagel, Duren, Germany)을 사용하여 아세틸-H3 결합 DNA 분획을 분리하였다. RALDH2 프로모터와 아세틸 H3와의 결합은 하기 프라이머를 사용하여 Mx3005P (Agilent Technologies) 상에서 정량적 PCR로 측정하였다: RALDH2 프로모터 부위 1 (센스e 5’-GGAGAGCGCATTCTCTTGGT, 안티센스 5’-AGTTACTGCCTTTGCCTGCT); RALDH2 프로모터 부위 2 (센스 5’-TGTGGCACTTGTCTGGGTTT, 안티센스 5’-CTGCTGGGAATGCTCACAGA); RALDH2 1st 인트론(센스 5’-CCCTCAAGACCCACACTCAC, 안티센스 5’-TACCTGGCCTGTAGAGGGTC); GAPDH 프로모터(센스 5’-CCCAACTTTCCCGCCTCTC, 안티센스 5’-CAGCCGCCTGGTTCAACTG).

통계 분석

데이타는 평균 (Mean) ±SD로 나타내었다. 마이크로어레이 데이타 분석을 하기 위하여, non-parametric SAM (Significance analysis of microarrays) 테스트를 사용하였다. 그 외 실험 데이터에는, 달리 언급하지 않는 한 Wilcoxon rank sum test를 사용하여 서술적데이터의 가시화에 사용하였다. P<0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

실시예 1. 정상 ECFC 및 MMD ECFC 의 세포표면 마커 발현 패턴 분석

MMD를 지닌 9명 환자 및 4명의 정상 대조군에서 late ECFC를 분리하였다(표 1). 방추형의 콜로니 및 양성 DiI-Ac-저밀도 리포단백질 섭취(uptake)가 씨딩(seeding) 7일 후에 나타났고 연속적으로 형태가 변화하는 것이 관찰되었다(도 7A 및 7C). 배양시에 MMD를 앓는 환자의 후기 ECFC이 전형적인 내피 조약돌 형태인 것은 정상 ECFC의 것과 다르지 않았다.

본 발명자는 또한, CD34, KDR, CD133, CD31, 및 CD45와 같은 late ECFC의 세포 표면 마커의 표현 레벨을 유세포 분석기로 체크하여 양 그룹사이의 유사 패턴을 찾았다(도 7B). 나아가 CD31 및 폰빌레브란트 인자에 대한 면역염색을 통해 분리한 ECFC의 분화 상태를 입증하였다(도 7D). MMD ECFC는 정상 ECFC는 알려진 모든 표면 마커의 발현 패턴은 동일한 것으로 나타났다.

실시예 2. MMD 환자 유래의 후기 ECFC의 유전자 발현 프로파일링

MMD ECFC의 기능적 결함(Kim JH, et al., J Neurosci Res. 2010;88:510518. doi: 10.1002/jnr.22228)을 이해하기 위하여, MMD 및 정상 ECFC의 유전자 발현 프로파일을 실험방법 부분에 기재된 바와 같이 분석하였다. 결과는 도 1에 기재되어 있다. 총 537개의 서로 다르게 발현된 유전자에 절대 배수(fold)-변화(≥ 2.0) 및 P 값(<0.01)과 같은 선택 기준을 적용하여 확인하였다. 유전자 온톨로지(생물학적 과정) 및 경로의 유전자 강화(enrichment) 분석을 통해, 면역 반응 및 주화성(chemotaxis)을 포함한 생물학적 과정이 MMD ECFC에서 상당히 증가되었다는 것을 알 수 있었다. 그러나 세포 주기 및 DNA 손상과 관련된 생물학적 과정은 MMD ECFC에서는 억제되어 있었다. 대사 및 시그날링 과정 측면에서, 세포외 기질-수용체 상호작용, 및 세포 응집 분자가 MMD ECFC에서 활성화된 반면, DNA 복제, 세포 주기 및 불일치 복구(mismatch repair)에 대한 유전자는 하향조절되었다. 이들 증강된(enriched) 생물학적 과정의 패턴 또는 경로에는 MMD ECFC의 결함 기능이 반영되었다. 서로 다르게 발현된 유전자 중에서, 생합성과정동안 레티날을 RA로 환원하는 것을 매개하는 효소인 RALDH2가 MMD ECFC에서 일관되게 하향 조절된 것으로 나타났다 (도 1A).

실시예 3. MMD ECFC에서 RA 생합성 및 RA 시그널링의 변경 확인

정상 ECFC와 비교하여 MMD ECFC에서 RALDH2의 발현이 4.2 배 감소한 것을 역전사 PCR(P<0.001; 도 1B)로 확인하였고 단백질 수준에서도 확인하였다(도 1C). RALDH2가 레티날이 RA로 환원하는 것을 촉매하기 때문에, 본 발명자는 RA가 ECFC의 정상적 생물학적 기능에 필요하다고 생각하였다. 이에 우선 RA가 인비트로에서 ECFC의 혈관 생성을 자극하는지 확인하였으며 이는 인비보에서 혈관을 생성여부도 확인할 수 있는 것이다. 도 2A에 나타난 바와 같이, ATRA를 추가하면 용량의존적으로 MMD ECFC의 혈관 형성이 자극되었다. 그러나 정상 ECFC의 혈관 형성은 ATRA에 의해 영향을 받지 않는 것으로 나타났다. MMD ECFC에서는, ATRA 처리에 의해 혈관 가지의 수 및 형성된 혈관의 수 모두 상당히 증가하였다(도 2B). 혈관 형성이 증가가 세포 증식에 의한 것일 가능성을 배제하기 위하여, 세포 생존능력, 세포 증식 및 세포 주기 콤포지션을 평가하였다. 그 결과 ATRA 처리의 존재 또는 부재시 상기 3개 파라미터에서 차이점이 발견되지 않았다(도 2C 및 2D). 또한, ATRA 처리에 의해 MMD ECFC의 이동에 변화가 없었다(도 2E). 이러한 결과는, 혈관 형성에서의 RA의 자극 효과가 세포 증식 또는 세포 이동의 변화로 인한 것이 아님을 나타낸다.

MMD ECFC에서의 RALDH2의 하향조절의 효과를 연구하기 위하여, 정상 ECFC에 RALDH2에 대한 siRNA를 도입하여 혈관 형성 활성을 측정하였다. 정상 ECFC에서 RALDH2를 녹다운한 후 (도 8), 인비트로 모세혈관 형성 능력이 상당히 감소하였다. 혈관의 형태는 현저하게 붕괴되었고(도 3A), 혈관 가지 수 및 형성된 혈관 수 모두 극적으로 감소하였다(도 3B). 정상 대조군의 ECFC의 세포 생존능력, 증식, 및 세포 주기는 siRNA-처리 세포에서는 변경되지 않았다(도 3C). 중요한 것은 정상 ECFC에서의 RALDH2 녹다운의 효과는 ATRA 처리에 의해 상당히 바뀌었다는 것으로 도 4에 나타난 바와 같이, RALDH2 녹다운된 정상 ECFC는 모세혈관 혈관을 형성하는 능력이 부분적으로 회복되었는데, 이는 RALDH2 녹다운의 효과가 RA 조절을 통해 나타났다는 것을 말한다. ATRA 존재 또는 부재시에 RALDH2 녹다운 후의 혈관 형성은 인간 탯줄정맥 내피 세포를 사용하였을 때에도 반복되었고 유사한 경향이 관찰되었다(도 9).

또한, 인비보에서 잠재적 혈관 신생에 대한 ATRA의 효과를 마트리겔 플러그 어세이를 사용하여 평가하였다. MMD ECFC는 정상 ECFC에 비해 잠재적 혈관 신생이 상당히 저조하였고(P<0.001, 도 5A 및 5B) 이는 인비트로 혈관 형성 결함 결과와 일치하는 것이다. 특히 ATRA 처리하거나 또는 처리하지 않은 경우 혈관 신생의 정도를 MMD ECFC를 비교하였을 때, ATRA 처리에 의해 MMD ECFC에서 인간 핵 및 CD31-이중 양성 혈관 부위에서 혈관 신생이 상당히 증가하였다(P<0.001, 도 5A 및 5C).

ATRA-조절 용해성 인자가 MMD ECFC에 대한 혈관 형성에 관여하는지를 테스트하기 위하여, 싸이토카인, MMP(matrix metalloproteinases), 및 혈관 신생 인자의 레벨을 다중분석으로 측정하였다. 상기 결과에서 ATRA 처리 후 MMD ECFC 배양의 상층액에서의 TGF-β1, MMP-9, 및 혈관 세포 고착 분자-1의 농도가 상당히 감소한 것으로 나타났다(표 2). 특히 MMP-9가 >10배 현저하게 감소하였다 (1308.4±518.7 pg/mL before ATRA treatment, 115.3±45.0 pg/mL after ATRA treatment; P=0.025).

[표 2] MMP (Matrix Metalloproteinases ), 싸이토카인 및 혈관신생 인자에 대한 멀티플렉스 분석

bFGF= 염기성 섬유모세포 생장인자(basic fibroblast growth factor); DMSO= 디메틸 설폭시드; HGF=간세포생장인자(hepatocyte growth factor); ICAM-1= 세포간 접합분자(intercellular adhesion molecule)-1; IL-β1= 인터루킨-β1; MCP-1= monocyte chemoattractant protein-1; MMP= matrix metallo proteinase; RA= retinoic acid; TGF-β1= transforming growth factor-β1; VCAM-1= vascular cell adhesion molecule-1; VEGF= vascular endothelial growth factor.

*대조군과 유의한 차이, P<0.05 by Student t test.

실시예 4. RALDH2 의 후성적 탈조절 (Epigenetic Deregulation)

MMD ECFC에서의 RALDH2 유전자 발현이 감소되는 기전을 규명하기 위하여, 우선 전사 개시 부위로의 상향 > 5kb 프로모터 서열에서 다형성 또는 변이여부를 조사하였는데, 아무것도 관찰되지 않았다(데이타는 제시하지 않음). 다음으로, 본 발명자는 RALDH2 프로모터 부위에 CpG 아일랜드의 DNA 메틸화를 체크하였다. 상기 프로모터 부위에는 1467-bp CpG 아일랜드가 있는데, 대부분 CpG 부위는 비설페이트 서열에는 메틸화되어 있지 않았다(데이타는 제시하지 않음). 최종적으로, RALDH2의 크로마틴 조절을 조사하였으며, ENCODE (Encylopedia of DNA elements) 데이터베이스에는, ChIP-seq 데이타를 근거로 H3K27Ac 히스톤 마크를 포함하는 5-kb 활성 프로모터 지역이 RALDH2 유전자인 것으로 예측되었다(http://genome.ucsc.edu/ENCODE). H3K27Ac 히스톤 마크는 활성화된 전사와 강한 연관성이 있기 때문에(Wang Z, et al., Nat Genet. 2008;40:897903. doi: 10.1038/ng.154.;KarliR, et al., Proc Natl Acad Sci U SA. 2010;107:29262931. doi: 10.1073/pnas.0909344107), RALDH2 프로모터 및 ChIP에 의한 아세틸-히스톤 H3 사이의 연관성을 조사하였다(도 6A 및 6B). 그 결과 RALDH2 프로모터는 정상 ECFC에서는 아세틸-H3와 연관되어 있었으며, 이는 2개의 프라이머 세트(RALDH2 프로모터 부위 1 및 RALDH2 프로모터 부위 2)로 재확인되었다. 반대로, MMD ECFC에서는 RALDH2 프로모터 부위와 아세틸-H3와의 연관이 소실된 것으로 나타났다. H3K27Ac 히스톤 마크 바깥에 위치한 RALDH2의 첫 인트론을 음성 대조군으로 작용하였으며, GAPDH 유전자 프로모터는 정상 및 MMD ECFC 둘다에서 아세틸-H3 연관이 서로 비슷한(comparable) 것으로 나타났는데, 이는 탈조절된 아세틸-H3 연관이 선택 부위에서 일어났다는 것을 의미한다. 즉, MMD ECFC에서 RALDH2 생산이 감소된 것이 변경된 히스톤 마크 및 프로모터 탈조절 때문이라는 것을 의미한다.

종합하면, 본원에서는 유전자 발현 프로파일링을 통해 정상 대조군에 비해 MMD ECFC에서 다르게 발현된 유전자 리스트를 생산하였으며, 그중 RA 생합성을 조절할 수 있는 RALDH2가 MMD ECFC에서 현저히 하향조절된다는 것을 발견하였다. RA는 내피 세포의 혈관 형성(혈관 신생)을 유도하는 작용을 하므로, RALDH2가 하향조절되면 MMD ECFC의 혈관 신생 기능에 결함이 생길 수 있다. 이러한 RALDH2 하향조절은 아세틸-히스톤 H3-프로모터 간의 결합이 감소하는 기전에 의해 일어나는 것을 확인하였다. 또한 본 발명에서는, RA 특히 ATRA 처리에 의해 MMD ECFC의 손상된 기능이 회복될 수 있다는 것을 입증하였다.

<110> SNU R&DB Foundation SAMSUNG LIFE PUBLIC WELFARE FOUNDATION <120> Diagnostic biomarker for Moyamoya disease and use thereof <130> DP201508014P <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1630 <212> DNA <213> RALDH2 gene from Homo sapiens <400> 1 gcactgcccc acgccgcggg ctagggacac ccggcccgcc accatgactt ccagcaagat 60 agagatgccc ggcgaggtga aggccgaccc cgccgccctc atggcgtcgc tgcacctcct 120 gccgtcgccc acgcccaatc tcgaaattaa gtacaccaag atctttataa acaacgagtg 180 gcagaactca gagagtggga gagtgttccc tgtctataat ccagccacag gagaacaggt 240 gtgtgaagtt caagaagcag acaaggcaga tatagacaaa gcagtgcagg cagcccgcct 300 ggctttctct cttggttcag tgtggagaag gatggatgct tcagaaaggg gacgtctgtt 360 ggataagctt gcagacttgg tggaacggga cagggcagtt cttgcaacca tggaatccct 420 aaatggtggc aaaccattcc tgcaagcttt ttatgtggat ttgcagggcg tcatcaaaac 480 ctttcgatat tacgcaggct gggctgataa aattcatggg atgaccattc ctgtagatgg 540 agactatttt acctttacaa gacatgaacc cattggagtg tgtggacaga tcatcccatg 600 gaacttcccc ctgctgatgt ttgcctggaa aatagctcca gctttgtgct gtggcaatac 660 agtagttatt aagccagcag agcaaacacc actcagtgca ctctacatgg gagccctcat 720 caaggaggct ggctttcctc ccggggtcat caatattttg ccaggatatg ggccaacggc 780 tggggcagca atagcttctc acattggcat agacaagatt gcattcacag ggtctactga 840 ggttggaaag cttatccaag aagcagctgg aagaagtaat ttgaagagag taactctgga 900 acttggaggc aaaagtccta atattatttt tgctgatgct gacttggact atgctgtgga 960 gcaggcccac cagggtgtgt tcttcaatca aggtcagtgc tgcactgcag gctctcgcat 1020 cttcgtggag gagtccatct atgaggagtt tgtgagaaga agcgtggagc gggccaagag 1080 gcgcatagtg gggagtccct ttgaccccac cactgagcag ggtccccaga ttgataagaa 1140 acagtacaac aagatcttgg aactcatcca gagtggtgtg gctgagggcg ccaagctgga 1200 atgtggaggc aaaggactgg gccgaaaggg gtttttcatt gagcccacag tgttttccaa 1260 cgtcactgat gatatgcgga ttgccaagga ggagatcttt ggccctgttc aggaaatttt 1320 gagatttaag acgatggatg aagttatcga aagagccaat aactcagact ttggactcgt 1380 agcagctgtc tttactaatg acatcaacaa ggccctcaca gtgtcttctg caatgcaagc 1440 tgggactgtt tggatcaatt gttacaatgc cttaaatgcc cagagcccct ttgggggatt 1500 caagatgtct ggaaatggga gagaaatggg agaatttggc ttgcgggagt actcagaagt 1560 taagacggtg acagtaaaga tcccccagaa gaactcctaa gaaggccaag aaggaggatg 1620 aagcccagcc 1630 <210> 2 <211> 518 <212> PRT <213> RALDH2 Protein from Homo sapiens <400> 2 Met Thr Ser Ser Lys Ile Glu Met Pro Gly Glu Val Lys Ala Asp Pro 1 5 10 15 Ala Ala Leu Met Ala Ser Leu His Leu Leu Pro Ser Pro Thr Pro Asn 20 25 30 Leu Glu Ile Lys Tyr Thr Lys Ile Phe Ile Asn Asn Glu Trp Gln Asn 35 40 45 Ser Glu Ser Gly Arg Val Phe Pro Val Tyr Asn Pro Ala Thr Gly Glu 50 55 60 Gln Val Cys Glu Val Gln Glu Ala Asp Lys Ala Asp Ile Asp Lys Ala 65 70 75 80 Val Gln Ala Ala Arg Leu Ala Phe Ser Leu Gly Ser Val Trp Arg Arg 85 90 95 Met Asp Ala Ser Glu Arg Gly Arg Leu Leu Asp Lys Leu Ala Asp Leu 100 105 110 Val Glu Arg Asp Arg Ala Val Leu Ala Thr Met Glu Ser Leu Asn Gly 115 120 125 Gly Lys Pro Phe Leu Gln Ala Phe Tyr Val Asp Leu Gln Gly Val Ile 130 135 140 Lys Thr Phe Arg Tyr Tyr Ala Gly Trp Ala Asp Lys Ile His Gly Met 145 150 155 160 Thr Ile Pro Val Asp Gly Asp Tyr Phe Thr Phe Thr Arg His Glu Pro 165 170 175 Ile Gly Val Cys Gly Gln Ile Ile Pro Trp Asn Phe Pro Leu Leu Met 180 185 190 Phe Ala Trp Lys Ile Ala Pro Ala Leu Cys Cys Gly Asn Thr Val Val 195 200 205 Ile Lys Pro Ala Glu Gln Thr Pro Leu Ser Ala Leu Tyr Met Gly Ala 210 215 220 Leu Ile Lys Glu Ala Gly Phe Pro Pro Gly Val Ile Asn Ile Leu Pro 225 230 235 240 Gly Tyr Gly Pro Thr Ala Gly Ala Ala Ile Ala Ser His Ile Gly Ile 245 250 255 Asp Lys Ile Ala Phe Thr Gly Ser Thr Glu Val Gly Lys Leu Ile Gln 260 265 270 Glu Ala Ala Gly Arg Ser Asn Leu Lys Arg Val Thr Leu Glu Leu Gly 275 280 285 Gly Lys Ser Pro Asn Ile Ile Phe Ala Asp Ala Asp Leu Asp Tyr Ala 290 295 300 Val Glu Gln Ala His Gln Gly Val Phe Phe Asn Gln Gly Gln Cys Cys 305 310 315 320 Thr Ala Gly Ser Arg Ile Phe Val Glu Glu Ser Ile Tyr Glu Glu Phe 325 330 335 Val Arg Arg Ser Val Glu Arg Ala Lys Arg Arg Ile Val Gly Ser Pro 340 345 350 Phe Asp Pro Thr Thr Glu Gln Gly Pro Gln Ile Asp Lys Lys Gln Tyr 355 360 365 Asn Lys Ile Leu Glu Leu Ile Gln Ser Gly Val Ala Glu Gly Ala Lys 370 375 380 Leu Glu Cys Gly Gly Lys Gly Leu Gly Arg Lys Gly Phe Phe Ile Glu 385 390 395 400 Pro Thr Val Phe Ser Asn Val Thr Asp Asp Met Arg Ile Ala Lys Glu 405 410 415 Glu Ile Phe Gly Pro Val Gln Glu Ile Leu Arg Phe Lys Thr Met Asp 420 425 430 Glu Val Ile Glu Arg Ala Asn Asn Ser Asp Phe Gly Leu Val Ala Ala 435 440 445 Val Phe Thr Asn Asp Ile Asn Lys Ala Leu Thr Val Ser Ser Ala Met 450 455 460 Gln Ala Gly Thr Val Trp Ile Asn Cys Tyr Asn Ala Leu Asn Ala Gln 465 470 475 480 Ser Pro Phe Gly Gly Phe Lys Met Ser Gly Asn Gly Arg Glu Met Gly 485 490 495 Glu Phe Gly Leu Arg Glu Tyr Ser Glu Val Lys Thr Val Thr Val Lys 500 505 510 Ile Pro Gln Lys Asn Ser 515

Claims (16)

1. RALDH2 (retinaldehyde dehydrogenase 2) 마커의 검출 시약을 포함하는 모야모야병(Moyamoya disease) 진단용 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 검출 시약은 상기 마커를 단백질 또는 핵산 수준에서 검출할 수 있는 시약인, 모야모야병 진단용 조성물.
   
3. 제 2 항에 있어서,
   상기 마커의 단백질 수준 검출 시약은 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석, 또는 단백질 마이크로어레이용 시약인, 모야모야병 진단용 조성물.
   
4. 삭제
5. 제 2 항에 있어서,
   상기 마커의 핵산 수준 검출 시약은 중합효소연쇄반응, 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, 핵산 마이크로어레이 또는 노던블랏에 사용되는 시약인, 모야모야병 진단용 조성물.
   
6. 삭제
7. RALDH2 (retinaldehyde dehydrogenase 2) 마커의 검출 시약을 포함하는 모야모야병(Moyamoya disease) 진단용 키트.
   
8. 모야모야병의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여,
   검사 대상체 유래의 생물학적 시료로부터 RALDH2 바이오마커의 핵산 또는 단백질의 존재 여부, 또는 RALDH2 바이오마커의 핵산 또는 단백질의 농도를 검출하는 단계로, 상기 생물학적 시료는 말초혈액 유래의 ECFC (Endothelial Colony Forming Cell) 또는 이의 인비트로 배양물이고;
   상기 핵산 또는 단백질의 농도 또는 존재에 대한 검출 결과를 정상 대조군 시료의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계; 및
   상기 정상 대조군 시료와 비교하여, 상기 대상체 유래 시료의 핵산 또는 단백질 농도의 변화가 있거나, 또는 상기 핵산 또는 단백질이 존재여부에 변화가 있는 경우, 이를 모야모야병으로 판정하는 단계를 포함하는, 모야모야병 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 RALDH2 바이오마커를 검출하는 방법.
9. 삭제
10. 제 8 항에 있어서,
    상기 비교하는 단계는 상기 검사 대상체의 비마커 임상 정보를 추가로 사용하는 것인, 방법.
    
11. 제 10 항에 있어서,
    상기 검사 대상체의 비마커 임상정보는 상기 대상체의 나이, 성별, 체중, 기저질환, 뇌자기공명 영상촬영(MRI & MRA) 및 뇌혈류 검사 다이아목스를 이용한 뇌스캔 결과, 또는 뇌혈관 조영술 결과인, 방법.
    
12. RALDH2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 제공하는 단계;
    상기 단백질 또는 핵산과 시험물질을 접촉시키는 단계로, 상기 RALDH2 단백질 또는 핵산은 이를 포함하는 이를 발현하는 세포 또는 동물모델의 형태로 제공되고, 상기 세포는 말초혈액 유래의 ECFC (Endothelial Colony Forming Cell) 또는 이의 인비트로 배양물이고 ;
    상기 단백질의 활성 또는 상기 핵산의 발현정도를 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정하는 단계; 및
    상기 측정 결과, 시험물질이 처리되지 않은 대조군과 비교하여 시험물질이 처리된 세포에서 상기 단백질의 활성 또는 상기 핵산의 발현량이 증가한 경우, 이를 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, 모야모야병 치료용 물질을 스크리닝하는 방법.
    
13. 삭제
14. 삭제
15. RALDH2 단백질 또는 그 유전자, RALDH2 단백질 활성화제, 또는 RALDH2 유전자 발현 활성화제를 유효성분으로 포함하는 모야모야병 예방 또는 치료용 약학 조성물.
    
16. 삭제

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