KR20230060087A - Egf 또는 egf 처리 대식세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 각막질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 EGF 또는 EGF 처리 대식세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 각막질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, M1 대식세포에 EGF 처리 시, IL-1β 및 IL-6의 발현이 감소되고, 각막내피세포에 EGF 처리 대식세포 유래 엑소좀 처리 시, VCAM-1, ICAM-1, VEGF, MMP-2, MMP-9, PDGF의 발현이 감소되는 것을 확인함으로써 EGF가 M1 대식세포의 염증을 억제하고, 상기 염증이 완화된 M1 대식세포 유래 엑소좀은 주위 각막내피세포의 혈관신생을 억제하는 것을 확인하였다. 또한, 각막내피세포에서 M2a 대식세포 자체가 항염 효과를 나타내며, 특히 염증 및 창상이 유도된 각막내피세포에서 EGF 처리 M2a 대식세포 유래 엑소좀의 항염 및 세포 증식 효과가 우수한 것을 확인하였다. 이와 같은 효과를 가지는 EGF 또는 EGF 처리 대식세포 유래 엑소좀은 다양한 각막질환 치료에 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 EGF 또는 EGF 처리 대식세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 각막질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
각막은 안구 앞쪽 표면에 있는 투명하고 혈관이 없는 조직으로 흔히 검은자위라고 불리는 부분이다. 각막은 눈을 외부로부터 보호할 뿐만 아니라, 빛을 통과, 굴절시켜 볼 수 있게 하는 투명한 조직으로 빛의 굴절과 전달에 있어 주요한 기능을 하며 신경이 잘 발달되어 있어 외부 이물질에 민감하게 반응한다. 각막은 각막상피, 보우만막, 각막실질(stroma), 뒤경계판(데스메막), 각막내피의 5개 층으로 구성된다.
각막 표면은 외부에 직접 노출되어 있어 외상이나 스크래치에 취약하다. 각막이 손상될 경우, 자극감, 이물감 또는 건조감 등의 자극 증상은 물론, 손상이 심각해질 경우 각막염 등으로 발전할 수 있다. 따라서, 안구를 건강하게 유지하고 시력을 보존하기 위해서는 각막 손상을 예방하거나, 경미한 각막 손상이 악화되지 않도록 하거나, 손상된 각막을 치료하는 것이 필수적이다.
한편, 혈관신생(Angiogenesis)은 새로운 혈관이 생성되는 것을 의미한다. 발생 과정이나 상처 치료와 관련하여 정상적인 신생혈관의 생성은 유도되거나 조절하여야 하지만, 혈관신생이 조직의 퇴화를 유도하는 경우에는 바람직한 현상이 아니다. 특히, 혈관신생은 각막 신생혈관증, 당뇨병성 망막증, 맥락막 신생혈관증, 황반변성과 같은 질환과 밀접한 관련이 있어 이러한 경우에는 혈관신생을 억제해야만 해당 질환의 치료 효과를 높일 수 있다.
혈관신생의 형성 기전과 관련하여서는 세포나 조직으로부터 혈관신생 유도 인자인 혈관내피세포성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF), 상피세포성장인자(Epidermal growth factor; EGF) 등이 발현되어 주변의 혈관으로부터 미세혈관이 형성되는 것으로 알려져 있고, 상기 혈관신생 유도 인자의 발현은 허혈성 손상과 염증반응에 의해 유도되는 것으로 알려져 있다.
EGF는 아토피 피부염 등에서 염증 완화 효과가 알려진 바 있으나 안과 영역에서는 각막 상피세포 재생, 각막 지각신경의 회복 등의 재생 의학적 역할에만 국한되어 있다. 한편, 각막에는 수지상세포, 대식세포 등의 항원표지세포가 존재하고, 특히 대식세포는 각막 내피층과 인접한 심부 기질에 위치한다. 현재까지 EGF가 대식세포와 각막내피세포 사이에서 염증 완화를 통해 혈관신생을 억제하는지 여부에 관한 연구가 알려진 바 없다.
본 발명의 목적은 각막질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 각막질환 예방 또는 치료용 개선용 건강식품 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 혈관신생 억제 방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상피세포성장인자(EGF) 또는 EGF 처리 대식세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 각막질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상피세포성장인자(EGF) 또는 EGF 처리 대식세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 각막질환 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 인간을 제외한 개체로부터 분리된 각막내피세포에 EGF 처리 대식세포 유래 엑소좀을 처리하는 단계를 포함하는 혈관신생 억제 방법을 제공한다.
본 발명에서는 M1 대식세포에 EGF 처리 시, IL-1β 및 IL-6의 발현이 감소되고, 각막내피세포에 EGF 처리 대식세포 유래 엑소좀 처리 시, VCAM-1, ICAM-1, VEGF, MMP-2, MMP-9, PDGF의 발현이 감소되는 것을 확인함으로써 EGF가 M1 대식세포의 염증을 억제하고, 상기 염증이 완화된 M1 대식세포 유래 엑소좀은 주위 각막내피세포의 혈관신생을 억제하는 것을 확인하였다. 또한, 각막내피세포에서 M2a 대식세포 자체가 항염 효과를 나타내며, 특히 염증 및 창상이 유도된 각막내피세포에서 EGF 처리 M2a 대식세포 유래 엑소좀의 항염 및 세포 증식 효과가 우수한 것을 확인하였다. 따라서 이와 같은 효과를 가지는 EGF 또는 EGF 처리 대식세포 유래 엑소좀은 다양한 각막질환 치료에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 THP-1 단핵구 세포주에서 M1 대식세포로의 분화 유도를 확인한 결과이다.
도 2는 M1 대식세포, 또는 M1 대식세포 및 각막내피세포 공배양에서 EGF에 의한 항염 및 항혈관신생 효과를 확인한 결과이다.
도 3은 M1 대식세포에서 EGF에 의한 엑소좀 내 프로테옴 구성 변화를 확인한 결과이다.
도 4는 M1 대식세포에서 EGF에 의한 엑소좀 내 프로테옴 경로 변화를 확인한 결과이다.
도 5는 각막내피세포에서 EGF 처리 M1 대식세포 유래 엑소좀에 의한 항염 효과를 확인한 결과이다.
도 6은 각막내피세포에서 EGF 처리 M1 대식세포 유래 엑소좀의 항혈관신생 효과를 확인한 결과이다.
도 7은 염증성 각막내피세포에서 M2a 대식세포에 의한 항염 효과를 확인한 결과이다.
도 8은 염증성 각막내피세포에서 M2a 대식세포 유래 엑소좀에 의한 항염 효과를 확인한 결과이다.
도 9는 염증성 각막내피세포에 창상을 만든 후 EGF 처리 M2a 대식세포 유래 엑소좀에 의한 항염 효과를 확인한 결과이다.
도 10은 M2a 대식세포 유래 엑소좀에 의한 각막내피세포 증식을 확인한 결과이다.
도 11은 EGF 처리 M2a 대식세포 유래 엑소좀에 의한 각막내피세포 증식을 확인한 결과이다.
도 2는 M1 대식세포, 또는 M1 대식세포 및 각막내피세포 공배양에서 EGF에 의한 항염 및 항혈관신생 효과를 확인한 결과이다.
도 3은 M1 대식세포에서 EGF에 의한 엑소좀 내 프로테옴 구성 변화를 확인한 결과이다.
도 4는 M1 대식세포에서 EGF에 의한 엑소좀 내 프로테옴 경로 변화를 확인한 결과이다.
도 5는 각막내피세포에서 EGF 처리 M1 대식세포 유래 엑소좀에 의한 항염 효과를 확인한 결과이다.
도 6은 각막내피세포에서 EGF 처리 M1 대식세포 유래 엑소좀의 항혈관신생 효과를 확인한 결과이다.
도 7은 염증성 각막내피세포에서 M2a 대식세포에 의한 항염 효과를 확인한 결과이다.
도 8은 염증성 각막내피세포에서 M2a 대식세포 유래 엑소좀에 의한 항염 효과를 확인한 결과이다.
도 9는 염증성 각막내피세포에 창상을 만든 후 EGF 처리 M2a 대식세포 유래 엑소좀에 의한 항염 효과를 확인한 결과이다.
도 10은 M2a 대식세포 유래 엑소좀에 의한 각막내피세포 증식을 확인한 결과이다.
도 11은 EGF 처리 M2a 대식세포 유래 엑소좀에 의한 각막내피세포 증식을 확인한 결과이다.
대식세포는 크게 M1 및 M2 대식세포로 나뉘는데 창상치유 과정에서 서로 상이한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 초기에 관여하는 M1 대식세포는 창상치유의 시작 단계에서 Tnf-α, IL-6, IL-1β 등을 분비하여 염증을 일으키고 화학주성인자들을 통해 각종 면역세포들을 불러온다. 이후 과정에서는 M2a 대식세포가 관여하는데, 항염증성 사이토카인과 VEGF, PDGF 등의 혈관형성인자들을 분비하여 창상부를 성숙시키는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 발명자들은 EGF가 M1 대식세포에서 IL-6, IL-1β 등으로 비롯된 염증반응을 완화시키고, EGF 처리 M1 대식세포 유래 엑소좀이 각막내피세포에서 VEGF 등의 혈관신생인자를 억제하는 것을 확인하였다. 또한, 각막내피세포에서 M2a 대식세포 자체가 항염 효과를 나타내나 염증 및 창상이 유도된 각막내피세포에서는 EGF 처리 M2a 대식세포 유래 엑소좀의 항염 및 세포 증식 효과가 우수한 것을 확인하였다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 상피세포성장인자(EGF) 또는 EGF 처리 대식세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 각막질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 각막질환은 각막 이식수술 후 면역거부반응, 이식편대숙주질환, 헤르페스 각막염, 각막염 및 각막내피의 창상으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
상기 대식세포는 M1 또는 M2a 대식세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
상기 조성물은 항염증 및 항혈관신생 효과를 나타낼 수 있다. 보다 상세하게는, EGF가 M1 대식세포의 염증을 억제하고, 상기 염증이 완화된 M1 대식세포 유래 엑소좀은 주위 각막내피세포의 혈관신생을 억제할 수 있다.
상기 조성물은 M1 대식세포에서 IL-1β 및 IL-6로 이루어진 군에서 선택된 염증성 사이토카인의 발현을 감소시킬 수 있다.
상기 조성물은 각막내피세포에서 IL-1β, IL-6, VCAM-1, ICAM-1, VEGF, MMP-2, MMP-9 및 PDGF로 이루어진 군에서 선택된 mRNA의 발현을 감소시킬 수 있다.
상기 조성물은 점안제, 주사제, 안연고, 안구 삽입제, 과립제, 정제, 환제, 캡슐제, 겔제, 현탁제, 유제, 점적제 및 액제로 이루어진 군에서 선택된 제형일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
본 발명의 조성물이 약학 조성물인 경우, 투여를 위하여, 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형 제제는 상기 유효성분 외에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 과제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로솔, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 시간에 따라 다르지만, 당 업자에 의해 적절하게 선택될 수 있는 바, 상기 조성물의 일일 투여량은 바람직하게는 0.001 mg/kg 내지 50 mg/kg이며, 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 상피세포성장인자(EGF) 또는 EGF 처리 대식세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 각막질환 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물이 건강식품 조성물인 경우, 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일 주스, 합성 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 건강식품 조성물은 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.
또한, 상기 건강식품 조성물은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, 식품첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안전처에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반 시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 식품첨가물공전에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산 칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고랭색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류 첨가 알칼리제, 보존료제제, 타르색소 제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.
이때, 건강식품 조성물을 제조하는 과정에서 식품에 첨가되는 본 발명에 따른 조성물은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있다.
또한, 본 발명은 인간을 제외한 개체로부터 분리된 각막내피세포에 EGF 처리 대식세포 유래 엑소좀을 처리하는 단계를 포함하는 혈관신생 억제 방법을 제공한다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 단핵구 분화 및 엑소좀 분리
인간 단핵세포주인 THP-1 세포는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하였고, 10% 우태아혈청(FBS, Gibco) 및 100units/mL 페니실린/스트렙토마이신(Gibco)이 첨가된 RPMI 1640 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에 배양하였다.
THP-1 단핵구 세포에서 대식세포 유사(macrophage-like; M0) 표현형으로의 분화를 위해, 50nM PMA(phorbol-12-myristate-13-acetate, #P8139, Sigma-Aldrich)로 24시간 처리하였다.
이후 M1 대식세포로 활성화시키기 위해, M0 대식세포를 5% 엑소좀 결핍 FBS(Gibco) 및 100ng/mL LPS(Lipopolysaccharides, O111:B4, #L2630, Sigma-Aldrich)와 IFN-gamma 20ng/mL(#570204, BioLegend)이 포함된 배양 배지로 24시간 처리하였다. 이후 인간 재조합 상피세포성장인자(hEGF) 단백질(#E9644, Sigma-Aldrich)(1 or 10ng/mL)로 24시간 처리 후, 엑소좀 분리를 위해 상층액을 수집하였다.
또한, M2a 대식세포로 활성화시키기 위해, M0 대식세포를 10ng/mL hEGF 유무 하에 IL-4(20ng/mL) 및 IL-13(20ng/mL)이 포함된 배양배지로 48시간 처리 후, 엑소좀 분리를 위해 상층액을 수집하였다.
엑소좀 분리를 위해, EGF가 처리된 M1 또는 M2a 대식세포의 상층액을 수집하여 2000g에서 30분 동안 원심분리하여 세포 잔해를 제거하였다. 이후 0.22μm 기공 사이즈 필터(Millipore)로 여과하였다. 세포 잔해가 제거된 상층액 900μL를 새 튜브에 넣고, 450μL의 Total Exosome Isolation 시약(#4478359, Invitrogen™)을 첨가한 후 4℃에서 밤새 반응시켰다. 이후, 4℃, 10,000g에서 1시간 동안 원심분리하고 상층액을 제거한 후 샘플을 4℃, 10,000g에서 5분 동안 다시 원심분리하여 과잉 시약을 제거하였다. 모든 상층액이 제거되면, 엑소좀 펠렛을 PBS 완충액(50μL)에 재현탁하고, -80℃에서 보관하였다.
실시예 2: 공배양(co-culture)
인간 각막내피세포를 6 웰 플레이트에 1.5 X 105 세포/웰 농도로 접종하고, 8% FBS(with 100 μg/ml pituitary extract, 0.08% Chondroitin sulfate)가 포함된 배지에서 하루 동안 배양한 후 4% FBS가 포함된 배지로 바꾸어 24시간 배양하였다. 이때, pituitary extract는 #13028014(Gibco), Chondroitin sulfate는 #C6737(sigma-aldrich)를 이용하였다.
각 insert(0.4μm pore, SPL Life Sciences, Pocheon, Gyeonggi-do, Republic of Korea)에 1 X 105개의 M1 대식세포를 접종한 후 1시간 동안 배양하고, insert를 6 웰 플레이트에 결합한 후 insert에 EGF를 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 이후 insert를 제거하고 인간 각막내피세포의 RNA와 단백질을 추출한 후 qRT-PCR과 웨스턴 블롯을 수행하였다.
다음으로 인간 각막내피세포를 24 웰 플레이트에 5 X 104 세포/웰 농도로 접종하고, 10% FBS가 포함된 배지에서 하루 동안 배양한 후 1% FBS가 포함된 배지로 바꾸어 24시간 배양하였다. 이후 창상 유무 하에 LPS 1μg/mL로 1시간 동안 처리하였다. 각 insert(0.4μm pore, SPL Life Sciences, Pocheon, Gyeonggi-do, Republic of Korea)는 1 X 104개의 M2a 대식세포를 접종한 후 1시간 동안 배양하고, insert를 24 웰 플레이트에 결합한 다음 24시간 추가 배양하였다. 이후 insert를 제거하고 인간 각막내피세포의 RNA를 추출한 후 qRT-PCR을 수행하였다.
실시예 3: 세포 증식 분석
96 웰 플레이트에 각막내피세포(100μL/웰)를 접종하고, M1 또는 M2a 대식세포 유래 엑소좀을 처리한 후 가습 인큐베이터(37℃, 5% CO2)에서 배양하였다. 세포 증식은 배양 0, 1, 2, 3, 4 및 5일 후에 측정하였다. 플레이트의 각 웰에 10μL의 CCK-8 시약(Enzo life sciences, Farmingdale, NY, USA)을 첨가하고 인큐베이터에서 2시간 동안 추가 배양하였다. SpectramaxTM 340PC384 microplate photometer(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였고, 생존 세포의 수를 알고 있는 웰에서 데이터를 획득하여 보정 곡선을 작성하였다.
실시예 4: 엑소좀 형광 표지
엑소좀을 1μL PKH26 적색 염료를 포함하는 100μL의 희석제 C에 현탁시켰다. 이후 실온에서 10분 동안 반응시킨 다음 10% BSA를 포함하는 PBS 200μL를 첨가하여 반응을 중단시키고, 엑소좀 스핀 컬럼 MW 3000(#4484449, Invitrogen™)에 통과시켜 엑소좀에 표지되지 않은 염료를 제거하였다.
실시예 5: 엑소좀 처리
각막내피세포를 6 웰 플레이트에 1.5 X 105 세포/웰 농도로 접종하고, 10% FBS가 포함된 배지에서 하루 동안 배양한 후 1% FBS가 포함된 배지로 바꾸어 24시간 배양하였다. MO, M1 대식세포 또는 EGF(1~100ng/mL) 처리된 M1 대식세포로부터 분비된 20μg/mL 엑소좀과 24시간 동안 배양하였다. 이후 RNA와 단백질을 추출한 후 qRT-PCR과 웨스턴 블롯을 수행하였다.
마찬가지로 각막내피세포를 6 웰 플레이트에 1.5 X 105 세포/웰 농도로 접종하고, 10% FBS가 포함된 배지에서 하루 동안 배양한 후 1% FBS가 포함된 배지로 바꾸어 24시간 배양하였다. M2a 대식세포 또는 EGF(10ng/mL) 처리된 M2a 대식세포로부터 분비된 10μg/mL 엑소좀과 24시간 동안 배양하였다. 이후 RNA를 추출한 후 qRT-PCR을 수행하였다.
실시예 6: Total RNA 정제 및 Real-time qRT-PCR
RiboEx total RNA isolation solution(GeneAll Inc., Korea)을 사용하여 대식세포와 인간 각막내피세포(HCEC)로부터 Total RNA를 획득하였다. cDNA 합성 키트(# K1622, Thermo Scientific)를 사용하여 1μg의 total RNA로 단일가닥 상보적 DNA(cDNA)를 합성하였다.
정량적 RT-PCR은 SYBR Premix Ex Taq(Takara Bio Inc. Otsu, Japan) 및 CFX96TM Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 수행하였다. 데이터는 레퍼런스 유전자인 18S 리보솜 RNA로 정규화한 후 comparative cycle threshold(Ct) 방법을 사용하여 상대적 유전자의 양을 획득하였다. 정량적 RT-PCR 분석의 결과는 평균 레퍼런스 유전자 발현에 대한 각 유전자의 평균 발현량으로 나타내었다.
실시예 7: 웨스턴 블롯
엑소좀 현탁액을 농축하고, BCA(bicinchoninic acid) 키트(23227, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 단백질 함량을 측정하였다. 비환원 조건하에 SDS-PAGE로 엑소좀을 분리하고, 전기영동으로 단백질을 멤브레인으로 이동시킨 다음, 엑소좀 특이적 마커 단백질 CD63(#10628D, Thermo) CD81(#10630D, Thermo)로 발현을 분석하였다.
총 세포 단백질은 protease inhibitor cocktail(Sigma Aldrich) 및 포스파타아제 억제제 (PhosSTOP™, Sigma Aldrich) 가 첨가된 RIPA 완충액(Sigma Aldrich, StLouis, MO, USA)을 사용하여 배양된 세포에서 분리하였다. 얼음 위에서 15분 동안 반응시킨 후 4℃, 13000rpm에서 10분 원심분리하였다. 이후 상층액을 취하여 웨스턴 블롯 분석에 사용하였다. 10% SDS-PAGE 겔을 사용하여 단백질을 분리한 후 PVDF(polyvinylidene fluoride membranes, Merck Millipore, Billerica, MA, USA) 막으로 옮기고, 비특이적 항체 결합을 위해 5% skim milk가 포함된 TBS-T(50mM Tris-HCl pH 7.5, 150mM NaCl 및 0.1% Tween-20)로 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 α-SMA(CBL171, Millipore), phosphorylated AKT(#4060, Cell Signaling Technology, MA, USA), VEGF A(sc-7269, snata cruz), Ki67(#ab15580, abcam) 및 β-actin( sc-47778, snata cruz)에 대한 1차 항체를 5% BSA(1:1000)가 포함된 TBS-T에 희석하여 4℃에서 밤새 반응시켰다. 이후 2차 항체를 5% skim milk(1:2000)가 포함된 TBS-T에 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 특이적 항체 결합은 enhanced chemiluminescence Western blotting detection kit(Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, USA)를 사용하여 시각화하였고, 각 밴드의 값은 β-액틴의 값으로 정규화하였다.
실시예 8: 유세포 분석
플레이트(plate)에 분화된 THP-1 세포는 1 X 106개의 농도로 튜브에 첨가하였다. cell staining buffer(1% BSA, 0.01% sodium azide in PBS)를 첨가하고 350xg에서 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. 이후 100μL 세포 현탁액 당 5μL의 Human TruStain FcX(Fc receptor blocking solutiuon, BioLegend)를 첨가하여 실온에서 10분 동안 반응시킨 후 형광색소가 접합된 항체(anti-CD14 PE, anti-CD11b FITC, anti-CD11c AP, anti-CD14 PE, anti-CD86 APC, anti-CD163 FITC, anti-CD206 BV421)와 차광 하에 얼음 위에서 20분 동안 반응시켰다. 세척 후 세포 펠렛을 0.5mL의 cell staining buffer에 현탁하고, 5μL의 7-AAD Viability staining solution(Biolegend)과 차광 하에 얼음 위에서 반응시켰다. 세포는 BD FACSCanto I 유세포 분석기를 이용하여 측정하였고, 데이터는 FlowJo를 사용하여 분석하였다.
실시예 9: 프로테옴 분석
1) 샘플 준비
샘플은 2% SDS에서 음파 프로브(QSonica)로 용해하였다: amplitude 40%, pulse 10 x 1s, 1 on 1 off. 각 샘플의 단백질 농도는 Qubit fluorometry(Invitrogen)로 측정하였다. 각 샘플 10μg은 MES 버퍼 시스템에서 10% Bis Tris NuPage mini-gel(Invitrogen)을 사용하여 SDS-PAGE로 분석하였다. migration window(1cm lane)를 제거하고 다음 프로토콜에 따라 ProGest robot(DigiLab)으로 in-gel digestion을 수행하였다.
(1) 25mM 중탄산암모늄으로 세척한 다음 아세토니트릴로 세척
(2) 60℃에서 10mM 디티오트레이톨로 환원시킨 후 실온에서 50mM 요오도아세트아미드로 알킬화
(3) 트립신(Promega)으로 37℃에서 4시간 동안 처리하여 분해
(4) 포름산으로 종지(quench)하고 상층액을 추가 처리없이 직접 분석에 사용
2) 질량 분석
분해된 샘플의 절반을 Waters NanoAcquity HPLC system(interfaced to a ThermoFisher Q Exactive)을 사용하여 nano LC-MS/MS로 분석하였다. 펩타이드를 trapping 컬럼에 로딩하고 2시간 역상 구배를 사용하여 350mL/min의 속도로 75μm 분석 컬럼에서 용리하였다. 두 컬럼 모두 Luna C18 resin(Phenomenex)으로 패킹되었다. 질량 분석기는 데이터 종속 모드에서 작동되었으며 Orbitrap은 MS 및 MS/MS에 대해 각각 70,000 FWHM 및 17,500 FWHM으로 수행하였다. 15개의 가장 풍부한 이온이 MS/MS용으로 선택되었다.
3) 데이터 처리
다음 매개변수와 함께 Mascot의 local copy를 사용하여 데이터를 분석하였다.
Enzyme: Trypsin/P
Databases: SwissProt Human
Fixed modifications: Carbamidomethyl (C)
Variable modifications: Oxidation (M), Acetyl (N-term), Pyro-Glu (N-term Q), Deamidation (N,Q)
Mass values: Monoisotopic
Peptide Mass Tolerance: 10 ppm
Fragment Mass Tolerance: 0.02 Da
Max Missed Cleavages: 2
Mascot DAT 파일은 유효성 검사, 필터링 및 샘플 당 비중복 목록 생성을 위해 Scaffold(Proteome Software)로 분석되었다. 데이터는 1% 단백질 및 펩타이드 FDR을 사용하여 필터링되었으며 단백질 당 최소 2개의 고유한 펩타이드가 필요하다.
실험예 1: 단핵구에서 M1 대식세포로의 분화 및 분극화
인간 THP-1 단핵구에 PMA를 처리하여 휴지 M0 대식세포로 분화시킨 다음, M0 대식세포에 LPS를 처리하여 M1 유사 대식세포로 분극화하였다(도 1A).
THP-1 단핵구가 M0 대식세포로 분화됨에 따라 Cd11b, Cd11c 유전자 발현이 증가하였고(도 1B), M0 대식세포에서 M1 대식세포로 분극화됨에 따라 IL-1β, IL-6, IL-12, Tnf-α를 포함한 염증성 사이토카인 및 Cd68 및 Cd86을 포함한 표면 분화 마커에 대한 유전자 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 1C).
CD14의 발현이 THP-1 단핵구에서 대식세포로 분화됨에 따라 감소한다는 것을 기반으로 하여, CD14mod to hi 세포 집단 및 CD14lo 세포 집단을 모두 확인하여 M1 대식세포의 추정 아형 중 하나인 CD86+CD206- 세포의 아형을 추가로 게이트(gate)하였다. THP-1 단핵구와 달리, M1 대식세포의 분극화된 집단 내에서 CD14loCD86+CD206- 세포와 CD14+CD86+CD206- 세포가 증가하는 것을 확인하였다(도 1D 및 1E).
상기 결과로부터 THP-1 단핵구에서 M1 대식세포로의 분화가 잘 이루어짐을 확인하였다.
실험예 2: M1 대식세포에서 EGF에 의한 항염증 및 항혈관신생 효과
외인성 EGF 처리가 M1 대식세포의 염증 및 혈관신생에 미치는 영향을 분석하였다. M1 대식세포를 EGF로 12시간 처리한 결과, 염증성 사이토카인인 IL-6, IL-1β, Tnf-α의 유전자 발현이 감소하고, 표면 분화 마커인 Cd68, 혈관신생 마커인 Vegfa, Vegfc의 유전자 발현이 감소하는 것을 확인하였다(도 2A 및 2B).
또한 M1 대식세포를 EGF로 24시간 처리한 결과, VEGF-A, VCAM-1, IL-1β의 단백질 발현이 감소하고, 면역조절에 관여하는 사이토카인인 IL-10의 단백질 발현이 증가하는 것을 확인하였다.(도 2C). M1 대식세포에서 IL-6의 분비는 EGF에 의해 크게 억제되는 것을 확인하였다(도 2D).
다음으로 각막내피세포와 M1 대식세포의 공배양에서 외인성 EGF 처리가 염증 및 혈관신생에 미치는 영향을 분석하였다(도 2E). EGF로 24시간 처리한 결과, 염증성 사이토카인인 IL-1β, Tnf-α의 유전자 발현이 감소하고, 혈관신생 마커인 Icam1, Vcam1, Vegfc의 유전자 발현이 감소하는 것을 확인하였다(도 2F).
실험예 3: M1 대식세포에서 EGF에 의한 엑소좀 내 프로테옴 구성 변화
엑소좀은 모든 세포에서 생성되는 직경 ~40~160nm 크기의 세포외 소포이다. 세포간 전달 시스템으로서 엑소좀은 유전자 전사 조절을 포함하여 다면발현 기능을 발휘하기 위해 다양한 메커니즘을 통해 세포에 직접 들어갈 수 있다. 이에, EGF가 처리된 M1 유래 엑소좀(EGF-M1 exo)이 항염증 효과를 나타낼 수 있는지를 분석하였다.
M0 및 M1 대식세포에서 엑소좀을 확인하고(도 3A), EGF를 처리한 M1 대식세포에서 엑소좀을 분리한 후 엑소좀 마커인 Hsp70, CD63 및 CD81로 엑소좀을 검증하였다(도 3B 및 3C). M1 대식세포를 EGF로 처리한 결과, EGF 전구체의 엑소좀 발현 및 IL-10이 증가하는 것을 확인하였다(도 3D). 상기 결과로부터 EGF의 외부 투여가 엑소좀 내 EGF의 양을 증가시키고 항염증 물질의 발현을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
EGF 처리에 의한 M1 유래 엑소좀 내 프로테옴 구성 변화를 확인하기 위해, M1 유래 엑소좀에서 프로테옴 분석을 수행하였다. EGF를 처리하지 않은 M1 대식세포 유래 엑소좀(M1 exo) 및 EGF를 처리한 M1 대식세포 유래 엑소좀(EGF-M1 exo)에서 각각 2024개 및 1980개의 단백질을 확인하였고, 이중 1814개의 단백질이 공통적으로 확인되었다(도 3E).
M1 exo 또는 EGF-M1 exo 특이적 프로테옴의 생물학적 중요성을 확인하기 위해, 공통적으로 존재하는 프로테옴 중 상대적인 풍부함을 기반으로 가장 상향 조절되고 가장 하향 조절되는 상위 25개 단백질을 분석하였다. EGF-M1 exo에 더 많이 존재하는 단백질로는 Ras GTPase-activating protein 1, Tumor necrosis factor alpha-induced protein 8-like protein 2, Inactive rhomboid protein 2를 포함하였고, 엑소좀에서 EGF에 의해 하향 조절되는 단백질로는 CD151 antigen, Elongation factor 1-delta, Ribonuclease T2를 포함하였다(도 3F 및 3G).
실험예 4: M1 대식세포에서 EGF에 의한 엑소좀 내 프로테옴 경로 변화
EGF 처리 전후 M1 대식세포 유래 엑소좀 내 프로테옴 경로를 분석하였다(도 4). Reactome 경로 분석을 사용하여 고유한 M1 exo 단백질과 고유한 EGF-M1 exo 단백질로서 각각 210개 및 166개 단백질의 경로 분석을 수행하였다. 흥미롭게도, EGF-M1 exo의 고유한 프로테옴 경로 중 heme 분해 경로가 가장 많은 것을 확인하였다. heme 분해 경로는 Tnf-α의 조절과 LPS에 의한 IL-6 생성 억제에 관여하는 것으로 알려져 있다.
실험예 5: 각막내피세포에서 EGF 처리 M1 대식세포 유래 엑소좀의 항염 효과
EGF를 처리한 M1 대식세포 유래 엑소좀을 각막내피세포에 처리하여 항염 효과를 분석하였다. 먼저, 엑소좀을 PHK26 적색 염료로 표지하고 각막내피세포에 처리하였을 때, 세포 내부로 잘 유입되는 것을 확인하였다(도 5A). 각막내피세포에 M1 exo를 처리 시, 별도의 염증 자극 없이도 염증이 잘 유도되는 것을 확인하였고(도 5B), EGF-M1 exo를 처리 시, 염증 유도가 억제되는 것을 확인하였다(도 5C).
실험예 6: 각막내피세포에서 EGF 처리 M1 대식세포 유래 엑소좀의 항혈관신생 효과
EGF를 처리한 M1 대식세포 유래 엑소좀을 각막내피세포에 처리하여 항혈관신생 효과를 분석하였다. 각막내피세포에 M1 exo를 처리 시, 별도의 자극 없이도 혈관신생 인자들이 잘 발현되는 것을 확인하였고(도 6A), EGF-M1 exo를 처리 시, 혈관신생 인자들의 발현이 억제되는 것을 확인하였다(도 5C).
실험예 7: M2a 대식세포 또는 M2a 대식세포 유래 엑소좀의 항염증 효과
LPS 유도 염증성 각막내피세포를 M2a 대식세포와 공배양한 결과, 염증성 각막내피세포에서 염증 마커인 IL-6, IL-1β의 유전자 발현이 유의하게 감소한 것을 확인하였고, 이러한 항염증 효과는 염증성 각막내피세포에 창상을 만드는 것과는 무관한 것으로 확인되었다(도 7).
다음으로 LPS 유도 염증성 각막내피세포에 M2a 대식세포 유래 엑소좀을 처리한 결과, IL-6, IL-1β, Vcam1, Icam1의 각종 염증성 사이토카인의 유전자 발현이 감소하고, Vegfc의 유전자 발현 역시 감소하는 것을 확인하였다(도 8).
실험예 8: EGF 처리 M2a 대식세포 유래 엑소좀의 항염증 효과
LPS 유도 염증성 각막내피세포에 추가로 창상을 만든 다음 M2a 대식세포 유래 엑소좀 또는 EGF 처리 M2a 대식세포 유래 엑소좀을 처리하였다. 그 결과, M2a 대식세포 유래 엑소좀은 뚜렷한 항염증 효과가 관찰되지 않은 반면, EGF를 처리한 M2a 대식세포에서 분리한 엑소좀을 처리 시, IL-6, IL-1β, Vcam1 및 Vegfa의 유전자 발현이 감소하는 것을 확인하였다(도 9).
실험예 9: M2a 대식세포 유래 엑소좀에 의한 각막내피세포 증식
각막내피세포에 M1 또는 M2a 대식세포 유래 엑소좀을 처리한 후 세포 성장곡선을 확인한 결과, Day 2와 Day 5를 참조하여 보면, 대조군 및 M1 대식세포 유래 엑소좀 투여군 대비 M2a 대식세포 유래 엑소좀 투여군에서 세포 증식이 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 효과는 Day 5에서 가장 뚜렷하게 관찰되었는데 Day 5의 세포를 이용한 PCR 결과, 대조군 대비 M2a 대식세포 유래 엑소좀 투여군에서 IL-6, IL-1β의 유전자 발현이 감소하고, Vegfa, Vegfc의 유전자 발현이 증가하고, 세포주기 관련 인자인 Cdc25a의 유전자 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 10).
실험예 10: EGF 처리 M2a 대식세포 유래 엑소좀에 의한 각막내피세포 증식
염증성 각막내피의 창상치유 과정을 모델링하기 위해서 LPS로 유도한 염증성 각막내피세포의 세포 성장을 분석하였다 그 결과, M2a 대식세포 유래 엑소좀 투여군에서는 세포 증식이 유의하게 관찰되지 않은 반면, EGF 처리 M2a 대식세포 유래 엑소좀 투여군에서는 세포 증식이 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 11).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (9)
- 상피세포성장인자(EGF) 또는 EGF 처리 대식세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 각막질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 각막질환은 각막 이식수술 후 면역거부반응, 이식편대숙주질환, 헤르페스 각막염, 각막염 및 각막내피의 창상으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 각막질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 대식세포는 M1 또는 M2a 대식세포인 것을 특징으로 하는 각막질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 항염증 및 항혈관신생 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 각막질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 M1 대식세포에서 IL-1β 및 IL-6로 이루어진 군에서 선택된 염증성 사이토카인의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 각막질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 각막내피세포에서 IL-1β, IL-6, VCAM-1, ICAM-1, VEGF, MMP-2, MMP-9 및 PDGF로 이루어진 군에서 선택된 mRNA의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 각막질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 점안제, 주사제, 안연고, 안구 삽입제, 과립제, 정제, 환제, 캡슐제, 겔제, 현탁제, 유제, 점적제 및 액제로 이루어진 군에서 선택된 제형인 것을 특징으로 하는 각막질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 상피세포성장인자(EGF) 또는 EGF 처리 대식세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 각막질환 예방 또는 개선용 건강식품 조성물.
- 인간을 제외한 개체로부터 분리된 각막내피세포에 EGF 처리 대식세포 유래 엑소좀을 처리하는 단계를 포함하는 혈관신생 억제 방법.
Priority Applications (1)
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| KR1020210144357A KR20230060087A (ko) | 2021-10-27 | 2021-10-27 | Egf 또는 egf 처리 대식세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 각막질환 예방 또는 치료용 조성물 |
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| KR1020210144357A KR20230060087A (ko) | 2021-10-27 | 2021-10-27 | Egf 또는 egf 처리 대식세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 각막질환 예방 또는 치료용 조성물 |
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| KR (1) | KR20230060087A (ko) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100455531B1 (ko) | 2001-11-13 | 2004-11-15 | 배선량 | 티클로피딘을 활성성분으로 함유하는 각막 혈관신생억제조성물과 그 제조방법 |
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2021
- 2021-10-27 KR KR1020210144357A patent/KR20230060087A/ko not_active Application Discontinuation
Patent Citations (1)
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