CN111254201A

CN111254201A - Dennd1c作为诊治腹主动脉瘤的分子标志物的应用

Info

Publication number: CN111254201A
Application number: CN202010233043.XA
Authority: CN
Inventors: 张慧; 李方达; 陈思良; 杨丹; 郑月宏
Original assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Current assignee: Beijing Novi Precision Medical Research Institute
Priority date: 2020-03-28
Filing date: 2020-03-28
Publication date: 2020-06-09
Anticipated expiration: 2040-03-28
Also published as: CN111254201B

Abstract

本发明提供DENND1C作为诊治腹主动脉瘤的分子标志物的应用。本发明的研究表明DENND1C在健康对照和在腹主动脉瘤患者中的表达存在显著差异，据此认为DENND1C可以作为诊断腹主动脉瘤的分子标志物。另外，本发明还公开了DENND1C在制备治疗腹主动脉瘤的药物中的应用。

Description

DENND1C作为诊治腹主动脉瘤的分子标志物的应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及DENND1C的应用，具体涉及DENND1C 作为诊治腹主动脉瘤的分子标志物的应用。

背景技术

腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA)是一种常见的危及生命的动脉退行性疾病，其定义为腹主动脉段动脉壁三层结构持续性扩张至肾动脉处腹主动脉直径大小的1.5倍以上。在65岁以上男性的死亡原因中，AAA居第10位，且有超过10％的人受其困扰，并且在西方国家AAA的发病有逐年上升的趋势。而我国随着人口老龄化以及饮食结构的改变，AAA的发病率呈明显上升趋势，己经成为严重威胁我国人民生命健康的重大疾病之一。

临床上诊断AAA常见的手段主要有：常规体格检查、X线、腹部超声、CT 及MRI等。但是，无论是超声检查还是CT检查都是属于物理诊断方式，诊断灵敏性和特异性较差。目前研究人员对AAA分子标志物的研究较为关注，希望通过研究可以发现能够筛选、诊断AAA患者的生物标志物。

目前，对于腹主动脉瘤具体发病机制尚不完全清楚，已有的报道显示其发病与遗传因素、炎症、蛋白酶降解、平滑肌细胞凋亡等因素密切相关，其发病与其他肿瘤因化学辐射、基因突变等不同。人腹主动脉平滑肌细胞(HVSMCs)作为腹主动脉中膜的主要构成成分，对维持动脉壁结构和功能的完整性起到重要作用。近年来，一些报道显示腹主动脉瘤组织中VSMC数量的减少是其形成过程中一个关键因素。如何有效抑制VSMC的凋亡有望为延缓AAA的形成、发展提供新的治疗思路。

发明内容

为了克服现有技术不足，本发明的目的在于提供一种用于诊断腹主动脉瘤的基因标志物。本发明QPCR实验证明DENND1C在腹主动脉瘤患者中的表达水平明显高于健康对照，因此可以将DENND1C作为诊断腹主动脉瘤的分子标志物。

为了实验上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了检测基因表达的试剂在制备腹主动脉瘤诊断产品的应用；所述基因是DENND1C。

进一步，所述试剂包括利用SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测DENND1C表达量时使用的PCR扩增引物。

在本发明的具体实施方案中，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，或SEQID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

本发明提供了一种用于腹主动脉瘤诊断的产品，所述产品包括检测 DENND1C表达水平的试剂。

进一步，所述试剂包括SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测DENND1C表达量时使用的PCR扩增引物。

进一步，前面所述的产品包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断腹主动脉瘤的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的RNA表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的RNA表达谱，容易分析出哪个RNA的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知DENND1C表达异常与腹主动脉瘤相关也属于 DENND1C的用途，同样在本发明的保护范围之内。

所述试剂盒包括检测DENND1C表达量的试剂，所述试剂包括与DENND1C 或其DNA序列结合的核酸，所述核酸包括SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测DENND1C表达量时使用的PCR扩增引物。

所述芯片包括检测DENND1C表达量的试剂，所述试剂包括与DENND1C或其DNA序列结合的核酸，所述核酸包括能够检测DENND1C表达量的探针。

所述试纸包括检测DENND1C表达量的试剂，所述试剂包括与DENND1C或其DNA序列结合的核酸，所述核酸包括能够检测DENND1C表达量的探针。

本发明提供了一种用于治疗腹主动脉瘤的药物组合物，所述药物组合物包括抑制DENND1C基因表达的试剂。

进一步，所述试剂不受限制，只要是可以抑制DENND1C表达水平即可。

所述试剂包括siRNA、shRNA、抑制型miRNA、或抑制型靶向小分子化合物。

本发明的药物组合物可以作为医药单独施用或与其它药物一起施用。可以与本发明的药物组合物一起施用的其它药物不受限制，只要它不损害本发明的治疗性或预防性药物组合物的效果即可。

本发明的药物组合物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。

本发明的药物组合物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。

本发明的药物组合物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明的治疗药物组合物或预防药物组合物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。

本发明还提供了DENND1C基因在制备治疗腹主动脉瘤的药物中的应用。所述药物包括抑制DENND1C基因表达的试剂。所述试剂不受限制，只要是可以抑制DENND1C表达水平即可。

本发明还提供了前面所述的抑制DENND1C基因表达的试剂在制备治疗腹主动脉瘤的药物中的应用。

本发明还提供了一种诊断腹主动脉瘤的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)获取受试者的样品；

(2)检测受试者样品中DENND1C的表达水平；

(3)将测得的DENND1C的表达水平与受试者的患病与否关联起来。

(4)与正常对照相比，DENND1C的表达水平显著升高，则该受试者被判断患有腹主动脉瘤、或判断该受试者患有腹主动脉瘤的风险高。

本发明还提供了一种腹主动脉瘤的治疗方法，所述方法包括抑制DENND1C 表达量或者抑制DENND1C的调节活性。

术语“DENND1C”中DENND1C基因编码的蛋白可以磷酸化核酮糖、核糖醇、L-阿拉伯糖醇等碳水化合物。

可用于本发明的DENND1C多核苷酸或蛋白(多肽)序列包括各种来源和物种的DENND1C，并且包括野生型、突变型的DENND1C，或其活性片段。在本发明的一些实施方案中，所述DENND1C来源于人类。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

编码DENND1C的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段，包括正义和反义的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码DENND1C蛋白的多核苷酸。

术语“芯片”也称为“阵列”，指包含连接的核酸或肽探针的固体支持物。阵列通常包含按照不同的已知位置连接至基底表面的多种不同的核酸或肽探针。这些阵列，也称为“微阵列”，通常可以利用机械合成方法或光引导合成方法来产生这些阵列，所述光引导合成方法合并了光刻方法和固相合成方法的组合。阵列可以包含平坦的表面，或者可以是珠子、凝胶、聚合物表面、诸如光纤的纤维、玻璃或任何其它合适的基底上的核酸或肽。可以以一定的方式来包装阵列，从而允许进行全功能装置的诊断或其它方式的操纵。

芯片包括基因芯片，是微观DNA点的集合，这些点连接到固体表面(例如，玻璃、塑料或硅芯片)上，形成用于对数千种基因同时进行表达谱分析或表达水平监测的阵列。固定的DNA片段称为探针，其数千个可用于单个DNA微阵列中。微阵列可用于通过比较疾病和正常细胞中的基因表达而识别疾病基因或转录本(例如，ncRNA)。微阵列可使用多种技术加以制造，包括但不限于：用细尖针印刷到载玻片上、使用预制的掩模进行光刻、使用动态微镜器件进行光刻、喷墨印刷或微电极阵列上的电化学方法。

芯片包括蛋白质芯片，指捕获试剂能结合蛋白质标志物的阵列。典型地，捕获试剂为多克隆或单克隆抗体，可以与特异的蛋白质结合。换句话说，可以特异性结合蛋白的任何蛋白、多肽、核酸或其他分子或表面都可以被应用于蛋白阵列中。这些阵列通常包括数百或数千个位于可寻址区域的不同捕获试剂。当标志物被可检测分子标记后，蛋白质阵列上的捕获试剂与标志物的结合通常被定量。

蛋白芯片上设置蛋白的检测点，这些检测点可以随机分布，也可以分布于芯片的不同检测区，或相对集中地分布于芯片的某一个或多个特定的检测区。

如本文所用，术语“检测点”指位于蛋白芯片上，用于检测某一蛋白质所对应的点样点，例如用于检测DENND1C蛋白的检测点，通常是将抗DENND1C 蛋白的单克隆抗体点样于芯片基片所形成的。

适用于本发明的蛋白质芯片没有特别限制，可以采用本领域中各种已知结构的空白蛋白质芯片。通常，这些蛋白质芯片载体包括：免疫微球、玻璃片、塑料片、硝酸纤维(NC)膜、PVDF膜等，其中特别优选的是免疫微球和各种基片。采用原位合成、机械点样或共价结合的方法将多肽、蛋白、或抗体有序地固定于各种载体上成为检测用的芯片，将标记荧光的抗体或其他成分与芯片相互作用，经漂洗将未能与芯片上蛋白质互补结合的成分洗去，再利用荧光等扫描仪或激光共聚焦扫描技术，测定芯片或其它载体上各点的荧光强度，以及标记物度强度来分析每种蛋白质的含量，由此达到测定各种蛋白质的目的。

在本发明的上下文中，“诊断腹主动脉瘤”包括判断受试者是否已经患有腹主动脉瘤、判断受试者是否存在患有腹主动脉瘤的风险。

本文所用的“治疗”涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的疾病或疾病状态，并且包括：

(1)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当该哺乳动物易感于所述疾病状态，但尚未被诊断出患有这种疾病状态时；

(2)抑制疾病或疾病状态，即阻止其发生；或者

(3)缓解疾病或疾病状态，即使疾病或疾病状态消退。

术语“治疗”通常涉及治疗人类或动物(例如，被兽医所应用)，其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止)、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施(例如预防)的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的患者的用途，也包括在术语“治疗”中。

本发明的优点和有益效果：

本发明发现了一种诊断腹主动脉瘤的分子标志物，使用该分子标志物可以在腹主动脉瘤发生的早期即可作为判断，提高了患者治愈率。

具体的实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 DENND1C基因表达与腹主动脉瘤的关联性研究

1、动物与处理

雄性野生型C57BL/6J获自杰克逊实验室(Bar Harbor,Me)。在无病原体的隔离笼中饲养所有小鼠作为同窝仔对照。小鼠接受正常的实验室饮食。将10-12 周龄的小鼠使用Alzet渗透微型泵(2004年，Durect Corporation)皮下注射生理盐水或血管紧张素II(AngII)，注射剂量为1000ng.kg-1.min-1(Sigma-Aldrich， St.Louis，MO)。将AAA小鼠和正常对照小鼠采用10％水合氯醛麻醉，75％酒精浸泡2min消毒。打开胸腔、腹腔，将脏器推至一边，暴露出心脏和主动脉，用纱布吸走血液。小心将心脏和主动脉全长剪下直至腹主动脉分叉处，立即放入 0.01M PBS缓冲液中。分离脂肪组织及结缔组织，小心剪掉心脏，其间采用0.01M PBS缓冲液冲洗三次。将分离好的透明的主动脉纵向剪开，刮去内膜，获得主动脉组织。

所有动物实验方案均经首都医科大学动物护理和使用委员会批准 (20120109)，并且实验符合《实验室动物的护理和使用指南》(美国国立卫生研究院出版号85-23，1996)。

2、RNA分离

按照产品说明书使用TRIzol试剂(Invitrogen，Life Technologies)分离总 RNA。使用Nanodrop 2000分光光度计(Thermo Scientific)、2100生物分析仪 (RNA6000 NanoLabChip；安捷伦科技公司，Santa Clara,CA)、琼脂糖凝胶电泳来评估RNA的纯度，浓度和完整性。

3、实时定量PCR(RT-qPCR)分析

使用TaqMan Gold RT-PCR试剂盒(Applied Biosystems)以500ng总RNA 为模板合成cDNA(具体步骤参见产生说明书)。

使用iCycler IQ系统(Bio-Rad)进行定量实时PCR(qPCR)。将cDNA样品稀释20倍，使用SYBR green JumpStart Taq ReadyMix(Sigma-Aldrich)和100μM 引物进行了实时PCR反应。然后，在ABI Prism 7000序列检测系统(Applied Biosystems)中扩增了上述产物。扩增条件是：50℃，2分钟；95℃，10分钟；95℃， 15秒，共40次循环，然后59℃，1分钟。β-actin作为参考基因以标准化所有样品。

引物序列如下：

DENND1C上游引物：5’-TACCTCATAGGAGTCCAT-3’(SEQ ID NO.1)；下游引物：5’-ATTCAACACCACAACATC-3’(SEQ ID NO.2)；

β-actin上游引物：5’-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3’(SEQ ID NO.3)；下游引物：5’-ATGTCACGCACGATTTCCC-3’(SEQ ID NO.4)。

4、统计分析

应用SPSS 20.0统计软件分析，计量数据以均数±标准差表示，两两比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

5、结果

结果显示，50只AAA小鼠中DENND1C基因表达上调的小鼠有39只；50 例对照组小鼠中DENND1C基因表达上调的是9只，统计结果显示，设定对照组DENND1C基因表达水平为1，2^-△△CT法计算的AAA组小鼠的DENND1C基因相对表达量的平均值约为8.03，组间差异有统计学意义(P<0.005)。ROC曲线分析显示，DENND1C基因在区分AAA患者和正常对照时，其AUC值是0.915。统计结果见表1。

表1 ROC结果统计

实施例2 DENND1C基因表达对主动脉平滑肌细胞功能的影响

一、干扰基因表达

1、人主动脉平滑肌细胞的培养

T/G HA-VSMC细胞(简称HVSMC细胞)用含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的孵箱中进行培养，取对数生长期细胞进行实验。

2、细胞转染

针对DENND1C区域选择作用靶点，根据确定序列的原则设计，委托上海吉玛制药技术有限公司选择合成3对siRNA，预实验结果显示以下 DENND1C-siRNA效率最高：其正义链为 5’-UCAAUAGCUUGUAAAACACCU-3’(SEQ ID NO.5)，反义链为 5’-GUGUUUUACAAGCUAUUGAAC-3’(SEQ ID NO.6)。确定该序列用于本研究。同时合成含荧光标志的通用随机阴性序列(NC-siRNA)用于计算转染率。将稀释后的LipofectamineTM 2000室温放置5min后与稀释的siRNA混合并室温放置20min形成转染复合物。转染前取对数生长期细胞悬浮于无抗生素培养基，转染时细胞密度达到(8～16)×10⁵/ml，接种于96孔板，每孔2×10⁴个细胞，终体积为100μl。对照组未加转染复合物，实验组分别加入不同浓度转染复合物使siRNA终浓度分别为60nmol/L。每组设6个平行孔，每孔终体积为2ml。转染后置37℃、5％CO₂、饱和湿度的孵箱中继续培养48h。

3、实时定量PCR(RT-qPCR)分析

步骤基本同实施例1，根据CT值通过公式2-ΔΔCt进行相对定量分析计算得 mRNA相对表达量。

引物序列如下：

DENND1C上游引物：5’-AAATGCCTCGTCTTTGGA-3’(SEQ ID NO.7)；下游引物：5’-TTCTTGGTCGGACTCTGA-3’(SEQ ID NO.8)；

β-actin上游引物：5’-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3’(SEQ ID NO.9)，下游引物：5’-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3’(SEQ ID NO.10)。

4、结果

结果显示，设定阴性对照组(NC-siRNA)DENND1C表达量为100％， DENND1C-siRNA组DENND1C相对表达量(29.33±3.79)％。

二、基因对平滑肌细胞凋亡的影响

1、步骤

使用血管紧张素II(A9525，购自SIGMA)诱导平滑肌细胞凋亡。

按照前面的步骤培养和转染，转染24小时后，加入血管紧张素II(终浓度为10μM)刺激细胞24h后，之后使用碧云天公司的TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(显色法)(货号：C1091)测定细胞凋亡情况，按照操作说明书进行。

2、结果

10μM血管紧张素II刺激组TUNEL染色阳性细胞百分数为(32.8±4.3)％，与未刺激对照组(11.2±1.9)％相比差异具有统计学意义(P<0.05)。在10μM 血管紧张素II刺激的条件下，NC-siRNA组TUNEL染色阳性细胞百分数为(34.2 ±3.1)％，而Dennd1c-siRNA组TUNEL染色阳性细胞百分数为(21.1±4.7)％，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述结果表明，干扰基因表达可以有效抑制平滑肌细胞凋亡，故基因可成为治疗AAA的药物靶标。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 中国医学科学院北京协和医院

<120> DENND1C作为诊治腹主动脉瘤的分子标志物的应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tacctcatag gagtccat 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

attcaacacc acaacatc 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagaccttca acaccccagc 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgtcacgca cgatttccc 19

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ucaauagcuu guaaaacacc u 21

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

guguuuuaca agcuauugaa c 21

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaatgcctcg tctttgga 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttcttggtcg gactctga 18

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgacgtggac atccgcaaag 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctggaaggtg gacagcgagg 20

Claims

1.检测基因表达的试剂在制备腹主动脉瘤的诊断产品中的应用；所述基因是DENND1C。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括利用SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测所述基因表达量时使用的PCR扩增引物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.4所示。

4.一种用于腹主动脉瘤诊断的产品，其特征在于，所述产品包括检测权利要求1所述的基因表达的试剂。

5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述试剂包括SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测所述基因表达量时使用的PCR扩增引物。

6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.4所示。

7.一种用于治疗腹主动脉瘤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的基因抑制剂。

8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，所述抑制剂包括抑制所述基因表达水平的试剂，或抑制所述基因功能活性的试剂。

9.权利要求1所述的基因在制备治疗腹主动脉瘤的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物包括抑制所述基因表达的试剂。