KR20220151148A - Stim1-r429c가 발현된 근육긴장저하 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 stim1-r429c가 발현된 근육긴장저하 관련 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 STIM1-R429C가 발현된 골격근 세포에서 골격근 수축시 근세포질세망에서 세포질로의 비정상적으로 과도한 칼슘 유리를 나타내는 것을 통해, 골격근 수축 및 이완시 칼슘이온의 이동과 관련된 RyR1 및/또는 SERCA1a의 활성을 조절하여 정상적인 수준의 칼슘 분포로 맞추는 것이 가능함을 확인함으로써, 상기 결과로부터 STIM1-R429C가 발현된 근육긴장저하 관련 질환을 진단하기 위한 정보를 제공할 수 있으며, STIM1-R429C가 발현된 근육긴장저하 관련 질환의 예방 또는 치료 및 이를 위한 약물을 스크리닝할 수 있다.
Description
본 발명은 STIM1의 R429C 변이가 발현된 근육긴장저하 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물, STIM1의 R429C 변이가 발현된 근육긴장저하 관련 질환의 치료를 위한 약물의 스크리닝 방법 및 STIM1의 R429C 변이가 발현된 근육긴장저하 관련 질환의 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.
근육긴장저하(muscular hypotonia)는 근육의 저항이 낮아진 상태를 말하며, 근육긴장저하 환자는 흔히 양팔과 다리를 힘없이 축 늘어뜨리는 모습을 하게 되고 머리를 잘 가누지 못하며, 이동, 자세 취하기, 호흡 및 발화에 곤란을 겪는다. 근육긴장저하는 지능에 직접적인 영향을 주지는 않으나, 발달기 아동에게서 사회적 능력, 언어, 그리고 전반적인 학습에 있어서 다른 사람들보다 지연을 초래한다. 특히, 근육긴장저하는 다운증후군(비특허문헌 1), 근이영양증(비특허문헌 2), 뇌성마비(비특허문헌 3), 프레더-윌리 증후군(비특허문헌 4) 및 테이-샥스병(비특허문헌 5)을 가진 사람들에게서 많이 발견되고, 근력이 떨어진 정상 고령자에게도 나타나고 있으며, 암, 에이즈, 노인성 질환 등에 대한 2차 질병 형태로도 나타난다. 근육긴장저하는 근육퇴행위축(muscular dystrophy)이나 뇌성마비(cerebral palsy)의 전조 증상으로 나타나 이들 병의 진행에 대한 사전 표시(indication)가 되기도 한다.
이에, 본 발명자들은 근육긴장저하, 그 중에서도 STIM1 단백질의 R429C 변이에 기인한 근육긴장저하의 진단 및 치료를 위한 작용기전을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
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본 발명의 목적은 STIM1의 R429C 변이가 발현된 근육긴장저하 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 STIM1의 R429C 변이가 발현된 근육긴장저하 관련 질환의 치료를 위한 약물의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 STIM1의 R429C 변이가 발현된 근육긴장저하 관련 질환의 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 분화 골격근 세포에서 기질 상호작용 분자 1(stromal interaction molecule 1; STIM1)의 R429C 변이를 발현시킨 결과, 상기 R429C 변이가 골격근 세포의 외형에 영향을 미치지 않으면서 야생형 STIM1을 발현하는 분화골격근세포에 비해 비정상적인 칼슘 분포를 나타내며, 특히 근수축 과정에서 근세포질세망에서 세포질로 비정상적으로 과도하게 칼슘이 유리되는 것을 확인함으로써 이러한 비정상적 칼슘 분포 또는 근수축 과정에서의 비정상적 칼슘 유리를 STIM1의 R429C 변이가 발현된 근육긴장저하의 진단 마커로 활용할 수 있을 뿐만 아니라, 칼슘 분포에 관여하는 SERCA1a 및/또는 RyR1의 활성을 조절함으로써 STIM1의 R429C 변이가 발현된 근육긴장저하를 치료할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 STIM1의 R429C 변이가 발현된 근육긴장저하 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물, STIM1의 R429C 변이가 발현된 근육긴장저하 관련 질환의 치료를 위한 약물의 스크리닝 방법 및 STIM1의 R429C 변이가 발현된 근육긴장저하의 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 SERCA1a(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase 1a) 활성 촉진제 또는 RyR1(Ryanodine receptor 1) 활성 저해제 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 STIM1의 R429C 변이가 발현된 근육긴장저하 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, “근육긴장저하(muscular hyotonia)”는 근육의 저항이 낮아진 상태를 의미하며, 근육긴장저하를 나타내는 환자들은 양팔과 다리를 힘없이 축 늘어뜨리거나, 머리를 잘 가누지 못해 이동, 자세 취하기, 호흡 또는 발화에 곤란을 겪는 증상을 보인다. 상기 근육긴장저하는 특히 다운증후군, 근이영양증, 뇌성마비, 프레더-윌리 증후군, 근긴장증, 테이-샥스병 환자에서 많이 발견되며, 근력이 약해진 고령자 또는 암, 에이즈, 노인성 질환 등에 대한 2차 질병의 형태로도 나타날 수 있다. 이에, 상기 “근육긴장저하 관련 질환”은 상기 근육긴장저하를 유발하는 다운증후군, 근이영양증, 뇌성마비, 프레더-윌리 증후군, 근긴장증 및 테이-샥스병으로 이루어진 군에서 선택된 질환일 수 있으며, 이에 제한 없이 근육긴장저하를 유발하는 질환이라면 모두 적용시킬 수 있다.
상기 근이영양증은 뒤시엔느 근이영양증(Dychenne muscular dystrophy), 벡커 근이영양증(Becker muscular dystrophy), 지대형 근이영양증(Limb-girdle muscular dystrophy), 안면견갑상완 근이영양증(Facioscapulohumeral muscular dystrophy) 또는 눈인두 근이영양증(Oculopharyngeal muscular dystrophy)를 포함할 수 있다.
예컨대, 본 발명의 근육긴장저하는 기질 상호작용 분자1(STIM1) 단백질의 R429C 변이가 발생하여 발병된 질환을 의미한다. 본 발명에서, 상기 STIM1 단백질의 R429C 변이는 “STIM1-R429C”와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 근육긴장저하 관련 질환은 STIM1-R429C 발현에 의한 근육긴장저하일 수 있다.
본 발명에서, “기질 상호작용 분자 1(stromal interaction molecule 1; STIM1)”는 Orai1 칼슘채널을 활성화하여 Orai1 칼슘채널을 통해 세포 외부로부터 세포 안으로 칼슘 유입을 일으키는 단백질을 의미하며, 포유동물, 바람직하게는 인간, 생쥐, 집쥐, 토끼, 오랑우탄, 원숭이, 햄스터, 고양이, 돌고래, 고릴라 등에서 기원하는 단백질을 의미한다. 예컨대 상기 STIM1 단백질의 아미노산 서열은 GenBank accession no. NP_003149로, 그 유전자 서열은 GenBank accession no. NM_003156.3으로 각각 알려져 있다.
본 발명에서, “STIM1 단백질의 R429C 변이” 또는 “STIM1-R429C”는 STIM1 단백질의 429번째 위치의 R(알지닌)이 C(시스테인)로 치환된 형태의 돌연변이를 의미한다.
하기 실시예에서는, STIM1-R429C가 발현된 분화골격근세포에서 골격근 세포의 외형 변화가 나타나지 않았음에도 근세포질세망에서 세포질로의 비정상적인 칼슘 유리가 나타나 비정상적인 칼슘 분포를 나타내는 것이 확인되었다. 이를 통해 분화골격근세포에서 칼슘 분포에 관여하는 SERCA1a 및/또는 RyR1의 활성 조절을 통해 STIM1-R429C가 발현된 근육긴장저하 관련 질환의 진단을 위한 정보를 제공할 수 있으며, 상기 SERCA1a 및/또는 RyR1의 활성 조절에 관여하는 후보물질로부터 근육긴장저하 관련 질환을 치료할 수 있음을 확인하였다.
이에, 본 발명은 STIM1-R429C가 발현된 근육긴장저하 관련 질환의 치료를 위한 유효성분으로 SERCA1a 활성 촉진제 또는 RyR1 활성 저해제를 포함한다.
본 발명에서, 상기 SERCA1a 활성 촉진제는 STIM1-R429C가 발현된 근육긴장저하 관련 질환에서 SERCA1a의 활성을 촉진하는 약물을 의미한다. 예컨대, 상기 SERCA1a 활성 촉진제는 4-(1-메틸에톡시)-N-(2-메틸-8-퀴놀리닐)-벤자마이드, 이스타록심(Istaroxime), 5'-벤질-1'-부틸N-(나프탈렌-2-일설포닐)-6'-옥소-1',6'-디하이드로-2,3'-비피리딘-4-카복사마이드 및 N-하이드록시-2-메탄설포닐벤젠-1-설폰아마이드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 4-(1-메틸에톡시)-N-(2-메틸-8-퀴놀리닐)-벤자마이드(4-(1-Methylethoxy)-N-(2-methyl-8-quinolinyl)-benzamide)는 하기 화학식 1로 표시되며, CAS No. 892711-75-0의 화합물이다(실험 약물명: CND1163):
[화학식 1]
상기 이스타록심(istaroxime)은 하기 화학식 2로 표시되며, IUPAC 명칭은 (3E,5S,8R,9S,10R,13S,14S)-3-(2-아미노에톡시이미노)-10,13-디메틸-1,2,4,5,7,8,9,11,12,14,15,16-도데카하이드로사이클로펜타[a]페난트렌-6,17-디온((3E,5S,8R,9S,10R,13S,14S)-3-(2-aminoethoxyimino)-10,13-dimethyl-1,2,4,5,7,8,9,11,12,14,15,16-dodecahydrocyclopenta[a]phenanthrene-6,17-dione)이다:
[화학식 2]
상기 5'-벤질-1'-부틸N-(나프탈렌-2-일설포닐)-6'-옥소-1',6'-디하이드로-2,3'-비피리딘-4-카복사마이드(5'-benzyl-1'-butylN-(naphthalen-2-ylsulfonyl)-6'-oxo-1',6'-dihydro-2,3'-bipyridine-4-carboxamide)는 하기 화학식 3으로 표시되며, 피리딘 유도체 화합물이다:
[화학식 3]
상기 N-하이드록시-2-메탄설포닐벤젠-1-설폰아마이드(N-hydroxy-2-methanesulfonylbenzene-1-sulfonamide)는 하기 화학식 4로 표시되며, CAS No. 950834-06-7의 화합물이다(실험 약물명: CXL-1020):
[화학식 4]
상기 SERCA1a는 Ca2+-펌프의 일종으로, ATP를 소모하여 세포질에 있는 칼슘을 근세포질세망(sarcoplasmic reticulum) 안으로 저장하는 역할을 하는데, 이 과정은 근육이 수축한 후에 다시 평상 상태인 이완 상태로 돌아오는 칼슘 재축적 과정의 핵심 과정이다.
본 발명에서, 상기 RyR1 활성 저해제는 STIM1-R429C가 발현된 근육긴장저하 관련 질환에서 RyR1의 활성을 저해하는 약물을 의미한다. 예컨대, 상기 RyR1 활성 저해제는 RyR1 유전자의 mRNA 발현 또는 이의 단백질의 발현을 넉다운(knock-down) 시키거나, 기능 또는 활성을 감소시키는 모든 제제를 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 RyR1 활성 저해제는 RyR1 유전자에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스-올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNa 또는 이를 포함하는 벡터; RyR1 단백질에 특이적인 항체; 또는 RyR1 활성을 저해하는 화합물 중 어느 하나일 수 있다.
본 명세서에서, “siRNA”는 표적 유전자의 mRNA의 절단을 통해 RNA 간섭현상을 유도하는 이중사슬 RNA를 의미하며, 표적 유전자의 mRNA와 같은 서열을 가지는 센스서열의 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 서열의 RNA 가닥으로 구성된다.
상기 siRNA는 시험관 내에서 합성한 siRNA 자체 또는 siRNA를 코딩하는 염기서열을 발현 벡터에 삽입하여 발현되는 형태를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 “벡터”는 폴리펩타이드를 코딩하는 게놈 내로 삽입된 외부 DNA를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.
본 발명과 관련된 벡터는 상기 유전자를 저해하는 핵산 서열이 게놈 내로 삽입된 벡터로서, 이들 벡터는 DNA 벡터, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터, 효모 벡터 또는 바이러스 벡터를 예로 들 수 있다.
또한, 상기 안티센스는 RyR1 유전자 또는 그의 단편으로부터 전사되는 mRNA 서열 전체 또는 일부와 상보적인 서열을 지니고, 상기 mRNA와 결합하여 상기 RyR1 유전자 또는 단편의 발현을 억제할 수 있다.
또한, 상기 shRNA(short hairpin RNA)는 인간 또는 생쥐상의 shRNA 공통 염기서열 부위를 표적으로 하여 통상의 방법에 따라 제작된 것을 사용할 수 있다.
또한, 항체는 RyR1 단백질에 대한 다클론 항체, 단클론 항체, 인간 항체 및 인간화 항체를 사용할 수 있다.
상기 항체 단편의 예로는, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디(diabody); 선형 항체[Zapata et al. Protein Eng. 8(10):1057-1062(1995)]; 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이성 항체 등이 포함된다.
항체를 파파인(papain)으로 분해하면 2개의 동일한 항원 결합 단편, 즉 단일 항원 결합 부위가 있는 각 “Fab” 단편, 및 그 나머지인 “Fc” 단편이 생성된다. 펩신을 처리하면, 2개의 항원 결합 부위가 있으며 여전히 항원에 교차결합할 수 있는 F(ab')2 단편이 생성된다. Fv는 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 포함하는 최소한의 항체 단편이다. 이 부위는 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 영역의 이합체로 구성되며 비공유결합으로 단단히 결합되어 있다.
다클론 항체의 제조방법은 당업자에게 공지되어 있다. 다클론 항체는 포유 동물에 1회 이상 면역화제를 주입, 필요한 경우 면역 보강제와 함께 주입하여 제조할 수 있다. 통상, 면역화제 및/또는 면역 보강제는 포유 동물에 피하주사 또는 복강내 주사로 수회 주입된다. 면역화제는 본 발명의 단백질 또는 이의 융합 단백질일 수 있다. 면역화되는 포유동물에 면역원성이 있는 것으로 공지된 단백질과 함께 면역화제를 주사하는 것이 효과적일 수 있다.
본 발명에 따른 단클론 항체는 문헌[Kohler et al. Nature, 256:495(1975)]에 기재된 하이브리도마 방법으로 제조하거나 또는 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국 특허 제4,816,576호 참조)으로 제조할 수 있다. 단클론 항체는 또한, 문헌[Clackson et al. Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al. J. Mol. Biol., 222:581-597(1991)]에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.
본 발명에서의 단클론 항체는 구체적으로, 목적하는 활성을 발휘한다면 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정 종으로부터 유래된 항체 또는 특정 항체 클래스 또는 서브 클래스에 속하는 항체에 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이 있지만, 쇄(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래된 항체 또는 다른 항체 클래스 또는 서브 클래스에 속하는 항체 또는 그러한 항체의 단편과 동일하거나 상동성이 있는 “키메라” 항체를 포함한다(Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984)).
비-인간(예컨대, 쥐과 동물) 항체의 “인간화” 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소서열을 포함하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 그의 단편(예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원 결합 서열)이다. 대부분의 경우 인간화 항체는 수용자의 상보성 결정(CDR)의 잔기를 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 생쥐, 쥐 또는 토끼와 같은 인간 이외의 종(공여자 항체)의 CDR 잔기로 치환시킨 인간 면역글로불린(수용자 항체)을 포함한다. 몇몇 경우에 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수용 항체, 또는 도입되는 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 인간화 항체는 하나 이상, 일반적으로 둘 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 영역에 대응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 영역에 해당한다. 또한, 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 일반적으로 인간 면역글로불린 영역의 일부를 포함한다(Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)).
본 발명에서 RyR1 활성을 저해하는 화합물은 RyR1에 대해 저해 활성을 갖는 공지의 화합물로 대체하여 적용할 수 있다. 예를 들어, 상기 RyR1 활성을 저해하는 화합물은 문헌[Riccardo Zucchi & Simonetta Ronca-testoni, The Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ Channel/Ryanodine Receptor: Modulation by Endogenous Effectors, Drugs and Disease States, Pharmacological Review, Vol. 49, No. 1]에 공지된 화합물일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 RyR1 활성을 저해하는 화합물은 라이아노딘(ryanodine); 4,6-디브로모-3-하이드록시카르바졸(4,6-dibromo-3-hyroxycarbazole)과 같은 카르바졸 유도체(carbazole derivatives); 독소루비신(doxorubicin), 미톡산트론(mitoxantrone), 다우노루비신(daunorubicin) 또는 루비다존(rubidazone)과 같은 안트라퀴논(anthraquinones); 루테늄 레드(Ruthenium red); 네오마이신(neomycin), 젠타마이신(gentamycin), 스트렙토마이신(streptomycin), 클린다마이신(clindamycin), 카나마이신(kanamycin) 또는 토브라마이신(tobramycin)과 같은 아미노글리코사이드; [2,6-디클로로-4-(디메틸아미노)페닐]-이소프로필아민([2,6-dichloro-4-(dimethylamino)phenyl]-isopropylamine; FLA365); 단트롤린(dantrolene; 1-[5-(4-니트로페닐)-2-퓨릴]메틸리딘아미노이미다졸리딘-2,4-디온(1-[5-(4-nitrophenyl)-2-furyl]methylideneaminoimidazolidine-2,4-dione)); 프로카인(procaine), 테트라카인(tetracaine), 에티도카인(etidocaine), 부피바카인(bupivacaine), 프릴로카인(prilocaine), 리도카인(lidocaine), 메피바카인(mepivacaine), N,N-디메틸-2-옥소-N-[2-옥소-2-(페닐아미노)에틸]-2-(페닐아미노)-에탄아미늄 클로라이드(QX 572(CAS No. 1042-42-8)), 리도카인 N-에틸 브로마이드(QX 314(CAS No. 21306-56-9)) 또는 벤조카인(benzocaine)과 같은 국소마취제(local anesthetics); 베라파밀(verapamil), 갈로파밀(gallopamil), 또는 아미파밀(amipamil)과 같은 페닐알킬아민; 임페라톡신-a(imperatoxin-a) 또는 임페라톡신-i(imperatoxin-i)와 같은 펩타이드; 과산화수소(hydrogen peroxide); 및 디사이클로헥실카르보디이미드(dicyclohexylcarbodiimide)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 상기 화합물 중 라이아노딘, 안트라퀴논, 루테늄 레드 및 과산화수소는 장기간 약물에 노출시키는 경우, RyR1에 대해 저해 활성을 나타낼 수 있다.
상기 STIM1-R429C가 발현된 골격근 세포에서는, STIM1-R429C 변이로 인해 DHPR(dihydropyridine receptor) 또는 DHPR과 RyR1의 상호작용에 이상이 생기는 것으로, ECC(excitation-contraction coupling)의 기능 이상에 따른 근육긴장저하를 유발할 수 있다. STIM1-R429C 변이에 의한 근육긴장저하는 종래 STIM1의 돌연변이에 의해 발생되는 저장소-작동 칼슘이동(store-operated Ca2+-entry: SOCE)의 기능 이상과는 전혀 다른 단백질과 작용기전을 갖는 근육긴장저하를 의미한다.
본 발명에서, 용어 “흥분-수축 연결(Excitation-Contraction coupling: ECC)”은 근육의 활동전위(action potential)가 칼슘 신호를 경유하여 골격근의 수축을 시작하게 하는 과정으로, 신경 자극 (아세틸콜린)에 의해서 골격근의 세포막에서 발생한 활동전위는 골격근육섬유 (세포)의 근세포질세망에 있는 칼슘이온 통로(Ca2+ release channel, 즉 라이아노딘 수용체 1 (RyR1))를 열어 근세포질세망에 저장되어 있던 칼슘이온을 전기화학적 기울기에 따라 골격근육세포의 세포질로 방출시키게 된다. 이때 세포질의 칼슘이온 양이 증가하면서 트로포닌(troponin)과 결합하고, 이로 인해 골격근 수축에 관여하는 단백질들이 서로 상호작용하여 골격근의 수축을 시작하게 된다. 이러한 과정을 역과정이 일어나면 골격근은 이완을 하게되며, 골격근의 수축 후에는 반드시 이완은 일어나, 즉 두 과정이 번갈아 반복적으로 일어날 때 정상적인 골격근의 생리현상이 가능하다. 이 과정에서 RyR1의 활성이 높게 되면, 우선적으로는 과도한 골격근 수축이 일어나지만, 이러한 수축 이상은 곧 이완 과정에 문제를 일으키고, 결국에는 골격근 근육긴장 저하를 일으키게 된다.
또한, 본 발명에서, 용어 “저장소-작동 칼슘이동(SOCE)”이란 세포 내 저장소, 즉 근세포질세망(sarcoplasmic reticulum) 또는 세포질세망(endoplasmic reticulum)으로부터의 칼슘이온이 세포질로 방출되어 근세포질세망 또는 세포질세망 안에 있던 칼슘이 고갈되는 현상이 하나의 신호가 되어서 원형질 막을 가로질러 외부의 칼슘이온이 세포질로 유입되는 것을 말한다. 이때 저장소 내 칼슘 센서로 작용하는 것이 STIM1 단백질이며, 원형질 막에서 외부 칼슘이 유입되는 길로 작용하는 칼슘채널이 Orai1이라고 알려져 있다.
상기 약학 조성물은 SERCA1a 활성 촉진제 및/또는 RyR1 활성 저해제를 통해 STIM1-R429C에 의한 비정상적인 칼슘 분포를 정상 수준으로 조절할 수 있으므로, STIM1-R429C가 발현된 근육긴장저하 관련 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 의약 분야에서 통상적으로 사용되는 담체 및 비히클을 포함하며, 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨 및 아연염), 교질성실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오즈계 기질, 폴리에틸렌글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈, 폴리아릴레이트, 왁스 또는 양모지 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움카르복시메틸셀룰로오즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.
본 발명의 조성물은 전신계 또는 국소적으로 투여될 수 있으며, 이러한 투여를 위해 공지의 기술로 적하반 제형으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 활성 화합물은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다.
주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야 공지된 기법 또는 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다. 또한, 유효량의 SERCA1a 활성 촉진제 및/또는 RyR1 활성 저해제를 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등에 적합한 형태로 식염수 또는 완충액에 투여 직전에 용액으로 제제화하여 투여할 수도 있다.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은 치료상 유효량의 SERCA1a 활성 촉진제 또는 RyR1 활성 저해제 중 하나 이상을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 STIM1-R429C가 발현된 근육긴장저하 관련 질환의 치료 방법을 제공한다.
여기에서 사용된 대상체는 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
본 명세서에서, "유효량"은 목적하는 치료되어야 할 특정 질환의 발병 또는 진행을 지연하거나 전적으로 중지시키는 데 필요한 양을 의미하며, 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 SERCA1a 활성 촉진제 또는 RyR1 활성 저해제의 유효량은 STIM1-R429C가 발현된 근육긴장저하 또는 다운증후군, 근이영양증, 뇌성마비, 근긴장증, 프레더-윌리 증후군 및 테이-샥스병에서 선택되는 질환에 있어서 비정상적인 칼슘 분포를 정상 수준으로 조절하는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 상기 유효량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 종류 및 함량, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단 범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다.
본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 명세서에서, “치료”는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화(즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감(부분적이거나 전체적으로), 검출 가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다. 또한, “치료”는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. “치료”는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방 조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 “완화”하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병 상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.
또한, 본 발명은
STIM1의 R429C 변이가 발현된 근육긴장저하 의심 개체로부터 분리한 생물학적 시료를 후보물질과 인체 외에서 접촉시키고,
상기 후보물질이 근세포질세망 내 칼슘이온 농도를 증가시키는지 또는 감소시키는지 확인하는 것; 또는 상기 후보물질이 세포질 내 칼슘이온 농도를 증가시키는지 또는 감소시키는지 확인하는 것을 포함하는 STIM1의 R429C 변이가 발현된 근육긴장저하 관련 질환의 치료를 위한 약물의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 후보물질은 통상적인 선정방식에 따라 근세포질세망 내 칼슘이온 농도를 증가시키거나, 세포질 내 칼슘이온 농도를 감소시키는 의약으로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되는 물질 또는 무작위로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 펩타이드, 기타 추출물 또는 천연물, 화합물 등이 될 수 있다.
즉, 후보물질이 근세포질세망 내 칼슘이온 농도를 증가시키거나/시키고, 세포질 내 칼슘이온 농도를 감소시키면 상기 후보물질을 STIM1-R429C 변이가 발현된 근육긴장저하 관련 질환을 치료할 수 있는 물질로 판단할 수 있다.
상기 근세포질세망 및 세포질 내 칼슘이온 양 또는 농도를 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 수행될 수 있다.
상기 생물학적 시료는 STIM1-R429C가 발현된 근육긴장저하 발생 또는 진행 정도에 따른 상기 근세포질세망 및 세포질 내 칼슘이온의 양 또는 농도가 정상 대조군과는 다른, 생체로부터 채취된 시료를 말하며, 상기 시료로는 예컨대, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 스크리닝 방법을 통해 얻은, 근세포질세망과 세포질 내 칼슘이온 농도를 조절시키는 후보물질은 STIM1-R429C가 발현된 근육긴장저하 관련 질환의 치료제의 후보물질이 될 수 있다. 즉, 본 발명에 있어서, 상기 스크리닝 방법에 따라 후보물질이 근세포질세망 내 칼슘이온 농도를 증가시키면 STIM1-R429C가 발현된 근육긴장저하 관련 질환의 치료제로 판정할 수 있으며, 상기 후보물질이 세포질 내 칼슘이온 농도를 감소시키면 STIM1-R429C가 발현된 근육긴장저하 관련 질환의 치료제로 판정할 수 있다.
이와 같은 STIM1-R429C가 발현된 근육긴장저하 관련 질환의 치료제 후보물질은 이후의 근육긴장저하 관련 치료제 개발 과정에서 선도물질(leading compound)로서 작용하게 되며, 선도물질이 근세포질세망과 세포질 내 칼슘이온 농도를 조절하는 효과를 나타낼 수 있도록 그 구조를 변형시키고 최적화함으로써, 새로운 근육긴장저하 관련 질환, 특히 STIM1-R429C가 발현된 근육긴장저하의 치료제를 개발할 수 있다.
본 발명에서 유전공학적 기술과 관련된 사항은 샘브룩 등의 문헌(Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y(2001)) 및 프레드릭 등의 문헌(Prederick M. Ausubel et al. Current protocols in molecular biology volume 1, 2, 3, John Wiley & Sons, Inc. (1994))에 개시되어 있는 내용에 의해 보다 명확하게 된다.
또한, 본 발명은
STIM1의 R429C 변이가 발현된 근육긴장저하 의심 개체에서 분리한 생물학적 시료로부터 근육세포의 근세포질세망 내 칼슘이온 농도의 감소 및 세포질 내 칼슘이온 농도의 증가 여부를 확인하는 단계를 포함하는 STIM1의 R429C 변이가 발현된 근육긴장저하 관련 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명에서, 상기 정보 제공 방법에 따라 정상 대조군과 비교하여 근육세포의 근세포질세망 및 세포질 내 칼슘이온 농도가 변화된 경우, 또는 골격근세포에서 비정상적인 칼슘 분포가 나타난 경우, STIM1-R429C 변이가 발현된 근육긴장저하 관련 질병이 발병하거나 STIM1-R429 변이가 발현된 근육긴장저하 관련 질환의 발병 가능성이 높은 것으로 판단할 수 있다. 즉, STIM1-R429C 변이가 발현된 근육긴장저하 의심 개체로부터 분리한 생물학적 시료로부터 근세포질세망 내 칼슘이온 농도의 감소 및 세포질 내 칼슘이온 농도의 증가 여부를 확인하여, 근세포질세망 내 칼슘이온 농도가 감소되고 세포질 내 칼슘이온 농도가 증가된 경우, STIM1-R429C 변이가 발현된 근육긴장저하 관련 질환이 발병하거나 STIM1-R429C 변이가 발현된 근육긴장저하 관련 질환의 발병 가능성이 높은 것으로 판단할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생물학적 시료는 조직, 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇨 또는 변일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
본 발명은 STIM1-R429C 변이가 발현된 골격근 세포에서 골격근 수축시 근세포질세망에서 세포질로의 비정상적으로 과도한 칼슘 유리를 나타내는 것을 통해, 골격근 수축 및 이완시 칼슘이온의 이동과 관련된 RyR1 및/또는 SERCA1a의 활성을 조절하여 정상적인 수준의 칼슘 분포로 맞추는 것이 가능함을 확인함으로써, 상기 결과로부터 STIM1-R429C 변이가 발현된 근육긴장저하 관련 질환을 진단하기 위한 정보를 제공할 수 있으며, STIM1-R429C 변이가 발현된 근육긴장저하 관련 질환의 예방 또는 치료 및 이를 위한 약물을 스크리닝할 수 있다.
도 1a는 STIM1 단백질 서열 상에서 R429의 위치를 표시한 것이고(S: signal peptide; cEF: canonical EF-hand domain; hEF: non-functional hidden EF-domain; SAM: sterile α-motif domain; T: transmembrane domain; C: coiled-coil domain; CAD/SOAR: Ca2+ release-activated Ca2+-activating domain/STIM1-Orai1-activating region; PS: Pro/Ser rich domain; L: Lys rich domain), 도 1b는 분화 골격근 세포에 CFP 벡터(control, 대조군), 야생형 STIM1, R429C의 발현을 확인한 결과이며, 도 1c는 정량적 실시간 유전자 증폭 실험으로, MyoD, myogenin 및 MHC에 대한 mRNA 양을 비교한 결과이고, 도 1d는 분화 골격근 세포의 너비를 측정한 결과이다.
도 2a는 R429C를 발현하는 분화 골격근 세포의 세포질 내 칼슘이온 양을 측정한 것이며, 도 2b는 R429C를 발현하는 분화 골격근 세포에 탑시가진(TG)을 처리하여 근세포질세망에 저장된 칼슘이온의 양을 간접적으로 측정한 것이고, 도 2c는 R429C를 발현하는 생쥐 분화골격근세포에 아이오노마이신을 처리하여 분화골격근세포 전체에 존재하는 칼슘이온의 양을 측정한 것이다.
도 3a는 R429C를 발현하는 분화 골격근 세포에 세포막 탈분극제인 KCl을 처리하여 골격근 수축을 위한 근세포질세망에서 세포질로의 칼슘 유리를 유도하고, 유리된 칼슘이온의 상대적인 양을 측정한 것이고, 도 3b는 R429C를 발현하는 분화 골격근 세포에서 골격근의 수축과 이완을 매개하는 핵심 단백질인 RyR1, DHPR 및 SERCA1a 단백질의 발현 양을 비교한 것이다.
도 2a는 R429C를 발현하는 분화 골격근 세포의 세포질 내 칼슘이온 양을 측정한 것이며, 도 2b는 R429C를 발현하는 분화 골격근 세포에 탑시가진(TG)을 처리하여 근세포질세망에 저장된 칼슘이온의 양을 간접적으로 측정한 것이고, 도 2c는 R429C를 발현하는 생쥐 분화골격근세포에 아이오노마이신을 처리하여 분화골격근세포 전체에 존재하는 칼슘이온의 양을 측정한 것이다.
도 3a는 R429C를 발현하는 분화 골격근 세포에 세포막 탈분극제인 KCl을 처리하여 골격근 수축을 위한 근세포질세망에서 세포질로의 칼슘 유리를 유도하고, 유리된 칼슘이온의 상대적인 양을 측정한 것이고, 도 3b는 R429C를 발현하는 분화 골격근 세포에서 골격근의 수축과 이완을 매개하는 핵심 단백질인 RyR1, DHPR 및 SERCA1a 단백질의 발현 양을 비교한 것이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1.
R429C에 대한 cDNA 제작 및 발현
인간 STIM1 cDNA (GenBank accession number: NM_003156.3)를 견본으로 하여, 표 1의 PCR 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 이렇게 얻은 PCR 합성체는 pGEX-4T-1에 제한효소 EcoR1과 Sal1을 이용하여 삽입하고, 완성된 cDNA의 염기 서열은 단백질 서열기를 통하여 재차 확인하였으며, 대장균 (E.coli(DH5α))로 형질전환하여 GST-STIM1-UI(도 1 참조) 단백질로 발현하고, GST 구슬(bead)을 이용하여 정제를 하였다.
| R429C에 대한 cDNA 제작을 위한 PCR 프라이머 서열 | |
| SEQ ID NO: 1 정방향 프라이머 |
5'-CATTGCGGGAGCGCCTGCACTGCTGGCAACAGATC-3' |
| SEQ ID NO: 2 역방향 프라이머 |
5'-GATCTGTTGCCAGCAGTGCAGGCGCTCCCGCAATG-3' |
골격근 위성 세포 분리 및 분화 골격근 세포(myotube)로의 분화 방법
생쥐(mouse)의 골격근에서 골격근 위성 세포(satellite cells)를 분리하고, 이를 일차 배양(primary culture)하여 골격근 전구세포(myoblast)를 얻었다. 배양 과정에서, 세포 배양액(F10 Nutrient Mixture 조성: 20% FBS, 100 units/ml penicillin, 100 ㎍/ml streptomycin, 2 mM L-glutamine, 20 nM basic fibroblast growth factor(bFGF))을 처리하여 37℃ 조건의 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 사용한 배양 접시로는 용도에 따라 10-cm 또는 96-well 접시를 사용하였고, 모든 접시는 matrigel로 코팅하여 사용하였다. 골격근 세포가 배양 접시의 70% 가량을 차지할 정도로 증식했을 때, 분화 골격근 세포로의 분화(differentiation)를 유도하였다(세포 분화액 조성: 세포 배양액에서 20% FBS와 F-10 Nutrient Mixture 대신 5% heat-inactivated horse serum과 low-glucose DMEM을 사용하고, bFGF는 넣지 않았음, 18% CO2 인큐베이터 사용). 분화가 완성된 세포는 분화 골격근 세포(myotube)라 명명하고, 이하 실험에 사용하였다.
골격근 분화세포(myotube)에 야생형(wild-type) STIM1과 R429C의 발현
분화가 유도된 날로부터 3일째가 되는 골격근 미성숙 분화세포(immature myotubes)에 야생형 STIM1과 R429C에 대한 cDNA를 4시간 동안 유전자 전달 감염(cDNA transfection: 각각의 cDNA는 pMO91-CFP vector 형태로 되어 있으며, 10-cm 배양 접시에 배양된 세포를 예로 들 경우, 30 ㎕ FuGENE6, 20 ㎍ cDNA가 같이 처리됨) 시켰다. cDNA가 전달감염된 세포는 36시간동안 추가 분화를 유도하였다. 이 상태의 세포가 야생형 STIM1과 R429C를 발현하는 동시에 분화가 완성된 분화 세포이며, 이하 실험에 사용하였다.
면역세포화학법
분화 골격근 세포에서 야생형 STIM1과 R429C의 발현을 확인하고자 면역세포화학법(immunocytochemistry)을 수행하였다. 차가운 메탄올(cold methanol)로 30분동안 분화 골격근 세포를 고정한 뒤에, anti-GFP 항체(1:500)과 cy3-융합부착된 이차 항체(1:500, Sigma)를 이용하여 수행하였다.
정량적 실시간 유전자 증폭 방법
야생형 STIM1 또는 R429C에 대한 mRNA 수준을 확인하고자, 분화가 완성된 분화 골격근 세포로부터 전체 RNA(total RNA)를 얻어 cDNA로 역전사를 수행한 후, 각 단백질에 대한 하기 표 2의 PCR 프라이머를 이용하여 정량적 실시간 PCR(quantitative real-time PCR)을 수행하였다.
| 프라이머 서열 | ||
| MyoD | SEQ ID NO: 3 정방향 프라이머 |
5'-GACCTGCGCTTTTTTGAGGACC-3' |
| SEQ ID NO: 4 역방향 프라이머 |
5'-CAGGCCCACAGCAAGCAGCGAC-3' | |
| Myogenin | SEQ ID NO: 5 정방향 프라이머 |
5'-TTGCTCAGCTCCCTCAACCAGGA-3' |
| SEQ ID NO: 6 역방향 프라이머 |
5'-TGCAGATTGTGGGCGTCTGTAGG-3' | |
| MHC(type II) | SEQ ID NO: 7 정방향 프라이머 |
5'-GGCCAAAATCAAAGAGGTGA-3' |
| SEQ ID NO: 8 역방향 프라이머 |
5'-CGTGCTTCTCCTTCTCAACC-3' | |
| GAPDH(대조군) | SEQ ID NO: 9 정방향 프라이머 |
5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG- 3' |
| SEQ ID NO: 10 역방향 프라이머 |
5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3' | |
단일세포 칼슘 이미징 기법
칼슘이온과 결합하게 되면 칼슘이온이 결합되기 전과는 다른 파장의 형광을 나타내는 칼슘이온 형광 염색약(Ca2+ dye)인 fluo-4(5 μM, 탑시가진(thapsigargin(TG)), 아이오노마이신(ionomycin) 및 KCl 반응 측정) 또는 fura-2(5 μM, 세포질 내 칼슘이온 양 측정)를 분화골격근세포에 45분동안 37℃를 유지하면서 주입하였다(incubation). 이때 분화골격근세포는 이미징 용액(125 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM KH2PO4, 2 mM CaCl2, 25 mM HEPES, 6 mM 글루코스, 1.2 mM MgSO4, 0.05% BSA(fraction V), pH 7.4)이 처리된 상태이다. 세포 내 칼슘이온의 이동 측정을 위해 형광 현미경(Nikon x40 oil-immersion objective, NA 1.30, ECLIPSE Ti, Nikon, JP)을 사용하였다. 칼슘이온 형광 염색약의 형광 변화는 형광 현미경에 연결된 75-watt Xenon lamp(FSM150Xe, Bentham Instruments, Ltd)와 12-bit CCD 카메라(DVC-340M-OO-CL, Digital Video Camera Company)를 사용하여 컴퓨터로 전송되었고, InCyt lm1 or Im2 image acquisition and analysis software(v5.29, Intracellular Imaging Inc)를 이용하여 분석되었다. 탑시가진, 아이오노마이신 및 KCl 처리에 의한 근세포질세망(SR)에서 세포질로의 칼슘이온 이동 및 세포질 내 칼슘이온 농도를 측정하였으며, 그래프의 피크 높이에 대한 수치를 통계 처리하였다(그래프의 면적에 대한 수치의 통계 처리와 동일 경향을 보임).
면역탁본검사
분화 골격근 세포(myotube)를 사용한 면역탁본검사를 수행하기 위해, 분화 골격근 세포는 용해 용액(lysis buffer 조성: 1% Triton X-100, 10 mM Tris-HCl(pH7.4), 1 mM Na3VO4, 10% glycerol, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, protease inhibitors(1 μM pepstatin, 1 μM leupeptin, 1 mM phenylmethysulfonyl fluoride, 20 mg/ml aprotinin, 1 μM trypsin inhibitor))을 처리하여 4℃에서 24시간 동안 용해시켰다(solubilize). 이때 10-cm 배양 접시에서 분화된 분화 골격근 세포를 예를 들면, 300 ㎕의 용해 용액을 처리하였다. 용해 용액을 처리하여 얻은 용해물은 10% SDS-PAGE 젤에서 분리하고, 젤 상에서 분리된 단백질들은 PVDF(poly-vinylidenefluoride) 막으로 옮겨 (100V로 2시간 동안) 5% 무지방 우유(non-fat milk)를 1시간동안 처리하였다. 해당 일차 항체(3 내지 12시간 동안, anti-Drp1, anti-Mfn1, anti-calcineurin, anti-CaMKII, anti-actin 항체(1:1000))를 처리하고, 연이어 해당 이차 항체(horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies)를 45분 동안 처리한 후, 발색 반응(SuperSignal ultrachemiluminescent substrate, Pierce)을 통해 시각화 및 분석하였다.
데이터 분석
모든 데이터는 다수의 실험을 통해 얻어진 데이터들을 종합하여 ± S.E.로 표현하였다. mRNA 발현양 및 단백질 발현양 비교의 경우, 대조군에서 얻어진 수치를 1로 하고 그에 대한 상대적 변화를 표현하는 표준화 비율(normalized ratio) 방식으로 표현하였다. 유의차(significant differences)는 unpaired t-test(GraphPad InStat, v2.04)를 이용하여 수행하였고, 유의차는 P < 0.05 일 경우에 별표로 표시하였다. 그래프 작성은 Origin v7 프로그램을 사용하였다.
실시예 2. 생쥐 분화 골격근 세포에서의 야생형 STIM1 또는 R429C의 발현 및 분화 상태 비교
1) 분화 골격근 세포에서의 R429C 발현 확인
분화 골격근 세포에 CFP 벡터(control, 대조군), 야생형 STIM1 및 R429C의 발현을 확인하였다. 도 1a는 STIM1 단백질 서열 상에서 R429C의 위치를 표시한 것으로, 숫자는 단백질 서열을 나타낸다. 야생형 STIM1 및 R429C의 발현 확인을 위해 CFP 항체와 Cy3 이차 항체를 이용하여 면역세포화학법으로 염색하여 도 1b에 나타내었다(흰색자: 100㎛).
2) R429C를 발현하는 생쥐 분화 골격근 세포에서의 MyoD, myogenin 및 MHC의 mRNA 발현 수준 비교
정량적 실시간 유전자 증폭 실험(qRT-PCR)으로, 각 유전자를 발현하는 분화 골격근 세포에서 분화의 정도에 따라 그 발현양이 달라지는 MyoD, myogenin, MHC에 대한 mRNA 양을 비교하였다. 분석과 통계에 사용된 실험의 횟수와 얻은 수치는 도 1c 및 하기 표 3의 괄호에 나타내었다. 대조군(GAPDH)의 수치를 1로 설정하고, 그에 대한 상대적 변화를 표준화 비율(normalized ratio)로 나타내었다.
|
Control
(대조군) |
Wild-type STIM1
(야생형 STIM1) |
R429C | |
| MyoD | 1.00 ± 0.02 (3) |
1.22± 0.05 (3) |
0.98 ± 0.14 (3) |
| Myogenin | 1.00 ± 0.02 (3) |
0.92 ± 0.05 (3) |
1.07 ± 0.14 (3) |
| MHC | 1.00 ± 0.15 (3) |
1.00 ± 0.04 (3) |
0.97 ± 0.25 (3) |
3) R429C를 발현하는 생쥐 분화 골격근 세포의 너비 비교
분화 골격근 세포의 너비 측정을 위해 가장 두꺼운 부분의 너비를 측정하였다. 측정된 너비 값은 대조군과 비교하여 분석하였으며, 분석과 통계에 사용된 실험의 횟수와 얻은 수치는 도 1d 및 하기 표 4의 괄호에 나타내었다. 이때 대조군의 수치를 1로 설정하고, 그에 대한 상대적 변화를 표준화 비율로 표현하였다.
|
Control
(대조군) |
Wild-type STIM1
(야생형 STIM1) |
R429C | |
| 분화 골격근 세포의 너비 | 1.00 ± 0.05 (40) |
1.02 ± 0.07 (40) |
0.95 ± 0.07 (40) |
투과전자현미경을 통한 분화 골격근 세포의 모양 관찰, 분화의 정도를 나타내는 단백질의 mRNA 발현 수준 비교, 및 분화 골격근 세포의 너비 관찰 등을 통해, R429C를 발현하는 분화 골격근 세포의 분화 상태를 다방면으로 살펴보았다. 그 결과, 분화의 정도에는 R429C에 의한 영향이 없음을 알 수 있었다. 이는 R429C가 근육긴장저하를 일으키지만, 골격근 세포의 외관(즉, 분화 정도)에는 영향을 미치지 않아 겉으로 보아서는 정상처럼 보였다. 이는 R429C에 기인된 골격근 질병을 세포 외관상으로 알아 볼 수 없음을 의미한다. 따라서, R429C에 기인된 골격근 질병을 쉽게 보여줄 수 있는 활성적 또는 내부적인 마커나 표지자가 필요함을 의미한다.
실시예 3. R429C를 발현하는 생쥐 분화 골격근 세포의 특징
1) 칼슘이온 양 비교
단일세포 칼슘이온 이미징 기법으로 R429C를 발현하는 생쥐 분화골격근세포에서 세포질의 칼슘이온 양과 근세포질세망(SR)에 저장된 칼슘이온의 양 및 세포 전체의 칼슘이온 양을 비교하였다. 먼저, R429C를 발현하는 생쥐 분화골격근세포에서 세포질 내 칼슘이온의 양을 측정하였고(도 2a), R429C를 발현하는 생쥐 분화골격근세포에 탑시가진(TG) 처리하여 근세포질세망에 저장된 칼슘이온의 양을 간접적으로 측정하였으며(도 2b), R429C를 발현하는 생쥐 분화골격근세포에 아이오노마이신을 처리하여 분화골격근세포 전체에 존재하는 칼슘이온의 양을 측정하여(도 2c) 하기 표 5에 비교하였다. 이때 하기 측정된 값은 대조군의 수치를 1로 설정하여 그에 대한 상대적 변화를 표준화 비율(normalized ratio)로 표현하였으며, 분석과 통계에 사용된 실험의 횟수와 얻은 수치는 하기 표 5에 괄호로 나타냈다. *는 대조군과 비교하여 유의성 있는 다름을 표시한 것이다(p < 0.05).
|
Control
(대조군) |
Wild-type STIM1
(야생형 STIM1) |
R429C | |
| 세포질의 칼슘 농도(nM) | 84.37 ± 4.67 (69) |
85.84 ± 5.99 (70) |
101.19 ± 8.07 * (70) |
| 근세포질세망 (SR)의 칼슘 정도 | 1.00 ± 0.09 (50) |
1.00 ± 0.10 (50) |
0.80 ± 0.10 * (50) |
| 세포 내 전체 칼슘 정도 | 1.00 ± 0.09(36) | 0.98 ± 0.09 (34) |
1.03 ± 0.11 (38) |
| KCl 반응 | 1.00 ± 0.07(54) | 0.79 ± 0.08 * (54) |
1.20 ± 0.10 * (72) |
그 결과, 단일세포 칼슘이온 이미징 기법으로 분화골격근세포에서 골격근 수축에 필요한 칼슘이온의 양을 측정한 결과, 세포 전체에 존재하는 칼슘이온의 양에는 변화가 없었으나, R429C 변이의 발현에 의해 세포질 내 칼슘이온 양은 늘고, 근세포질세망 내 칼슘이온의 양은 감소하여 비정상적인 칼슘 분포가 나타났다. 이는 R429C를 발현하는 분화골격근세포는 대조군 또는 야생형 STIM1을 발현하는 세포에 비해, 비정상적 칼슘 분포를 나타낸다는 점을 통해, 비정상적 칼슘 분포가 R429C에 기인된 골격근 질병을 보여줄 수 있는 마커나 표지자가 될 수 있음을 확인할 수 있다. 또한 상기 결과는 이에 대한 상보적 조치(세포질 내 칼슘이온 양 감소 유도 또는 근세포질세망 내 칼슘이온 양 증가 유도)를 통해 R429C에 기인된 골격근 질병에 대한 치료 효과를 나타낼 수 있음을 의미한다.
2) 칼슘이온 이동량 비교
R429C를 발현하는 생쥐 분화골격근세포에서, 골격근 수축에 사용되는 칼슘이온의 이동을 비교하였다. 이에, R429C를 발현하는 생쥐 분화골격근세포에서 세포막 탈분극제인 KCl을 처리하여, 골격근 수축을 위한 근세포질세망에서 세포질로의 칼슘이온 유리를 유도하고, 유리된 칼슘이온의 상대적인 양을 측정하여 비교하였다(도 3a). 또한, R429C를 발현하는 생쥐 분화골격근세포에서 골격근 수축과 이완을 매개하는 핵심 단백질들인 RyR1, DHPR 및 SERCA1a 단백질의 발현 양을 비교하기 위해 면역탁본법을 사용하여 하였다(도 3b). 이때, 하기 측정된 값은 대조군의 수치를 1로 설정하여 그에 대한 상대적 변화를 표준화 비율로 표현하였으며, 분석과 통계에 사용된 실험의 횟수와 얻은 수치는 하기 표 6에 괄호로 나타냈다. *는 대조군과 비교하여 유의성 있는 다름을 표시한 것이다(P < 0.05).
|
Control
(대조군) |
Wild-type STIM1
(야생형 STIM1) |
R429C | |
| RyR1 | 1.00 ± 0.00 (3) |
0.99 ± 0.11 (3) |
1.02 ± 0.04 (3) |
| DHPR | 1.00 ± 0.00 (3) |
0.99 ± 0.09 (3) |
1.03 ± 0.08 (3) |
| SERCA1a | 1.00 ± 0.00 (3) |
1.02 ± 0.07 (3) |
0.99 ± 0.09 (3) |
그 결과, 골격근 수축 시에 일어나는 세포막 탈분극 유도(KCl 처리)하고, 그에 따른 근세포질세망에서 세포질로의 칼슘이온 유리를 단일세포 칼슘이온 이미징 기법으로 측정한 결과, 대조군 또는 야생형 STIM1을 발현하는 세포에 비해, R429C를 발현하는 분화골격근세포는 비정상적으로 매우 많은 양의 칼슘이 근세포질세망으로부터 세포질로 유리됨을 관찰할 수 있었다. 한편, 골격근 세포의 수축과 이온을 매개하는 핵심 단백질인 RyR1, DHPR 및 SERCA1a 단백질의 발현 양에는 변화가 없음을 확인하였다. 이는 R429C를 발현하는 분화골격근세포에서 발견되는 근수축 과정에서 비정상적으로 과도한 칼슘이온 유리가 확인되므로, 이러한 비정상적인 칼슘 유리가 R429C에 의한 근육긴장저하의 원인이 될 수 있음을 알 수 있다. 골격근의 수축과 이완이 순환적인 현상임을 고려할 때, 골격근의 과도한 수축에 따른 이상 증상(즉, 근육긴장저하의 초기 증상에 해당)은 후에 일어나는 이완에 문제를 일으킬 수 있으므로, 결국 장기적으로는 근육긴장저하를 일으킬 수 있다. 또한, 본 실험은 세포에서 R429C에 의한 근육긴장저하 현상을 단기적으로 관찰했다고 볼 수 있다. 따라서, 근육긴장저하의 초기 증상으로 세포질로의 과도한 칼슘 조달이 일어날 수 있으며, 이러한 증상은 근육긴장저하의 초기 증상을 진단하기 위한 표지자로 이용될 수 있다.
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<220>
<223> R429C_primer_F
<400> 1
cattgcggga gcgcctgcac tgctggcaac agatc 35
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> R429C_primer_R
<400> 2
gatctgttgc cagcagtgca ggcgctcccg caatg 35
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MyoD_primer_F
<400> 3
gacctgcgct tttttgagga cc 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MyoD_primer_R
<400> 4
caggcccaca gcaagcagcg ac 22
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Myogenin_primer_F
<400> 5
ttgctcagct ccctcaacca gga 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Myogenin_primer_R
<400> 6
tgcagattgt gggcgtctgt agg 23
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MHC(typeII)_primer_F
<400> 7
ggccaaaatc aaagaggtga 20
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<211> 20
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<213> Artificial Sequence
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<400> 8
cgtgcttctc cttctcaacc 20
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aggtcggtgt gaacggattt g 21
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<220>
<223> GAPDH_primer_R
<400> 10
tgtagaccat gtagttgagg tca 23
Claims (7)
- STIM1의 R429C 변이가 발현된 근육긴장저하 의심 개체로부터 분리한 생물학적 시료를 후보물질과 인체 외에서 접촉시키고,
상기 후보물질이 근세포질세망 내 칼슘이온 농도를 증가시키는지 또는 감소시키는지 확인하는 것; 또는 상기 후보물질이 세포질 내 칼슘이온 농도를 증가시키는지 또는 감소시키는지 확인하는 것을 포함하며,
다운증후군, 근이영양증, 뇌성마비, 프레더-윌리 증후군 또는 테이-샥스병으로부터 선택되는 STIM1의 R429C 변이가 발현된 근육긴장저하 관련 질환의 치료를 위한 약물의 스크리닝 방법. - 제1항에 있어서,
후보물질이 근세포질세망 내 칼슘이온 농도를 증가시키면 STIM1의 R429C 변이가 발현된 근육긴장저하 관련 질환의 치료제로 판정하는 STIM1의 R429C 변이가 발현된 근육긴장저하 관련 질환의 치료를 위한 약물의 스크리닝 방법. - 제1항에 있어서,
후보물질이 세포질 내 칼슘이온 농도를 감소시키면 STIM1의 R429C가 발현된 근육긴장저하 관련 질환의 치료제로 판정하는 STIM1의 R429C 변이가 발현된 근육긴장저하 관련 질환의 치료를 위한 약물의 스크리닝 방법. - SERCA1a(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase 1a) 활성 촉진제 또는 RyR1(Ryanodine receptor 1) 활성 저해제 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하며, 다운증후군, 근이영양증, 뇌성마비, 프레더-윌리 증후군 또는 테이-샥스병으로부터 선택되는 STIM1의 R429C 변이가 발현된 근육긴장저하 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제4항에 있어서,
SERCA1a 활성 촉진제는 4-(1-메틸에톡시)-N-(2-메틸-8-퀴놀리닐)-벤자마이드, 이스타록심(Istaroxime), 5'-벤질-1'-부틸N-(나프탈렌-2-일설포닐)-6'-옥소-1',6'-디하이드로-2,3'-비피리딘-4-카복사마이드 및 N-하이드록시-2-메탄설포닐벤젠-1-설폰아마이드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 STIM1의 R429C 변이가 발현된 근육긴장저하 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제4항에 있어서,
RyR1 활성 저해제는 RyR1 유전자에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스-올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA 또는 이를 포함하는 벡터; RyR1 단백질에 특이적인 항체; 또는 RyR1 활성을 저해하는 화합물 중 어느 하나인 STIM1의 R429C 변이가 발현된 근육긴장저하 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제4항에 있어서,
RyR1 활성을 저해하는 화합물은 라이아노딘, 4,6-디브로모-3-하이드록시카바졸, 독소루비신, 미톡산트론, 다우노루비신, 루비다존, 루테늄 레드, 네오마이신, 젠타마이신, 스트렙토마이신, 클린다마이신, 카나마이신, 토브라마이신, [2,6-디클로로-4-(디메틸아미노)페닐]-이소프로필아민, 단트롤린, 프로카인, 테트라카인, 에티도카인, 부피바카인, 프릴로카인, 리도카인, 메피바카인, N,N-디메틸-2-옥소-N-[2-옥소-2-(페닐아미노)에틸]-2-(페닐아미노)-에탄아미늄 클로라이드, 리도카인 N-에틸 브로마이드, 벤조카인, 베라파밀, 갈로파밀, 아미파밀, 임페라톡신-a, 임페라톡신-i, 과산화수소 및 디사이클로헥실카르보디이미드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 STIM1의 R429C 변이가 발현된 근육긴장저하 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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