WO2021045595A1 - 치아 주변조직 유래 다분화능 줄기세포를 포함하는 비만 또는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

치아 주변조직 유래 다분화능 줄기세포를 포함하는 비만 또는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2021045595A1
WO2021045595A1 PCT/KR2020/012045 KR2020012045W WO2021045595A1 WO 2021045595 A1 WO2021045595 A1 WO 2021045595A1 KR 2020012045 W KR2020012045 W KR 2020012045W WO 2021045595 A1 WO2021045595 A1 WO 2021045595A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tissue
stem cells
alcoholic fatty
fatty liver
obesity
Prior art date
Application number
PCT/KR2020/012045
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
노규진
김경민
장시정
이성림
박봉욱
이현정
Original Assignee
경상대학교 산학협력단
주식회사 스템센트릭
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 경상대학교 산학협력단, 주식회사 스템센트릭 filed Critical 경상대학교 산학협력단
Priority to JP2022515589A priority Critical patent/JP2022546856A/ja
Priority to US17/640,725 priority patent/US20220339196A1/en
Publication of WO2021045595A1 publication Critical patent/WO2021045595A1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/32—Bones; Osteocytes; Osteoblasts; Tendons; Tenocytes; Teeth; Odontoblasts; Cartilage; Chondrocytes; Synovial membrane
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of obesity or non-alcoholic fatty liver comprising mesenchymal stem cells derived from tissues around teeth that have been cryopreserved vitrified.
  • Obesity is a phenomenon that occurs when excess energy is accumulated in the body as fat, which causes metabolic abnormalities due to abnormally large body fat.
  • the causes are presumed to be neuroendocrine causes, drug causes, decreased activity levels, and genetic diseases.
  • Obesity is a chronic disease that is recognized as the cause of complications such as diabetes, heart disease, high blood pressure, and stroke, and is mainly treated with appetite suppressants and fat absorption inhibitors.
  • sibutramine an appetite suppressant
  • sibutramine an appetite suppressant
  • Non-alcoholic fatty liver disease is the most common chronic liver disease and is known to be closely related to type 2 diabetes, obesity and metabolic syndrome.
  • the number of patients with non-alcoholic fatty liver disease is increasing rapidly in Korea due to the increase of westernized dietary habits, obesity, and diabetic population. It is expected. This is a number that grows at an annual average of 45%.
  • the exact pathologic mechanism of non-alcoholic fatty liver disease has not been identified, the effect of drug treatment reported so far is not sufficient in the number of study subjects, and there is no officially approved treatment system yet. Therefore, there is a need for a new treatment that can ensure stability even when used for a long period of time and can exert a distinct therapeutic effect for NAFLD.
  • dental tissue-derived mesenchymal stem cells are a type of mesenchymal stem cells, and recent studies have shown that mesenchymal stem cells are not only mesoderm but also ectoderm (mainly neurons) or endoderm. It has been found that it can differentiate into (hepatocytes, pancreatic cells, etc.), and is recognized as having multipotency.
  • the present inventors endeavored to develop a new therapeutic agent for obesity or non-alcoholic fatty liver.
  • a new therapeutic agent for obesity or non-alcoholic fatty liver after administering vitreous cryopreserved mesenchymal stem cells derived from tooth surrounding tissue to a high fat diet animal model, weight loss and serum adipocaine concentration decrease And the histological findings of the liver were recovered to confirm that it is effective in improving obesity or non-alcoholic fatty liver, and the present invention was completed.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of obesity or non-alcoholic fatty liver comprising mesenchymal stem cells derived from tissue around teeth.
  • Another object of the present invention is to provide a stem cell therapeutic agent for the treatment of obesity or non-alcoholic fatty liver, including mesenchymal stem cells derived from tissue surrounding teeth.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity or non-alcoholic fatty liver comprising mesenchymal stem cells derived from tissues around teeth.
  • the present invention provides a stem cell therapeutic agent for the treatment of obesity or non-alcoholic fatty liver, including mesenchymal stem cells derived from tissue surrounding teeth.
  • the present invention provides a method for preventing or treating obesity or non-alcoholic fatty liver, comprising the step of treating an individual with mesenchymal stem cells derived from tissue surrounding teeth.
  • the present invention provides the use of mesenchymal stem cells derived from tissue surrounding teeth as a medicament for preventing or treating obesity or non-alcoholic fatty liver.
  • the present invention provides the use of mesenchymal stem cells derived from tissue surrounding teeth to produce a pharmaceutical preparation for the prevention or treatment of obesity or non-alcoholic fatty liver.
  • the pharmaceutical composition for the prevention or treatment of obesity or non-alcoholic fatty liver of the present invention significantly prevents obesity or non-alcoholic fatty liver by reducing weight, reducing serum adipocaine concentration, recovering histological findings of the liver, and improving lipid metabolism in the liver. And therapeutic effect.
  • the mesenchymal stem cells derived from tooth surrounding tissues, which are the active ingredients of the present invention are mesodermal stem cells whose safety has been verified, and can be obtained by the most non-invasive method, so they are useful as a cell therapy for obesity or non-alcoholic fatty liver. It is expected to be used.
  • FIG. 3 shows the Western blot results for liver tissue, which corresponds to the result of confirming the expression level of androgen receptor (AR) in the liver tissue (A) and the result of quantifying the expression level (B) (* p ⁇ 0.05, compared to the control group; #p ⁇ 0.05, compared to the HFD group).
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of ELISA analysis on the level of serum adipokine, an indicator of obesity (*p ⁇ 0.05, compared with the control group; #p ⁇ 0.05, compared with the HFD group).
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity or non-alcoholic fatty liver comprising mesenchymal stem cells derived from tissue around teeth.
  • stem cells refers to undifferentiated cells in a stage before differentiation into each cell constituting a tissue, and differentiation proceeds to a specific cell by a specific differentiation stimulation (environment). It means the cells that become.
  • mesenchymal stem cells is also referred to as mesenchymal stem cells or adult stem cells, and collectively refers to stem cells isolated and cultured from tissues other than embryos.
  • Mesenchymal stem cells are present in small amounts in most tissues that have already been differentiated, and their existence has been confirmed in almost all tissues studied so far, such as umbilical cord blood, umbilical cord, teeth, eyes, placenta, hair follicles, lungs, and liver.
  • the term “dental-tissue derived mesenchymal stem cells” refers to adult stem cells derived from teeth and surrounding tissues, and cells similar in shape to mesenchymal stem cells (mesenchymal stem cells). -like cells), and has the advantage of minimizing tissue damage and being easily obtainable (non-invasive) compared to other adult stem cells present in the bone marrow or umbilical cord, and thus was used as an active ingredient of the present invention.
  • the tissue surrounding the tooth is not limited thereto, but may be a pulp tissue of an indwelling or permanent tooth, a periodontal ligament tissue, a dental sac tissue of an erupting tooth, a tooth stem tissue, a root papillary tissue of an immature permanent tooth, preferably a wisdom tooth. It could be the surrounding tissue.
  • the tissue may be characterized in that it contains mesenchymal stem cells, and the mesenchymal stem cells are dental pulp stem cells (DPSCs), stem cells from human exfoliated deciduous stem cells. at least one selected from the group consisting of teeth, SHEDs), periodontal ligament stem cells (PDLSCs), dental follicle stem cells (DFSCs), and stem cells from apical papilla (SCAP)
  • DPSCs dental pulp stem cells
  • SHEDs periodontal ligament stem cells
  • DFSCs dental follicle stem cells
  • SCAP apical papilla
  • mesenchymal stem cells derived from surrounding tooth tissues have been applied clinically in regenerative medicine to treat or improve peri-implantitis, nerve damage, and loss of gum bones, but to date, medical treatment for obesity or non-alcoholic liver disease. No effect has been reported.
  • the tissue surrounding the tooth is separated from the human body and frozen for supermagnetization, and the method for cryopreservation for supermagnetization can use the method described in Korean Patent Registration No. 10-1551900, which is a prior patent of the present inventors. have.
  • the method for isolating mesenchymal stem cells can be used without limitation, methods known in the art, for example, can be isolated and purified from tissue surrounding teeth, and the isolated mesenchymal stem cells are cultured as needed. You may.
  • the obesity refers to an obesity standard of 25 kg/m 2 or more, which is the basis for obesity, and various metabolic syndromes and cardiovascular diseases including arteriosclerosis, type 2 diabetes, and myocardial infarction. Means, but is not limited thereto.
  • non-alcoholic fatty liver disease is a case where the fat content in liver cells not caused by alcohol is 5% or more of the weight of the liver. It refers to a state in which accumulation has occurred, a state of hepatic steatosis, or a disease state in which an inflammatory reaction occurs in the liver tissue as a result of an increase in fat accumulation in the liver tissue, but is not limited thereto.
  • the "pharmaceutical composition for preventing or treating obesity or non-alcoholic fatty liver comprising mesenchymal stem cells derived from tooth surrounding tissues” may be mesenchymal stem cells itself derived from tooth surrounding tissues, and intermediate
  • mesenchymal stem cells it includes a culture medium, a composition containing a material generally used in the art when culturing stem cells.
  • it is meant to include the use of a substance secreted by mesenchymal stem cells derived from tissue surrounding teeth or a substance extracted from mesenchymal stem cells derived from tissue surrounding teeth in place of the mesenchymal stem cells derived from tissue surrounding teeth.
  • the pharmaceutical composition may include a conventional pharmaceutically acceptable carrier in addition to the mesenchymal stem cells derived from tissues around the tooth, and in the case of injection, a preservative, painless agent, solubilizer or stabilizer, for topical administration
  • a preservative for topical administration
  • it may contain a base agent, an excipient, a lubricant or a preservative.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical composition of the present invention are commonly used at the time of formulation, and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, calcium phosphate, alginate, gelatin, Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, etc. It does not become.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, and the like in addition to the above components.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared in unit dosage form by formulating using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily carried out by a person having ordinary knowledge in the technical field to which the present invention belongs. Or it can be prepared by incorporating it into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or aqueous medium, and may additionally include a dispersant or a stabilizer.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered parenterally, and can be administered intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically, and the composition for parenteral administration of the composition according to the present invention (eg, injection) is pharmaceutically acceptable.
  • Possible carriers for example, sterile purified water, a buffer solution of about pH 7, or dispersed and/or dissolved in physiological saline may be injected into the living body, and if necessary, may contain conventional additives such as preservatives, stabilizers, etc. .
  • the amount of mesenchymal stem cells in the present invention may be administered 10 4 to 10 10 cells/cycle, preferably 10 5 to 10 9 cells/cycle, more preferably 10 6 to 10 8 cells /Time, most preferably 5 x 10 7 to 10 8 cells / time may be administered, but is not limited thereto.
  • the dosage may be prescribed in various ways depending on factors such as formulation method, mode of administration, age, weight, pathological condition, food, administration time, route of administration, excretion rate, and response sensitivity of the patient.
  • the pharmaceutical composition is characterized in that it can improve weight loss, blood adipocaine concentration reduction, and histological recovery of the liver to improve obesity or non-alcoholic fatty liver caused by high fat diet or metabolic syndrome. It is done.
  • the body weight of the animal model of the high fat diet is reduced, and the findings of fat adhesion in the liver tissue are significantly improved, and the serum adipocaine TNF- ⁇ And IL-1 ⁇ decreased, it was confirmed that obesity and non-alcoholic fatty liver can be improved.
  • the serum adipokines are secreted from activated adipocytes in the obese state, and consist of proinflammatory cytokines including TNF- ⁇ and IL-1 ⁇ .
  • the liver locally exhibits pathological symptoms similar to obesity.Through the above results, the mesenchymal stem cells derived from tooth surrounding tissues according to the present invention control adipocaine concentration through activation of fat metabolism. Reduction, thereby preventing or treating obesity or non-alcoholic fatty liver.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used alone for the prevention and treatment of obesity or non-alcoholic fatty liver, or in combination with methods for preventing or treating obesity or non-alcoholic fatty liver known in the art.
  • the present invention provides a stem cell therapeutic agent for the treatment of obesity or non-alcoholic fatty liver, including mesenchymal stem cells derived from tissue surrounding teeth.
  • the tissue surrounding the tooth is not limited thereto, but may be a pulp tissue of an indwelling or permanent tooth, a periodontal ligament tissue, a dental sac tissue of an erupting tooth, a tooth stem tissue, a root papillary tissue of an immature permanent tooth, and preferably It may be the tissue around the wisdom teeth.
  • the term "cell therapy” refers to a drug used for treatment, diagnosis, and prevention of cells and tissues manufactured through isolation, culture and special manipulation from humans (US FDA regulations), and functions of cells or tissues It refers to a drug used for treatment, diagnosis, and prevention through a series of actions such as proliferating and selecting living autologous, allogeneic or heterogeneous cells in vitro to restore, or changing the biological properties of cells in other ways.
  • prevention means any action of inhibiting or delaying progression of obesity or non-alcoholic fatty liver by administration of the pharmaceutical composition or stem cell therapeutic agent according to the present invention.
  • treatment refers to any action in which obesity or non-alcoholic fatty liver is improved or beneficially altered by administration of the pharmaceutical composition or stem cell therapeutic agent according to the present invention.
  • the present invention provides a method for preventing or treating obesity or non-alcoholic fatty liver, comprising the step of treating an individual with mesenchymal stem cells derived from tissue surrounding teeth.
  • the present invention provides the use of mesenchymal stem cells derived from tissue surrounding teeth as a medicament for preventing or treating obesity or non-alcoholic fatty liver.
  • the present invention provides the use of mesenchymal stem cells derived from tissue surrounding teeth to produce a pharmaceutical preparation for the prevention or treatment of obesity or non-alcoholic fatty liver.
  • tissue around the teeth that are discarded after extraction from patients with impacted teeth around the age of 20 were provided and used by the Department of Oral and Maxillofacial Surgery at Gyeongsang National University Hospital, and the tooth tissue was separated from the extracted wisdom teeth using a sterilized scalpel and vitrified It was frozen, stored for at least 3 months, and then thawed.
  • the freezing tube stored in liquid nitrogen is thawed in water at 37°C for 1 to 2 minutes, and then 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.25 ⁇ g/ml amphotericin B ( amphotericin B, Invitrogen) was centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes and washed several times.
  • collagenase type IV (Sigma, USA) was enzymatically treated for 30 minutes.
  • the treated tissue was filtered once in a 100 ⁇ m cell strainer (BD FalconTM, USA) and a 40 ⁇ m cell strainer (BD FalconTM, USA), and then transferred to a 15ml conical tube (15ml polypropylene conical tube; BD FalconTM, USA), followed by penicillin. /Streptomycin, amphotericin B (amphotericin B, Gibco, USA) was washed twice by centrifuging for 5 minutes at 1500rpm using DPBS containing.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's Medium
  • FBS fetal bovine serum
  • L-glutamine GlutamaxTM and 1% penicillin/streptomycin
  • Mesenchymal stem cells derived from the tissues around the teeth were cultivated in 5% CO 2 , 37° C. and humidity conditions, and the medium was changed once every 3 days.
  • E. Cells were subcultured 4 to 5 times, removed from the bottom of the culture vessel with 0.25% trypsin/EDTA, and washed with DPBS, Count the separated cells using a hemocytometer, and count 1 ⁇ 10 6 cells. It was diluted in 200 ⁇ l of cold DPBS and used in subsequent experiments (hereinafter referred to as MSCs).
  • mice 40 8-week-old male C57BL/6J mice weighing 20-22 g were collected from Central Lab Animal Inc. (Seoul, Korea) was purchased and used. All mice were reared at a temperature of 25 ⁇ 2°C and a humidity of 30-40% by maintaining a 12-hour light-dark cycle, and free access to water and food was allowed. Mice were randomly divided into 4 groups:
  • mice All mice were weighed every week, and after 10 weeks, 0.5 ⁇ L/g tiletamine-zolazepam (Zoletil® and 0.5 ⁇ L/g xylazine (Rompun, Bayer Korea Ltd., Seoul, Korea) were injected and sacrificed. puncture) to collect blood from mice, perfusion with PBS containing heparin to remove residual blood Liver tissue was obtained and weight was measured for tissue weight/weight calculation All animal experiments were conducted in Gyeongsang National University's experimental animals. It was carried out according to the guidelines for treatment and use, and the results are shown in Fig. 1.
  • the body weight of the HDF group was significantly higher than that of the control group in the high fat diet from 3 weeks (p ⁇ 0.05).
  • the body weight of the MSCi group was significantly lower than that of the HFD group at the first administration of MSC (p ⁇ 0.05).
  • the liver weight of the HFD group was significantly increased compared to the control group (p ⁇ 0.05), and the MSCi group showed a significantly decreased liver weight compared to the HFD group (p ⁇ 0.05).
  • the MSCs group did not show a significant difference compared to the HFD group.
  • liver tissue was fixed in 4% formaldehyde, dehydrated, and cut into 5 ⁇ m-thick sections by placing it in paraffin. After removing the paraffin component from the tissue section using xylene, it was rehydrated with ethanol and stained with H&E (hematoxylin and eosin). All stained tissues were dehydrated and washed, and then mounted with permount (Fisher scientific, NH, USA), and the degree of staining was confirmed with an optical microscope (Nikon Eclipse 80i) and Photo Imaging System (Canon 600D). The results are shown in FIG. 2.
  • the control group showed the characteristics of normal liver tissue, whereas the HFD group had both macrovesicular steatosis and microvesicular steatosis, a serious symptom. It was confirmed that it was shown.
  • Microvesicular steatosis is a histological feature of NAFLD.
  • hepatic steatosis was improved by recovering to a level similar to that of the normal model after stem cell administration in liver tissues showing severe localization in both MSCs and MSCi groups, and in particular, it was confirmed that the MSCi group was significantly improved than the MSCs group.
  • liver tissue and androgen receptor which induces lipolysis through lipid oxidation in liver and adipose tissue.
  • AR expression level was analyzed.
  • Liver tissues of each experimental group were collected and stored at -80°C until use. Each tissue was lysed using RIPA buffer (PIERCE, Rockford, IL, USA), and the extracted protein was quantified using the BCA Protein Analysis Kit (PIERCE). 50 ⁇ g of protein was loaded on SDS-PAGE and transferred to a nitrocellulose membrane (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA).
  • the membrane was reacted with a primary monoclonal anti-androgen receptor (ab133273, Abcam) diluted 1:1000 and beta-actin (a5441, sigma) diluted 1:5000 overnight at 4°C. Thereafter, after washing three times with 0.1% TBST, HRP-conjugated goat anti-mouse (Invitrogen) and goat anti-rabbit (Invitrogen) secondary antibodies diluted to 1:10000 were added to react at room temperature for 1 hour. .
  • the membrane was developed using the ECL kit (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA), and the optical density of the target protein for beta-actin was measured using ImageJ software (NIH, USA). The results are shown in FIG. 3.
  • the concentration of AR in the liver significantly decreased (p ⁇ 0.05), but it was confirmed that it increased significantly after MSC administration.
  • lipid metabolism including lipid oxidation was increased in liver tissue through AR recovery.
  • both serum adipokines TNF- ⁇ and IL-1 ⁇ significantly increased in the HFD group (p ⁇ 0.05), but decreased after MSC administration.
  • the high fat diet animal model has the most similar pathological characteristics to human NAFLD, and has been reported to show similar physiological changes such as weight gain, blood sugar increase and metabolic disease increase.
  • the present inventors prepared an animal model induced by a high-fat diet, and weight loss after administration of mesenchymal stem cells derived from tooth surrounding tissues to the animal model, and normalization of blood adipocaine levels. , It was confirmed that obesity and NAFLD can be improved through the improvement of lipid metabolism enzymes in the liver.
  • mesenchymal stem cells derived from tissues around the teeth which are the active ingredients of the present invention, can obtain cells by the most non-invasive method, so the present invention is expected to be usefully used as a cell therapy for obesity or non-alcoholic fatty liver.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 초자화 동결보존된 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 비만 또는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 비만 또는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 체중 감소, 혈청 아디포카인 농도 감소, 간의 조직학적 소견 회복 및 간 내 지질대사효소를 개선시켜 비만 또는 비알코올성 지방간에 대한 현저한 예방 및 치료 효과를 나타낸다. 또한, 본 발명의 유효성분인 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포는 안전성이 검증된 중배엽성 줄기세포이면서, 가장 비침습적인 방법으로 세포를 얻을 수 있어, 비만 또는 비알코올성 지방간에 대한 세포 치료제로서 유용하게 사용될 것으로 기대된다.

Description

치아 주변조직 유래 다분화능 줄기세포를 포함하는 비만 또는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 발명은 초자화 동결보존된 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 비만 또는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
비만 (Obesity)은 체내에 과잉상태인 에너지가 지방으로 축적되어 체지방이 비정상적으로 많아 대사이상이 유발되어 나타나는 현상으로, 그 원인은 신경내분비적 원인, 약물원인, 활동량 감소, 유전적 질환으로 추정된다. 비만은 당뇨병, 심장병, 고혈압, 뇌졸중 등 합병증을 일으키는 원인으로 인식되는 만성 질환으로, 주로 식욕억제제와 지방흡수 억제제를 통한 치료가 이루어진다. 한편, 이러한 비만 약물 요법 시행 시에는 비만 약물의 부작용 측면에서 의존성 발생, 심혈관 질환의 위험 및 기분장애의 발생 우려를 염두에 두어야 한다. 예를 들어, 식욕억제제인 시부트라민 (sibutramine)의 경우 국내 비만치료제 시장에서 대표적인 치료제였으나 심혈관 질환의 위험을 높일 가능성이 있어 판매 중단된 상태이다. 따라서, 부작용이 적으면서도 비만을 유발하는 병태생리의 단계를 효과적으로 조절할 수 있는 치료제의 개발이 절실히 필요하다.
비알코올성 지방간 질환 (non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)은 만성 간 질환 중에서 가장 흔한 질환으로, 제2형 당뇨병, 비만 및 대사증후군과 밀접한 관계가 있다고 알려져 있다. 서구화된 식습관 및 비만, 당뇨병 인구의 증가로 우리나라에서도 비알코올성 지방간 질환 환자가 급격하게 증가하고 있으며, 글로벌데이터 (GlobalData) 사에 따르면 비알코올성 지방간 치료제 시장은 오는 2026년까지 약 253억달러 규모에 이를 것으로 전망된다. 이는 연평균 45%씩 성장하는 수치이다. 그러나, 비알코올성 지방간 질환은 정확한 병리기전이 규명되지 않았고, 현재까지 보고된 약물 치료의 효과도 연구 대상수가 충분하지 않으며, 아직까지 공식적인 승인치료제도 없는 실정이다. 따라서, 장기간 사용시에도 안정성이 확보되며, NAFLD에 대한 뚜렷한 치료 효과를 발휘할 수 있는 새로운 치료법이 필요하다.
한편, 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포 (dental tissue-derived mesenchymal stem cells)는 중간엽 줄기세포의 한 종류로, 최근의 연구에 의하면 중간엽 줄기세포는 중배엽뿐 아니라 외배엽 (주로 신경세포) 혹은 내배엽 (간세포, 췌장세포 등)으로도 분화할 수 있음이 밝혀져 다분화능 (Multipotency)을 가지는 것으로 인정되고 있다.
이에, 본 발명자들은 비만 또는 비알코올성 지방간의 새로운 치료제를 개발하고자 노력한 결과, 초자화 동결보존된 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포를 고지방식이 동물모델에 투여 후 체중 감소, 혈청 아디포카인 농도 감소 및 간의 조직학적 소견이 회복되어 비만 또는 비알코올성 지방간 개선에 효과적임을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 비만 또는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 비만 또는 비알코올성 지방간 치료용 줄기세포 치료제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 비만 또는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 비만 또는 비알코올성 지방간 치료용 줄기세포 치료제를 제공한다.
또한, 본 발명은 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포를 개체에 처리하는 단계를 포함하는, 비만 또는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포의 비만 또는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 의약으로써의 사용을 제공한다.
또한, 본 발명은 비만 또는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 의약제제를 생산하기 위한, 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포의 사용을 제공한다.
본 발명의 비만 또는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 체중 감소, 혈청 아디포카인 농도 감소, 간의 조직학적 소견 회복 및 간 내 지질대사효소를 개선시켜 비만 또는 비알코올성 지방간에 대한 현저한 예방 및 치료 효과를 나타낸다. 또한, 본 발명의 유효성분인 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포는 안전성이 검증된 중배엽성 줄기세포이면서, 가장 비침습적인 방법으로 세포를 얻을 수 있어, 비만 또는 비알코올성 지방간에 대한 세포 치료제로서 유용하게 사용될 것으로 기대된다.
도 1은 대조군과 고지방식이로 비만 및 NAFLD가 유도된 각 실험군 마우스의 체중 (A), 간 조직 (B)의 무게를 측정한 결과를 나타낸 것이다 (*p<0.05, 대조군과 비교; #p<0.05, HFD 그룹과 비교).
도 2는 대조군과 각 실험군 마우스 간 조직의 조직학적 분석 결과를 나타낸 것으로, 각 행에 해당하는 H&E 염색 결과는 각각 서로 다른 마우스의 조직학적 소견을 나타낸다 (scale bar = 50 μm, Magnification = x 400).
도 3은 간 조직에 대한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸 것으로, 간 조직에서의 안드로겐 수용체 (androgen receptor, AR) 발현 정도를 확인한 결과 (A) 및 상기 발현량을 정량화한 결과 (B)에 해당한다 (*p<0.05, 대조군과 비교; #p<0.05, HFD 그룹과 비교).
도 4는 비만 지표인 혈청 아디포카인 (adipokine)의 수준에 대한 ELISA 분석 결과를 나타낸 도이다 (*p<0.05, 대조군과 비교; #p<0.05, HFD 그룹과 비교).
본 발명은 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 비만 또는 비알코올성 지방간 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
본 발명에서 용어, “줄기세포 (stem cells)”란 조직을 구성하는 각 세포로 분화 (differentiation) 되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭하는 것으로, 특정 분화 자극 (환경)에 의해 특정 세포로 분화가 진행되는 세포를 의미한다.
본 발명에서 용어, “중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cells, MSCs)”는 중간엽 줄기세포 혹은 성체 줄기세포라고도 하며 배아 이외의 조직에서 분리 및 배양된 줄기세포를 통칭하는 것이다. 간엽줄기세포는 이미 분화가 완료된 대부분의 조직에 소량으로 존재하는 것으로 현재까지 제대혈, 탯줄, 치아, 눈, 태반, 모낭, 허파, 간 등 연구된 거의 모든 조직에서 이의 존재가 확인된 바 있다.
본 발명에서 용어, “치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포 (dental-tissue derived mesenchymal stem cells)”는 치아 및 치아 주변조직에서 유래한 성체 줄기세포, 중간엽 줄기세포와 형태가 유사한 세포 (mesenchymal stem cell-like cells)를 모두 포함하는 개념이며, 골수나 탯줄 등에 존재하는 다른 성체줄기세포에 비하여 조직의 손상을 최소화하고 (비침습적) 쉽게 얻을 수 있는 장점이 있어 본 발명의 유효성분으로 사용하였다. 상기 치아 주변조직은 이에 제한되지는 않으나 유치 또는 영구치의 치수조직, 치주인대조직, 맹출 중인 치아의 치낭조직, 치배줄기조직, 미성숙 영구치의 치근 유두조직일 수 있으며, 바람직하게는 사랑니 (wisdom teeth) 주변 조직일 수 있다.
또한, 상기 조직은 중간엽 줄기세포를 포함하고 있는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 중간엽 줄기세포는 치아 치수 줄기세포 (dental pulp stem cells, DPSCs), 탈락 유치 줄기세포 (stem cells from human exfoliated deciduous teeth, SHEDs), 치주인대 줄기세포 (periodontal ligament stem cells, PDLSCs), 치배줄기 세포 (dental follicle stem cells, DFSCs) 및 치근단유두 줄기세포 (stem cells from apical papilla, SCAP)로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 이와 같은 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포는 임플란트 주위염, 신경손상, 잇몸뼈 소실 등을 치료 또는 개선하기 위해 재생의학적으로 임상에 적용된 바는 있으나, 현재까지 비만 또는 비알코올성 간질환에 대한 의학적 효과에 대해서는 보고된 바가 없다.
본 발명에 있어서, 상기 치아 주변조직은 인체로부터 분리되어 초자화 동결보존된 것을 특징으로 하며, 상기 초자화 동결보존 방법은 본 발명자들의 선행특허인 한국 등록특허 10-1551900에 기술된 방법을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 중간엽 줄기세포의 분리방법은 당업계에 공지되어 있는방법을 제한 없이 사용할 수 있으며, 예컨대 치아 주변조직으로부터 분리되고 정제될 수 있고, 분리된 중간엽 줄기세포는 필요에 따라 배양할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 비만은 대한비만학회에서 제시한 비만기준인 체지방지수 25 kg/m 2 이상임을 의미하며 이로 인해 수반된 동맥경화, 제 2형당뇨, 심근경색을 포함한 각종 대사증후군 및 심혈관질환을 의미하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 비알코올성 지방간 질환 (non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)은 알코올에 기인하지 않은 간 세포 내의 지방 함량이 간 무게의 5% 이상인 경우로서, 간 조직 내에 지방 (트리글리세리드, 지방산 등)의 단순 축적이 일어난 상태, 간 지방증(hepatic steatosis) 상태, 간 조직 내의 지방 축적이 심해진 결과 간 조직 내에 염증반응이 일어난 질병 상태를 의미하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, “치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 비만 또는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학적 조성물”은 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포 자체일 수도 있으며, 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포 이외에 배양액, 줄기세포 배양 시 당업계에서 일반적으로 사용되는 물질을 포함하는 조성물을 포함하는 것이다. 또한, 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포가 분비하는 물질 또는 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포로부터 추출한 물질을 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포를 대체하여 사용하는 것도 포함하는 의미이다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포 이외에 약학적으로 허용 가능한 통상의 담체를 포함할 수 있고, 주사제의 경우 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제, 국소투여용 제제의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태일 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있고, 정맥 내, 피하, 복강 내 투여 또는 국소 적용이 가능하며, 본 발명에 따른 조성물의 비경구 투여용 조성물 (예, 주사제)은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 예를 들어, 멸균 정제수, 약 pH 7의 완충액, 또는 생리식염수 중에 분산 및/또는 용해시켜 생체 내에 주입될 수 있으며, 필요할 경우, 보존제, 안정화제 등과 같은 통상의 첨가제를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 중간엽 줄기세포의 양은 10 4 내지 10 10 cells/회로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 10 5 내지 10 9 cells/회로 투여될 수 있으며, 보다 바람직하게는 10 6 내지 10 8 cells/회, 가장 바람직하게는 5 x 10 7 내지 10 8 cells/회로 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 용량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 병적상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 체중 감소, 혈중 아디포카인 농도 감소 및 간의 조직학적 회복을 유도하여 고지방식 섭취 또는 대사 증후군에 의하여 발생한 비만 또는 이에 따른 비알코올성 지방간을 개선시킬 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에서는, 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포를 투여하는 경우 고지방식이 동물모델의 체중이 감소하고, 간조직의 지방침착 소견이 현저히 개선되며, 혈청 아디포카인인 TNF-α와 IL-1β가 감소하여, 비만 및 비알코올성 지방간을 개선시킬 수 있음을 확인하였다. 한편, 상기 혈청 아디포카인은 비만 상태에서 활성화된 지방 세포 (adipocytes)로부터 분비되며, TNF-α와 IL-1β를 비롯한 전염증성 사이토카인 (proinflammatory cytokines)으로 이루어져 있다. 비알코올성 지방간의 경우 간에서 국소적으로 비만과 유사한 병리학적 증상을 나타낸다고 보고되어 있는바, 상기 결과를 통해 본 발명에 따른 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포는 지방대사 활성화를 통해 아디포카인 농도를 감소시키고, 이를 통해 비만 또는 비알코올성 지방간을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 비만 또는 비알코올성 지방간 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 당업계에 공지된 비만 또는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 비만 또는 비알코올성 지방간 치료용 줄기세포 치료제를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 치아 주변조직은 이에 제한되지는 않으나 유치 또는 영구치의 치수조직, 치주인대조직, 맹출 중인 치아의 치낭조직, 치배줄기조직, 미성숙 영구치의 치근 유두조직일 수 있으며, 바람직하게는 사랑니 (wisdom teeth) 주변 조직일 수 있다.
본 발명에서 용어, "세포 치료제"는 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품 (미국 FDA규정)이며, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아 있는 자가, 동종 또는 이종 세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 말한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명에 따른 약학적 조성물 또는줄기세포 치료제의 투여로 비만 또는 비알코올성 지방간을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명에 따른 약학적 조성물 또는줄기세포 치료제의 투여로 비만 또는 비알코올성 지방간이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
또한, 본 발명은 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포를 개체에 처리하는 단계를 포함하는, 비만 또는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포의 비만 또는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 의약으로써의 사용을 제공한다.
또한, 본 발명은 비만 또는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 의약제제를 생산하기 위한, 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포의 사용을 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 통계 분석은 SPSS (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 one-way ANOVA followed by Tukey's test에 따라 이루어졌다. 결과는 평균 ± 표준 오차로 나타내었다. P<0.05인 경우 유의적인 것으로 판단하였다.
실시예 1. 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포의 준비
모든 화학물질은 SigmaAldrich®(St. Louis, MO, USA)에서 구매하였고, 배지는 Gibco Life Technologies (Gaithersburg, MD, USA)에서 구매하여 사용하였다. 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포를 수득하기 위하여 본 발명자들은 새로운 동결 프로토콜을 확립하였으며, 이를 초자화 동결보존방법으로 명명하였다. 상기 방법은 에틸렌 글라이콜 (Ethylene glycol), 수크로오스 (Sucrose) 및 글루코오스를 함유하는 조직의 초자화 동결보존용 조성물을 이용하여 조직 내의 세포를 효과적으로 보존하기 위한 것으로서, 본 발명자들의 선행특허인 한국 등록특허 10-1551900에 기술되어 있고 이는 그 전체로 본원에 참고로 인용된다.
보다 구체적으로, 20세 전후의 매복지치 환자에게서 발치된 후 폐기되는 치아 주변 조직을 경상대학교병원 구강악안면외과에서 제공받아 이용하였고, 멸균된 메스를 사용하여 추출된 사랑니에서 치아 조직을 분리하고 초자화 동결시켜 최소 3개월간 보관한 후 해동하였다. 조직 해동시 액체질소에 보관된 동결용 튜브를 37℃의 물에서 1~2분간 해동한 후, 동결 보존제를 완전히 제거하기 위하여 100 U/㎖ 페니실린/스트렙토마이신, 0.25 ㎍/㎖ 암포테리신 B (amphotericin B, Invitrogen)가 함유된 DPBS를 이용하여 1500rpm에 5분간 원심분리하여 수차례 세척하였다. 상기 치아 주변조직에서 중간엽줄기세포 (mesenchymal stem cell)을 분리하기 위하여 collagenase type IV (Sigma, USA)를 30분간 효소처리 하였다. 처리된 조직을 100 μm cell strainer (BD FalconTM, USA), 40 μm cell strainer (BD FalconTM, USA)에 각각 한차례 거른 후, 15ml 코니컬 튜브 (15ml polypropylene conical tube; BD FalconTM, USA)에 옮긴 다음 페니실린/스트렙토마이신, 암포테리신B (amphotericin B, Gibco, USA)가 함유된 DPBS를 이용하여 1500rpm에서 5분간 원심분리하여 두 차례 세척하였다.
10% FBS (fetal bovine serum), 1% L-글루타민 (Glutamax™ 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 4mL DMEM (Dulbecco's modified Eagle's Medium)을 사용하여 25 T-플라스크 (NuncTM, Roskilde, Denmark) 내에서 5% CO 2, 37℃와 습한 (humidity) 조건으로 상기 초자화 동결보존된 치아 주변조직에서 유래된 중간엽 줄기세포를 배양하였다. 배지는 3일에 한번씩 교체하였다. 동물에 투여하기 바로 직전에, 계대배양 4~5회의 세포를 0.25% 트립신/EDTA로 배양용기 바닥에서 떼어낸 후 DPBS로 세척하였다. 혈구계수기 (hemocytometer)를 사용하여 분리한 세포들을 계수하고, 세포 1×10 6 개를 차가운 DPBS 200 μl에 희석하여 이후 실험에 사용하였다 (이하, MSCs라 한다).
실시예 2. 고지방식 섭취를 통한 동물모델 제조
20-22g의 8주령 수컷 C57BL/6J 마우스 40마리를 Central Lab Animal Inc. (Seoul, Korea)로부터 구매하여 사용하였다. 모든 마우스는 12시간의 명암주기를 유지하여 방 온도는 25±2℃, 습도 30-40%로 사육하였고 물과 음식에 대해 자유롭게 접근 가능하게 하였다. 마우스들은 무작위로 하기 4 그룹으로 나누었다:
1. 대조군 (Con) (n=10): 10주간 정상식이
2. HFD 그룹 (n=10): 10주간 60 kcal%의 지방을 포함하는 고지방식이 + 10주 후 200 μl PBS 복강내 투여
3. MSCi 그룹 (n=10): 10주간 60 kcal%의 지방을 포함하는 고지방식이 + 고지방식이 5주, 7주 및 9주 후 1×10 6/200 μl MSCs를 각각 복강내 투여
4. MSCs 그룹 (n=10): 10주간 60 kcal%의 지방을 포함하는 고지방식이 + 고지방식이 8주 후 1×10 6/200 μl MSCs를 5일 연속 복강내 투여.
매주 모든 마우스들의 체중을 측정하고, 10주 후 0.5 μL/g tiletamine-zolazepam (Zoletil®및 0.5 μL/g xylazine (Rompun, Bayer Korea Ltd., Seoul, Korea)를 주입하여 희생시켰다. 심장 천자 (cardiac puncture)하여 마우스의 혈액을 수집하고, 헤파린이 포함된 PBS로 관류하여 잔류 혈액을 제거하였다. 간 조직을 수득하고 조직 무게/체중 계산을 위해 무게를 측정하였다. 모든 동물 실험은 경상대학교의 실험동물 처치와 사용에 관한 가이드라인을 따라 수행하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1의 A에 나타낸 바와 같이, HDF 그룹의 체중은 고지방식이 3주부터 대조군보다 유의하게 더 높았다 (p<0.05). MSCi 그룹의 체중은 MSC의 첫번째 투여시 HFD 그룹과 비교하여 체중이 현저히 낮았다 (p<0.05). 간 중량의 경우, 도 1의 B에 나타낸 바와 같이, HFD 그룹의 간 중량은 대조군에 비해 현저히 증가하였고 (p<0.05), MSCi 그룹은 HFD 그룹에 비해 현저히 감소한 간 중량을 나타냈으며 (p<0.05), 반면 MSCs 그룹은 HFD 그룹과 비교하여 유의한 차이를 보이지 않았다.
실시예 3. MSC 투여 전후의 조직학적 분석
간에 대한 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포의 치료적 효과를 확인하기 위하여, 조직학적 분석을 수행하였다. 간 조직을 4% 포름알데하이드에 고정시키고 탈수시킨 다음 파라핀에 끼워 5 μm 두께의 절편으로 절단하였다. 자일렌 (xylene)을 사용하여 조직 절편에서 파라핀 성분을 제거한 후, 에탄올로 재수화 (rehydration)한 뒤 H&E (hematoxylin and eosin)으로 염색하였다. 염색된 모든 조직은 탈수, 세척과정을 거쳐 permount (Fisher scientific, NH, USA)로 마운팅한 뒤 광학현미경 (Nikon Eclipse 80i) 및 Photo Imaging System (Canon 600D)으로 염색 정도를 확인하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 간조직의 조직학적 분석 결과 대조군은 정상 간조직의 특성을 나타낸 반면, HFD 그룹은 거대수포성 지방증 (macrovesicular steatosis) 및 심각한 증상인 미세소포형 지방증 (microvesicular steatosis)을 모두 나타냄을 확인하였다. 미세소포형 지방증은 NAFLD의 조직학적 특징에 해당한다. 한편, MSCs 및 MSCi 그룹 모두에서 심각한 지방침착소견을 보이던 간조직이 줄기세포 투여 후 정상모델과 유사한 수준으로 회복되어 간지방증이 개선됨을 확인하였으며, 특히 MSCi 그룹이 MSCs 그룹보다 현저히 개선됨을 확인하였다.
실시예 4. MSC 투여에 따른 지질 항상성 평가
4-1. 웨스턴 블랏
지질 항상성 (lipid homeostasis)에 대한 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포 투여의 효과를 확인하기 위하여 간 조직에 대하여 웨스턴 블랏을 실시하고 간과 지방 조직에서 지질 산화를 통해 지방 분해를 유도하는 안드로겐 수용체 (androgen receptor, AR)의 발현 정도를 분석하였다. 각 실험군의 간 조직을 수집하고 사용 전까지 -80℃에 보존하였다. 각 조직을 RIPA 완충액 (PIERCE, Rockford, IL, USA)을 이용하여 용균 (lysed)시켜 추출된 단백질을 BCA 단백질 분석 키트 (PIERCE)를 이용하여 정량하였다. 단백질 50 ㎍을 SDS-PAGE에 로딩하고 니트로셀룰로오스 막 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)으로 이동시켰다. 상기 막을 1:1000으로 희석된 1차 모노클로날 항-안드로겐 수용체 (ab133273, Abcam), 1:5000으로 희석된 베타-액틴 (a5441, sigma)으로 4℃에서 밤새도록 반응시켰다. 이후, 0.1% TBST로 3번 세척한 후, 1:10000으로 희석된 HRP-결합된 염소 항-마우스 (Invitrogen), 염소 항-래빗 (Invitrogen) 2차 항체를 첨가하여 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 막은 ECL kit (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)를 사용하여 현상하였고, ImageJ software (NIH, USA)를 사용하여 베타-액틴에 대한 타겟 단백질의 광학 밀도 (optical density)를 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 간에서 AR의 농도는 유의하게 감소하였으나 (p<0.05), MSC 투여 후 유의하게 증가함을 확인하였다. 상기 결과를 통해 지질 산화를 포함하는 지질 대사는 AR 회복을 통해 간 조직에서 증가함을 확인하였다.
4-2. ELISA
체중 감소 및 AR 발현 회복 간의 관련성을 확인하기 위하여 비만 지표인 혈청 아디포카인 (adipokine)의 수준을 ELISA 방법으로 측정하였다. 실시예 2에 기재한 방법으로 심장 천자 (cardiac puncture)하여 마우스의 혈액을 수집하고, 400 x G에서 10분간 원심분리하여 혈청을 수집하고 사용 전까지 -80℃에 보존하였다. 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포가 고지방식이에 의해 유도된 비만 및 비알코올성 지방간을 개선할 수 있는지 확인하기 위하여 ELISA를 통해 마우스 혈청에 있는 TNF-α (ADI-900-047, ENZO), IL-1β을 분석하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 혈청 아디포카인인 TNF-α와 IL-1β 모두 HFD 그룹에서 유의하게 증가하였으나 (p<0.05) MSC 투여 후 감소함을 확인하였다. 상기 결과를 통해, 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포의 투여가 비만에서 염증 상태를 감소시키고, 그에 따라 비만을 개선시킬 수 있음을 확인하였다.
NAFLD를 유도시키는 다양한 동물 모델 중에서, 고지방식이 동물 모델은 인간 NAFLD와 가장 유사한 병리학적 특징을 가지며, 체중 증가, 혈당 증가 및 대사성 질병 증가와 같은 유사한 생리적 변화를 나타내는 것으로 보고되어 있다.
본 발명자들은 비만 및 NAFLD의 새로운 치료제를 개발하기 위하여 고지방식이로 유도한 동물 모델을 제조하고, 상기 동물 모델에 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포의 투여 후 체중 감소, 혈중 아디포카인 수준의 정상화, 간 내 지질대사효소의 개선을 통해 비만 및 NAFLD가 개선될 수 있음을 확인하였다.
뿐만 아니라, 본 발명의 유효성분인 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포는 가장 비침습적인 방법으로 세포를 얻을 수 있어, 본 발명은 비만 또는 비알코올성 지방간에 대한 세포 치료제로서 유용하게 사용될 것으로 기대된다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (9)

  1. 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 비만 또는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 치아 주변조직은 유치 또는 영구치의 치수조직, 치주인대조직, 치낭조직, 치배줄기조직 및 치근 유두조직으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 비만 또는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 치아 주변조직은 사랑니 (wisdom teeth) 주변조직인 것을 특징으로 하는, 비만 또는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 치아 주변조직은 초자화 동결보존된 것을 특징으로 하는, 비만 또는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 비만 또는 비알코올성 지방간 치료용 줄기세포 치료제.
  6. 제5항에 있어서, 상기 치아 주변조직은 유치 또는 영구치의 치수조직, 치주인대조직, 치낭조직, 치배줄기조직 및 치근 유두조직으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 비만 또는 비알코올성 지방간 치료용 줄기세포 치료제.
  7. 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포를 개체에 처리하는 단계를 포함하는, 비만 또는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료 방법.
  8. 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포의 비만 또는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 의약으로써의 사용.
  9. 비만 또는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 의약제제를 생산하기 위한, 치아 주변조직 유래 중간엽 줄기세포의 사용.
PCT/KR2020/012045 2019-09-06 2020-09-07 치아 주변조직 유래 다분화능 줄기세포를 포함하는 비만 또는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 WO2021045595A1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022515589A JP2022546856A (ja) 2019-09-06 2020-09-07 歯周組織由来の多分化能幹細胞を含む肥満または非アルコール性脂肪肝の予防または治療用薬学的組成物
US17/640,725 US20220339196A1 (en) 2019-09-06 2020-09-07 Pharmaceutical composition for preventing or treating obesity or non-alcoholic fatty liver, containing dental tissue-derived multipotent stem cells

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190110968A KR20210029569A (ko) 2019-09-06 2019-09-06 치아 주변조직 유래 다분화능 줄기세포를 포함하는 비만 또는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR10-2019-0110968 2019-09-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021045595A1 true WO2021045595A1 (ko) 2021-03-11

Family

ID=74853390

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2020/012045 WO2021045595A1 (ko) 2019-09-06 2020-09-07 치아 주변조직 유래 다분화능 줄기세포를 포함하는 비만 또는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20220339196A1 (ko)
JP (1) JP2022546856A (ko)
KR (2) KR20210029569A (ko)
WO (1) WO2021045595A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113577105A (zh) * 2021-09-08 2021-11-02 南通大学 尿源干细胞在制备非酒精性脂肪肝治疗、减肥和降脂的生物制剂、药物中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160054336A (ko) * 2014-11-06 2016-05-16 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 치수줄기세포를 포함하는 신경질환 치료용 약학 조성물 및 이의 제조방법
JP2016517405A (ja) * 2013-03-15 2016-06-16 アヴィタ・インターナショナル・リミテッド 多機能未成熟歯髄幹細胞および療法適用
WO2018116732A1 (ja) * 2016-12-22 2018-06-28 ロート製薬株式会社 非アルコール性脂肪肝炎治療剤及び非アルコール性脂肪肝炎治療用キット

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101551900B1 (ko) 2013-12-13 2015-09-09 경상대학교산학협력단 치아 주변 조직의 초자화 동결보존용 조성물 및 이를 이용하는 초자화 동결보존방법
JP6894674B2 (ja) * 2016-06-13 2021-06-30 学校法人 日本歯科大学 肝臓組織再生用組成物

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016517405A (ja) * 2013-03-15 2016-06-16 アヴィタ・インターナショナル・リミテッド 多機能未成熟歯髄幹細胞および療法適用
KR20160054336A (ko) * 2014-11-06 2016-05-16 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 치수줄기세포를 포함하는 신경질환 치료용 약학 조성물 및 이의 제조방법
WO2018116732A1 (ja) * 2016-12-22 2018-06-28 ロート製薬株式会社 非アルコール性脂肪肝炎治療剤及び非アルコール性脂肪肝炎治療用キット

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIAO NAISHUN, PAN FAN, WANG YINGCHAO, ZHENG YOUSHI, XU BO, CHEN WENWEI, GAO YUNZHEN, CAI ZHIXIONG, LIU XIAOLONG, LIU JINGFENG: "Adipose tissue-derived stem cells promote the reversion of non-alcoholic fatty liver disease: An in vivo study", INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR MEDICINE, SPANDIDOS PUBLICATIONS, GR, vol. 37, no. 5, 1 May 2016 (2016-05-01), GR, pages 1389 - 1396, XP055788959, ISSN: 1107-3756, DOI: 10.3892/ijmm.2016.2528 *
MATSUSHITA KENICHI, DZAU VICTOR J: "Mesenchymal stem cells in obesity: insights for translational applications", LABORATORY INVESTIGATION, NATURE PUBLISHING GROUP, THE UNITED STATES AND CANADIAN ACADEMY OF PATHOLOGY, INC., vol. 97, no. 10, 1 October 2017 (2017-10-01), The United States and Canadian Academy of Pathology, Inc., pages 1158 - 1166, XP055788961, ISSN: 0023-6837, DOI: 10.1038/labinvest.2017.42 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20210148958A (ko) 2021-12-08
US20220339196A1 (en) 2022-10-27
JP2022546856A (ja) 2022-11-09
KR20210029569A (ko) 2021-03-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5712207B2 (ja) 脳疾患及び状態の予防及び治療のための組成物及び方法
JP5340941B2 (ja) 血液、特に末梢血から成体幹細胞を増殖させるための方法及び医療分野におけるその利用
Young et al. Alzheimer’s disease treated with autologous and allogeneic telomerase-positive stem cells
US11040072B2 (en) Composition for inducing beige adipocyte differentiation containing exosome derived from stem cells
WO2018004143A1 (ko) 성체줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클을 포함하는 혈관 신생 촉진용 조성물
WO2021045595A1 (ko) 치아 주변조직 유래 다분화능 줄기세포를 포함하는 비만 또는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR102330083B1 (ko) 포유류 탯줄 유래 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 근위축증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
US11154564B2 (en) Composition for cough
WO2016190785A1 (ru) Бисамидное производное дикарбоновой кислоты в качестве средства, стимулирующего регенерацию тканей и восстановление сниженных функций тканей
WO2015160181A1 (ko) 황칠 추출물을 포함하는 혈관 평활근세포 이상 증식 및 이동성 질환 또는 혈관 내막증식 질환의 예방 또는 치료용 조성물
KR102600585B1 (ko) 홍삼을 유효성분으로 하는 만성폐쇄성폐질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물
KR20200022789A (ko) 디옥시콜산 (Deoxycholic acid) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 근력약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2021249402A1 (zh) 无细胞脂肪提取液对巨噬细胞极化调节与疾病治疗的作用
WO2020226451A1 (ko) 치아 주변조직 유래 다분화능 줄기세포를 포함하는 남성 불임 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2020022541A1 (ko) 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 급성 간부전의 예방 또는 치료용 조성물
WO2014182050A1 (ko) Amd3100을 포함하는 골질환 예방 또는 치료용 조성물
KR101091117B1 (ko) 골수유래 중간엽 줄기세포의 면역조절기전을 통한 치매증상 개선의 새로운 세포치료제
US20200353007A1 (en) Pharmacological Composition for Prevention or Treatment of Lupus, Comprising Mesenchymal Stem Cell-Derived Secretome
KR20140042759A (ko) 아세카이니드 또는 이의 유도체를 포함하는 근력약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR102600598B1 (ko) 홍삼을 유효성분으로 하는 미세먼지로 인한 만성폐쇄성폐질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물
WO2024005563A1 (ko) 편도유래줄기세포를 유효성분으로 포함하는 감염성 폐 질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2023182609A1 (ko) 지방 조직 유래 중간엽 줄기세포 및 인간 기질 혈관 분획을 포함하는 혈관신생 촉진용 조성물
WO2017069376A1 (ko) ＩＫＫε 억제제를 함유하는 염증질환의 치료용 조성물
CN116925186B (zh) 一种新生儿肺发育不良的间充质干细胞治疗方法
US20240058428A1 (en) Composition for treating or preventing myopathy, obesity or diabetes

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20861609

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022515589

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 20861609

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1