WO2024096661A1 - 축방향 사양 정보를 포함하는 신경능선줄기세포의 분화 방법 - Google Patents
축방향 사양 정보를 포함하는 신경능선줄기세포의 분화 방법 Download PDFInfo
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Definitions
- the present invention relates to a method for selectively differentiating and isolating neural crest cells containing human axial specification information from pluripotent stem cells.
- Nervous system cells can be broadly divided into two types: central nervous system and motor nerve cells, which make up the brain and spinal cord, and peripheral nervous system cells, which make up sensory nerves and autonomic nerves.
- Neurons, astrocytes, and oligodendrocytes that make up the central nervous system (brain and spinal cord) and motor neurons are neural progenitor cells (neural stem cells or neural progenitors) differentiated from pluripotent stem cells.
- cell: NPC neural progenitor cells
- the peripheral nerve cells (autonomic nerves and sensory nerves) and Schwann cells that make up the peripheral nervous system are neural crest stem cells (neural crest cells) differentiated from pluripotent stem cells. It is derived from stem cell (NCSC). Therefore, central nervous system cells and peripheral nervous system cells are created from pluripotent stem cells along different differentiation paths, through neural progenitor cells and neural crest cells, respectively, and these different paths depend on the surrounding environment and intracellular signaling systems. It is known that
- Neural crest stem cells present in the human body during embryonic or fetal development are located widely along the rostro-caudal axis from the head and neck to the tailbone, and depending on the location of the human spinal axis, the head and neck-(cranial-), trunk-( Neural crest stem cells, which are subdivided into trunk-, cardiac-, and sacral-) neural crest stem cells, have different differentiation target cells, tissues, and organs depending on the type.
- Neural crest stem cells at the beginning of embryonic development do not have information about the spinal axis, and during the period of embryo elongation along with neural tube formation, the neural crest also moves along the elongating spinal axis and naturally acquires spinal axis position information.
- Neural crest stem cells migrate from the posterior part of the neural fold during the migratory stage of development, and neural crest stem cells migrate and distribute to a wide range of tissues and organs in the body. After this cycle, neural crest stem cells differentiate into neurons of the peripheral nervous system, glial cells, melanocytes of the skin, cells of the endocrine system, and various mesenchymal cells, forming the nervous system or non-nervous system in adults. It is known to be distributed in tissues and organs (Dev Dyn 2007;236:3242).
- neural crest stem cell-like cells have been found in peripheral nerves, dorsal root ganglia, gut, hair follicles, dermal papillae, cornea, and tooth medulla even after birth. It was found to exist in dental pulp. Among these, adult human neural crest stem cell-like cells were isolated only from hair follicles, dermal papilla, and tooth pulp (J Cell Biochem 2009;107:1046). Previously, neural crest stem cells derived from the dermis or isolated from hair follicles were reported in human adults.
- neural crest stem cells that differentiate into various cells that are located and function in each organ or tissue of the human body
- adult neural crest stem cells or neural crest stem cell-like cells cultured using conventional techniques are already significant. It is highly likely that differentiation has progressed and the initial multipotent nature has been lost.
- the conventional technology used specific markers to isolate neural crest stem cells, but the problem has emerged that there is no marker that can specifically represent the developmental stage of neural crest stem cells to date.
- the purpose of the present invention is to provide a method for producing early neural crest stem cells.
- an object of the present invention is to provide a method for producing neural crest stem cells.
- an object of the present invention is to provide a composition for detecting early neural crest stem cells.
- an object of the present invention is to provide a method for detecting early neural crest stem cells.
- an object of the present invention is to provide a use for detecting early neural crest stem cells.
- an object of the present invention is to provide a use for preparing a composition for detecting early neural crest stem cells.
- an object of the present invention is to provide a composition for detecting neural crest stem cells.
- an object of the present invention is to provide a method for detecting neural crest stem cells.
- an object of the present invention is to provide a use for detecting neural crest stem cells.
- the purpose of the present invention is to provide a use for preparing a composition for detecting neural crest stem cells.
- the present invention provides a composition for detecting early neural crest stem cells, including an agent for measuring the expression level of p75 NGFR or HNK1 gene.
- the present invention provides a method for detecting early neural crest stem cells including the step of measuring the expression level of p75 NGFR or HNK1 gene in an isolated sample.
- the sample may be any material, biological fluid, tissue, or cell derived from the subject.
- the method for detecting early neural crest stem cells may further include the step of identifying early neural crest stem cells when the expression level of the p75 NGFR or HNK1 gene is increased or positive compared to the control group.
- the present invention provides the use of an agent measuring the expression level of p75 NGFR or HNK1 gene for detection of early neural crest stem cells.
- the present invention provides a use for the preparation of a composition for detecting early neural crest stem cells using an agent that measures the expression level of the p75 NGFR or HNK1 gene.
- the present invention provides a use for detecting p75 NGFR or HNK1 in early neural crest stem cells.
- the present invention provides a composition for detecting neural crest stem cells containing axial specification information, including an agent for measuring the expression level of the ETS1 gene or ZIC1 gene.
- the present invention provides a method for detecting neural crest stem cells having axial specification information, which includes measuring the expression level of the ETS1 gene or ZIC1 gene in an isolated sample.
- the sample may be any material, biological fluid, tissue, or cell derived from the subject.
- the method for detecting neural crest stem cells having axial specification information includes, when the expression level of the ETS1 gene or ZIC1 gene is increased or positive compared to the control group, neural crest stem cells having axial specification information.
- a step of determining cells may be further included.
- the present invention provides a use for detecting neural crest stem cells carrying axial specification information of the agent for measuring the expression level of the ETS1 gene or ZIC1 gene.
- the present invention provides a use for preparing a composition for detecting neural crest stem cells that holds axial specification information of an agent for measuring the expression level of the ETS1 gene or ZIC1 gene.
- the present invention provides a use for detecting neural crest stem cells that possess axial specification information of the ETS1 gene or ZIC1 gene.
- the present invention provides a method for producing early neural crest stem cells.
- the present invention provides a method for producing neural crest stem cells.
- the method of the present invention it is possible to produce early neural crest cells that correspond to the neural tube formation (neurulation) stage of the embryo and have not yet formed human axial information, and to produce neural crest cells that possess specific human axial information. Since they can be specifically separated and cultured in vitro, various types of neural crest cells can be obtained at once, and the biological processes of neural crest cells to retain axial information can be studied to develop tissues and organs. By identifying the process, it is possible to develop a variety of cell therapy products optimized for the characteristics of the human body location.
- Figure 1 is a diagram depicting the stages of cell development within an embryo during human embryo development.
- Figure 2 is a diagram confirming cell surface markers for isolation of early neural crest stem cells:
- Figure 3 is a diagram confirming the expression of early neural crest stem cell markers (P75 NGFR and HNK1) and axial specification marker (HOX) in early neural crest stem cells differentiated from pluripotent stem cells for 5 days.
- Figure 4 is a diagram showing the production process of neural crest stem cells.
- Figure 5 is a diagram comparing the gene expression levels of early neural crest stem cells on day 5 of differentiation and neural crest stem cells with axial specifications on day 10 of differentiation.
- Figure 6 is a diagram confirming the expression level of ZIC1 and ETS1 when only early neural crest stem cells exist alone without treatment with axial specification stimulating factors.
- Figure 7 is a diagram analyzing gene expression of secondary differentiated neural crest stem cells by adding axial specification stimulating factors:
- TWIST1 gene marker gene for head and neck neural crest stem cells
- HOX gene in early neural crest stem cells treated with FGF2 during secondary differentiation
- Figure 8 is a diagram analyzing the mechanism of maintaining axial specification of early neural crest stem cells by signaling factors.
- Figures 9 and 10 show confirmation that multiple axially specified neural crest populations were simultaneously generated within one batch by treating various axial specification stimulating factors in early neural crest stem cells isolated through primary differentiation:
- the present invention relates to a composition for detecting early neural crest stem cells comprising an agent for measuring the expression level of p75 NGFR or HNK1 gene.
- the present invention relates to a method for detecting early neural crest stem cells comprising measuring the expression level of p75 NGFR or HNK1 gene in an isolated sample.
- the sample may be any material, biological fluid, tissue, or cell derived from the subject.
- the method for detecting early neural crest stem cells may further include the step of identifying early neural crest stem cells when the expression level of the p75 NGFR or HNK1 gene is increased or positive compared to the control group.
- the present invention relates to the use of an agent measuring the expression level of p75 NGFR or HNK1 gene for detecting early neural crest stem cells.
- the present invention relates to the use of an agent for measuring the expression level of p75 NGFR or HNK1 gene for the preparation of a composition for detecting early neural crest stem cells.
- the present invention relates to the use of p75 NGFR or HNK1 for detecting early neural crest stem cells.
- the initial neural crest stem cells may be neural crest stem cells corresponding to the neural plate border-stage during the neural tube formation (neurulation) stage of the embryo.
- the initial neural crest stem cells may be neural crest stem cells that express the PAX7 gene and protein.
- early neural crest stem cells may reside in the neural plate.
- the initial neural crest stem cells may be PAX7, MSX1, AP2alpha, p75 NGFR or HNK1 positive cells, and are more preferably p75 NGFR or HNK1 positive cells.
- an agent for measuring the expression level of a gene may be an agent for measuring the expression level of mRNA or protein of the gene.
- an agent for measuring the expression level of mRNA of a gene includes a nucleic acid sequence of the marker, a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence, a primer pair that specifically recognizes a fragment of the nucleic acid sequence and the complementary sequence, It may include a probe, or a primer pair and a probe, and its measurement can be performed using polymerase chain reaction (PCR), real-time polymerase chain reaction (qPCR), or reverse transcription polymerase chain reaction (RT- PCR; reverse transcription PCR), competitive RT-PCR, nuclease protection assay (RNase and S1 nuclease protection assay), in situ hybridization, nucleic acid microarray, It may be performed by a method selected from the group consisting of northern blotting or DNA chip.
- PCR polymerase chain reaction
- qPCR real-time polymerase chain reaction
- RT- PCR reverse transcription polymerase chain reaction
- RNase and S1 nuclease protection assay RNase and S1 nucleas
- the agent for measuring the expression level of the marker protein is an antibody, antibody fragment, aptamer, avidity multimer, or peptido that specifically recognizes the full-length protein of the gene or a fragment thereof. It may include peptidomimetics, and its measurement can include Western blot, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, It may be performed by a method selected from the group consisting of immunoprecipitation assay, complement fixation assay, flow cytometry (FACS), mass spectrometry, or protein microarray.
- ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
- RIA radioimmunoassay
- immunoelectrophoresis immunoelectrophoresis
- tissue immunostaining It may be performed by a method selected from the group consisting of immunoprecipitation assay, complement fixation assay, flow cytometry (FACS), mass spectrometry, or
- the present invention relates to a composition for detecting neural crest stem cells containing axial specification information, including an agent for measuring the expression level of the ETS1 gene or ZIC1 gene.
- the present invention relates to a method for detecting neural crest stem cells having axial specification information, including measuring the expression level of the ETS1 gene or ZIC1 gene in an isolated sample.
- the sample may be any material, biological fluid, tissue, or cell derived from the subject.
- the method for detecting neural crest stem cells having axial specification information includes, when the expression level of the ETS1 gene or ZIC1 gene is increased or positive compared to the control group, neural crest stem cells having axial specification information.
- a step of determining cells may be further included.
- the invention relates to the use of an agent for detecting neural crest stem cells bearing axial specification information that measures the expression level of the ETS1 gene or the ZIC1 gene.
- the present invention relates to the use of a composition for detecting neural crest stem cells that retains axial specification information of an agent for measuring the expression level of the ETS1 gene or ZIC1 gene.
- the invention relates to the use for detecting neural crest stem cells carrying axial specification information of the ETS1 gene or ZIC1 gene.
- the neural crest stem cells retaining axial specification information include cranial neural crest stem cells, vagal neural crest stem cells, cardiac neural crest stem cells, and trunk neural crest stem cells. It may be stem cells or sacral neural crest stem cells, and head and neck neural crest stem cells are more preferable.
- an agent for measuring the expression level of a gene may be an agent for measuring the expression level of mRNA or protein of the gene.
- an agent for measuring the expression level of mRNA of a gene includes a nucleic acid sequence of the marker, a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence, a primer pair that specifically recognizes a fragment of the nucleic acid sequence and the complementary sequence, It may include probes, or primer pairs and probes, and their measurements include polymerase chain reaction, real-time polymerase chain reaction, reverse transcription polymerase chain reaction, competitive polymerase chain reaction, nuclease protection assay, in situ hybridization, and nucleic acid microscopy. It may be performed by a method selected from the group consisting of array, Northern blot, or DNA chip.
- the agent for measuring the expression level of the marker protein is an antibody, antibody fragment, aptamer, avidity multimer, or peptido that specifically recognizes the full-length protein of the gene or a fragment thereof. It may include peptidomimetics, and its measurement includes Western blot, ELISA, radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FACS, and mass spectrometry. Alternatively, it may be performed by a method selected from the group consisting of protein microarray.
- the term “detection” or “measurement” means quantifying the concentration of a detected or measured object.
- the term "primer” is a nucleic acid sequence with a short free 3-terminal hydroxyl group that can form a base pair with a complementary template and serves as a starting point for copying the template strand. It refers to a short nucleic acid sequence that performs a function. Primers can initiate DNA synthesis in the presence of four different nucleoside triphosphates and reagents for polymerization (i.e., DNA polymerase or reverse transcriptase) in an appropriate buffer solution and temperature.
- probe refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA that is as short as a few bases or as long as several hundred bases, capable of forming a specific binding to mRNA, and is labeled to confirm the presence or absence of a specific mRNA.
- Probes may be manufactured in the form of oligonucleotide probes, single stranded DNA probes, double stranded DNA probes, RNA probes, etc.
- hybridization is performed using a probe complementary to the gene, and the level of gene expression can be diagnosed based on hybridization. Selection of appropriate probes and hybridization conditions can be modified based on those known in the art, so the present invention is not particularly limited thereto.
- Primers or probes of the present invention can be chemically synthesized using the phosphoramidite solid support method or other well-known methods. These nucleic acid sequences can also be modified using many means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include methylation, capping, substitution of a native nucleotide with one or more homologues, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkages (e.g., methyl phosphonate, phosphotriester, phosphoronucleotide). amidate, carbamate, etc.) or charged linkages (e.g. phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.).
- uncharged linkages e.g., methyl phosphonate, phosphotriester, phosphoronucleotide
- charged linkages e.g. phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.
- suitable conditions for hybridizing a probe to a cDNA molecule can be determined through a series of processes through an optimization procedure. These procedures are performed as a series by those skilled in the art to establish protocols for use in the laboratory. For example, conditions such as temperature, concentration of components, hybridization and washing time, buffer components and their pH and ionic strength depend on various factors such as the length of the probe, the amount of GC, and the target nucleotide sequence. Detailed conditions for hybridization are described in Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); and M.L.M. Anderson, NucleicAcidHybridization, Springer-Verlag New York Inc.
- the high stringency conditions are hybridization at 65°C in 0.5 M NaHPO4, 7% SDS (sodium dodecylsulfate), and 1mM EDTA, and 68°C in 0.1 x standard saline citrate (SSC)/0.1% SDS.
- SSC standard saline citrate
- high stringency means washing at 48°C in 6 x SSC/0.05% sodium pyrophosphate.
- Low stringency conditions mean, for example, washing at 42°C in 0.2 x SSC/0.1% SDS.
- the term “antibody” is a term known in the art and refers to a specific protein molecule directed to an antigenic site.
- an antibody refers to an antibody that specifically binds to a protein expressed in the gene, and the antibody can be produced using a well-known method. This also includes partial peptides that can be made from the above proteins.
- the form of the antibody of the present invention is not particularly limited, and if it is a polyclonal antibody, monoclonal antibody, or has antigen binding properties, a part of it is included in the antibody of the present invention, and all immunoglobulin antibodies are included. .
- the antibodies of the present invention also include special antibodies such as humanized antibodies.
- the present invention relates to a kit containing the composition for detecting early neural crest stem cells or neural crest stem cells of the present invention.
- the present invention includes culturing pluripotent stem cells; Differentiating the cultured cells into early neural crest stem cells; and a method for producing early neural crest stem cells, including the step of isolating the early neural crest stem cells.
- the initial neural crest stem cells may be neural crest stem cells corresponding to the neural plate border-stage during the neural tube formation (neurulation) stage of the embryo.
- the initial neural crest stem cells may be neural crest stem cells that express the PAX7 gene and protein.
- early neural crest stem cells may reside in the neural plate.
- the initial neural crest stem cells may be PAX7, MSX1, AP2alpha, p75 NGFR or HNK1 positive cells, and are more preferably p75 NGFR or HNK1 positive cells.
- the initial neural crest stem cells may be neural crest stem cells that do not form axial information.
- differentiation may be performed for 4 to 7 days.
- the present invention includes culturing pluripotent stem cells; Primary differentiation of cultured cells into early neural crest stem cells; Isolating early neural crest stem cells; and secondary differentiation of initial neural crest stem cells into neural crest stem cells retaining axial specification information.
- WNT, BMP, BMP4, SHH, FGF2, NOTCH, or bFGF may be treated during secondary differentiation, and treatment with FGF2 (fibroblast growth factor 2) is more preferable.
- bFGF or FGF2 and BMP or BMP4 may be treated together during secondary differentiation.
- secondary differentiation may be treated with FGF2 at 5 to 100 ng/ml.
- the expression level of the ZIC1 gene may be reduced compared to before secondary differentiation, and the expression ratio of the ETS1 gene/ZIC1 gene during secondary differentiation may increase compared to before secondary differentiation.
- FGF2 can suppress ZIC1 gene expression and FGF2 can promote ETS1 protein expression through BMP4.
- the neural crest stem cells that retain axial specification information may be head and neck neural crest stem cells, vagal neural crest stem cells, cardiac neural crest stem cells, trunk neural crest stem cells, or sacral neural crest stem cells. .
- the neural crest stem cell carrying axial specification information may be a cell expressing the gene or protein of SOX9 or SOX10.
- primary differentiation may be performed for 4 to 7 days and secondary differentiation may be performed for 3 to 10 days.
- neural crest stem cells possess axial specification information by accurately controlling and transmitting cell signal transmission that acts directly on neural crest stem cells, excluding the influence of non-neural crest stem cells. was able to be created effectively and accurately, and when bFGF was applied to the two-step differentiation method in the embodiment of the present invention, the differentiation efficiency of head and neck neural crest stem cells using SOX9 reporter hESC increased from around 30% to 80% compared to the conventional method. It was confirmed that there was improvement both internally and externally (see Figure 8 (c)-(d)).
- the present invention is a two-step neural crest stem cell differentiation method to solve various limitations due to the existing conventional one-step neural crest stem cell differentiation method being a method of obtaining differentiation of only one type of neural crest stem cell.
- stem cell differentiation technology nerves with various location information, such as head and neck, cranial, trunk, cardiac, and sacral, are generated in the same differentiation round (single batch). It has the advantage of being able to differentiate and obtain ridge stem cells at the same time.
- neural tube formation (neurulation) stage it is important to secure early neural crest cells that have differentiated from totipotent stem cells into neural crest stem cells but have not yet established axial specification information, that is, before the neural tube formation (neurulation) stage.
- the present invention it was confirmed that labeling of early neural crest cells using p75 NGFR was possible by staining neural crest cells of developing chicken embryos, and when human pluripotent stem cells were differentiated in a newly prepared differentiation medium (PIM). , it was confirmed that the p75 NGFR protein was expressed first before the expression of the SOX10 protein expressed by neural crest stem cells with migration ability using axis specification information. Accordingly, primary neural crest cells with undetermined axial specification information are differentiated into pluripotent stem cells through primary differentiation for 5 to 7 days, cells are isolated using p75 NGFR antibody, and then secondary differentiation of these cells is performed. During the differentiation process, bFGF was treated to differentiate into head and neck neural crest stem cells, and WNT was treated to differentiate into torso neural crest stem cells, and these cells were verified through changes in ZIC1 or ETS1 expression.
- the conventional neural crest stem cell differentiation method can differentiate into specific neural crest cells, but early neural crest cells that have not yet acquired axis specification information (located in the neural tube during the neuralization process and expressing PAX7 protein) are differentiated. , there are limitations in securing or confirming, and because various cell types such as neural crest stem cells and non-neural crest stem cells are mixed during the cell differentiation process, there are limitations in understanding the exact mechanism of signaling proteins such as bFGF and WNT.
- the present invention can isolate pure early neural crest cells, it is possible to differentiate and secure more efficient axial-specified neural crest stem cells by delivering signaling proteins such as bFGF and WNT to these cells.
- signaling proteins such as BMP and SHH, which are known to play a role in the axial specification of neural crest stem cells, does it act directly on neural crest stem cells, or does it act on mixed non-neural crest stem cells, resulting in neural crest stem cells? It was confirmed whether it had an indirect effect affecting ridge cells.
- NCSCs neural crest stem cells
- Early neural crest stem cells correspond to the neural tube formation (neurulation) stage of human embryonic development ( Figure 1) and have not yet formed human axial information (before predestination into cranial/vagal/trunk/sacral neural crest stem cells).
- Figure 1 To select cell surface markers specific to neural crest stem cells, the expression of p75 NGFR was confirmed in the dorsal regional early neural crest by immunofluorescence staining after tissue transparency of developing chicken embryos, and human During the process of differentiating pluripotent stem cells into neural crest cells, the expression of SOX10 and p75 NGFR was confirmed over the differentiation time.
- NGFR/HNK1 expression takes precedence over the conventional expression of SOX10, which marks migrating neural crest stem cells, and through this, pre-migrating early neural crest stem cells. It was confirmed that cells could be separated using p75 NGFR or HNK1 antibodies ( Figure 2).
- Example 2 Primary differentiation into early neural crest stem cells at the neural plate border-stage
- hESC human pluripotent stem cell
- an appropriate solution such as Accutase (Innovative Cell Technologies) or Versene (Thermo Fisher)
- 100,000 cells per well of a 24 well plate were placed on a plate coated with Geltrex ECM. It was busy.
- PIM medium DMEM/F-12; Thermo Fishser
- 3uM CHIR99021 GSK-3 inhibitor, WNT activation
- 0.5% KSR Thermo Fishser
- B-27 supplement Thermo Fishser
- Glutamax Thermo Fishser
- Example 3 Isolation and confirmation of early neural crest stem cells in the neural plate border-stage
- neural plate border-stage early neural crest stem cells To isolate early neural crest stem cells, neural plate border-stage early neural crest stem cells, they were collected on the 5th day (day 5) to the 7th day (day 7) of differentiation using Accutase, and the cell pellet was washed with PBS. Resuspend in FACS buffer. Multiple cell clumps were removed by filtration twice using 35um strainer snap-cap round bottom tubes, labeled with antibodies against neural crest stem cell surface antigen p75 NGFR or HNK1, and sorted using a FACS sorter ( Neural plate border-stage early neural crest stem cells were isolated using SONY SH-800).
- NCSCs (cells on day 5 of differentiation) expressing p75 NGFR or HNK1 isolated by FACS in Example 3-1 were seeded at 30 cells per well in a 24-well plate coated with Geltrex, Matrigel, or Laminin+Fibronectin. They were re-distributed to 10,000 pieces. After 24 hours, the PIM medium added on day 5 for stabilization was gradually changed to Neurobasal medium containing 2% B-27 supplement, 1% N2 supplement, and 1% Glutamax along with FGF2 (fibroblast growth factor 2). (Table 2).
- FGF2 As an axial specification stimulating factor, FGF2 was added to the culture medium on days 6 to 10 of differentiation, and on days 11 to 14 of differentiation, neural crest stem cells proliferated using an antibody against the neural crest stem cell surface antigen p75 NGFR were FACS. It was purified ( Figure 4).
- the isolated early neural crest stem cells were found to express NGFR, HNK1, PAX7, MSX1, and AP2alpha (Figure 5 (a) to (d)).
- early neural crest stem cells at the neural plate border-stage isolated on day 5 of differentiation were found to express significantly more ZIC1 than pre-differentiation cells and neural crest stem cells isolated on day 10 of differentiation, and ETS1 was found to be expressed as differentiation progressed. It was found to increase as time goes by ((e) in Figure 5). Since the continued expression of ZIC1 after developmental differentiation is a specification factor for trunk neural crest stem cells rather than head and neck neural crest stem cells, head and neck neural crest stem cells are transformed between 5 and 10 days after differentiation. It was confirmed that the schedule had been made.
- the initial neural crest stem cells (expressing p75 NGFR or HNK1) on the 5th day of differentiation in Example 3-1 were isolated, or mixed cells were mixed for 5 days without adding FGF2, an axial specification stimulating factor, for a second time for 5 days.
- the expression of the ZIC1 gene and ETS1 gene was confirmed, and the expression of the ZIC1 gene was not reduced, and the expression of the ETS1 gene was found to increase with the additional differentiation days ( Figure 6 (a) and (b) ).
- the expression ratio of the ZIC1 gene and the ETS1 gene (ETS1/ZIC1), which can determine the specification of head and neck neural crest stem cells, was found to be maintained without increasing ( Figure 6(c)).
- the early neural crest stem cells (expressing p75 NGFR or HNK1) on the 5th day of differentiation in Example 3-1 were isolated (NC only), or in a mixed cell state without separation, and WNT (GSK-3) was used as an axial specification stimulating factor.
- FGF2-treated neural crest stem cells showed increased expression of the TWIST1 gene, a marker gene for head and neck neural crest stem cells, and a decrease in the HOX gene, which is known not to be expressed in head and neck neural crest stem cells. ((c) in Figure 7).
- ZIC1 and ETS1 genes were significantly reduced in each single neural crest stem cell from the 4th day of FGF2 treatment ( Figure 7 (d) and (e) ).
- Example 7 Analysis of the axial specification retention mechanism of early neural crest stem cells by signaling factors
- the protein expression of ETS1 was confirmed in the neural crest stem cells treated with FGF2 on the 5th to 10th day by immunochemical analysis, and the expression of various signaling factors in the early neural crest stem cells was confirmed. The direct effect was confirmed by FACS analysis.
- FGF2 was shown to suppress ZIC1 gene expression and promote ETS1 protein expression through BMP4 (Figure 8(b)), and SOX9:reporter hESC, known as a marker for head and neck neural crest stem cells,
- SOX9:reporter hESC known as a marker for head and neck neural crest stem cells
- the neural plate border-stage NCSCs (cells on day 5 of differentiation) obtained through primary differentiation in Example 3-1 were re-distributed, and then treated with bFGF or CHIR99021+retinoic acid, respectively, to produce head and neck nerves. They were differentiated into ridge stem cells or cardiac neural crest stem cells. Afterwards, the mRNA expression of SOX9, TWIST1, and PRRX2, which are head and neck neural crest stem cell markers, and the mRNA expression of cKIT, MEF2c, and MAFB, which are cardiac neural crest stem cell markers, were confirmed. As a result, the head and neck neural crest stem cells were found in the bFGF-treated group.
- Example 8-1 In order to confirm whether each neural crest cell secondaryly differentiated in Example 8-1 differentiates into a target cell for differentiation in the corresponding location in the human body, the initial neural crest stem cells in Example 8-1 were treated with bFGF and differentiated. The head and neck neural crest stem cells were differentiated into chondroblasts or osteoblasts, which were then stained with Alcian blue and Alizarin red to confirm the expression of each related gene marker. In addition, the cardiac neural crest stem cells differentiated by WNT activation of early neural crest stem cells in Example 8-1 were differentiated into SMC (smooth muscle cells), which was confirmed by immunofluorescence and the expression of related marker genes was confirmed.
- SMC smooth muscle cells
- the head and neck neural crest stem cells were differentiated into the corresponding target cells, chondroblasts or osteoblasts ( Figure 9 (b) and (c)), and the cardiac neural crest stem cells were the target cells. It was confirmed that the cells were differentiated into SMCs ( Figures 10 (e) and (f)).
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Abstract
본 발명은 전분화능줄기세포로부터 인체 축방향 사양 정보를 포함하는 신경능선세포를 선택적으로 분화 및 분리하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법에 따르면, 배아의 신경관 형성(neurulation) 단계에 해당하여 아직 인체 축방향 정보를 형성하지 않은 초기 신경능선세포를 생산할 수 있으며, 특정한 인체 축방향 정보를 보유하는 신경능선세포를 생산할 수 있고, 이들을 특이적으로 분리 및 체외 배양할 수 있으므로, 다양한 종류의 신경능선세포를 한 번에 획득할 수 있고, 축방향 정보를 보유하기 위한 신경능선세포의 생물학적 과정을 연구하여 조직과 장기의 발생 과정을 규명함으로써 인체 위치 특성에 최적화된 다양한 세포치료제를 개발할 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 전분화능줄기세포(pluripotent stem cell)로부터 인체 축방향 사양 정보를 포함하는 신경능선세포를 선택적으로 분화 및 분리하는 방법에 관한 것이다.
신경계 세포는 크게 두 종류로 구분할 수 있는데, 뇌와 척수를 구성하는 중추신경계 및 운동신경 세포와, 감각신경, 자율신경 등을 구성하는 말초신경계 세포로 나눠진다. 중추신경계(뇌와 척수) 및 운동신경을 구성하는 신경세포(neuron), 성상세포(astrocyte), 및 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)는 만능 줄기 세포에서 분화된 신경전구세포(neural stem cell 또는 neural progenitor cell: NPC)를 분화시켜 만들 수 있으며, 반면에 말초신경계를 구성하는 말초신경세포(자율신경, 및 감각신경)와 슈반세포(Schwann cells)는 만능 줄기 세포에서 분화된 신경능선줄기세포(neural crest stem cell: NCSC)로부터 유래된다. 따라서 중추신경계 세포와 말초신경계 세포는 만능줄기세포로부터 서로 다른 분화경로를 따라, 각각 신경전구세포와 신경능선세포를 거쳐 만들어지며, 이러한 서로 다른 경로는 주변 환경과 세포 내 신호전달 체계에 따라 좌우되는 것으로 알려져 있다.
배아 또는 태아 발생 중 인체에 존재하는 신경능선줄기세포는 두경부에서 꼬리뼈에 이르는 척추 축(Rostro-caudal axis)을 따라서 광범위하게 위치하며, 인체 척추 축 위치에 따라 두경부-(cranial-), 몸통-(trunk-), 심장-(cardiac-), 천추골-(sacral-) 신경능선줄기세포 등 세부적으로 나뉘는 신경능선줄기세포는 그 종류에 따라 분화 대상 세포와 조직, 장기가 달라진다. 배아 발생 초기 신경능선줄기세포는 척추 축 정보를 가지고 있지 않으며, 신경관 형성과 함께 배아 신장(embryo elongation)이 되는 시기에 신경능(neural crest) 역시 신장되는 척추 축을 따라 이동하면서 척추 축 위치 정보를 자연스럽게 획득하고, 이에 따라 두경부-(cranial-), 몸통-(trunk-), 심장-(cardiac-), 천추골-(sacral-) 신경능선세포의 구분이 나타나게 된다. 신경능선줄기세포는 발생기의 이주기(migratory stage) 동안에 신경주름(neural fold) 후방부에서부터 이주하며, 신경능선줄기세포는 신체 내 광범위한 조직과 장기로 이주하여 분포하게 된다. 이주기 이후 신경능선줄기세포는 말초신경계의 신경세포, 신경아교세포(glial cells), 피부의 멜라닌세포(melanocytes), 내분비계 세포, 그리고 다양한 중간엽세포(mesenchymal cells)로 분화하여 성인의 신경계 또는 비 신경계 조직과 장기에 분포하는 것으로 알려졌다(Dev Dyn 2007;236:3242).
최근 신경능선줄기세포 유사세포가 태생이후에도 말초신경(peripheral nerves), 후근절(dorsal root ganglia), 창자(gut), 모낭(hair follicle), 진피유두(dermal papillae), 각막(cornea), 치아속질(dental pulp)에 존재하는 것이 밝혀졌다. 이들 중 모낭, 진피유두, 치아속질에서만 성인 인간의 신경능선줄기세포 유사세포가 분리되었다(J Cell Biochem 2009;107:1046). 종래에 인간 성인에서는 진피유도 혹은 모낭에서부터 분리한 신경능선줄기세포가 보고되었다. 그러나 진피유도 혹은 모낭은 표피세포 유래의 여러 부속 기관이 많이 존재하므로, 해당 조직으로부터 신경구를 형성하는 세포는 신경능선줄기세포 외에 피부 부속기관으로부터 유래한 이질적 세포들이 혼합될 가능성이 높아 세포치료제로 적용하기란 문제점이 따른다(PNAS 2005;102:5530). 또한, 종래의 연구결과는 신경능선줄기세포 또는 신경능선줄기세포 유사세포가 성인 인간에서도 존재한다는 사실을 입증하였으나, 종래의 기술은 신경능선줄기세포의 분리 배양을 위하여 3개월이라는 장기간의 세포 배양을 요하고 또한 장기간의 배양에 의해 형질전환, 탈분화 등의 다양한 세포 변형이 일어났을 가능성을 배제할 수 없다는 문제점이 있다. 또한, 인체 각 장기 또는 조직에 위치하여 기능하는 다양한 세포로 분화하는 신경능선줄기세포의 특성을 고려하면 종래의 기술을 이용하여 배양한 성인의 신경능선줄기세포 또는 신경능선줄기세포 유사세포는 이미 상당한 분화가 진행되어 그 초기 다분화능 성질을 상실하였을 가능성이 크다. 이와 더불어, 종래의 기술은 신경능선줄기세포를 분리하기 위하여 특정 표지자를 사용하였으나, 현재까지 신경능선줄기세포의 발생 단계에 따라 특이하게 대변할 수 있는 표지자가 없다는 문제점이 대두되었다.
본 발명의 목적은 초기 신경능선줄기세포의 생산 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 신경능선줄기세포의 생산 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 초기 신경능선줄기세포 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 초기 신경능선줄기세포 검출 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 초기 신경능선줄기세포 검출을 위한 용도를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 초기 신경능선줄기세포 검출용 조성물의 제조를 위한 용도를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 신경능선줄기세포 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 신경능선줄기세포 검출 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 신경능선줄기세포 검출을 위한 용도를 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 목적은 신경능선줄기세포 검출용 조성물의 제조를 위한 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 p75 NGFR 또는 HNK1 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 초기 신경능선줄기세포 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 분리된 시료에서 p75 NGFR 또는 HNK1 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 초기 신경능선줄기세포 검출 방법을 제공하는 것이다.
일 구현예에서, 상기 시료는 대상체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포일 수 있다.
일 구현예에서, 초기 신경능선줄기세포 검출 방법은, p75 NGFR 또는 HNK1 유전자의 발현 수준이 대조군에 비해 더 증가된 경우 또는 양성인 경우, 초기 신경능선줄기세포로 판별하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 p75 NGFR 또는 HNK1 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제의 초기 신경능선줄기세포 검출을 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 p75 NGFR 또는 HNK1 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제의 초기 신경능선줄기세포 검출용 조성물의 제조를 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 p75 NGFR 또는 HNK1의 초기 신경능선줄기세포 검출을 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 ETS1 유전자 또는 ZIC1 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 축방향 사양 정보를 보유하는 신경능선줄기세포 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 분리된 시료에서 ETS1 유전자 또는 ZIC1 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 축방향 사양 정보를 보유하는 신경능선줄기세포 검출 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 상기 시료는 대상체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포일 수 있다.
일 구현예에서, 축방향 사양 정보를 보유하는 신경능선줄기세포 검출 방법은, ETS1 유전자 또는 ZIC1 유전자의 발현 수준이 대조군에 비해 더 증가된 경우 또는 양성인 경우, 축방향 사양 정보를 보유하는 신경능선줄기세포로 판별하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 ETS1 유전자 또는 ZIC1 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제의 축방향 사양 정보를 보유하는 신경능선줄기세포 검출을 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 ETS1 유전자 또는 ZIC1 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제의 축방향 사양 정보를 보유하는 신경능선줄기세포 검출용 조성물의 제조를 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 ETS1 유전자 또는 ZIC1 유전자의 축방향 사양 정보를 보유하는 신경능선줄기세포 검출을 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 초기 신경능선줄기세포의 생산 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 신경능선줄기세포의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 따르면, 배아의 신경관 형성(neurulation) 단계에 해당하여 아직 인체 축방향 정보를 형성하지 않은 초기 신경능선세포를 생산할 수 있으며, 특정한 인체 축방향 정보를 보유하는 신경능선세포를 생산할 수 있고, 이들을 특이적으로 분리 및 체외 배양할 수 있으므로, 다양한 종류의 신경능선세포를 한 번에 획득할 수 있고, 축방향 정보를 보유하기 위한 신경능선세포의 생물학적 과정을 연구하여 조직과 장기의 발생 과정을 규명함으로써 인체 위치 특성에 최적화된 다양한 세포치료제를 개발할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 인간 배아 발생 시 배아 내 세포 발생 단계를 묘사한 도이다.
도 2는 초기 신경능선줄기세포 분리를 위한 세포 표면 마커를 확인한 도이다:
(a): 닭 배아; 및
(b): 인간 전분화능줄기세포.
도 3은 전분화능줄기세포를 5일간 분화시킨 초기 신경능선줄기세포에서 초기 신경능선줄기세포 마커(P75 NGFR 및 HNK1) 및 축방향 사양 마커(HOX)의 발현을 확인한 도이다.
도 4는 신경능선줄기세포의 생산 과정을 표시한 도이다.
도 5는 분화 5일차의 초기 신경능선줄기세포와 분화 10일차의 축방향 사양을 보유한 신경능선줄기세포의 유전자 발현 정도를 비교한 도이다.
도 6은 축방향 사양 자극 인자를 처리하지 않고, 초기 신경능선줄기세포만 단독으로 존재하는 경우 ZIC1 및 ETS1의 발현 정도를 확인한 도이다.
도 7은 축방향 사양 자극 인자를 추가하여 2차 분화한 신경능선줄기세포의 유전자 발현을 분석한 도이다:
(a): 신경능선줄기세포를 분리하지 않고 세포신호 전달 단백질을 처리하여 배양한 군의 ETS1/ZIC1 발현 비율;
(b): 초기 신경능선줄기세포만 분리하여 단독으로 추가 배양하는 과정에서 세포신호 전달 단백질을 처리하여 배양한 군의 ETS1/ZIC1 발현 비율;
(c): 2차 분화시기에 FGF2를 처리한 초기 신경능선줄기세포에서 TWIST1 유전자(두경부 신경능선줄기세포의 마커 유전자) 및 HOX 유전자의 발현량;
(d): 2차 분화시기에 FGF2 처리 후 단일 세포에서의 ZIC1 및 ETS1의 유전자 발현량; 및
(e): 2차 분화시기에 FGF2 처리 후 단일 세포에서의 ETS1/ZIC1의 발현 비율.
도 8은 신호전달 인자에 의한 초기 신경능선줄기세포의 축방향 사양 보유 기전을 분석한 도이다.
도 9 및 도 10은 1차 분화를 통해 분리한 초기 신경능선줄기세포에 다양한 축방향 사양 자극 인자를 처리함으로써 한 batch 내에서 복수의 axially specified neural crest population이 동시에 생성된 것을 확인한 도이다:
(a): 두경부 신경능선줄기세포 마커 유전자의 mRNA 발현량;
(b) 및 (c): 두경부 신경능선줄기세포의 분화 대상 세포로의 분화능 검증;
(d): 심장 신경능선줄기세포 마커 유전자의 mRNA 발현량; 및
(e) 및 (f): 심장 신경능선줄기세포의 분화 대상 세포로의 분화능 검증.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 테스트하기 위한 실행에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에서 기술된다.
일 측면에서, 본 발명은 p75 NGFR 또는 HNK1 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 초기 신경능선줄기세포 검출용 조성물에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 분리된 시료에서 p75 NGFR 또는 HNK1 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 초기 신경능선줄기세포 검출 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 시료는 대상체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포일 수 있다.
일 구현예에서, 초기 신경능선줄기세포 검출 방법은, p75 NGFR 또는 HNK1 유전자의 발현 수준이 대조군에 비해 더 증가된 경우 또는 양성인 경우, 초기 신경능선줄기세포로 판별하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 p75 NGFR 또는 HNK1 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제의 초기 신경능선줄기세포 검출을 위한 용도에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 p75 NGFR 또는 HNK1 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제의 초기 신경능선줄기세포 검출용 조성물의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 p75 NGFR 또는 HNK1의 초기 신경능선줄기세포 검출을 위한 용도에 관한 것이다.
일 구현예에서, 초기 신경능선줄기세포는 배아의 신경관 형성(neurulation) 단계 중 신경판 경계-단계(neural plate border-stage)에 해당하는 신경능선줄기세포일 수 있다.
일 구현예에서, 초기 신경능선줄기세포는 PAX7 유전자 및 단백질을 발현하는 신경능선줄기세포일 수 있다.
일 구현예에서, 초기 신경능선줄기세포는 신경판에 존재할 수 있다.
일 구현예에서, 초기 신경능선줄기세포는 PAX7, MSX1, AP2alpha, p75 NGFR 또는 HNK1 양성 세포일 수 있으며, p75 NGFR 또는 HNK1 양성 세포인 것이 더욱 바람직하다.
일 구현예에서, 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제일 수 있다.
일 구현예에서, 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 마커의 핵산서열, 상기 핵산서열에 상보적인 핵산서열, 상기 핵산서열 및 상보적인 서열의 단편을 특이적으로 인식하는 프라미어 쌍, 프로브, 또는 프라이머 쌍 및 프로브를 포함할 수 있으며, 이의 측정은 중합효소연쇄반응(PCR; polymerase chain reaction), 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR; qPCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR; reverse transcription PCR), 경쟁적 중합효소연쇄반응(competitive RT-PCR), Nuclease 보호 분석(RNase and S1 nuclease protection assay), in situ 교잡법(in situ hybridization), 핵산 마이크로어레이(nucleic acid microarray), 노던블랏(northern blotting) 또는 DNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법으로 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 마커의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자의 단백질 전장 또는 그 단편을 특이적으로 인식하는 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)를 포함할 수 있으며, 이의 측정은 웨스턴블랏, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA; radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 면역 전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 유세포분석(FACS), 질량분석 또는 단백질 마이크로어레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법으로 수행될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 ETS1 유전자 또는 ZIC1 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 축방향 사양(axial specification) 정보를 보유하는 신경능선줄기세포 검출용 조성물에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 분리된 시료에서 ETS1 유전자 또는 ZIC1 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 축방향 사양 정보를 보유하는 신경능선줄기세포 검출 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 시료는 대상체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포일 수 있다.
일 구현예에서, 축방향 사양 정보를 보유하는 신경능선줄기세포 검출 방법은, ETS1 유전자 또는 ZIC1 유전자의 발현 수준이 대조군에 비해 더 증가된 경우 또는 양성인 경우, 축방향 사양 정보를 보유하는 신경능선줄기세포로 판별하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 ETS1 유전자 또는 ZIC1 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제의 축방향 사양 정보를 보유하는 신경능선줄기세포 검출을 위한 용도에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 ETS1 유전자 또는 ZIC1 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제의 축방향 사양 정보를 보유하는 신경능선줄기세포 검출용 조성물의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 ETS1 유전자 또는 ZIC1 유전자의 축방향 사양 정보를 보유하는 신경능선줄기세포 검출을 위한 용도에 관한 것이다.
일 구현예에서, 축방향 사양 정보를 보유하는 신경능선줄기세포는 두경부(Cranial) 신경능선줄기세포, 미주(vagal) 신경능선줄기세포, 심장(cardiac) 신경능선줄기세포, 몸통(trunk) 신경능선줄기세포 또는 천추골(sacral) 신경능선줄기세포일 수 있으며, 두경부 신경능선줄기세포인 것이 더욱 바람직하다.
일 구현예에서, 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제일 수 있다.
일 구현예에서, 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 마커의 핵산서열, 상기 핵산서열에 상보적인 핵산서열, 상기 핵산서열 및 상보적인 서열의 단편을 특이적으로 인식하는 프라미어 쌍, 프로브, 또는 프라이머 쌍 및 프로브를 포함할 수 있으며, 이의 측정은 중합효소연쇄반응, 실시간 중합효소연쇄반응, 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응, Nuclease 보호 분석, in situ 교잡법, 핵산 마이크로어레이, 노던블랏 또는 DNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법으로 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 마커의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자의 단백질 전장 또는 그 단편을 특이적으로 인식하는 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)를 포함할 수 있으며, 이의 측정은 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석(RIA), 방사면역확산법, 면역 전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석 또는 단백질 마이크로어레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법으로 수행될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "검출" 또는 "측정"은 검출 또는 측정된 대상의 농도를 정량하는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기 (free 3 hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)를 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 폴리머레이트 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다.
본 발명에서 용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 상기 유전자와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 상기 유전자 발현 정도를 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 통상의 기술분야에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있으므로 본 발명에서는 이에 대해 특별히 한정하지 않는다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명에서, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시키는 적합한 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, NucleicAcidHybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO4, 7% SDS(sodium dodecylsulfate),1mM EDTA에서 65℃조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃조건으로 세척하는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 상기 유전자에서 발현되는 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 상기 항체의 제조방법은 널리 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함된다. 본발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 다클론항체(polyclonal antibody), 단클론항체(monoclonal antibody) 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 초기 신경능선줄기세포 또는 신경능선줄기세포 검출용 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 전분화능줄기세포를 배양하는 단계; 배양된 세포를 초기 신경능선줄기세포로 분화시키는 단계; 및 초기 신경능선줄기세포를 분리하는 단계를 포함하는 초기 신경능선줄기세포의 생산 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 초기 신경능선줄기세포는 배아의 신경관 형성(neurulation) 단계 중 신경판 경계-단계(neural plate border-stage)에 해당하는 신경능선줄기세포일 수 있다.
일 구현예에서, 초기 신경능선줄기세포는 PAX7 유전자 및 단백질을 발현하는 신경능선줄기세포일 수 있다.
일 구현예에서, 초기 신경능선줄기세포는 신경판에 존재할 수 있다.
일 구현예에서, 초기 신경능선줄기세포는 PAX7, MSX1, AP2alpha, p75 NGFR 또는 HNK1 양성 세포일 수 있으며, p75 NGFR 또는 HNK1 양성 세포인 것이 더욱 바람직하다.
일 구현예에서, 초기 신경능선줄기세포는 축방향(axial) 정보를 형성하지 않은 신경능선줄기세포일 수 있다.
일 구현예에서, 분화는 4 내지 7일 동안 수행될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 전분화능줄기세포를 배양하는 단계; 배양된 세포를 초기 신경능선줄기세포로 1차 분화시키는 단계; 초기 신경능선줄기세포를 분리하는 단계; 및 초기 신경능선줄기세포를 축방향 사양 정보를 보유하는 신경능선줄기세포로 2차 분화시키는 단계를 포함하는, 신경능선줄기세포의 생산 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 2차 분화시 WNT, BMP, BMP4, SHH, FGF2, NOTCH 또는 bFGF를 처리할 수 있으며, FGF2(fibroblast growth factor 2)를 처리하는 것이 더욱 바람직하다.
일 구현예에서, 2차 분화시 bFGF 또는 FGF2와 BMP 또는 BMP4를 함께 처리할 수 있다.
일 구현예에서, 2차 분화시 FGF2를 5 내지 100 ng/ml로 처리할 수 있다.
일 구현예에서, 2차 분화시 ZIC1 유전자 발현량이 2차 분화 전에 비해 감소될 수 있으며, 2차 분화시 ETS1 유전자/ZIC1 유전자의 발현 비율이 2차 분화 전에 비해 증가할 수 있다.
일 구현예에서, 2차 분화시 FGF2가 ZIC1 유전자 발현을 억제하고, FGF2가 BMP4를 통해 ETS1 단백질 발현을 촉진할 수 있다.
일 구현예에서, 축방향 사양 정보를 보유하는 신경능선줄기세포는 두경부 신경능선줄기세포, 미주 신경능선줄기세포, 심장 신경능선줄기세포, 몸통 신경능선줄기세포 또는 천추골 신경능선줄기세포일 수 있다.
일 구현예에서, 축방향 사양 정보를 보유하는 신경능선줄기세포는 SOX9 또는 SOX10의 유전자 또는 단백질을 발현하는 세포일 수 있다.
일 구현예에서, 1차 분화는 4 내지 7일 동안 수행될 수 있으며, 2차 분화는 3 내지 10일 동안 수행될 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명의 방법을 이용하여 비-신경능선줄기세포에 의한 영향을 배제하고 신경능선줄기세포에 직접 작용하는 세포신호 전달을 정확히 조절하여 전달함으로써 축사양 정보를 보유한 신경능선줄기세포를 효과적이고 정확하게 만들 수 있었으며, 본 발명의 실시예에서 2단계 분화 방법에 bFGF를 적용하였을 때, 종래의 방법에 비해 SOX9 리포터 hESC를 이용한 두경부 신경능선줄기세포의 분화 효율이 30% 내외에서 80% 내외로 향상되는 것을 확인하였다 (도 8의 (c)-(d) 참조).
종래의 신경능선줄기세포 분화 기술은 인체 각 위치의 신경능선세포를 분화, 획득하기 위해 FGF, WNT 등의 세포신호 활성을 자극함으로써 두경부-, 몸통- 신경능선세포 등을 확보했으나, 이는 한 회차(batch) 당 한 종류의 신경능선줄기세포만을 확보할 수 있는 단점이 있어왔다. 반면, 본 발명은 기존의 종래의 one-step 신경능선줄기세포 분화방법이 신경능선줄기세포 중 한 종류만을 분화 획득하는 방법인 관계로 다양한 제약이 발생하는 점을 해결하기 위해, two-step 신경능선줄기세포 분화 기술을 개발함으로써 동일한 분화 회차(single batch)에서 두경부-(cranial-), 몸통-(trunk-), 심장-(cardiac-), 천추골-(sacral-) 등 다양한 위치 정보를 보유한 신경능선줄기세포를 동시에 분화 및 획득이 가능한 장점이 있다.
이를 위해서는 전분화능줄기세포에서 신경능선줄기세포로 분화는 되었으나 아직 축사양 정보가 정립되지 않은, 즉 신경관 형성(neurulation) 단계 이전의 초기 신경능선세포를 확보하는 것이 중요하다.
이에, 본 발명에서는 발생중인 닭 배아의 신경능선세포를 염색을 통해 p75 NGFR을 이용한 초기 신경능선세포 표지가 가능함을 확인하였으며, 신규로 조성한 분화 배양액 (PIM)에서 인간 전분화능줄기세포를 분화시킨 경우, 축사양 정보를 가지고 이주(migration) 능력을 보유한 신경능선줄기세포가 발현하는 SOX10 단백질발현에 앞서 p75 NGFR 단백질이 먼저 발현되는 것을 확인하였다. 이에 따라 전분화능줄기세포에 5 내지 7일간의 1차 분화를 통해 축사양 정보가 정해지지 않은 초기 신경능선세포를 분화하고 p75 NGFR 항체를 이용하여 세포를 분리한 뒤, 이들 세포를 재배양하는 2차 분화 과정에서 bFGF를 처리하여 두경부 신경능선줄기세포로, WNT를 처리하여 몸통 신경능선줄기세포로 각각 분화시켰으며, 이들 세포를 ZIC1 또는 ETS1 발현 변화를 통해 검증하였다.
또한, 종래의 신경능선줄기세포 분화 방법은 특정 신경능선세포로 분화할 수는 있으나, 축 사양정보를 아직 획득하지 않은 초기신경능선세포 (neuralation 과정 중의 neural tube에 위치하여 PAX7 단백질을 발현)는 분화, 확보 또는 확인하지 못하는 한계가 있고, 세포 분화과정 중에 신경능선줄기세포와 비-신경능선줄기세포 등 다양한 세포 종류가 섞여있으므로 bFGF, WNT 등 신호전달 단백질의 정확한 기전을 이해할 수 없는 제약이 있다.
반면, 본 발명은 순수한 초기신경능선세포를 분리할 수 있으므로, 이를 대상으로 bFGF, WNT 등 신호전달 단백질을 전달함으로써 보다 효율적인 axial-specified 신경능선줄기세포의 분화 및 확보가 가능하다. 이와 더불어, 신경능선줄기세포의 axial-specification에 역할한다고 알려진 BMP, SHH 등 신호전달 단백질의 역할도 신경능선줄기세포에 직접 작용하는 것인지, 혹은 섞여있는 비-신경능선줄기세포에 작용하여 결과적으로 신경능선세포에 영향을 미치는 간접 작용하는 것인지를 확인하였다.
결과적으로 본 발명에서는 상기 방법을 통해, 순수한 초기신경능선줄기세포에 대한 bFGF의 ZIC1 억제, bFGF의 WNT 기능 억제, BMP4의 ETS1 촉진과 같은 조건이 초기신경능선줄기세포의 cranial-axial-specification을 촉진하고, WNT에 의한 ZIC1 촉진, SHH에 의한 bFGF 기능 억제와 같은 조건이 초기신경능선줄기세포의 trunk-axial-specification을 촉진하는 것을 확인하였다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 초기 신경능선줄기세포(neural crest stem cells, NCSCs)의 마커 선별
인간 배아 발생시 신경관 형성(neurulation) 단계 (도 1)에 해당하여 아직 인체 축방향 정보를 형성하지 않은 (Cranial/vagal/trunk/sacral 신경능선줄기세포로의 예정화 전) 초기 신경능선줄기세포(Early neural crest stem cell)에 특이적인 세포 표면 마커를 선별하기 위해, 발달 중인 닭 배아의 조직투명화 이후 배측 영역 초기 신경 능선(dorsal regional early neural crest)에서 p75 NGFR의 발현을 면역형광염색법으로 확인하고, 인간 전분화능줄기세포를 신경능선세포로 분화시키는 과정에서 SOX10 및 p75 NGFR의 발현을 분화 시간 경과에 따라 확인하였다.
그 결과, 인간 전분화능줄기세포를 분화하는 과정에서 이주 신경능선줄기세포(migrating neural crest stem cell)를 표지하는 종래의 SOX10 발현보다 NGFR/HNK1 발현이 우선하며, 이를 통해 pre-migrating early neural crest stem cell을 p75 NGFR 또는 HNK1 항체를 이용하여 분리할 수 있음을 확인하였다 (도 2).
실시예 2. 신경판 경계-단계(neural plate border-stage)의 초기 신경능선줄기세포로의 1차 분화
인간 만능줄기세포(hESC) 클론들을 Accutase(Innovative Cell Technologies) 또는 Versene(Thermo Fisher)와 같은 적절한 용액으로 단일 세포로 만든 뒤, 24 well plate 1개 well 당 10만개 세포를 Geltrex ECM을 코팅한 플레이트에 분주하였다. hESC의 밀도가 70%에 도달했을 때, hESC의 유지 배지를 분화 배지인 3uM CHIR99021(GSK-3 억제제, WNT 활성화)를 포함하는 PIM 배지 (DMEM/F-12; Thermo Fishser), 0.5% KSR(Thermo Fishser), 2% B-27 supplement(Thermo Fishser) 및 1% Glutamax(Thermo Fishser), pH7.5)로 교체하였다(day 0). 그 후, 2일차 및 4일차에 3uM CHIR99021를 포함하는 PIM 배지로 교체하고 격일로 추가하여 배아의 신경관 형성(neurulation) 단계에 해당하여 아직 인체 축방향 정보를 형성하지 않은 초기 신경능선줄기세포를 제작하였다(표 1).
| DAY | 배지 조성 |
| Day 0 | PIM + CHIR99021 (3 uM) |
| Day 1 | PIM + CHIR99021 (3 uM) |
| Day 2 | PIM + CHIR99021 (3 uM) |
| Day 3 | PIM + CHIR99021 (3 uM) |
| Day 4 | PIM + CHIR99021 (3 uM) |
실시예 3. 신경판 경계-단계의 초기 신경능선줄기세포 분리 및 확인
3-1. 초기 신경능선줄기세포 분리
초기 신경능선줄기세포인 신경판 경계-단계 초기 신경능선줄기세포들을 분리하기 위해, Accutase를 이용하여 분화 5일차(day 5) 내지 7일차(day 7)에 수집하고, 세포 펠릿을 PBS로 세척하여 FACS 버퍼로 재현탁하였다. 35um 스트레이너 스냅-캡 라운드 바텀 튜브(strainer snap-cap round bottom tubes)를 이용하여 2회 여과함으로써 다중 세포 덩어리들을 제거하고, 신경능선줄기세포 표면 항원 p75 NGFR 또는 HNK1에 대한 항체로 표지하여 FACS sorter (SONY SH-800)로 신경판 경계-단계 초기 신경능선줄기세포들을 분리하였다.
3-2. 초기 신경능선줄기세포 확인
전분화능줄기세포로부터 5일간 분화한 세포들을 FACS 분석으로 확인한 결과, 세포들 중 일부는 NGFR 및/또는 HNK1을 발현하는 초기 신경능선줄기세포(early neural crest stem cell)로 나타났으며, p75 NGFR을 발현하는 세포는 많은 경우 HNK1을 동시에 발현하는 것으로 나타났고, P75 NGFR+/HNK1+인 세포의 비율은 평균 50%로 나타났다(도 3). 또한, HOX 유전자 발현 패턴을 확인한 결과, 분화 5일차 초기 신경능선줄기세포는 아직 두경부 예정화(cranial specification)가 이루어지지 않은 것으로 나타났다(도 3).
이에 따라 p75 NGFR 양성 세포만 분리하여도 초기 신경능선줄기세포를 분리할 수 있음을 확인하였다.
실시예 4. 축방향(axial) 사양 정보를 포함하는 NCSCs로의 2차 분화
상기 실시예 3-1에서 FACS로 분리한 p75 NGFR 또는 HNK1를 발현하는 신경판 경계-단계 NCSCs(분화 5일차 세포)을 Geltrex, Matrigel 또는 Laminin+Fibronectin으로 코팅된 24웰 플레이트에 1개 웰 당 30만개씩 재-분주하였다. 24시간 후, 안정화를 위해 5일차에 추가한 PIM 배지를, FGF2(fibroblast growth factor 2)와 함께 2% B-27 supplement, 1% N2 supplement 및 1% Glutamax를 포함하는 Neurobasal 배지로 단계적으로 변경하였다(표 2). 축방향 사양 자극 인자로서 FGF2를 분화 6 내지 10일차에 배양 배지에 첨가하였으며, 분화 11일 내지 14일차에 신경능선줄기세포 표면 항원 p75 NGFR에 대한 항체를 이용하여 증식된 신경능선줄기세포를 FACS로 정제하였다(도 4).
| DAY | 배지 조성 |
| Day 6 | 75% PIM + 25% NB (Neurobasal medium) + FGF2 (20 ng/ml) |
| Day 8 | 50% PIM + 50% NB + FGF2 (20 ng/ml) |
| Day 10 | 25% PIM + 75% NB + FGF2 (20 ng/ml) |
실시예 5. 초기 신경능선줄기세포의 유전자 발현 분석
상기 실시예 3에서 분화 5일차에 p75 NGFR 항체를 이용하여 분리한 신경판 경계-단계의 초기 신경능선줄기세포들에서의 신경능선줄기세포 마커 유전자인 NGFR, HNK1, PAX7, MSX1 및 AP2alpha의 발현과 신경능선줄기세포 분화 촉진 유전자인 ZIC1 및 두경부 신경능선줄기세포(cranial neural crest stem cell) 마커인 ETS1의 발현을 FACS로 분석하고, 신경판 경계에서 발현되는 PAX7의 발현을 면역형광분석을 이용하여 단백질 수준에서 확인하였다.
그 결과, 분리한 초기 신경능선줄기세포가 NGFR, HNK1, PAX7, MSX1 및 AP2alpha를 발현하는 것으로 나타났다(도 5의 (a) 내지 (d)). 또한, 분화 5일차 분리된 신경판 경계-단계의 초기 신경능선줄기세포가 분화 전 세포 및 분화 10일차 분리된 신경능선줄기세포에 비해 ZIC1을 현저히 많이 발현하는 것으로 나타났으며, ETS1은 분화가 진행되면서 높아지는 것으로 나타났다(도 5의 (e)). 발생 분화 이후 ZIC1의 지속적인 발현은 두경부 신경능선줄기세포가 아닌 몸통 신경능선줄기세포(trunk neural crest stem cell)로의 예정화 인자(specification factor)이므로, 분화 5일에서 10일 사이에 두경부 신경능선줄기세포로 예정화가 이루어졌음을 확인하였다.
실시예 6. 축방향 사양 NCSCs의 유전자 발현 변화 분석
6-1. 축방향 사양 자극 인자 없이 2차 분화한 신경능선줄기세포의 유전자 발현 분석
상기 실시예 3-1의 분화 5일차의 초기 신경능선줄기세포(p75 NGFR 또는 HNK1를 발현)를 분리하거나, 분리하지 않은 혼합세포 상태로 축방향 사양 자극 인자인 FGF2를 추가하지 않고 5일간 2차 배양한 뒤, ZIC1 유전자 및 ETS1 유전자의 발현을 확인한 결과, ZIC1 유전자의 발현이 감소되지 않았으며, ETS1 유전자의 발현은 추가 분화일수에 따라 증가하는 것으로 나타났다(도 6의 (a) 및 (b)). 또한, 두경부 신경능선줄기세포의 예정화(specification)를 가늠할 수 있는 ZIC1 유전자 및 ETS1 유전자의 발현 비율(ETS1/ZIC1)은 증가하지 않고 유지되는 것으로 나타났다(도 6의 (c)).
이를 통해, 초기 신경능선줄기세포가 분화 과정에서 비-신경능선줄기세포와 함께 존재할 경우 세포간 상호작용을 통해 두경부 신경능선줄기세포로 예정화될 수 있으나, 초기 신경능선줄기세포만 단독으로 존재할 경우 두경부 신경능선줄기세포로 예정화되지 못하며, 그 주요 원인은 ZIC1 유전자 발현의 감소가 이루어지지 않기 때문임을 유추할 수 있었다.
6-2. 축방향 사양 자극 인자를 추가하여 2차 분화한 신경능선줄기세포의 유전자 발현 분석
상기 실시예 3-1의 분화 5일차의 초기 신경능선줄기세포(p75 NGFR 또는 HNK1를 발현)를 분리하거나(NC only), 분리하지 않은 혼합세포 상태로 축방향 사양 자극 인자로서 WNT(GSK-3 억제제 CHIR99021를 처리하여 WNT 활성화), BMP, SHH 또는 FGF2를 처리한 뒤 5일간 2차 배양한 축방향 사양 신경능선줄기세포의 ZIC1, ETS1, TWIST1 및 HOX 유전자의 발현을 확인한 결과, FGF2를 처리한 경우 분리한 초기 신경능선줄기세포군 및 분리하지 않은 혼합세포군 모두에서 ETS1/ZIC1의 발현 비율이 증가하는 것으로 나타났으며(도 7의 (a)), 특히, 분리한 초기 신경능선줄기세포에서 현저히 증가한 것으로 나타났다(도 7의 (b)). 이를 통해, 비-신경능선줄기세포의 역할이 초기 신경능선줄기세포의 FGF 신호전달을 활성화시켜 두경부 예정화(cranial specification)를 유도하는 것을 알 수 있었다. 또한, FGF2가 처리된 신경능선줄기세포는 두경부 신경능선줄기세포의 마커 유전자인 TWIST1 유전자의 발현이 증가하는 것으로 나타났으며, 두경부 신경능선줄기세포에서는 발현되지 않는 것으로 알려진 HOX 유전자가 감소하는 것으로 나타났다(도 7의 (c)). 아울러, 단일 세포에서의 ZIC1 및 ETS1 유전자의 발현량을 비교한 결과, 각각의 단일 신경능선줄기세포가 FGF2 처리 4일차부터 ZIC1 유전자가 현저히 감소되는 것으로 나타났다(도 7의 (d) 및 (e)).
이를 통해, 분리된 신경능선줄기세포만 존재할 경우 신경능선줄기세포가 아닌 타세포와의 상호관계가 결여되어 ZIC1이 감소하지 않으며, 이를 FGF2가 감소시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 7. 신호전달 인자에 의한 초기 신경능선줄기세포의 축방향 사양 보유 기전 분석
분화 5일차에 초기 신경능선줄기세포를 분리한 후 5 내지 10일차에 FGF2를 처리한 신경능선줄기세포에서 ETS1의 단백질 발현을 면역화학분석으로 확인하고, 각종 신호전달 인자의 초기 신경능선줄기세포에 대한 직접적인 영향을 FACS 분석으로 확인하였다.
그 결과, FGF2는 ZIC1 유전자 발현을 억제하고, BMP4를 통해 ETS1 단백질 발현 촉진에 영향을 주는 것으로 나타났으며(도 8의 (b)), 두경부 신경능선줄기세포의 마커로 알려진 SOX9:reporter hESC를 이용하여 FGF2를 처리하지 않고 신경능선줄기세포를 분화시킨 경우, 25% 내외의 두경부 신경능선줄기세포로의 분화 효율을 보였으며, bFGF를 처리한 경우 80% 이상의 SOX9 발현 세포 비율을 나타내는 것을 확인하였다(도 8의 (c) 및 (d)).
실시예 8. 복수의 axially specified 신경능선줄기세포 집단의 동시 생성 확인
8-1. 복수의 axially specified 신경능선줄기세포 분화 확인
상기 실시예 3-1에서 1차 분화를 통해 확보한 신경판 경계-단계의 NCSCs(분화 5일차 세포)을 재-분주한 뒤, 각각 bFGF, 또는 CHIR99021+레틴산(retinoic acid)을 처리하여 두경부 신경능선줄기세포 또는 심장 신경능선줄기세포로 분화시켰다. 이 후, 두경부 신경능선줄기세포 마커인 SOX9, TWIST1 및 PRRX2의 mRNA 발현과, 심장 신경능선줄기세포 마커인 cKIT, MEF2c 및 MAFB의 mRNA 발현을 확인한 결과, bFGF를 처리한 군에서는 두경부 신경능선줄기세포 마커인 SOX9, TWIST1 및 PRRX2의 mRNA 발현이 증가하고(도 9의 (a)), CHIR99021+레틴산을 처리하여 WNT 활성화 유도한 군에서는 심장 신경능선줄기세포의 마커인 cKIT, MEF2c 및 MAFB의 mRNA 발현이 증가하는 것으로 나타났다(도 10의 (d)).
8-2. axially specified 신경능선줄기세포의 다른 세포로의 분화능 확인
상기 실시예 8-1에서 2차 분화시킨 각 신경능선세포가 해당하는 인체의 위치에서 분화 대상 세포로 분화되는지 확인하기 위해, 상기 실시예 8-1에서 초기 신경능선줄기세포에 bFGF를 처리하여 분화시킨 두경부 신경능선줄기세포를 조연골세포(chondroblast) 또는 조골세포(osteoblast)로 분화시킨 뒤, 이를 Alcian blue 및 Alizarin red로 염색하여 확인하고, 각 관련 유전자 마커들의 발현을 확인하였다. 또한, 상기 실시예 8-1에서 초기 신경능선줄기세포를 WNT 활성화하여 분화시킨 심장 신경능선줄기세포를 SMC(smooth muscle cell)로 분화시켜 이를 면역형광법으로 확인하고 관련 마커 유전자의 발현을 확인하였다.
그 결과, 두경부 신경능선줄기세포가 해당 대상세포인 조연골세포(chondroblast) 또는 조골세포(osteoblast)로 분화되었으며(도 9의 (b) 및 (c)), 심장 신경능선줄기세포가 해당 대상세포인 SMC로 분화된 것을 확인하였다(도 10의 (e) 및 (f)).
이를 통해, 본 발명의 2 단계에 걸친 분화 방법을 통해 한 batch 내에서 복수의 axially specified neural crest population을 동시에 생성할 수 있음을 알 수 있다.
Claims (14)
- p75 NGFR 또는 HNK1 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 초기 신경능선줄기세포 검출용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 초기 신경능선줄기세포는 배아의 신경관 형성(neurulation) 단계 중 신경판 경계-단계(neural plate border-stage)에 해당하는, 초기 신경능선줄기세포 검출용 조성물.
- ETS1 유전자 또는 ZIC1 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 축방향 사양(axial specification) 정보를 보유하는 신경능선줄기세포 검출용 조성물.
- 제 3항에 있어서, 축방향 사양 정보를 보유하는 신경능선줄기세포는 두경부(Cranial) 신경능선줄기세포, 미주(vagal) 신경능선줄기세포, 심장(cardiac) 신경능선줄기세포, 몸통(trunk) 신경능선줄기세포 또는 천추골(sacral) 신경능선줄기세포인, 신경능선줄기세포 검출용 조성물.
- a) 전분화능줄기세포를 배양하는 단계;b) 배양된 세포를 초기 신경능선줄기세포로 분화시키는 단계; 및c) 초기 신경능선줄기세포를 분리하는 단계를 포함하는 초기 신경능선줄기세포의 생산 방법.
- 제 5항에 있어서, 초기 신경능선줄기세포는 배아의 신경관 형성 단계 중 신경판 경계-단계에 해당하는, 초기 신경능선줄기세포의 생산 방법.
- 제 5항에 있어서, 초기 신경능선줄기세포는 축방향(axial) 정보를 형성하지 않은, 초기 신경능선줄기세포의 생산 방법.
- 제 5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 신경능선줄기세포는 PAX7, MSX1, AP2alpha, p75 NGFR 또는 HNK1 양성 세포인, 초기 신경능선줄기세포의 생산 방법.
- a) 전분화능줄기세포를 배양하는 단계;b) 배양된 세포를 초기 신경능선줄기세포로 1차 분화시키는 단계;c) 초기 신경능선줄기세포를 분리하는 단계; 및d) 초기 신경능선줄기세포를 축방향 사양 정보를 보유하는 신경능선줄기세포로 2차 분화시키는 단계를 포함하는, 신경능선줄기세포의 생산 방법.
- 제 9항에 있어서, 초기 신경능선줄기세포는 PAX7, MSX1, AP2alpha, p75 NGFR 또는 HNK1 양성 세포인, 신경능선줄기세포의 생산 방법.
- 제 9항에 있어서, 2차 분화시 WNT, BMP, BMP4, SHH, FGF2(fibroblast growth factor 2), NOTCH 또는 bFGF를 처리하는, 신경능선줄기세포의 생산 방법.
- 제 9항에 있어서, 2차 분화시 ZIC1 유전자 발현량이 2차 분화 전에 비해 감소되는, 신경능선줄기세포의 생산 방법.
- 제 9항에 있어서, 2차 분화시 ETS1 유전자/ZIC1 유전자의 발현 비율이 2차 분화 전에 비해 증가하는, 신경능선줄기세포의 생산 방법.
- 제 9항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 축방향 사양 정보를 보유하는 신경능선줄기세포는 두경부 신경능선줄기세포, 미주 신경능선줄기세포, 심장 신경능선줄기세포, 몸통 신경능선줄기세포 또는 천추골 신경능선줄기세포인, 신경능선줄기세포의 생산 방법.
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