JP2004529916A - パーキンソン病の治療において神経栄養活性化合物と組み合わせたアデノシンａ２ａレセプターアンタゴニスト - Google Patents
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Abstract
本発明は、パーキンソン病の治療に神経栄養活性を有する化合物とアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニストの組み合わせ作用を使用する方法に関する。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パーキンソン病の治療に神経栄養活性を有する化合物とアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニストの組み合わせ作用を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病は世界中で約４００万人が患う運動能力の進行性悪化によって特徴づけられる神経変性疾患である。パーキンソン病患者は動作を開始するのが更に困難になり、腕及び肢の硬直並びに震えが増すことに悩まされている。パーキンソン病の特定の原因は知られていないが、この疾患は動作の連携に係わっていると信じられている黒質として知られている脳の領域で特定のドパミン含有ニューロンが変性することに関係があると示されてきた。
【０００３】
治療法の１つとして単独で又はたとえばドパミンアゴニストとの組み合わせるＬ−ＤＯＰＡ治療がある。しかし、Ｌ−ＤＯＰＡ治療後３〜５年で、不本意の運動障害（ジスキネジー）が現れる。
【０００４】
別の治療法はモノアミン再取り込み阻害剤（たとえばドパミン再取り込み阻害剤）の使用であり、それによってシナプス間隙で存在するドパミンレベルは増加する。
【０００５】
他の可能な治療は、病変した及び損傷したニューロンに神経保護及び（又は）神経変性作用を与える神経栄養化合物を使用することである。
【０００６】
提案されたまた別の治療は、増加したドパミン作動性活性をもたらすアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニストの使用である。さらに、アデノシンＡ2Aレセプター及びその神経保護への関連は議論されてきた（Ongini, E.等(1977) Adenosine A2Areceptors and neuroprotection, Ann NY Acad Sci 825:30-48)。
【０００７】
パーキンソン病の患者の治療により少ない副作用でより選択的かつ有効な治療の開発に対して強い興味が相変わらずある。
【０００８】
発明の要旨
本発明者は、本発明によれば神経栄養活性を有する化合物をアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニストと組み合わせた作用がパーキンソン病の治療に有利に使用することができることを見出した。
【０００９】
したがって、その第一の観点で、本発明は神経栄養活性を有する化合物少なくとも１個とアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニスト少なくとも１個の治療上有効な量を薬学的に許容し得るキャリヤー又は希釈剤少なくとも１個と共に含有する薬学的調合物に関する。
【００１０】
もう一つの観点で、本発明はパーキンソン病患者の治療、予防又は軽減に使用される薬剤を製造するために神経栄養活性を有する化合物少なくとも１個とアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニスト少なくとも１個を使用する方法に関する。
【００１１】
その原理は迅速な開始作用（アデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニストの作用）と長期間の有効な主作用（神経栄養活性）との組み合わせである。したがってアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニストは疾患の症状を軽減し（ドパミン作動性活性を増加させることによって）、一方神経栄養活性が疾患の原因（ニューロンを変性する）を、疾患の進行の遅延によってか又は逆行によって処置する。
【００１２】
本発明の他の目的は下記の詳細な説明及び実施例から当業者に明らかである。
【００１３】
発明の詳細な説明
第一の観点で、本発明はパーキンソン病患者の治療、予防又は軽減に使用される薬剤を製造するために神経栄養活性を有する化合物少なくとも１個とアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニスト少なくとも１個を使用する方法を提供する。
【００１４】
第二の観点で、本発明は神経栄養活性を有する化合物少なくとも１個とアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニスト少なくとも１個の治療上有効な量を薬学的に許容し得るキャリヤー又は希釈剤少なくとも１個と共に含有する薬学的調合物を提供する。
【００１５】
第三の観点で、本発明は治療用剤として使用される、神経栄養活性を有する化合物少なくとも１個とアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニスト少なくとも１個の組み合わせ物を提供する。
【００１６】
別の観点で、本発明はパーキンソン病患者の治療、予防又は軽減方法において、この方法が神経栄養活性を有する化合物少なくとも１個とアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニスト少なくとも１個の治療上有効な組み合わせ物を上記患者に投与することを特徴とする、上記方法を提供する。
【００１７】
また別の観点で、本発明は神経栄養活性を有する化合物少なくとも１個とアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニスト少なくとも１個から成るパーツを含むキットを提供する。
【００１８】
１つの実施態様において、アデノシンＡ2AレセプターアンタゴニストはＫＷ−６００２，ＺＭ−２４１３８５、８ＦＢ−ＰＴＰ、ＳＣＨ−５８２６１、ＫＦ−１７８３７、ＣＧＳ−１５９４３、ＤＭＰＸ及びそれらの薬学的に許容し得る塩から選ばれる。
【００１９】
第二の実施態様において、神経栄養活性を有する化合物は、
５−（４−クロロフェニル）−８−メチル−６．７．８．９−テトラヒドロ−１−Ｈ−ピロロ［３．２−ｈ］イソキノリン−２，３−ジオン−３−オキシム；
５−（４−クロロフェニル）−６．７．８．９−テトラヒドロ−１−Ｈ−ピロロ［３．２−ｈ］ナフタレン−２，３−ジオン−３−オキシム；
ＧＤＮＦ；
ニューブラスチン
及びそれらの薬学的に許容し得る塩より成る群から選ばれた化合物である。
【００２０】
具体的な実施態様において、神経栄養活性を有する化合物はＧＤＮＦであり、アデノシンＡ2AレセプターアンタゴニストがＳＣＨ−５８２６１である。別の具体的な実施態様において、神経栄養活性を有する化合物はＧＤＮＦであり、アデノシンＡ2AレセプターアンタゴニストはＫＦ−１７８３７である。
【００２１】
別の実施態様において、上記の薬学的調合物は神経変性状態の治療、予防又は軽減に使用される。また別の実施態様において、上記の薬学的調合物はパーキンソン病患者の治療、予防又は軽減に使用される。
【００２２】
本発明にしたがって治療される患者はこのような治療を必要とする生体、好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトである。
【００２３】
ここに記載された実施態様の２つ以上のすべての可能な組み合わせは本発明の範囲内である。
【００２４】
神経栄養活性を有する化合物
生体内神経栄養因子、たとえば神経発育因子（ＮＧＦ）、脳に由来する神経栄養因子（ＢＮＤＦ）、ヒフ発育因子（ＥＧＦ）、基礎型（basic)線維芽細胞発育因子（ｂＦＧＦ又はＦＧＦ２）、ＮＴ３／４、ニュールチュリン(neurturin) （ＮＴＮ）、ニューブラスチン／アーテミン、パーセフィン(persephin) 及びグリア細胞系に由来する神経栄養因子（ＧＤＮＦ）は成長及び成人期の間、多くの末梢及び中枢神経系ニューロンの分化（differentiation)、発育及び生存を促進する。
【００２５】
本発明において、神経栄養活性を有する化合物は１種以上の内因性神経栄養因子の機能を擬似するか又は増加させる化合物である。ある実施態様において、神経栄養活性を有する化合物はＮＧＦ、ＢＤＮＦ及び（又は）ＧＤＮＦの機能を擬似するか又は増加させる化合物である。別の実施態様において、神経栄養活性を有する化合物はｂＦＧＦ及び（又は）ＥＧＦの機能を擬似するか又は増加させる化合物である。特定の実施態様において、神経栄養活性を有する化合物はＮＧＦの機能を擬似するか又は増加させる化合物である。神経栄養活性は発育因子とそのレセプターの相互作用での又は発育因子シグナルトランスダクション経路での特異的段階にあるとされていなかった。
【００２６】
神経栄養活性を有する化合物として作用する一定の化合物の潜在能力(potential) を、標準インビトロ結合アッセイ及び（又は）標準インビボ機能テスト、たとえば“テスト法”に記載された方法を用いて測定することができる。
【００２７】
１つの実施態様において、１μＭで神経栄養活性を有する化合物は、ＰＣ１２細胞生存アッセイ（方法２）でテストした場合、３ｎＭ ＮＧＦの作用に対して１０％より多く（より好ましくは２０％より多く、そして最も好ましくは３０％より多く）示す。
【００２８】
第二の実施態様において、１μＭで神経栄養活性を有する化合物は、胎生ラット(Embryonic rat) ドパミン作動性ニューロンの生存（方法３）でテストした場合、１０ｎｇ／ｍｌＧＤＮＦの作用に対して１０％より多く（より好ましくは２０％より多く、そして最も 好ましくは３０％より多く）示す。
【００２９】
具体的な実施態様において、神経栄養活性を有する化合物はアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニストでない。
【００３０】
別の実施態様において、神経栄養活性を有する化合物及びアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニストは同一化合物でない。
【００３１】
本発明にしたがって使用される神経活性を有する化合物は国際特許出願（ＷＯ）第９８／０７７０５号明細書（Takeda Chem Ind Ltd)、国際特許出願（ＷＯ）第００／３４２６２号明細書（Takeda Chem Ind Ltd)、国際特許出願（ＷＯ）第００／３２１９７号明細書（Alcon Lab Inc)、国際特許出願（ＷＯ）第９７／４００３５号明細書（NeuroSearch)、国際特許出願（ＷＯ）第００／４３３９７号明細書（NeuroSearch)、国際特許出願ＰＣＴ／ＤＫ０１／０００４４９号明細書（NeuroSearch)、特開２００２−２６３８８号公報（Takeda Chem Ind Ltd)、国際特許出願（ＷＯ）第００／３２１９７号明細書（Alcon Lab Inc)及び国際特許出願（ＷＯ）第００／４６２２２号明細書（Schering AG)に記載されている物質を含む。
【００３２】
本発明の神経栄養活性を有する化合物の別の例は、１−（１，３−ベンゾジオキソル−５−イル）−７，８，９，１０−テトラヒドロ−１，３−ベンゾジオキソル「４，５−」イソキノリン−７−オン（Takeda) 、２−（２，２，４，６，７−ペンタメチル−３−フェニル−２，３−ジヒドロ−１−ベンゾフラン−５−イル）−イソインドリン（Takeda) 、４−アリル−１−フェニルアルキル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（Sanofi-Synthelabo)、ＳＲ５７７４６Ａ又は１−（２−ナフト−２−イル）エチル−４−（３−トリフルオロメチルフェニル）−１，２，５，６−テトラヒドロピリジン（Sanofi-Synthelabo)、ＡＩＴ−０８２（Neo Therapeutics) 、ＮＩＬ−Ａ（Amgen Inc)、Ｋ−２５２ａ(Cephalon)、ＣＥＰ１３４７、ＧＰＩ−１０４６(Guilford)、ＣＴＱ３、ＣＴＱ５及びＣＴＱ８（Centre de Neurochimie du CNRS)、Ｖ−１０，３６７及びＶ−１３，６６１(Vertex Pharmaceuticals Inc)、ＡＢＳ ２０５（American Biogenic Sciences) 、Ｄｅｘａｎａｂｉｎｏｌ又はＨＵ−２１１（Pharmos)、又はその塩、遊離塩基、ラセミ化合物又はエナンチオマーを含む。
【００３３】
神経栄養活性を有する化合物の上記例は、請求項に記載される本発明の範囲に何ら限定を与えることを意図するものではない。
【００３４】
アデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニスト
本発明の範囲で、アデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニストはキサンチンを主体とする同族体及び非キサンチンを主体とする同族体を含む。
【００３５】
アデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニストの例は、ＫＷ−６００２（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ Ｌｔｄ），ＺＭ−２４１３８５，８ＦＢ−ＰＴＰ，ＳＣＨ−５８２６１、ＫＦ−１７８３７、ＣＧＳ−１５９４３、ＤＭＰＸ、８−（ｍ−クロロスチリル）−ＤＭＰＸ、８−（ｍ−ブロモスチリル）−ＤＭＰＸ（又はＢＳ−ＤＭＰＸ）、８−（３，４−ジメトキシスチリル）−ＤＭＰＸを含む。
【００３６】
アデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニストとして作用する特定の化合物の潜在能力(potential) を、標準インビトロ結合アッセイ及び（又は）標準インビボ機能テスト、たとえば“テスト法”に記載された方法を用いて測定することができる。
【００３７】
１つの実施態様において、アデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニストは3Ｈ−ＺＭ ２４１３８５結合のインビトロ阻害でテストした場合（方法７ａ）、１０μＭより小さい、好ましくは１μＭより小さい、そして最も好ましくは０．１μＭより小さいＩＣ50値を示す。
【００３８】
アデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニストの上記例は、請求項に記載された本発明の範囲に何ら限定を与えることを意図するものではない。
【００３９】
薬学的に許容し得る塩
本発明の化合物を、意図される投与に適するすべての形態で提供することができる。適する形態は薬学的に（すなわち生理学的に）許容し得る塩及び本発明の化合物のプレドラッグ形及びプロドラッグ形を含む。
【００４０】
薬学的に許容し得る付加塩の例としては、以下のものに限定されないが、非毒性無機- 及び有機酸付加塩、たとえば塩酸に由来する塩酸塩、臭化水素酸に由来する臭化水素酸塩、硝酸に由来する硝酸塩、過塩素酸に由来する過塩素酸塩、リン酸に由来するリン酸塩、硫酸に由来する硫酸塩、ギ酸に由来するギ酸塩、酢酸に由来する酢酸塩、アコニチン酸に由来するアコニチン酸塩、アスコルビン酸に由来するアスコルビン酸塩、ベンゼンスルホン酸に由来するベンゼンスルホン酸塩、安息香酸に由来する安息香酸塩、ケイヒ酸に由来するケイヒ酸塩、クエン酸に由来するクエン酸塩、エンボン酸(embonic acid)に由来するエンボン酸塩、エナンチン酸(enanthic acid) に由来するエナンチン酸塩、フマル酸に由来するフマル酸塩、グルタミン酸に由来するグルタミン酸塩、グリコール酸に由来するグリコール酸塩、乳酸に由来する乳酸塩、マレイン酸に由来するマレイン酸塩、マロン酸に由来するマロン酸塩、マンデル酸に由来するマンデル酸塩、メタンスルホン酸に由来するメタンスルホン酸塩、ナフタレン-2- スルホン酸に由来するナフタレン-2- スルホン酸塩、フタル酸に由来するフタル酸塩、サリチル酸に由来するサリチル酸塩、ソルビン酸に由来するソルビン酸塩、ステアリン酸に由来するステアリン酸塩、コハク酸に由来するコハク酸塩、酒石酸に由来する酒石酸塩、トルエン-p- スルホン酸に由来するトルエン-p- スルホン酸塩を含む。この様な塩は技術上公知の方法及びで製造することができる。
【００４１】
他の酸、たとえばシュウ酸──これ自体、薬学的に許容されない──は、本発明の化合物及びその薬学的に許容し得る酸付加塩を得る際の中間体として有用な塩の製造に適している。
【００４２】
本発明に使用される本発明の有効化合物の金属塩はアルカリ金属塩、たとえばカルボキシ基を含有する本発明に使用される有効化合物のナトリウム塩を含む。
【００４３】
本発明の範囲いおいて、Ｎ−含有化合物の“オニウム塩”も薬学的に許容し得る塩として考慮される。好ましい“オニウム塩”はアルキル−オニウム塩、シクロアルキル−オニウム塩及びシクロアルキルアルキル−オニウム塩を含む。
【００４４】
本発明の有効化合物は薬学的に許容し得る溶剤、たとえば水、エタノール等々と共に溶解可能な形又は溶解不可能な形で提供されてよい。溶解可能な形はまた水和形、たとえば一水和物、二水和物、ヘミ水和物、三水和物、四水和物等々を包含することができる。一般に、溶解可能な形は本発明の目的にとって溶解不可能な形に相当するものと考えられる。
【００４５】
薬学的調合物
本発明の有効化合物を治療で使用するにあたり、そのまま化合物として投与することもできるが、有効成分を場合により生理学的に許容し得る塩の形で、１種以上の佐剤、賦形剤、希釈剤、緩衝剤、及び（又は）その他の慣用の薬学的助剤と共に薬学的調合物の形で提供するが好ましい。
【００４６】
本発明により使用される有効化合物は別々に又は組み合わせて投与することができる。本発明により使用される薬学的調合物は別々に又は組み合わせて使用される有効化合物を含有することができる。
【００４７】
１つの具体例において、本発明は、更に本発明の有効化合物又はその薬学的に許容し得る塩又は誘導体を薬学的に許容し得るキャリヤー１種以上及び場合により他の治療及び（又は）予防成分（これは当該技術上周知であり、使用されている。）と共に含有する薬剤を提供する。このキャリヤーは、製剤中の他の成分と適合しかつこれが投与される患者に有害でないという意味で“許容し得”なければならない。
【００４８】
本発明の薬学的調合物は経口、直腸、鼻腔、局所（バッカル及び舌下を含めて）、経皮、膣又は腸管外（皮膚−、皮下−、筋肉内−、腹腔内−、静脈内−、動脈内−、脳内−、眼内注射又は注入）投与に適するものであるか、あるいは粉末及び液体エアゾール投与を含む吸入又はガス注入による又は徐放システムによる投与に適する形のものであってよい。徐放システムの適当な例は、本発明の化合物を含有する固形疎水性ポリマーの半透過性マトリックス────そのマトリックスは製品の形で、たとえばフィルム又はマイクロカプセルであってよい────を含む。
【００４９】
通常の佐薬、キャリヤー又は希釈剤と共に、本発明の有効化合物を、薬学的調合物の形及びその単位投薬形とすることができる。このような形態は固体、特に錠剤又は充填カプセル、又は液体、たとえば溶液、懸濁液、エマルジョンン、エリキシル又はこれによって充填されたカプセル、経口使用するためのすべての形で、直腸投与用座剤の形で又は非経口用滅菌注射溶液の形で使用する。この様な薬学的調合物及びその単位投薬形は通常の成分を通常の割合で、別の有効物質又は成分の存在下又は不存在下に含有し、この様な単位投薬形は、有効成分の適する有効量を、使用される、計画された一日投薬範囲に相応して含有することができる。
【００５０】
本発明の有効化合物を、多種の経口及び非経口投薬形で投与することができる。下記の投薬形は、有効成分として本発明の化合物又は本発明の化学物の薬学的に許容し得る塩のどちらかを含有してよいことは当業者に明らかである。
【００５１】
本発明の有効化合物から薬学的調合物を製造することに関して薬学的に許容し得るキャリヤーは固体又は液体のどちらかである。固形薬剤として粉末、錠剤、丸薬、カプセル、カッシェ、坐剤及び分散可能な顆粒が挙げられる。固体キャリヤーは、希釈剤、風味剤、可溶化剤、滑沢剤、懸濁化剤、結合剤、保存剤、錠剤崩壊剤又はカプセル化材料として作用してもよい物質１種又はそれ以上であることができる。
【００５２】
粉末中に、キャリヤーは微粉砕された固体であって、これは微粉砕された有効成分との混合物中にある。
【００５３】
錠剤中に、有効成分は適する割合で必要な結合容量を有するキャリヤーと混合され、所望の形態と大きさに圧縮される。
【００５４】
粉末及び錠剤は有効物質約５又は１０〜約７０％を含有する。適するキャリヤーは炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、乳糖、ペクチン、デキストリン、でんぷん、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点ロウ、カカオバター等々である。“製造”なる言葉は、キャリヤー含有又は不含で有効物質を有効物質と関連するキャリヤーによって含有するカプセルを供給するキャリヤーとしてカプセル化材料を用いる有効物質の調製を含む。同様にカッシェ及びロゼンジも含まれる。錠剤、粉末、カプセル、丸薬、カッシェ及びロゼンジを経口投与に適する固形で使用することができる。
【００５５】
座剤を製造するために、低融点ロウ、たとえば脂肪酸グリセリド又はカカオバターの混合物を先ず融解し、有効成分をこれ中に均一に攪拌によって分散する。次いで融解された均一な混合物を通常のサイズの型に注ぎ、冷却し、それによって固化する。
【００５６】
膣投与に適する製剤を、有効成分に加えて従来公知の適するキャリヤーを含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム又はスプレーとして製造する。
【００５７】
液剤としては、溶液、懸濁液及びエマルジョン、たとえば水又は水- プロピレングリコール溶液が挙げられる。たとえば非経口注射液剤をポリエチレングリコール水溶液中の溶液として調製することができる。
【００５８】
本発明の有効化合物を非経口投与（たとえば注射、たとえばボルス注射液又は連続注入による）のために調製し、そして単位投薬形でアンプル、前もって充填された注射器、少量の注入剤中に又は多様な投薬容器中に添加される保存剤と共に存在する。製剤を油状又は水性賦形剤中の懸濁液、溶液又はエマルジョンとなし、調製剤、たとえば懸濁剤、安定剤及び（又は）分散剤を含有する。あるいは有効成分は、無菌固体の無菌単離によって又は使用前に適する賦形剤、たとえば発熱性物質不含無菌水を溶液からの凍結乾燥によって得られる粉末形であってよい。
【００５９】
経口使用に適する水溶液を、水中に有効成分を溶解し、所望に応じて適する着色剤、風味剤、安定剤及び増粘剤を加えて製造することができる。
【００６０】
経口使用に適する水性懸濁液を、微粉砕された有効成分を水中で粘性物質、たとえば天然又は合成ゴム、樹脂、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、又は他のよく知られた懸濁液と共に懸濁化することによって製造することができる。
【００６１】
使用する少し前に、経口投与のために液状形製剤に変えられる固形製剤も挙げられる。この様な液状形として溶液、懸濁液及びエマルジョンが挙げられる。これらの製剤は、有効成分に加えて、着色剤、風味剤、安定剤、緩衝物質、人工及び天然甘味料、分散剤、増粘剤、可溶化剤等々を含有する。
【００６２】
表皮への局所投与のために、本発明の化合物を軟膏、クリーム又はローションとして又は経皮吸収パッチとして調製する。軟膏及びクリームをたとえば適する増粘剤及び（又は）ゲル化剤の添加して水性又は油性ベースを用いて調製する。ローションを水性又は油性ベースを用いて調製し、これは一般に１種又はそれ以上の乳化剤、安定剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、又は着色剤を含有する。
【００６３】
口中での局所投与に呈する薬剤としては風味ベース、通常ショ糖及びアカシア又はトラガント中に有効成分を含有するロゼンジ、不活性ベース、たとえばゼラチン及びグリセリン又はショ糖及びアカシア中に有効成分を含有するパスチル、及び適する液体キャリヤー中に有効成分を含有する洗口剤が挙げられる。
【００６４】
溶液又は懸濁液を鼻腔に通常の手段、たとえば点滴器、ピペット又はスプレーによって直接に投与する。薬剤は単一又は多様- 投薬形で供給される。
【００６５】
呼吸器官への投与はエアゾール製剤によって達成される。このエアゾール中に有効成分を適する噴射剤、たとえばクロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）、たとえばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン又はジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適するガスで加圧パックして供給する。エアゾールはまた界面活性剤、たとえばレシチンを通常含有する。薬剤の投薬量は計量バルブの供給によって調節される。
【００６６】
あるいは有効成分を、乾燥粉末の形でたとえば適する粉末ベース、たとえば乳糖、でんぷん、でんぷん誘導体、たとえばヒドロキシプロピルメチルセルロース及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）中の化合物の粉末混合物の形で供給する。通常、粉末キャリヤーは鼻腔内でゲルを形成する。粉末製剤は、単位投薬形の形で、たとえばゼラチンのカプセル又はカードリッジ、又は発泡パックの形で存在し、これから粉末を吸入器によって投与する。
【００６７】
呼吸器官への投与を意図する製剤（鼻腔製剤を含む）中で、化合物はたとえば５ミクロン又はそれ以下の大きさの小粒サイズを一般に有する。この様な粒子サイズは従来公知の方法、たとえば微粒子への細砕化によって得られる。
【００６８】
所望の場合、有効成分の徐放を付与する適した製剤を使用する。
【００６９】
薬学的調合物は、単位投薬形であるのが好ましい。この様な形で、薬剤を有効成分の適する量を含有する単位投薬形に再分割する。単位投薬形は、包装された薬剤、薬剤の別々の量を含有するパッケージ、たとえば包装された錠剤、カプセル、及び小瓶又はアンプル中の粉末であってよい。単位投薬形はまたカプセル、錠剤、カッシェ又はロゼンジそれ自体であるか又は包装された形でこれらのいずれかの適する数であってもよい。
【００７０】
経口投与用錠剤又はカプセル及び静脈内投与用液体及び連続注入剤が好ましい製剤である。
【００７１】
製剤及び投与方法に関する更に詳しい説明は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）の最新版中に見出される。
【００７２】
本発明の薬学的調合物は、好ましくはパーキンソン病患者の治療、予防又は軽減に使用するためのものである。
【００７３】
実際の薬用量は治療される疾患の性質及び過酷さ及び投与経路に依存し、更にその量は医師の裁量にまかされており、所望の治療効果を生じるために本発明の特定の状況に薬用量を適合させることによって変化させることができる。単一投薬量あたり有効成分約０．０１〜約５００ｍｇ、好ましくは約０．１〜約１００ｍｇ、最も好ましくは約１〜約１０ｍｇを含有する調合物が治療的処置に適当であると現在考えられている。
【００７４】
有効成分を、１日１回又は数回の薬用量で投与することができる。満足のいく結果は、ある場合、０．１μｇ／ｋｇ（静脈内）及び１μｇ／ｋｇ（腹腔内）ほどの低い薬用量で得ることができる。薬用量範囲の上限は約１０ｍｇ／ｋｇ（静脈内）及び１００ｍｇ／ｋｇ（腹腔内）であると現在見なされる。好ましい範囲は、一日あたり約０．１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ（静脈内）及び約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ（腹腔内）である。
【００７５】
本発明の薬学的調合物はパーキンソン病の治療、予防又は軽減に有用な付加的な薬物１個以上と組み合わせて含むか又は使用するか又は投与することができる。このような付加的な薬物は、Ｌ−ＤＯＰＡ［場合によりデカルボキシラーゼ阻害剤（たとえばカルビドーパ(carbidopa) ）又はＣＯＭＴ阻害剤（たとえばエンタカポン(entacapone)）との組み合わせで］、モノアミンオキシダーゼ阻害剤、モノアミンオキシダーゼＢ阻害剤（たとえばセレギリン(selegiline)），ドパミンアゴニスト［たとえばブロモクリプチン(bromocriptine) 、ペルゴリド(pergolide) 、カバーゴリン(cabergoline) 、ロピニロル(ropinirole)、プラミペキソル(pramipexole) 、又はアポモルフィンとドンペリドン(domperidone) との組み合わせで］、モノアミン再取り込み阻害剤［たとえば国際特許出願（ＷＯ）第９７／１６４５１号明細書（NeuroSearch)及び国際特許出願（ＷＯ）第９７／１３７７０号明細書（NeuroSearch)に記載されている物質、又はＡＬＥ−２６０１８）、ドパミン再取り込み阻害剤（たとえば米国特許第６０１１０７０号明細書、米国特許第５８２１３８６号明細書、米国特許第６００１３３０号明細書、米国特許第５７９５９１５号明細書、米国特許第５５７４０６０号明細書に記載された物質）、ＮＡ／ＤＡ−再取り込み阻害剤［たとえばベンラファキシン(Venlafaxin)、ミナシプラム(Minacipram)、レボキセチン(Reboxetin) ］、古典的な三環状抗うつ剤（たとえばイミプラミン、アミトリプチリン、クロミプラミン、ドキセピン、アモキサピン、デシプラミン、マプロチリン、ノルトリプチリン及びプロトリプチリン）、選択的ドパミン再取り込み阻害剤（たとえばＧＲＢ−１２９０９、ＧＲＢ−１２９３５、インダトラリン（Ｌｕ−１９−００５）、ブプロピオン、アンホネリン酸、ＢＴＣＰ、マジンドール、ノミフェンジン、ベータ−ＣＦＴ（ＷＩＮ３５，４２８）、ベータ−ＣＴＰ（ＷＩＮ３５，０６５−２），ベータ−ＣＩＰ（ＲＴＩ−５５），ＧＹＫＩ５２８９５，４’，４”−ジフルオロ−３−アルファ−ジフェニル−メトキシトロパン、４’−クロロ−３−アルファ−ジフェニルメトキシトロパン、５−（４−クロロフェニル）−８−メチル−６，７，８，９−テトラヒドロ−１−Ｈ−ピロロ［３．２−ｈ］イソキノリン−２，３−ジオン−３−オキシム、及び５−（４−クロロフェニル）−６，７，８，９−テトラヒドロ−１−Ｈ−ピロロ［３．２−ｈ］ナフタレン−２，３−ジオン−３−オキシム）、相対的に選択的なドパミン再取り込み阻害剤（たとえばアミンプチン、３，４−ジクロロフェニル４−（３，４−ジクロロフェニル）−４−ヒドロキシ−１−メチル−３−ピペリジル ケトン（Ｗａｎｇ、Ｓ．等、１９９９）、１−［２−（ジフェニルメトキシ）エチル］−４−（３−フェニルプロピル）ホモピペラジン（ＬＲ−１１１１）、１−［２−（ジフェニルメトキシ）−エチル］−４−（３−フェニル−２−プロペニル）ホモピペラジン、（Ｓ）−（−）−１−［２−ジフェニルメトキシ）エチル］−２−［［Ｎ−（３−フェニルプロピル］アミノ］メチル］ピロリジン及び（Ｓ）−（−）−１−［２−［ビス（４−フルオロフェニル）−メトキシ］エチル］−２−［［Ｎ−（３−フェニルプロピル］アミノ］メチル］ピロリジン）を含む。
【００７６】
更に、本発明の治療はその他の公知のパーキンソン病の治療と組み合わせて、たとえばドパミン分泌細胞を線条体に移植又は神経栄養発育因子を側脳室に適用と組み合わせることができる。
【００７７】
本発明は更に下記試験法及び例によって説明するが、これらは請求項に記載された本発明の範囲を何ら限定することを意図するものではない。
【００７８】
試験法
方法１
ＰＣ１２細胞における神経突起成長の刺激
この試験で、神経栄養活性を有する化合物（以下、化合物と略称する。）がＰＣ１２細胞においてＮＧＦ−誘発された神経突起成長を高める能力を判定する。
【００７９】
方法
ＰＣ１２細胞をコラーゲンコーティングされた組織培養プレートで細胞密度１５，０００／ｃｍ2で７．５％ＦＣＳ及び７．５％ＤＨＳを有するＤＭＥＭに植える。翌日、培地をＮＧＦの不在下又は存在下で上記化合物が補充された培地に変更する。
【００８０】
培地変更して２日後、細胞を４％パラホルムアルデヒド中に固定し、神経フィラメントを染色する。細胞をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド中でインキュベートし、ついで１０％ＤＨＳの存在下に０．０５％トリトン−Ｘ１００に浸透させて、非特異結合部位を遮断して組織培養プレートに固定する。洗浄後、プレートを０．０５％トリトン−Ｘ１００／１０％ＤＨＳ中で１：２００に希釈された抗神経フィラメント（ＮＦ）抗体（クローンＲＴ９７）（ベーリンガー社製）と共にインキュベートし、ついで１：２００に希釈されたビオチン化抗マウス免疫グロブリンＲＰＮ１００１（Amersham) と共にインキュベートする。ＮＦ−免疫反応性細胞を、基質としてＡＢＣ−複合体／ＨＲＰキットＫ０３５５（ＤＡＫＯ）及び３，３−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド（ＤＡＢ）を用いて染色する。
【００８１】
ウエルあたりの全細胞数並びに神経突起全体の長さの見積りを不偏２Ｄ立体学(unbiased 2D stereology)（オリンパスＢＨ−２顕微鏡に連結されたＣＡＳＴグリッドシステム）を用いて行う。
【００８２】
方法２
ＰＣ１２細胞生存アッセイ
この試験で、神経栄養活性を有する化合物（以下、化合物と略称する。）がＰＣ１２細胞の生存に影響を及ぼす能力を判定する。
【００８３】
方法
ＰＣ１２細胞を２ｎＭ マウス７ＳＮＧＦ（Alomone Labs Ltd., Jerusalem, Israel) が補充された増殖培地でコラーゲンコーティングされた９６ウエルプレート（well plate) に植え、ついで６日間培養する。ついでこの培地を化合物が補充された血清不含ＤＭＥＭに変える。ＮＧＦ（３ｎＭ）を正のコントロールとして含む。インキュベーション４日後、細胞生存能力を製造業者の指示（Molecular Probes、Ｃ−７０２６）にしたがってCyQUANT Cell Proliferation Assay を用いて評価する。すぐに培地を吸気し、細胞を−８０℃で少なくとも１時間インキュベートする。ついで細胞を解かし、蛍光CyQUANT 染料を含有する緩衝液中でインキュベートする。この染料は核酸に結合すると強い蛍光増加を示す。４８０ｎｍでの劣化の尺度となる蛍光及び５２０ｎｍでの発光検出をウエルでの生存細胞の数に関連させることができる。
【００８４】
方法３
胎生ラット(Embryonic rat) ドパミン作動性ニューロンの生存
この試験で、神経栄養活性を有する化合物（以下、化合物と略称する。）がラットＥ１４腹側中脳（ventral mesencephali (VM))から得られ、解離された培養液中でドパミン作動性ニューロンの生存に影響を及ぼすことを判定する。
【００８５】
方法
胎生ラット脳（ウスター；Ｅ１４）を滅菌状態で単離し、グルコース（６．５ｍｇ／ｍｌ）を有する冷却されたゲイ（Ｇｅｙ）均衡塩類溶液（ＣＩＢＣＯ）中に置く。
【００８６】
腹側中脳を切断し、小さい組織片に切断し、Ｂ２７サプレメントを有するニューロン性培地(nuerobasal medium) 中に置き、Nitex フィルター８０μｍによって穏やかにプレスする。細胞を血球計算板を用いて数え、約２．０×１０6細胞／ウエルの密度で６ウエルマルチ皿（a 6 well multi dish)中に置く。培養皿をポリ−Ｄ−リジンで被覆する。
【００８７】
１時間後、培地を除き、新たな培地を添加する（１．５ｍｌ／ウエル）。培養のうちの１つのグループを１μＭ濃度で上記化合物で常に処理する。未処理培養をコントロールとして使用する。培地を１日おきに変え、抗有糸分裂薬及び抗生物質をどの段階でも使用しない。
【００８８】
培養７日後、培養をチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）に対して免疫染色しする。すぐに細胞を１％トリトンＸ−１００含有０．０５Ｍトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ、ｐＨ７．４）中で３×１５分洗浄し、３０分間ＴＢＳ中で１０％胎児牛血清（FBS ，Life Technologies)と共にインキュベートする。ついで細胞を２４時間４℃で１０％ＦＢＳを有するＴＢＳ中で１：６００に希釈されたモノクロナールマウス抗TH抗体（ベ−リンガー、マンハイム）と共にインキュベートする。１％トリトンＸ−１００を有するＴＢＳ中で洗浄した後、細胞を１０％ＦＢＳを有するＴＢＳ中で１：２００に希釈されたビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体（Amersham) と共に６０分間インキュベートする。細胞を１％トリトンＸ−１００含有ＴＢＳ中で洗浄し（３×１５分）、１０％ＦＢＳを有するＴＢＳ中で１：２００に希釈されたストレプタビジン−パーオキシダーゼ（Ｄａｋｏ）と共に６０分間インキュベートする。ＴＢＳ中で洗浄した後（３×１５分）、結合した抗体を０．０１％Ｈ2Ｏ2含有ＴＢＳ中で０．０５％３，３−ジアミノベンジジン（Ｓｉｇｍａ）で処理して可視化する。ＴＨ−免疫反応性（ｉｒ）細胞を手動で数える。
【００８９】
方法４
Ｅ２８ 豚腹側中脳(ventral mesencephali)からドパミン作動性ニューロンの生存
この試験で、神経栄養活性を有する化合物（以下、化合物と略称する。）が豚Ｅ２８腹側中脳から得られた臓器典型スライス培養（organotypic slice culture)中でドパミン作動性ニューロンの生存に影響を及ぼすことを判定する。
【００９０】
方法
腹側中脳（ＶＭ）を豚胎児（Ｅ２８）から滅菌状態で単離し、４００μｍのスライスに刻み、グルコース（６．５ｍｇ／ｍｌ）を有する冷却されたゲイ均衡塩類溶液（ＣＩＢＣＯ）中に置く。組織スライスを、本来Stoppini等によって開発されたインターフェース培養方法で培養する［L. Stoppini, P.A. Buchs, D. Muller. A simple method for organotypic culture of nervous tissue; J. Neurosci. Methods 1991 37 173-182 ］。
【００９１】
すぐに、血清含有培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を有する６−ウエルプレート（Ｃｏｓｔｅｒ）中に挿入物としてある半多孔性膜（ミリ小孔、０．３μｍ；４つのスライス／膜）上にスライスを置く。それぞれのウエルは最終濃度２５ｍＭまでＤ−グルコースが補充された培地１ｍｌ（５０％オプチメン、２５％馬血清、２５％ハンクス均衡塩類溶液（すべてのＧＩＢＣＯ））を含有する。
【００９２】
３日目、培地を限定された血清不含培地（Life Technologies のＢ２７サプレメントを有するNeurobasal培地）に代える。切片を方法２に記載した様にＴＨに対して免疫染色した後、２１日間３６℃で５％ＣＯ2によってインキュベーター中で培養を増殖させる。スライス培養グループのうちの１つを、１μＭ濃度の化合物で常に処理する。未処理培養をコントロールとして使用する。培地を１週間に２回変え、抗有糸分裂薬及び抗生物質をどの段階でも使用しない。
【００９３】
オリンパスＢＸ５０顕微鏡及びコンピューター制御されたｘ−ｙ−ｚ step motor stage からなるオリンパスＣ．Ａ．Ｓ．Ｔ．グリッドシステム（version 1.10; Olympus, Albertslund, Denmark)を用いて、ＴＨ−ｉｒニューロンの定量化をコードされたスライド（サンプル同定のために盲検（"blinded")による分析を可能にする）上で行う。培養スライスの領域を正確に描き、数える枠を無作為に置き、サンプルとする最初の領域に印を付ける。ついでそのフレームを規則的に切片じゅうを移動させ、ＴＨ−ｉｒ細胞を数える。
【００９４】
方法５
ＰＣ１２細胞におけるＮＧＦシグナルトランスダクションの強化
この試験で、神経栄養活性を有する化合物（以下、化合物と略称する。）がＥＲＫｓ及びＡｋｔキナーゼのＮＧＦ−誘発されたリン酸化に影響を及ぼすことを判定する。
【００９５】
方法
約２００，０００個のＰＣ１２細胞を２４ウエルプレートで７．５％ＦＣＳ及び７．５％ＤＨＳを有するＤＭＥＭ中に入れ、ＯＮをインキュベートする。翌日、ＮＧＦ及び上記化合物を細胞に添加し、２４時間インキュベートし、その後細胞を２×Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液中で収得する。
【００９６】
細胞溶解物全体をＰＶＤＦ膜にエレクトロブロットされた８−１８％勾配ＳＤＳゲル上で電気泳動する。リン酸化されたＥＲＫ１及びＥＲＫ２をマウスanti-Phospho-p44/p42 MAPキナーゼＥ１０ｍＡｂ（New England Biolabs #9106)及びＨＲＰ−結合抗マウス抗体を用いて免疫検定する。リン酸化されたＡｋｔキナーゼをウサギPhospho-specificＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３）抗体（New England Biolabs #9271)及びＨＲＰ−結合抗ウサギ抗体を用いて免疫検定する。バンドをＥＣＬシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて化学発光によって検出する。
【００９７】
方法６
非分化ＰＣ１２細胞におけるＣＲＥＢリン酸化の刺激
この試験で、神経栄養活性を有する化合物（以下、化合物と略称する。）がＣＲＥＢ（環状ＡＭＰ−応答エレメント結合蛋白質）リン酸化に影響を及ぼすことを判定する。
【００９８】
方法
ウエルあたり約７．５×１０5ＰＣ１２細胞をコラーゲンコーティングされた６−ウエルプレートで０．７５％ＦＣＳ及び０．７５％ＤＨＳを有するＤＭＥＭ中に植え、４８時間インキュベートする。ついで５、１０又は２０分間上記化合物で刺激する前に、血清不含ＤＭＥＭ中で２時間更に細胞を飢餓状態(starved) にする。細胞を１×加熱されたサンプル緩衝液（２％ＳＤＳ、４００ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１０ｍＭＤＴＴ及び０．２５ｍＭＮａ3ＶＯ4）中に収得し、細胞溶解物を、ＰＶＤＦ膜にエレクトロブロットされた８−１８％勾配ＳＤＳゲル上で電気泳動する。
【００９９】
リン酸化されたＣＲＥＢをウサギanti-Phospho- ＤＲＥＢ（UpState Biotechnology #06-519)、ついでＨＲＰ−結合抗ウサギ抗体（Amersham Life Science #NA 934)を用いて免疫検定する。バンドをＥＣＬシステム（Amersham）を用いて化学発光によって免疫検定する。
【０１００】
方法７ａ
3Ｈ−ＺＭ２４１３８５結合のインビトロ阻害
この試験で、アデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニストが線条体組織中の選択的及び強力なアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニスト3Ｈ−ＺＭ２４１３８５の特異結合を阻害する能力を判定する。
【０１０１】
組織調製：
その他に明記しない限り、０〜４0Cで調製を行う。雄性ウスターラット(150-200g)から得られた線条体組織を、Ultra-Turraxホモジナーザーを用いて２０容量のトリスＨＣｌ（５０ｍＭ，ｐＨ７．４）中で１０〜２０秒間ホモジナイズする。ついでこの膜ホモジナートを１０分間４８，０００×ｇで遠心分離する。上澄みを捨て，ペレットを原組織重量１０ｍｇ／ｍｌに対してアデノシン デアミナーゼ２ ＩＵ／ｍｌを含有する緩衝液に浮遊し、３７℃で３０分間インキュベートし、内因性アデノシンを除去する。この膜ホモジナートを再遠心分離し、最終ペレットを緩衝液５０容量に再浮遊し、アッセイの時まで−８０℃で凍結する。
【０１０２】
アッセイ：
膜調製物を解凍し、２℃で１０分間、２７，０００×ｇで遠心分離し、ペレットを１０ｍＭ ＭｇＣｌ2を有する５０ｍＭトリス，ＨＣｌ，ｐＨ７．４（原組織１ｇあたり５００ｍｌ）に再浮遊させ、ついで結合アッセイに使用する。０．５ｍｌのホモジナートを有するアリコートを、試験溶液０．０２５ｍｌ及び3Ｈ- ＺＭ２４１３８５（最終濃度１ｎＭ）０．０２５ｍｌに加え、混合し、室温で３０分間インキュベートする。非特異結合をＮＥＣＡ（１００μＭ、最終濃度）を用いて測定する。インキュベーション後、サンブルを吸引下にワットマンＧＦ／Ｃガラスファイバーフィルター上に直接注ぎ、直ちに氷冷緩衝液２×５ｍｌで洗滌する。フィルター上の放射能の量を通常の液体シンチレーション計数器によって測定する。特異結合を全結合と非特異結合の差異として算出する。
【０１０３】
結果
試験値をＩＣ50として表わす（3Ｈ- ＺＭ２４１３８５の特異結合を５０％阻害する試験化合物の濃度（μＭ））。
【０１０４】
方法７ｂ
3Ｈ−ＣＧＳ ２１６８０結合のインビトロ阻害
この方法で、線条体中のアデノシンＡ2Aレセプターアゴニスト3Ｈ−ＣＧＳ ２１６８０の特異結合を阻害するアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニストの能力を判定する。
【０１０５】
組織調製： 上記方法７ａに記載した通り行う。
【０１０６】
アッセイ：
膜調製物を解凍し、２℃で１０分間、２７，０００×ｇで遠心分離し、ペレットを１０ｍＭ ＭｇＣｌ2を有する５０ｍＭトリス，ＨＣｌ，ｐＨ７．４（原組織１ｇあたり２００ｍｌ）に再浮遊させ、ついで結合アッセイに使用する。０．５ｍｌのホモジナートを有するアリコートを、試験溶液０．０２５ｍｌ及び3Ｈ−ＣＧＳ ２１６８０（最終濃度５ｎＭ）０．０２５ｍｌに加え、混合し、室温で２時間インキュベートする。非特異結合をＮＥＣＡ（１００μＭ、最終濃度）を用いて測定する。インキュベーション後、サンブルを吸引下にワットマンＧＦ／Ｃガラスファイバーフィルター上に直接注ぎ、直ちに氷冷緩衝液２×５ｍｌで洗滌する。フィルター上の放射能の量を通常の液体シンチレーション計数器によって測定する。特異結合を全結合と非特異結合の差異として算出する。
【０１０７】
結果
試験値をＩＣ50として表わす（3Ｈ−ＣＧＳ ２１６８０の特異結合を５０％阻害する試験化合物の濃度（μＭ））。
【０１０８】
方法７ａ及び７ｂのＩＣ50値を阻害曲線から決定する。完全な曲線が得られないならば、ＩＣ50を算出する前に、２５−７５％特異結合阻害を得ることが必要である。
【数１】
【０１０９】
｛上記式中、
Ｃｏはコントロールアッセイ中の特異結合であり、Ｃｘはテストアッセイ中の特異結合である。（算出は正常の質量作用動力学であるとする。）｝
方法８
微量透析法によって測定された細胞外ドパミンへの化合物の作用
この試験で、種々の脳領域において線条体ドパミンを増加させるドパミン活性増加化合物の能力を判定する。
【０１１０】
雄性ＳＰＦ Ｍｏｌウスターラット（体重３００−３５０ｇ）をM φllegaad Breedingand Research Centre から得、標準Ｍａｃｒｏｌｏｎケージ（サイズ２４×３６×１８ｃｍ）中に少なくとも５日間標準条件下で２３±２℃の温度で、６０％±１０％の湿度で、そして１２時間明るい及び暗いのサイクルで入れる。ラットを任意に自由に得られる餌及び水と共に２つのグループに分けて入れる。微量透析法のために、ラットを１ １／２％ハロタン、２０％酸素及び８０％亜酸化窒素を用いてハロタン麻酔下で定位装置中に置く。直腸の温度を監視し、加熱パッド（ＣＭＡ１５０ Carnegie Medicin ）を用いて実験の間３７．０±１℃で保つ。小さい穴をあけ、垂直なプローブ（ＣＭＡ／１２３）を右線条体にブレグマに対して次の座標を用いて定位にインプラントさせる：ＡＰ＋１ｍｍ；Ｌ３ｍｍ；ＤＶ−６ｍｍ。側坐核（ＣＭＡ１２２）に対するプローブを次の座標で垂直にインプラントする：ＡＰ＋２．４ｍｍ；Ｌ１．４ｍｍ；ＤＶ−８ｍｍ。同様な実験を麻酔されていない自由に動く動物で側坐核にインプラントされたプローブを用いて行う。これらの実験は手術後４８時間で任意に自由に得られる餌及び水を有するプラスチックケージ中に個々に入れられた動物において昼間行われる。すべての場合、注射部位をPaxinos 及びWatsonの地図にしたがって組織学的に確認する。
【０１１１】
最初の２時間後、透析物のサンプルをハロタン麻酔されたラットから集める。これらのラットへの試験化合物の投薬を３つのベースライン分析の収集後に常に開始する。ドパミン及びその代謝物を急速に−１８℃に凍結させ、ついでその後できるだけ早く分析する。透析プローブを、リンガー（Ｒｉｎｇｅｒ）液（１４７ｍＭＮａＣｌ、４ｍＭＫＣｌ、２．３ｍＭＣａＣｌ）、すなわち２ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液でｐＨ６．５に調整されたリンガー液（ＮａＣｌ４．３ｇ、ＫＣｌ１５０ｍｇ、ＣａＣｌ2１１０．３ｍｇ、全量５００ｍｌ）を用いて２μＬ／分の速度で（ＣＭＡ／１００微量潅流ポンプによって）潅流する。リンガー液を、使用する前にMillipore ガラスフィルター（０．２２μｍ）によって濾過する。透析分画（４０μＬ）２０分間隔で集め、ついでＨＰＬＣシステムに注入する。ドパミン（ＤＡ）、ジヒドロキシフェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）, ホモバニリン酸（ＨＶＡ）及び５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）の濃度を電気化学検出の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ−ＥＤ）によって測定する。カラムは２３℃で逆相液体クロマトグラフィーカテコールアミン３μｍＥＳＡカラムであり、移動相は０．１ｎＭオクタンスルホン酸、０．０１ｍＭＮａＥＤＴＡ及びｐＨ３．７に氷酢酸で調整された１０％メタノールと０．０５５Ｍ酢酸ナトリウムから成る。移動相を０．５５ｍｌ／分でＨＰＬＣポンプ（ＥＳＡ）によって送る。電気化学的検出はガラス状炭素電極（０．８ＶＡｇ/AgCl 比較）で電流測定検出器（Ａｎｔｅｃ）又は熱量測定検出器（Choulochem II medel ESA;高感度分析セル（５０１１）を用いる）（０．４ＶＡｇ/AgCl 比較）を用いて行われる。クロマトグラムをインテグレーターで記録する。データを基本濃度の現在の変更として算出し、１００％値を各ラットに対する最後の３個の前処理の平均として定義する。ついで平均パーセント値を各グループの処理においてラットに関して各２０分サンプルに対して算出する。
【０１１２】
方法９
内側前脳束及び腹側被蓋領域の６−ＯＨＤＡ病変後、黒質ドパミン作動性ニューロン変性への化合物の作用
線条体６−ＯＨＤＡ病変後、黒質において生存するドパミンニューロンの生存数を増加させる、神経栄養活性を有する化合物の能力を判定する。
【０１１３】
FluoroGold（０．９％ＮａＣｌ中の０．２％溶液、０．２μＬ／side) をハロタン麻酔された雄性Sprague Dawleyラット（体重約２００−２５０ｇ）の線条体に１０μＬハミ ルトン注射器で左右に注射する。次の座標を使用する：ＡＰ＝＋１．０ｍｍ；ＭＬ＝＋／−３．０ｍｍ；ＤＶ＝−５．０ｍｍ，歯バー（tooth bar) ＝０．０。１週間後、６−ＯＨＤＡ（０．０２％アスコルビン酸が補充された０．９％ＮａＣｌに溶解された遊離塩基２０μｇ）を次の座標(coordinate)：ＡＰ＝−４．４ｍｍ；ＭＬ＝−１．２ｍｍ；ＤＶ＝−７．８ｍｍ，tooth bar＝−２．３（ＭＦＢ）及びＡＰ＝−４．０ｍｍ；ＭＬ＝−０．８ｍｍ；ＤＶ＝−８．０ｍｍ，tooth bar＝＋３．４（ＶＴＡ）を用いてガラス製キャピラリーで内側前脳束（ＭＦＢ）及び腹側被蓋領域（ＶＴＡ）に一側性に注射する。
試験化合物又は賦形剤を毎日又は６−ＯＨＤＡ注射後に開始する特定の時間ポイントで腹腔内、経口、皮下又は静脈内投与する。６−ＯＨＤＡ注射３〜４週間後、ラットを深く麻酔し、１分間０．９％ＮａＣｌを用いて、ついで６分間０．１Ｍリン酸緩衝液中の４％パラホルムアルデヒドを用いて心臓経由で(transcardically) 潅流する。脳を切断し、３〜６時間ホルマリン中に添加し（postfixed)、ついで４８時間０．１Ｍリン酸緩衝液中の２５％ショ糖に移す。一連の４０μｍ切片を線条体及び黒質によるミクロトミーを凍結して得る。切片をチロシン ヒドロキシラーゼ（ＴＨ）のために染色する。６−ＯＨＤＡ−病変側及び−無傷側でのドパミン作動性ニューロンの生存を、フルオロゴールド蛍光を示す黒質中で反対に標識されたニューロンの数をステレオロジカリーに（stereologically)カウントし、そしてＴＨ免疫活性を示すニューロンの数をカウントしてブラインドリーに定量化する（quantified blindly) 。
【０１１４】
方法１０
６−ＯＨＤＡ病変後、挙動変化への化合物の作用
線条体又は内側前脳束及び腹側被蓋領域の６−ＯＨＤＡ病変後、挙動変化に影響を与えるアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニスト及び（又は）神経栄養活性を有する化合物の能力を判定する。
【０１１５】
６−ＯＨＤＡ（０．０２％アスコルビン酸が補充された０．９％ＮａＣｌに溶解された遊離塩基２０μｇ）をハロタン麻酔された雌性Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ ラット（体重約２００−２５０ｇ）の線条体に又は内側前脳束（ＭＦＢ）及び腹側被蓋領域（ＶＴＡ）にガラス製キャピラリーで一側性に注射する。試験化合物又は賦形剤を毎日又は６−ＯＨＤＡ注射後に開始する特定の時間ポイントで腹腔内、経口、皮下又は静脈内投与する。
【０１１６】
６−ＯＨＤＡ注射後種々の時間ポイントで、アンフェタミン（２．５ｍｇ／ｋｇ腹腔内）、アポモルフィン（０．２５ｍｇ／ｋｇ皮下）又はＬ−ドーパ（２−１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）の投与後６−ＯＨＤＡにより病変した動物の回転動作を自動化されたロトメーターボウルで監視する。
【０１１７】
方法１１
カタレプシーへの化合物の作用
この試験で、アデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニスト及び（又は）神経栄養活性誘導体を有する化合物がハロペリドールによって誘発されたカタレプシーに影響を与える能力を判定する。
【０１１８】
雄性ウスターラット（体重２００−２５０ｇ）をラット４匹づつ随意に餌及び水と共に及び１２時間照明サイクルでケージに入れる。試験化合物又は賦形剤をハロペリドール投与（０．１ｍｇ／ｋｇ皮下）前の特定の時間に腹腔内、経口、皮下又は静脈内投与する。それぞれの投薬量に関して、６匹のラットを試験する。カタレプシーに関する試験は１５分間隔で行われ、連続的に行われる４つの試験が含まれる。各試験で１０秒間カタレプシー強度を判定する。
１）竪形ワイヤーネット（４０×４０ｃｍ高さ）。ネットのメッシュ（開口部）は約１×２ｃｍである。
２）床から９ｃｍのところに水平バー。
３）高さ９ｃｍのブロック（バー）。
４）高さ３ｃｍのブロック（コルク）。
【０１１９】
ラットを竪形ワイヤーネットの中央に置き、ついで前肢をバーで支える延長された位置での水平バー上に置く。カタレプシーの強度を総体的な静止（total immobility) １０秒の基準にしたがってスコア２と判定する。頭又は体の最小の動きはスコア１、そしてラットが一連の行動を示さない場合、スコアは０である。バーテストの後、１０秒間先ず９ｃｍブロックに、ついで３ｃｍブロックに前肢又は右前肢を置いてラットがすわるのをいとわないかどうかを試験する。４つの試験すべての最大スコアは全部で８である。
【０１２０】
方法１２
ＭＰＴＰで処理されたマウスにおけるアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニスト及び神経栄養活性を有する化合物の別々の投与又は組み合わせ投与の線条体ドパミンへの作用
この試験で、ＭＰＴＰで処理されたマウスにおいて線条体ドパミンを増加させる、アデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニスト及び神経栄養活性を有する化合物の別々の投与又は組み合わせ投与の能力を判定する。
【０１２１】
雌性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（体重２０−２５ｇ）（M&E breeding centre, Ltd. Ejby, Denmark)を室温２２−２４℃で、実験の５−７日前に自由に得られる餌及び水を用いて実験室に順応させる。電灯を午前７時につけ、午後６時に消灯する。１つのグループに少なくとも５−８匹のマウスを使用する。ＭＰＴＰ（ＲＢＩ）を実験直前に生理食塩水に溶解させ、種々の投薬量で試験する。アデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニストの別々の投与の効果をＭＰＴＰ処理の１−５日前に種々の薬用量（皮下、腹腔内、経口又はi.c.v.）で化合物の一日投与後に調べる。マウスをＭＰＴＰ処理後４８時間で殺す。神経栄養化合物の別々の投与の効果を、ＭＰＴＰ処理後１〜５日で種々の投薬量（皮下、腹腔内、経口又はi.c.v.）で化合物の一日投与後に調べる。マウスを神経栄養化合物で最後に処理した後４８時間で殺す。２つの化合物の組み合わせ投与の効果を、ＭＰＴＰ処理の１−５日前に種々の薬用量（皮下、腹腔内、経口又はi.c.v.）でアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニストの一日投与によって、ついで同一動物においてＭＰＴＰ処理後１〜５日で種々の投薬量（皮下、腹腔内、経口又はi.c.v.）で神経栄養化合物の一日投与によって調べる。マウスを神経栄養化合物で最後に処理した後４８時間で殺す。脳を迅速に除き、マウスの線条体を切断し、凍結させ、ドパミン及びその代謝物 ＨＶＡ及びＤＯＰＡＣの生化学分析まで−８０℃で貯蔵する。分析のその日に、マウス１匹あたり１つの線条体（重さ５−７ｍｇ）を５％ＥＤＴＡ含有０．１Ｎ 過塩素酸１ｍｌにホモジナイズする。３０分間遠心分離１４，００００×Ｇ後、上澄み２００μＬをガラス０．２２μｍによって濾過する。ついで２０μＬを下記カラム（Caracholamine HR-80 4.6mm ×80mm 3μｍ Nucleosil C 18) を有するESA Coulochem II HPLC 装置に注入する。溶離剤はＮａＨ2ＰＯ4１０．２５ｇ、ＥＤＴＡ１８５ｍｇ、オクタンスルホン酸１００ｍｇである。９％メタノール、ｐＨ３．７をＭｉｌｌｉＱ ｗａｔｅｒに添加し、０．２２μｍによって濾過する。ＣｏｌｏｃｈｅｍＥＳＡ分析細胞は５０１４Ａであり、ＥＳＡ検出器は次の設定を有する：Ｅ２−１７５ｍＶ、ドパミン、ＤＯＰＡＣ及びＨＶＡの溶離に対する実行時間（run time) （ＤＯＰＡＣ＝４．３分；ドパミン＝６．４分；及びＨＶＡ＝１２．７分）。自動注入器ＳＨＩＭＡＤＺＹ ｓｉｌ−１０Ａはつぎの設定を有する；注入容量２０μＬ、分析時間１６分、温度４℃。ポンプからの流速は０．８０ｍｌ／分である。分析を、それぞれ１２回分析を行ったドパミン、ＨＶＡ及びＤＯＰＡＣの３ｐＭのスタンダードを用いて目盛りを定め、そしてスタンダードカーブと比べる。
【０１２２】
方法１３
線条体６−ＯＨＤＡ病変後、アデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニスト及び神経栄養活性を有する化合物の別々の投与又は組み合わせ投与の黒質ドパミン作動性ニューロン変性への作用
線条体６−ＯＨＤＡ病変後、黒質において生存するドパミンニューロンの数を増加させる、アデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニスト及び神経栄養活性を有する化合物の別々の投与又は組み合わせ投与の能力を判定する。
【０１２３】
FluoroGold（０．９％ＮａＣｌ中の０．２％溶液、０．２μＬ／side) をハロタン麻酔された雄性Sprague Dawleyラット（体重約２００−２５０ｇ）の線条体に１０μＬハミ ルトン注射器で左右に注射する。次の座標を使用する：ＡＰ＝＋１．０ｍｍ；ＭＬ＝＋／−３．０ｍｍ；ＤＶ＝−５．０ｍｍ，歯バー（tooth bar) ＝０．０。１週間後、６−ＯＨＤＡ（０．０２％アスコルビン酸が補充された０．９％ＮａＣｌに溶解された遊離塩基２０μｇ）を次の座標(coordinate)：ＡＰ＝＋１．０ｍｍ；ＭＬ＝−３．０ｍｍ；ＤＶ＝−５．０ｍｍ，tooth bar＝０．０を用いてガラス製キャピラリーで線条体に一側性に注射する。アデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニストの別々の投与の効果を、毎日又は６−ＯＨＤＡ注射後の特定の時間に種々の薬用量（皮下、腹腔内、経口又はi.c.v.）で化合物の投与後に調べる。２つの化合物の組み合わせ投与の効果を、毎日又は６−ＯＨＤＡ注射前の特定の時間に種々の薬用量（皮下、腹腔内、経口又はi.c.v.）でアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニストの投与によって、ついで同一動物において毎日又は６−ＯＨＤＡ注射前の特定の時間に種々の薬用量（皮下、腹腔内、経口又はi.c.v.）で神経栄養化合物の投与によって調べる。６−ＯＨＤＡ注射３〜４週間後、ラットを深く麻酔し、１分間０．９％ＮａＣｌを用いて、ついで６分間０．１Ｍリン酸緩衝液中の４％パラホルムアルデヒドを用いて心臓経由で(transcardically) 潅流する。
【０１２４】
脳を切断し、３〜６時間ホルマリン中に入れ（postfixed)、ついで４８時間０．１Ｍリン酸緩衝液中の２５％ショ糖に移す。一連の４０μｍ切片を線条体及び黒質によるミクロトミーを凍結して得る。切片をマウス−ａｎｔｉ−ＴＨ（Chemicon, #MAB 318) を用いてチロシン ヒドロキシラーゼ（ＴＨ）免疫活性のために染色する。切片をＫＰＢＳ中で洗浄し、その後ＫＰＢＳ中の１０％メタノール＋３％過酸化水素を用いて急冷する。ＫＰＳＢ中の２％正常のウマ血清（ＮＨＳ）＋０．３％トリトンＸ−１００を用いて１時間予備インキュベートする。その後切片をＫＰＳＢ中のマウス−ａｎｔｉ−ＴＨ（Chemicon, #MAB 318) １：２０００＋２％ＮＨＳ＋０．３％トリトンＸ−１００中で一晩インキュベートする。ＫＰＢＳ中で洗浄した後、切片をＫＰＢＳ中の０．３％トリトンでビオチン化ウマ抗マウス（ベクター）１：２００中で２時間インキュベートする。ＫＰＢＳ中で洗浄した後、免疫活性をＡＢＣ反応（ベクターキット）によって、ついでＤＡＢ染色によって可視化する。６−ＯＨＤＡ−病変側及び−無傷側でのドパミン作動性ニューロンの生存を、フルオロゴールド蛍光を示す黒質中で反対に標識されたニューロンの数をステレオロジカリーに（stereologically)カウントし、そしてＴＨ免疫活性を示すニューロンの数をカウントしてブラインドリーに定量化する（quantified blindly) 。ある場合には、ニューロン生存度を、生存するドパミン作動性細胞分画に基づき各切片に１から５のスコアを割り当てて見積もる。上記分画はフルオロゴールド蛍光及び（又は）ＴＨ免疫組織化学（immunohistrochemistry)のために処理された切片を観察してブラインドリーに見積もられている。スコア“１”をすべてのニューロンが生存し、そして非病変ニューロンと形態学的に区別されない切片に割り当て、一方スコア“５”をニューロンが６−ＯＨＤＡ病変側で生存する切片に割り当てる。
【０００１】
本発明は、パーキンソン病の治療に神経栄養活性を有する化合物とアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニストの組み合わせ作用を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病は世界中で約４００万人が患う運動能力の進行性悪化によって特徴づけられる神経変性疾患である。パーキンソン病患者は動作を開始するのが更に困難になり、腕及び肢の硬直並びに震えが増すことに悩まされている。パーキンソン病の特定の原因は知られていないが、この疾患は動作の連携に係わっていると信じられている黒質として知られている脳の領域で特定のドパミン含有ニューロンが変性することに関係があると示されてきた。
【０００３】
治療法の１つとして単独で又はたとえばドパミンアゴニストとの組み合わせるＬ−ＤＯＰＡ治療がある。しかし、Ｌ−ＤＯＰＡ治療後３〜５年で、不本意の運動障害（ジスキネジー）が現れる。
【０００４】
別の治療法はモノアミン再取り込み阻害剤（たとえばドパミン再取り込み阻害剤）の使用であり、それによってシナプス間隙で存在するドパミンレベルは増加する。
【０００５】
他の可能な治療は、病変した及び損傷したニューロンに神経保護及び（又は）神経変性作用を与える神経栄養化合物を使用することである。
【０００６】
提案されたまた別の治療は、増加したドパミン作動性活性をもたらすアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニストの使用である。さらに、アデノシンＡ2Aレセプター及びその神経保護への関連は議論されてきた（Ongini, E.等(1977) Adenosine A2Areceptors and neuroprotection, Ann NY Acad Sci 825:30-48)。
【０００７】
パーキンソン病の患者の治療により少ない副作用でより選択的かつ有効な治療の開発に対して強い興味が相変わらずある。
【０００８】
発明の要旨
本発明者は、本発明によれば神経栄養活性を有する化合物をアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニストと組み合わせた作用がパーキンソン病の治療に有利に使用することができることを見出した。
【０００９】
したがって、その第一の観点で、本発明は神経栄養活性を有する化合物少なくとも１個とアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニスト少なくとも１個の治療上有効な量を薬学的に許容し得るキャリヤー又は希釈剤少なくとも１個と共に含有する薬学的調合物に関する。
【００１０】
もう一つの観点で、本発明はパーキンソン病患者の治療、予防又は軽減に使用される薬剤を製造するために神経栄養活性を有する化合物少なくとも１個とアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニスト少なくとも１個を使用する方法に関する。
【００１１】
その原理は迅速な開始作用（アデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニストの作用）と長期間の有効な主作用（神経栄養活性）との組み合わせである。したがってアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニストは疾患の症状を軽減し（ドパミン作動性活性を増加させることによって）、一方神経栄養活性が疾患の原因（ニューロンを変性する）を、疾患の進行の遅延によってか又は逆行によって処置する。
【００１２】
本発明の他の目的は下記の詳細な説明及び実施例から当業者に明らかである。
【００１３】
発明の詳細な説明
第一の観点で、本発明はパーキンソン病患者の治療、予防又は軽減に使用される薬剤を製造するために神経栄養活性を有する化合物少なくとも１個とアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニスト少なくとも１個を使用する方法を提供する。
【００１４】
第二の観点で、本発明は神経栄養活性を有する化合物少なくとも１個とアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニスト少なくとも１個の治療上有効な量を薬学的に許容し得るキャリヤー又は希釈剤少なくとも１個と共に含有する薬学的調合物を提供する。
【００１５】
第三の観点で、本発明は治療用剤として使用される、神経栄養活性を有する化合物少なくとも１個とアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニスト少なくとも１個の組み合わせ物を提供する。
【００１６】
別の観点で、本発明はパーキンソン病患者の治療、予防又は軽減方法において、この方法が神経栄養活性を有する化合物少なくとも１個とアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニスト少なくとも１個の治療上有効な組み合わせ物を上記患者に投与することを特徴とする、上記方法を提供する。
【００１７】
また別の観点で、本発明は神経栄養活性を有する化合物少なくとも１個とアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニスト少なくとも１個から成るパーツを含むキットを提供する。
【００１８】
１つの実施態様において、アデノシンＡ2AレセプターアンタゴニストはＫＷ−６００２，ＺＭ−２４１３８５、８ＦＢ−ＰＴＰ、ＳＣＨ−５８２６１、ＫＦ−１７８３７、ＣＧＳ−１５９４３、ＤＭＰＸ及びそれらの薬学的に許容し得る塩から選ばれる。
【００１９】
第二の実施態様において、神経栄養活性を有する化合物は、
５−（４−クロロフェニル）−８−メチル−６．７．８．９−テトラヒドロ−１−Ｈ−ピロロ［３．２−ｈ］イソキノリン−２，３−ジオン−３−オキシム；
５−（４−クロロフェニル）−６．７．８．９−テトラヒドロ−１−Ｈ−ピロロ［３．２−ｈ］ナフタレン−２，３−ジオン−３−オキシム；
ＧＤＮＦ；
ニューブラスチン
及びそれらの薬学的に許容し得る塩より成る群から選ばれた化合物である。
【００２０】
具体的な実施態様において、神経栄養活性を有する化合物はＧＤＮＦであり、アデノシンＡ2AレセプターアンタゴニストがＳＣＨ−５８２６１である。別の具体的な実施態様において、神経栄養活性を有する化合物はＧＤＮＦであり、アデノシンＡ2AレセプターアンタゴニストはＫＦ−１７８３７である。
【００２１】
別の実施態様において、上記の薬学的調合物は神経変性状態の治療、予防又は軽減に使用される。また別の実施態様において、上記の薬学的調合物はパーキンソン病患者の治療、予防又は軽減に使用される。
【００２２】
本発明にしたがって治療される患者はこのような治療を必要とする生体、好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトである。
【００２３】
ここに記載された実施態様の２つ以上のすべての可能な組み合わせは本発明の範囲内である。
【００２４】
神経栄養活性を有する化合物
生体内神経栄養因子、たとえば神経発育因子（ＮＧＦ）、脳に由来する神経栄養因子（ＢＮＤＦ）、ヒフ発育因子（ＥＧＦ）、基礎型（basic)線維芽細胞発育因子（ｂＦＧＦ又はＦＧＦ２）、ＮＴ３／４、ニュールチュリン(neurturin) （ＮＴＮ）、ニューブラスチン／アーテミン、パーセフィン(persephin) 及びグリア細胞系に由来する神経栄養因子（ＧＤＮＦ）は成長及び成人期の間、多くの末梢及び中枢神経系ニューロンの分化（differentiation)、発育及び生存を促進する。
【００２５】
本発明において、神経栄養活性を有する化合物は１種以上の内因性神経栄養因子の機能を擬似するか又は増加させる化合物である。ある実施態様において、神経栄養活性を有する化合物はＮＧＦ、ＢＤＮＦ及び（又は）ＧＤＮＦの機能を擬似するか又は増加させる化合物である。別の実施態様において、神経栄養活性を有する化合物はｂＦＧＦ及び（又は）ＥＧＦの機能を擬似するか又は増加させる化合物である。特定の実施態様において、神経栄養活性を有する化合物はＮＧＦの機能を擬似するか又は増加させる化合物である。神経栄養活性は発育因子とそのレセプターの相互作用での又は発育因子シグナルトランスダクション経路での特異的段階にあるとされていなかった。
【００２６】
神経栄養活性を有する化合物として作用する一定の化合物の潜在能力(potential) を、標準インビトロ結合アッセイ及び（又は）標準インビボ機能テスト、たとえば“テスト法”に記載された方法を用いて測定することができる。
【００２７】
１つの実施態様において、１μＭで神経栄養活性を有する化合物は、ＰＣ１２細胞生存アッセイ（方法２）でテストした場合、３ｎＭ ＮＧＦの作用に対して１０％より多く（より好ましくは２０％より多く、そして最も好ましくは３０％より多く）示す。
【００２８】
第二の実施態様において、１μＭで神経栄養活性を有する化合物は、胎生ラット(Embryonic rat) ドパミン作動性ニューロンの生存（方法３）でテストした場合、１０ｎｇ／ｍｌＧＤＮＦの作用に対して１０％より多く（より好ましくは２０％より多く、そして最も 好ましくは３０％より多く）示す。
【００２９】
具体的な実施態様において、神経栄養活性を有する化合物はアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニストでない。
【００３０】
別の実施態様において、神経栄養活性を有する化合物及びアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニストは同一化合物でない。
【００３１】
本発明にしたがって使用される神経活性を有する化合物は国際特許出願（ＷＯ）第９８／０７７０５号明細書（Takeda Chem Ind Ltd)、国際特許出願（ＷＯ）第００／３４２６２号明細書（Takeda Chem Ind Ltd)、国際特許出願（ＷＯ）第００／３２１９７号明細書（Alcon Lab Inc)、国際特許出願（ＷＯ）第９７／４００３５号明細書（NeuroSearch)、国際特許出願（ＷＯ）第００／４３３９７号明細書（NeuroSearch)、国際特許出願ＰＣＴ／ＤＫ０１／０００４４９号明細書（NeuroSearch)、特開２００２−２６３８８号公報（Takeda Chem Ind Ltd)、国際特許出願（ＷＯ）第００／３２１９７号明細書（Alcon Lab Inc)及び国際特許出願（ＷＯ）第００／４６２２２号明細書（Schering AG)に記載されている物質を含む。
【００３２】
本発明の神経栄養活性を有する化合物の別の例は、１−（１，３−ベンゾジオキソル−５−イル）−７，８，９，１０−テトラヒドロ−１，３−ベンゾジオキソル「４，５−」イソキノリン−７−オン（Takeda) 、２−（２，２，４，６，７−ペンタメチル−３−フェニル−２，３−ジヒドロ−１−ベンゾフラン−５−イル）−イソインドリン（Takeda) 、４−アリル−１−フェニルアルキル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（Sanofi-Synthelabo)、ＳＲ５７７４６Ａ又は１−（２−ナフト−２−イル）エチル−４−（３−トリフルオロメチルフェニル）−１，２，５，６−テトラヒドロピリジン（Sanofi-Synthelabo)、ＡＩＴ−０８２（Neo Therapeutics) 、ＮＩＬ−Ａ（Amgen Inc)、Ｋ−２５２ａ(Cephalon)、ＣＥＰ１３４７、ＧＰＩ−１０４６(Guilford)、ＣＴＱ３、ＣＴＱ５及びＣＴＱ８（Centre de Neurochimie du CNRS)、Ｖ−１０，３６７及びＶ−１３，６６１(Vertex Pharmaceuticals Inc)、ＡＢＳ ２０５（American Biogenic Sciences) 、Ｄｅｘａｎａｂｉｎｏｌ又はＨＵ−２１１（Pharmos)、又はその塩、遊離塩基、ラセミ化合物又はエナンチオマーを含む。
【００３３】
神経栄養活性を有する化合物の上記例は、請求項に記載される本発明の範囲に何ら限定を与えることを意図するものではない。
【００３４】
アデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニスト
本発明の範囲で、アデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニストはキサンチンを主体とする同族体及び非キサンチンを主体とする同族体を含む。
【００３５】
アデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニストの例は、ＫＷ−６００２（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ Ｌｔｄ），ＺＭ−２４１３８５，８ＦＢ−ＰＴＰ，ＳＣＨ−５８２６１、ＫＦ−１７８３７、ＣＧＳ−１５９４３、ＤＭＰＸ、８−（ｍ−クロロスチリル）−ＤＭＰＸ、８−（ｍ−ブロモスチリル）−ＤＭＰＸ（又はＢＳ−ＤＭＰＸ）、８−（３，４−ジメトキシスチリル）−ＤＭＰＸを含む。
【００３６】
アデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニストとして作用する特定の化合物の潜在能力(potential) を、標準インビトロ結合アッセイ及び（又は）標準インビボ機能テスト、たとえば“テスト法”に記載された方法を用いて測定することができる。
【００３７】
１つの実施態様において、アデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニストは3Ｈ−ＺＭ ２４１３８５結合のインビトロ阻害でテストした場合（方法７ａ）、１０μＭより小さい、好ましくは１μＭより小さい、そして最も好ましくは０．１μＭより小さいＩＣ50値を示す。
【００３８】
アデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニストの上記例は、請求項に記載された本発明の範囲に何ら限定を与えることを意図するものではない。
【００３９】
薬学的に許容し得る塩
本発明の化合物を、意図される投与に適するすべての形態で提供することができる。適する形態は薬学的に（すなわち生理学的に）許容し得る塩及び本発明の化合物のプレドラッグ形及びプロドラッグ形を含む。
【００４０】
薬学的に許容し得る付加塩の例としては、以下のものに限定されないが、非毒性無機- 及び有機酸付加塩、たとえば塩酸に由来する塩酸塩、臭化水素酸に由来する臭化水素酸塩、硝酸に由来する硝酸塩、過塩素酸に由来する過塩素酸塩、リン酸に由来するリン酸塩、硫酸に由来する硫酸塩、ギ酸に由来するギ酸塩、酢酸に由来する酢酸塩、アコニチン酸に由来するアコニチン酸塩、アスコルビン酸に由来するアスコルビン酸塩、ベンゼンスルホン酸に由来するベンゼンスルホン酸塩、安息香酸に由来する安息香酸塩、ケイヒ酸に由来するケイヒ酸塩、クエン酸に由来するクエン酸塩、エンボン酸(embonic acid)に由来するエンボン酸塩、エナンチン酸(enanthic acid) に由来するエナンチン酸塩、フマル酸に由来するフマル酸塩、グルタミン酸に由来するグルタミン酸塩、グリコール酸に由来するグリコール酸塩、乳酸に由来する乳酸塩、マレイン酸に由来するマレイン酸塩、マロン酸に由来するマロン酸塩、マンデル酸に由来するマンデル酸塩、メタンスルホン酸に由来するメタンスルホン酸塩、ナフタレン-2- スルホン酸に由来するナフタレン-2- スルホン酸塩、フタル酸に由来するフタル酸塩、サリチル酸に由来するサリチル酸塩、ソルビン酸に由来するソルビン酸塩、ステアリン酸に由来するステアリン酸塩、コハク酸に由来するコハク酸塩、酒石酸に由来する酒石酸塩、トルエン-p- スルホン酸に由来するトルエン-p- スルホン酸塩を含む。この様な塩は技術上公知の方法及びで製造することができる。
【００４１】
他の酸、たとえばシュウ酸──これ自体、薬学的に許容されない──は、本発明の化合物及びその薬学的に許容し得る酸付加塩を得る際の中間体として有用な塩の製造に適している。
【００４２】
本発明に使用される本発明の有効化合物の金属塩はアルカリ金属塩、たとえばカルボキシ基を含有する本発明に使用される有効化合物のナトリウム塩を含む。
【００４３】
本発明の範囲いおいて、Ｎ−含有化合物の“オニウム塩”も薬学的に許容し得る塩として考慮される。好ましい“オニウム塩”はアルキル−オニウム塩、シクロアルキル−オニウム塩及びシクロアルキルアルキル−オニウム塩を含む。
【００４４】
本発明の有効化合物は薬学的に許容し得る溶剤、たとえば水、エタノール等々と共に溶解可能な形又は溶解不可能な形で提供されてよい。溶解可能な形はまた水和形、たとえば一水和物、二水和物、ヘミ水和物、三水和物、四水和物等々を包含することができる。一般に、溶解可能な形は本発明の目的にとって溶解不可能な形に相当するものと考えられる。
【００４５】
薬学的調合物
本発明の有効化合物を治療で使用するにあたり、そのまま化合物として投与することもできるが、有効成分を場合により生理学的に許容し得る塩の形で、１種以上の佐剤、賦形剤、希釈剤、緩衝剤、及び（又は）その他の慣用の薬学的助剤と共に薬学的調合物の形で提供するが好ましい。
【００４６】
本発明により使用される有効化合物は別々に又は組み合わせて投与することができる。本発明により使用される薬学的調合物は別々に又は組み合わせて使用される有効化合物を含有することができる。
【００４７】
１つの具体例において、本発明は、更に本発明の有効化合物又はその薬学的に許容し得る塩又は誘導体を薬学的に許容し得るキャリヤー１種以上及び場合により他の治療及び（又は）予防成分（これは当該技術上周知であり、使用されている。）と共に含有する薬剤を提供する。このキャリヤーは、製剤中の他の成分と適合しかつこれが投与される患者に有害でないという意味で“許容し得”なければならない。
【００４８】
本発明の薬学的調合物は経口、直腸、鼻腔、局所（バッカル及び舌下を含めて）、経皮、膣又は腸管外（皮膚−、皮下−、筋肉内−、腹腔内−、静脈内−、動脈内−、脳内−、眼内注射又は注入）投与に適するものであるか、あるいは粉末及び液体エアゾール投与を含む吸入又はガス注入による又は徐放システムによる投与に適する形のものであってよい。徐放システムの適当な例は、本発明の化合物を含有する固形疎水性ポリマーの半透過性マトリックス────そのマトリックスは製品の形で、たとえばフィルム又はマイクロカプセルであってよい────を含む。
【００４９】
通常の佐薬、キャリヤー又は希釈剤と共に、本発明の有効化合物を、薬学的調合物の形及びその単位投薬形とすることができる。このような形態は固体、特に錠剤又は充填カプセル、又は液体、たとえば溶液、懸濁液、エマルジョンン、エリキシル又はこれによって充填されたカプセル、経口使用するためのすべての形で、直腸投与用座剤の形で又は非経口用滅菌注射溶液の形で使用する。この様な薬学的調合物及びその単位投薬形は通常の成分を通常の割合で、別の有効物質又は成分の存在下又は不存在下に含有し、この様な単位投薬形は、有効成分の適する有効量を、使用される、計画された一日投薬範囲に相応して含有することができる。
【００５０】
本発明の有効化合物を、多種の経口及び非経口投薬形で投与することができる。下記の投薬形は、有効成分として本発明の化合物又は本発明の化学物の薬学的に許容し得る塩のどちらかを含有してよいことは当業者に明らかである。
【００５１】
本発明の有効化合物から薬学的調合物を製造することに関して薬学的に許容し得るキャリヤーは固体又は液体のどちらかである。固形薬剤として粉末、錠剤、丸薬、カプセル、カッシェ、坐剤及び分散可能な顆粒が挙げられる。固体キャリヤーは、希釈剤、風味剤、可溶化剤、滑沢剤、懸濁化剤、結合剤、保存剤、錠剤崩壊剤又はカプセル化材料として作用してもよい物質１種又はそれ以上であることができる。
【００５２】
粉末中に、キャリヤーは微粉砕された固体であって、これは微粉砕された有効成分との混合物中にある。
【００５３】
錠剤中に、有効成分は適する割合で必要な結合容量を有するキャリヤーと混合され、所望の形態と大きさに圧縮される。
【００５４】
粉末及び錠剤は有効物質約５又は１０〜約７０％を含有する。適するキャリヤーは炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、乳糖、ペクチン、デキストリン、でんぷん、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点ロウ、カカオバター等々である。“製造”なる言葉は、キャリヤー含有又は不含で有効物質を有効物質と関連するキャリヤーによって含有するカプセルを供給するキャリヤーとしてカプセル化材料を用いる有効物質の調製を含む。同様にカッシェ及びロゼンジも含まれる。錠剤、粉末、カプセル、丸薬、カッシェ及びロゼンジを経口投与に適する固形で使用することができる。
【００５５】
座剤を製造するために、低融点ロウ、たとえば脂肪酸グリセリド又はカカオバターの混合物を先ず融解し、有効成分をこれ中に均一に攪拌によって分散する。次いで融解された均一な混合物を通常のサイズの型に注ぎ、冷却し、それによって固化する。
【００５６】
膣投与に適する製剤を、有効成分に加えて従来公知の適するキャリヤーを含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム又はスプレーとして製造する。
【００５７】
液剤としては、溶液、懸濁液及びエマルジョン、たとえば水又は水- プロピレングリコール溶液が挙げられる。たとえば非経口注射液剤をポリエチレングリコール水溶液中の溶液として調製することができる。
【００５８】
本発明の有効化合物を非経口投与（たとえば注射、たとえばボルス注射液又は連続注入による）のために調製し、そして単位投薬形でアンプル、前もって充填された注射器、少量の注入剤中に又は多様な投薬容器中に添加される保存剤と共に存在する。製剤を油状又は水性賦形剤中の懸濁液、溶液又はエマルジョンとなし、調製剤、たとえば懸濁剤、安定剤及び（又は）分散剤を含有する。あるいは有効成分は、無菌固体の無菌単離によって又は使用前に適する賦形剤、たとえば発熱性物質不含無菌水を溶液からの凍結乾燥によって得られる粉末形であってよい。
【００５９】
経口使用に適する水溶液を、水中に有効成分を溶解し、所望に応じて適する着色剤、風味剤、安定剤及び増粘剤を加えて製造することができる。
【００６０】
経口使用に適する水性懸濁液を、微粉砕された有効成分を水中で粘性物質、たとえば天然又は合成ゴム、樹脂、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、又は他のよく知られた懸濁液と共に懸濁化することによって製造することができる。
【００６１】
使用する少し前に、経口投与のために液状形製剤に変えられる固形製剤も挙げられる。この様な液状形として溶液、懸濁液及びエマルジョンが挙げられる。これらの製剤は、有効成分に加えて、着色剤、風味剤、安定剤、緩衝物質、人工及び天然甘味料、分散剤、増粘剤、可溶化剤等々を含有する。
【００６２】
表皮への局所投与のために、本発明の化合物を軟膏、クリーム又はローションとして又は経皮吸収パッチとして調製する。軟膏及びクリームをたとえば適する増粘剤及び（又は）ゲル化剤の添加して水性又は油性ベースを用いて調製する。ローションを水性又は油性ベースを用いて調製し、これは一般に１種又はそれ以上の乳化剤、安定剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、又は着色剤を含有する。
【００６３】
口中での局所投与に呈する薬剤としては風味ベース、通常ショ糖及びアカシア又はトラガント中に有効成分を含有するロゼンジ、不活性ベース、たとえばゼラチン及びグリセリン又はショ糖及びアカシア中に有効成分を含有するパスチル、及び適する液体キャリヤー中に有効成分を含有する洗口剤が挙げられる。
【００６４】
溶液又は懸濁液を鼻腔に通常の手段、たとえば点滴器、ピペット又はスプレーによって直接に投与する。薬剤は単一又は多様- 投薬形で供給される。
【００６５】
呼吸器官への投与はエアゾール製剤によって達成される。このエアゾール中に有効成分を適する噴射剤、たとえばクロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）、たとえばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン又はジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適するガスで加圧パックして供給する。エアゾールはまた界面活性剤、たとえばレシチンを通常含有する。薬剤の投薬量は計量バルブの供給によって調節される。
【００６６】
あるいは有効成分を、乾燥粉末の形でたとえば適する粉末ベース、たとえば乳糖、でんぷん、でんぷん誘導体、たとえばヒドロキシプロピルメチルセルロース及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）中の化合物の粉末混合物の形で供給する。通常、粉末キャリヤーは鼻腔内でゲルを形成する。粉末製剤は、単位投薬形の形で、たとえばゼラチンのカプセル又はカードリッジ、又は発泡パックの形で存在し、これから粉末を吸入器によって投与する。
【００６７】
呼吸器官への投与を意図する製剤（鼻腔製剤を含む）中で、化合物はたとえば５ミクロン又はそれ以下の大きさの小粒サイズを一般に有する。この様な粒子サイズは従来公知の方法、たとえば微粒子への細砕化によって得られる。
【００６８】
所望の場合、有効成分の徐放を付与する適した製剤を使用する。
【００６９】
薬学的調合物は、単位投薬形であるのが好ましい。この様な形で、薬剤を有効成分の適する量を含有する単位投薬形に再分割する。単位投薬形は、包装された薬剤、薬剤の別々の量を含有するパッケージ、たとえば包装された錠剤、カプセル、及び小瓶又はアンプル中の粉末であってよい。単位投薬形はまたカプセル、錠剤、カッシェ又はロゼンジそれ自体であるか又は包装された形でこれらのいずれかの適する数であってもよい。
【００７０】
経口投与用錠剤又はカプセル及び静脈内投与用液体及び連続注入剤が好ましい製剤である。
【００７１】
製剤及び投与方法に関する更に詳しい説明は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）の最新版中に見出される。
【００７２】
本発明の薬学的調合物は、好ましくはパーキンソン病患者の治療、予防又は軽減に使用するためのものである。
【００７３】
実際の薬用量は治療される疾患の性質及び過酷さ及び投与経路に依存し、更にその量は医師の裁量にまかされており、所望の治療効果を生じるために本発明の特定の状況に薬用量を適合させることによって変化させることができる。単一投薬量あたり有効成分約０．０１〜約５００ｍｇ、好ましくは約０．１〜約１００ｍｇ、最も好ましくは約１〜約１０ｍｇを含有する調合物が治療的処置に適当であると現在考えられている。
【００７４】
有効成分を、１日１回又は数回の薬用量で投与することができる。満足のいく結果は、ある場合、０．１μｇ／ｋｇ（静脈内）及び１μｇ／ｋｇ（腹腔内）ほどの低い薬用量で得ることができる。薬用量範囲の上限は約１０ｍｇ／ｋｇ（静脈内）及び１００ｍｇ／ｋｇ（腹腔内）であると現在見なされる。好ましい範囲は、一日あたり約０．１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ（静脈内）及び約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ（腹腔内）である。
【００７５】
本発明の薬学的調合物はパーキンソン病の治療、予防又は軽減に有用な付加的な薬物１個以上と組み合わせて含むか又は使用するか又は投与することができる。このような付加的な薬物は、Ｌ−ＤＯＰＡ［場合によりデカルボキシラーゼ阻害剤（たとえばカルビドーパ(carbidopa) ）又はＣＯＭＴ阻害剤（たとえばエンタカポン(entacapone)）との組み合わせで］、モノアミンオキシダーゼ阻害剤、モノアミンオキシダーゼＢ阻害剤（たとえばセレギリン(selegiline)），ドパミンアゴニスト［たとえばブロモクリプチン(bromocriptine) 、ペルゴリド(pergolide) 、カバーゴリン(cabergoline) 、ロピニロル(ropinirole)、プラミペキソル(pramipexole) 、又はアポモルフィンとドンペリドン(domperidone) との組み合わせで］、モノアミン再取り込み阻害剤［たとえば国際特許出願（ＷＯ）第９７／１６４５１号明細書（NeuroSearch)及び国際特許出願（ＷＯ）第９７／１３７７０号明細書（NeuroSearch)に記載されている物質、又はＡＬＥ−２６０１８）、ドパミン再取り込み阻害剤（たとえば米国特許第６０１１０７０号明細書、米国特許第５８２１３８６号明細書、米国特許第６００１３３０号明細書、米国特許第５７９５９１５号明細書、米国特許第５５７４０６０号明細書に記載された物質）、ＮＡ／ＤＡ−再取り込み阻害剤［たとえばベンラファキシン(Venlafaxin)、ミナシプラム(Minacipram)、レボキセチン(Reboxetin) ］、古典的な三環状抗うつ剤（たとえばイミプラミン、アミトリプチリン、クロミプラミン、ドキセピン、アモキサピン、デシプラミン、マプロチリン、ノルトリプチリン及びプロトリプチリン）、選択的ドパミン再取り込み阻害剤（たとえばＧＲＢ−１２９０９、ＧＲＢ−１２９３５、インダトラリン（Ｌｕ−１９−００５）、ブプロピオン、アンホネリン酸、ＢＴＣＰ、マジンドール、ノミフェンジン、ベータ−ＣＦＴ（ＷＩＮ３５，４２８）、ベータ−ＣＴＰ（ＷＩＮ３５，０６５−２），ベータ−ＣＩＰ（ＲＴＩ−５５），ＧＹＫＩ５２８９５，４’，４”−ジフルオロ−３−アルファ−ジフェニル−メトキシトロパン、４’−クロロ−３−アルファ−ジフェニルメトキシトロパン、５−（４−クロロフェニル）−８−メチル−６，７，８，９−テトラヒドロ−１−Ｈ−ピロロ［３．２−ｈ］イソキノリン−２，３−ジオン−３−オキシム、及び５−（４−クロロフェニル）−６，７，８，９−テトラヒドロ−１−Ｈ−ピロロ［３．２−ｈ］ナフタレン−２，３−ジオン−３−オキシム）、相対的に選択的なドパミン再取り込み阻害剤（たとえばアミンプチン、３，４−ジクロロフェニル４−（３，４−ジクロロフェニル）−４−ヒドロキシ−１−メチル−３−ピペリジル ケトン（Ｗａｎｇ、Ｓ．等、１９９９）、１−［２−（ジフェニルメトキシ）エチル］−４−（３−フェニルプロピル）ホモピペラジン（ＬＲ−１１１１）、１−［２−（ジフェニルメトキシ）−エチル］−４−（３−フェニル−２−プロペニル）ホモピペラジン、（Ｓ）−（−）−１−［２−ジフェニルメトキシ）エチル］−２−［［Ｎ−（３−フェニルプロピル］アミノ］メチル］ピロリジン及び（Ｓ）−（−）−１−［２−［ビス（４−フルオロフェニル）−メトキシ］エチル］−２−［［Ｎ−（３−フェニルプロピル］アミノ］メチル］ピロリジン）を含む。
【００７６】
更に、本発明の治療はその他の公知のパーキンソン病の治療と組み合わせて、たとえばドパミン分泌細胞を線条体に移植又は神経栄養発育因子を側脳室に適用と組み合わせることができる。
【００７７】
本発明は更に下記試験法及び例によって説明するが、これらは請求項に記載された本発明の範囲を何ら限定することを意図するものではない。
【００７８】
試験法
方法１
ＰＣ１２細胞における神経突起成長の刺激
この試験で、神経栄養活性を有する化合物（以下、化合物と略称する。）がＰＣ１２細胞においてＮＧＦ−誘発された神経突起成長を高める能力を判定する。
【００７９】
方法
ＰＣ１２細胞をコラーゲンコーティングされた組織培養プレートで細胞密度１５，０００／ｃｍ2で７．５％ＦＣＳ及び７．５％ＤＨＳを有するＤＭＥＭに植える。翌日、培地をＮＧＦの不在下又は存在下で上記化合物が補充された培地に変更する。
【００８０】
培地変更して２日後、細胞を４％パラホルムアルデヒド中に固定し、神経フィラメントを染色する。細胞をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド中でインキュベートし、ついで１０％ＤＨＳの存在下に０．０５％トリトン−Ｘ１００に浸透させて、非特異結合部位を遮断して組織培養プレートに固定する。洗浄後、プレートを０．０５％トリトン−Ｘ１００／１０％ＤＨＳ中で１：２００に希釈された抗神経フィラメント（ＮＦ）抗体（クローンＲＴ９７）（ベーリンガー社製）と共にインキュベートし、ついで１：２００に希釈されたビオチン化抗マウス免疫グロブリンＲＰＮ１００１（Amersham) と共にインキュベートする。ＮＦ−免疫反応性細胞を、基質としてＡＢＣ−複合体／ＨＲＰキットＫ０３５５（ＤＡＫＯ）及び３，３−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド（ＤＡＢ）を用いて染色する。
【００８１】
ウエルあたりの全細胞数並びに神経突起全体の長さの見積りを不偏２Ｄ立体学(unbiased 2D stereology)（オリンパスＢＨ−２顕微鏡に連結されたＣＡＳＴグリッドシステム）を用いて行う。
【００８２】
方法２
ＰＣ１２細胞生存アッセイ
この試験で、神経栄養活性を有する化合物（以下、化合物と略称する。）がＰＣ１２細胞の生存に影響を及ぼす能力を判定する。
【００８３】
方法
ＰＣ１２細胞を２ｎＭ マウス７ＳＮＧＦ（Alomone Labs Ltd., Jerusalem, Israel) が補充された増殖培地でコラーゲンコーティングされた９６ウエルプレート（well plate) に植え、ついで６日間培養する。ついでこの培地を化合物が補充された血清不含ＤＭＥＭに変える。ＮＧＦ（３ｎＭ）を正のコントロールとして含む。インキュベーション４日後、細胞生存能力を製造業者の指示（Molecular Probes、Ｃ−７０２６）にしたがってCyQUANT Cell Proliferation Assay を用いて評価する。すぐに培地を吸気し、細胞を−８０℃で少なくとも１時間インキュベートする。ついで細胞を解かし、蛍光CyQUANT 染料を含有する緩衝液中でインキュベートする。この染料は核酸に結合すると強い蛍光増加を示す。４８０ｎｍでの劣化の尺度となる蛍光及び５２０ｎｍでの発光検出をウエルでの生存細胞の数に関連させることができる。
【００８４】
方法３
胎生ラット(Embryonic rat) ドパミン作動性ニューロンの生存
この試験で、神経栄養活性を有する化合物（以下、化合物と略称する。）がラットＥ１４腹側中脳（ventral mesencephali (VM))から得られ、解離された培養液中でドパミン作動性ニューロンの生存に影響を及ぼすことを判定する。
【００８５】
方法
胎生ラット脳（ウスター；Ｅ１４）を滅菌状態で単離し、グルコース（６．５ｍｇ／ｍｌ）を有する冷却されたゲイ（Ｇｅｙ）均衡塩類溶液（ＣＩＢＣＯ）中に置く。
【００８６】
腹側中脳を切断し、小さい組織片に切断し、Ｂ２７サプレメントを有するニューロン性培地(nuerobasal medium) 中に置き、Nitex フィルター８０μｍによって穏やかにプレスする。細胞を血球計算板を用いて数え、約２．０×１０6細胞／ウエルの密度で６ウエルマルチ皿（a 6 well multi dish)中に置く。培養皿をポリ−Ｄ−リジンで被覆する。
【００８７】
１時間後、培地を除き、新たな培地を添加する（１．５ｍｌ／ウエル）。培養のうちの１つのグループを１μＭ濃度で上記化合物で常に処理する。未処理培養をコントロールとして使用する。培地を１日おきに変え、抗有糸分裂薬及び抗生物質をどの段階でも使用しない。
【００８８】
培養７日後、培養をチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）に対して免疫染色しする。すぐに細胞を１％トリトンＸ−１００含有０．０５Ｍトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ、ｐＨ７．４）中で３×１５分洗浄し、３０分間ＴＢＳ中で１０％胎児牛血清（FBS ，Life Technologies)と共にインキュベートする。ついで細胞を２４時間４℃で１０％ＦＢＳを有するＴＢＳ中で１：６００に希釈されたモノクロナールマウス抗TH抗体（ベ−リンガー、マンハイム）と共にインキュベートする。１％トリトンＸ−１００を有するＴＢＳ中で洗浄した後、細胞を１０％ＦＢＳを有するＴＢＳ中で１：２００に希釈されたビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体（Amersham) と共に６０分間インキュベートする。細胞を１％トリトンＸ−１００含有ＴＢＳ中で洗浄し（３×１５分）、１０％ＦＢＳを有するＴＢＳ中で１：２００に希釈されたストレプタビジン−パーオキシダーゼ（Ｄａｋｏ）と共に６０分間インキュベートする。ＴＢＳ中で洗浄した後（３×１５分）、結合した抗体を０．０１％Ｈ2Ｏ2含有ＴＢＳ中で０．０５％３，３−ジアミノベンジジン（Ｓｉｇｍａ）で処理して可視化する。ＴＨ−免疫反応性（ｉｒ）細胞を手動で数える。
【００８９】
方法４
Ｅ２８ 豚腹側中脳(ventral mesencephali)からドパミン作動性ニューロンの生存
この試験で、神経栄養活性を有する化合物（以下、化合物と略称する。）が豚Ｅ２８腹側中脳から得られた臓器典型スライス培養（organotypic slice culture)中でドパミン作動性ニューロンの生存に影響を及ぼすことを判定する。
【００９０】
方法
腹側中脳（ＶＭ）を豚胎児（Ｅ２８）から滅菌状態で単離し、４００μｍのスライスに刻み、グルコース（６．５ｍｇ／ｍｌ）を有する冷却されたゲイ均衡塩類溶液（ＣＩＢＣＯ）中に置く。組織スライスを、本来Stoppini等によって開発されたインターフェース培養方法で培養する［L. Stoppini, P.A. Buchs, D. Muller. A simple method for organotypic culture of nervous tissue; J. Neurosci. Methods 1991 37 173-182 ］。
【００９１】
すぐに、血清含有培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を有する６−ウエルプレート（Ｃｏｓｔｅｒ）中に挿入物としてある半多孔性膜（ミリ小孔、０．３μｍ；４つのスライス／膜）上にスライスを置く。それぞれのウエルは最終濃度２５ｍＭまでＤ−グルコースが補充された培地１ｍｌ（５０％オプチメン、２５％馬血清、２５％ハンクス均衡塩類溶液（すべてのＧＩＢＣＯ））を含有する。
【００９２】
３日目、培地を限定された血清不含培地（Life Technologies のＢ２７サプレメントを有するNeurobasal培地）に代える。切片を方法２に記載した様にＴＨに対して免疫染色した後、２１日間３６℃で５％ＣＯ2によってインキュベーター中で培養を増殖させる。スライス培養グループのうちの１つを、１μＭ濃度の化合物で常に処理する。未処理培養をコントロールとして使用する。培地を１週間に２回変え、抗有糸分裂薬及び抗生物質をどの段階でも使用しない。
【００９３】
オリンパスＢＸ５０顕微鏡及びコンピューター制御されたｘ−ｙ−ｚ step motor stage からなるオリンパスＣ．Ａ．Ｓ．Ｔ．グリッドシステム（version 1.10; Olympus, Albertslund, Denmark)を用いて、ＴＨ−ｉｒニューロンの定量化をコードされたスライド（サンプル同定のために盲検（"blinded")による分析を可能にする）上で行う。培養スライスの領域を正確に描き、数える枠を無作為に置き、サンプルとする最初の領域に印を付ける。ついでそのフレームを規則的に切片じゅうを移動させ、ＴＨ−ｉｒ細胞を数える。
【００９４】
方法５
ＰＣ１２細胞におけるＮＧＦシグナルトランスダクションの強化
この試験で、神経栄養活性を有する化合物（以下、化合物と略称する。）がＥＲＫｓ及びＡｋｔキナーゼのＮＧＦ−誘発されたリン酸化に影響を及ぼすことを判定する。
【００９５】
方法
約２００，０００個のＰＣ１２細胞を２４ウエルプレートで７．５％ＦＣＳ及び７．５％ＤＨＳを有するＤＭＥＭ中に入れ、ＯＮをインキュベートする。翌日、ＮＧＦ及び上記化合物を細胞に添加し、２４時間インキュベートし、その後細胞を２×Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液中で収得する。
【００９６】
細胞溶解物全体をＰＶＤＦ膜にエレクトロブロットされた８−１８％勾配ＳＤＳゲル上で電気泳動する。リン酸化されたＥＲＫ１及びＥＲＫ２をマウスanti-Phospho-p44/p42 MAPキナーゼＥ１０ｍＡｂ（New England Biolabs #9106)及びＨＲＰ−結合抗マウス抗体を用いて免疫検定する。リン酸化されたＡｋｔキナーゼをウサギPhospho-specificＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３）抗体（New England Biolabs #9271)及びＨＲＰ−結合抗ウサギ抗体を用いて免疫検定する。バンドをＥＣＬシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて化学発光によって検出する。
【００９７】
方法６
非分化ＰＣ１２細胞におけるＣＲＥＢリン酸化の刺激
この試験で、神経栄養活性を有する化合物（以下、化合物と略称する。）がＣＲＥＢ（環状ＡＭＰ−応答エレメント結合蛋白質）リン酸化に影響を及ぼすことを判定する。
【００９８】
方法
ウエルあたり約７．５×１０5ＰＣ１２細胞をコラーゲンコーティングされた６−ウエルプレートで０．７５％ＦＣＳ及び０．７５％ＤＨＳを有するＤＭＥＭ中に植え、４８時間インキュベートする。ついで５、１０又は２０分間上記化合物で刺激する前に、血清不含ＤＭＥＭ中で２時間更に細胞を飢餓状態(starved) にする。細胞を１×加熱されたサンプル緩衝液（２％ＳＤＳ、４００ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１０ｍＭＤＴＴ及び０．２５ｍＭＮａ3ＶＯ4）中に収得し、細胞溶解物を、ＰＶＤＦ膜にエレクトロブロットされた８−１８％勾配ＳＤＳゲル上で電気泳動する。
【００９９】
リン酸化されたＣＲＥＢをウサギanti-Phospho- ＤＲＥＢ（UpState Biotechnology #06-519)、ついでＨＲＰ−結合抗ウサギ抗体（Amersham Life Science #NA 934)を用いて免疫検定する。バンドをＥＣＬシステム（Amersham）を用いて化学発光によって免疫検定する。
【０１００】
方法７ａ
3Ｈ−ＺＭ２４１３８５結合のインビトロ阻害
この試験で、アデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニストが線条体組織中の選択的及び強力なアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニスト3Ｈ−ＺＭ２４１３８５の特異結合を阻害する能力を判定する。
【０１０１】
組織調製：
その他に明記しない限り、０〜４0Cで調製を行う。雄性ウスターラット(150-200g)から得られた線条体組織を、Ultra-Turraxホモジナーザーを用いて２０容量のトリスＨＣｌ（５０ｍＭ，ｐＨ７．４）中で１０〜２０秒間ホモジナイズする。ついでこの膜ホモジナートを１０分間４８，０００×ｇで遠心分離する。上澄みを捨て，ペレットを原組織重量１０ｍｇ／ｍｌに対してアデノシン デアミナーゼ２ ＩＵ／ｍｌを含有する緩衝液に浮遊し、３７℃で３０分間インキュベートし、内因性アデノシンを除去する。この膜ホモジナートを再遠心分離し、最終ペレットを緩衝液５０容量に再浮遊し、アッセイの時まで−８０℃で凍結する。
【０１０２】
アッセイ：
膜調製物を解凍し、２℃で１０分間、２７，０００×ｇで遠心分離し、ペレットを１０ｍＭ ＭｇＣｌ2を有する５０ｍＭトリス，ＨＣｌ，ｐＨ７．４（原組織１ｇあたり５００ｍｌ）に再浮遊させ、ついで結合アッセイに使用する。０．５ｍｌのホモジナートを有するアリコートを、試験溶液０．０２５ｍｌ及び3Ｈ- ＺＭ２４１３８５（最終濃度１ｎＭ）０．０２５ｍｌに加え、混合し、室温で３０分間インキュベートする。非特異結合をＮＥＣＡ（１００μＭ、最終濃度）を用いて測定する。インキュベーション後、サンブルを吸引下にワットマンＧＦ／Ｃガラスファイバーフィルター上に直接注ぎ、直ちに氷冷緩衝液２×５ｍｌで洗滌する。フィルター上の放射能の量を通常の液体シンチレーション計数器によって測定する。特異結合を全結合と非特異結合の差異として算出する。
【０１０３】
結果
試験値をＩＣ50として表わす（3Ｈ- ＺＭ２４１３８５の特異結合を５０％阻害する試験化合物の濃度（μＭ））。
【０１０４】
方法７ｂ
3Ｈ−ＣＧＳ ２１６８０結合のインビトロ阻害
この方法で、線条体中のアデノシンＡ2Aレセプターアゴニスト3Ｈ−ＣＧＳ ２１６８０の特異結合を阻害するアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニストの能力を判定する。
【０１０５】
組織調製： 上記方法７ａに記載した通り行う。
【０１０６】
アッセイ：
膜調製物を解凍し、２℃で１０分間、２７，０００×ｇで遠心分離し、ペレットを１０ｍＭ ＭｇＣｌ2を有する５０ｍＭトリス，ＨＣｌ，ｐＨ７．４（原組織１ｇあたり２００ｍｌ）に再浮遊させ、ついで結合アッセイに使用する。０．５ｍｌのホモジナートを有するアリコートを、試験溶液０．０２５ｍｌ及び3Ｈ−ＣＧＳ ２１６８０（最終濃度５ｎＭ）０．０２５ｍｌに加え、混合し、室温で２時間インキュベートする。非特異結合をＮＥＣＡ（１００μＭ、最終濃度）を用いて測定する。インキュベーション後、サンブルを吸引下にワットマンＧＦ／Ｃガラスファイバーフィルター上に直接注ぎ、直ちに氷冷緩衝液２×５ｍｌで洗滌する。フィルター上の放射能の量を通常の液体シンチレーション計数器によって測定する。特異結合を全結合と非特異結合の差異として算出する。
【０１０７】
結果
試験値をＩＣ50として表わす（3Ｈ−ＣＧＳ ２１６８０の特異結合を５０％阻害する試験化合物の濃度（μＭ））。
【０１０８】
方法７ａ及び７ｂのＩＣ50値を阻害曲線から決定する。完全な曲線が得られないならば、ＩＣ50を算出する前に、２５−７５％特異結合阻害を得ることが必要である。
【数１】
｛上記式中、
Ｃｏはコントロールアッセイ中の特異結合であり、Ｃｘはテストアッセイ中の特異結合である。（算出は正常の質量作用動力学であるとする。）｝
方法８
微量透析法によって測定された細胞外ドパミンへの化合物の作用
この試験で、種々の脳領域において線条体ドパミンを増加させるドパミン活性増加化合物の能力を判定する。
【０１１０】
雄性ＳＰＦ Ｍｏｌウスターラット（体重３００−３５０ｇ）をM φllegaad Breedingand Research Centre から得、標準Ｍａｃｒｏｌｏｎケージ（サイズ２４×３６×１８ｃｍ）中に少なくとも５日間標準条件下で２３±２℃の温度で、６０％±１０％の湿度で、そして１２時間明るい及び暗いのサイクルで入れる。ラットを任意に自由に得られる餌及び水と共に２つのグループに分けて入れる。微量透析法のために、ラットを１ １／２％ハロタン、２０％酸素及び８０％亜酸化窒素を用いてハロタン麻酔下で定位装置中に置く。直腸の温度を監視し、加熱パッド（ＣＭＡ１５０ Carnegie Medicin ）を用いて実験の間３７．０±１℃で保つ。小さい穴をあけ、垂直なプローブ（ＣＭＡ／１２３）を右線条体にブレグマに対して次の座標を用いて定位にインプラントさせる：ＡＰ＋１ｍｍ；Ｌ３ｍｍ；ＤＶ−６ｍｍ。側坐核（ＣＭＡ１２２）に対するプローブを次の座標で垂直にインプラントする：ＡＰ＋２．４ｍｍ；Ｌ１．４ｍｍ；ＤＶ−８ｍｍ。同様な実験を麻酔されていない自由に動く動物で側坐核にインプラントされたプローブを用いて行う。これらの実験は手術後４８時間で任意に自由に得られる餌及び水を有するプラスチックケージ中に個々に入れられた動物において昼間行われる。すべての場合、注射部位をPaxinos 及びWatsonの地図にしたがって組織学的に確認する。
【０１１１】
最初の２時間後、透析物のサンプルをハロタン麻酔されたラットから集める。これらのラットへの試験化合物の投薬を３つのベースライン分析の収集後に常に開始する。ドパミン及びその代謝物を急速に−１８℃に凍結させ、ついでその後できるだけ早く分析する。透析プローブを、リンガー（Ｒｉｎｇｅｒ）液（１４７ｍＭＮａＣｌ、４ｍＭＫＣｌ、２．３ｍＭＣａＣｌ）、すなわち２ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液でｐＨ６．５に調整されたリンガー液（ＮａＣｌ４．３ｇ、ＫＣｌ１５０ｍｇ、ＣａＣｌ2１１０．３ｍｇ、全量５００ｍｌ）を用いて２μＬ／分の速度で（ＣＭＡ／１００微量潅流ポンプによって）潅流する。リンガー液を、使用する前にMillipore ガラスフィルター（０．２２μｍ）によって濾過する。透析分画（４０μＬ）２０分間隔で集め、ついでＨＰＬＣシステムに注入する。ドパミン（ＤＡ）、ジヒドロキシフェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）, ホモバニリン酸（ＨＶＡ）及び５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）の濃度を電気化学検出の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ−ＥＤ）によって測定する。カラムは２３℃で逆相液体クロマトグラフィーカテコールアミン３μｍＥＳＡカラムであり、移動相は０．１ｎＭオクタンスルホン酸、０．０１ｍＭＮａＥＤＴＡ及びｐＨ３．７に氷酢酸で調整された１０％メタノールと０．０５５Ｍ酢酸ナトリウムから成る。移動相を０．５５ｍｌ／分でＨＰＬＣポンプ（ＥＳＡ）によって送る。電気化学的検出はガラス状炭素電極（０．８ＶＡｇ/AgCl 比較）で電流測定検出器（Ａｎｔｅｃ）又は熱量測定検出器（Choulochem II medel ESA;高感度分析セル（５０１１）を用いる）（０．４ＶＡｇ/AgCl 比較）を用いて行われる。クロマトグラムをインテグレーターで記録する。データを基本濃度の現在の変更として算出し、１００％値を各ラットに対する最後の３個の前処理の平均として定義する。ついで平均パーセント値を各グループの処理においてラットに関して各２０分サンプルに対して算出する。
【０１１２】
方法９
内側前脳束及び腹側被蓋領域の６−ＯＨＤＡ病変後、黒質ドパミン作動性ニューロン変性への化合物の作用
線条体６−ＯＨＤＡ病変後、黒質において生存するドパミンニューロンの生存数を増加させる、神経栄養活性を有する化合物の能力を判定する。
【０１１３】
FluoroGold（０．９％ＮａＣｌ中の０．２％溶液、０．２μＬ／side) をハロタン麻酔された雄性Sprague Dawleyラット（体重約２００−２５０ｇ）の線条体に１０μＬハミ ルトン注射器で左右に注射する。次の座標を使用する：ＡＰ＝＋１．０ｍｍ；ＭＬ＝＋／−３．０ｍｍ；ＤＶ＝−５．０ｍｍ，歯バー（tooth bar) ＝０．０。１週間後、６−ＯＨＤＡ（０．０２％アスコルビン酸が補充された０．９％ＮａＣｌに溶解された遊離塩基２０μｇ）を次の座標(coordinate)：ＡＰ＝−４．４ｍｍ；ＭＬ＝−１．２ｍｍ；ＤＶ＝−７．８ｍｍ，tooth bar＝−２．３（ＭＦＢ）及びＡＰ＝−４．０ｍｍ；ＭＬ＝−０．８ｍｍ；ＤＶ＝−８．０ｍｍ，tooth bar＝＋３．４（ＶＴＡ）を用いてガラス製キャピラリーで内側前脳束（ＭＦＢ）及び腹側被蓋領域（ＶＴＡ）に一側性に注射する。
試験化合物又は賦形剤を毎日又は６−ＯＨＤＡ注射後に開始する特定の時間ポイントで腹腔内、経口、皮下又は静脈内投与する。６−ＯＨＤＡ注射３〜４週間後、ラットを深く麻酔し、１分間０．９％ＮａＣｌを用いて、ついで６分間０．１Ｍリン酸緩衝液中の４％パラホルムアルデヒドを用いて心臓経由で(transcardically) 潅流する。脳を切断し、３〜６時間ホルマリン中に添加し（postfixed)、ついで４８時間０．１Ｍリン酸緩衝液中の２５％ショ糖に移す。一連の４０μｍ切片を線条体及び黒質によるミクロトミーを凍結して得る。切片をチロシン ヒドロキシラーゼ（ＴＨ）のために染色する。６−ＯＨＤＡ−病変側及び−無傷側でのドパミン作動性ニューロンの生存を、フルオロゴールド蛍光を示す黒質中で反対に標識されたニューロンの数をステレオロジカリーに（stereologically)カウントし、そしてＴＨ免疫活性を示すニューロンの数をカウントしてブラインドリーに定量化する（quantified blindly) 。
【０１１４】
方法１０
６−ＯＨＤＡ病変後、挙動変化への化合物の作用
線条体又は内側前脳束及び腹側被蓋領域の６−ＯＨＤＡ病変後、挙動変化に影響を与えるアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニスト及び（又は）神経栄養活性を有する化合物の能力を判定する。
【０１１５】
６−ＯＨＤＡ（０．０２％アスコルビン酸が補充された０．９％ＮａＣｌに溶解された遊離塩基２０μｇ）をハロタン麻酔された雌性Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ ラット（体重約２００−２５０ｇ）の線条体に又は内側前脳束（ＭＦＢ）及び腹側被蓋領域（ＶＴＡ）にガラス製キャピラリーで一側性に注射する。試験化合物又は賦形剤を毎日又は６−ＯＨＤＡ注射後に開始する特定の時間ポイントで腹腔内、経口、皮下又は静脈内投与する。
【０１１６】
６−ＯＨＤＡ注射後種々の時間ポイントで、アンフェタミン（２．５ｍｇ／ｋｇ腹腔内）、アポモルフィン（０．２５ｍｇ／ｋｇ皮下）又はＬ−ドーパ（２−１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）の投与後６−ＯＨＤＡにより病変した動物の回転動作を自動化されたロトメーターボウルで監視する。
【０１１７】
方法１１
カタレプシーへの化合物の作用
この試験で、アデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニスト及び（又は）神経栄養活性誘導体を有する化合物がハロペリドールによって誘発されたカタレプシーに影響を与える能力を判定する。
【０１１８】
雄性ウスターラット（体重２００−２５０ｇ）をラット４匹づつ随意に餌及び水と共に及び１２時間照明サイクルでケージに入れる。試験化合物又は賦形剤をハロペリドール投与（０．１ｍｇ／ｋｇ皮下）前の特定の時間に腹腔内、経口、皮下又は静脈内投与する。それぞれの投薬量に関して、６匹のラットを試験する。カタレプシーに関する試験は１５分間隔で行われ、連続的に行われる４つの試験が含まれる。各試験で１０秒間カタレプシー強度を判定する。
１）竪形ワイヤーネット（４０×４０ｃｍ高さ）。ネットのメッシュ（開口部）は約１×２ｃｍである。
２）床から９ｃｍのところに水平バー。
３）高さ９ｃｍのブロック（バー）。
４）高さ３ｃｍのブロック（コルク）。
【０１１９】
ラットを竪形ワイヤーネットの中央に置き、ついで前肢をバーで支える延長された位置での水平バー上に置く。カタレプシーの強度を総体的な静止（total immobility) １０秒の基準にしたがってスコア２と判定する。頭又は体の最小の動きはスコア１、そしてラットが一連の行動を示さない場合、スコアは０である。バーテストの後、１０秒間先ず９ｃｍブロックに、ついで３ｃｍブロックに前肢又は右前肢を置いてラットがすわるのをいとわないかどうかを試験する。４つの試験すべての最大スコアは全部で８である。
【０１２０】
方法１２
ＭＰＴＰで処理されたマウスにおけるアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニスト及び神経栄養活性を有する化合物の別々の投与又は組み合わせ投与の線条体ドパミンへの作用
この試験で、ＭＰＴＰで処理されたマウスにおいて線条体ドパミンを増加させる、アデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニスト及び神経栄養活性を有する化合物の別々の投与又は組み合わせ投与の能力を判定する。
【０１２１】
雌性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（体重２０−２５ｇ）（M&E breeding centre, Ltd. Ejby, Denmark)を室温２２−２４℃で、実験の５−７日前に自由に得られる餌及び水を用いて実験室に順応させる。電灯を午前７時につけ、午後６時に消灯する。１つのグループに少なくとも５−８匹のマウスを使用する。ＭＰＴＰ（ＲＢＩ）を実験直前に生理食塩水に溶解させ、種々の投薬量で試験する。アデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニストの別々の投与の効果をＭＰＴＰ処理の１−５日前に種々の薬用量（皮下、腹腔内、経口又はi.c.v.）で化合物の一日投与後に調べる。マウスをＭＰＴＰ処理後４８時間で殺す。神経栄養化合物の別々の投与の効果を、ＭＰＴＰ処理後１〜５日で種々の投薬量（皮下、腹腔内、経口又はi.c.v.）で化合物の一日投与後に調べる。マウスを神経栄養化合物で最後に処理した後４８時間で殺す。２つの化合物の組み合わせ投与の効果を、ＭＰＴＰ処理の１−５日前に種々の薬用量（皮下、腹腔内、経口又はi.c.v.）でアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニストの一日投与によって、ついで同一動物においてＭＰＴＰ処理後１〜５日で種々の投薬量（皮下、腹腔内、経口又はi.c.v.）で神経栄養化合物の一日投与によって調べる。マウスを神経栄養化合物で最後に処理した後４８時間で殺す。脳を迅速に除き、マウスの線条体を切断し、凍結させ、ドパミン及びその代謝物 ＨＶＡ及びＤＯＰＡＣの生化学分析まで−８０℃で貯蔵する。分析のその日に、マウス１匹あたり１つの線条体（重さ５−７ｍｇ）を５％ＥＤＴＡ含有０．１Ｎ 過塩素酸１ｍｌにホモジナイズする。３０分間遠心分離１４，００００×Ｇ後、上澄み２００μＬをガラス０．２２μｍによって濾過する。ついで２０μＬを下記カラム（Caracholamine HR-80 4.6mm ×80mm 3μｍ Nucleosil C 18) を有するESA Coulochem II HPLC 装置に注入する。溶離剤はＮａＨ2ＰＯ4１０．２５ｇ、ＥＤＴＡ１８５ｍｇ、オクタンスルホン酸１００ｍｇである。９％メタノール、ｐＨ３．７をＭｉｌｌｉＱ ｗａｔｅｒに添加し、０．２２μｍによって濾過する。ＣｏｌｏｃｈｅｍＥＳＡ分析細胞は５０１４Ａであり、ＥＳＡ検出器は次の設定を有する：Ｅ２−１７５ｍＶ、ドパミン、ＤＯＰＡＣ及びＨＶＡの溶離に対する実行時間（run time) （ＤＯＰＡＣ＝４．３分；ドパミン＝６．４分；及びＨＶＡ＝１２．７分）。自動注入器ＳＨＩＭＡＤＺＹ ｓｉｌ−１０Ａはつぎの設定を有する；注入容量２０μＬ、分析時間１６分、温度４℃。ポンプからの流速は０．８０ｍｌ／分である。分析を、それぞれ１２回分析を行ったドパミン、ＨＶＡ及びＤＯＰＡＣの３ｐＭのスタンダードを用いて目盛りを定め、そしてスタンダードカーブと比べる。
【０１２２】
方法１３
線条体６−ＯＨＤＡ病変後、アデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニスト及び神経栄養活性を有する化合物の別々の投与又は組み合わせ投与の黒質ドパミン作動性ニューロン変性への作用
線条体６−ＯＨＤＡ病変後、黒質において生存するドパミンニューロンの数を増加させる、アデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニスト及び神経栄養活性を有する化合物の別々の投与又は組み合わせ投与の能力を判定する。
【０１２３】
FluoroGold（０．９％ＮａＣｌ中の０．２％溶液、０．２μＬ／side) をハロタン麻酔された雄性Sprague Dawleyラット（体重約２００−２５０ｇ）の線条体に１０μＬハミ ルトン注射器で左右に注射する。次の座標を使用する：ＡＰ＝＋１．０ｍｍ；ＭＬ＝＋／−３．０ｍｍ；ＤＶ＝−５．０ｍｍ，歯バー（tooth bar) ＝０．０。１週間後、６−ＯＨＤＡ（０．０２％アスコルビン酸が補充された０．９％ＮａＣｌに溶解された遊離塩基２０μｇ）を次の座標(coordinate)：ＡＰ＝＋１．０ｍｍ；ＭＬ＝−３．０ｍｍ；ＤＶ＝−５．０ｍｍ，tooth bar＝０．０を用いてガラス製キャピラリーで線条体に一側性に注射する。アデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニストの別々の投与の効果を、毎日又は６−ＯＨＤＡ注射後の特定の時間に種々の薬用量（皮下、腹腔内、経口又はi.c.v.）で化合物の投与後に調べる。２つの化合物の組み合わせ投与の効果を、毎日又は６−ＯＨＤＡ注射前の特定の時間に種々の薬用量（皮下、腹腔内、経口又はi.c.v.）でアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニストの投与によって、ついで同一動物において毎日又は６−ＯＨＤＡ注射前の特定の時間に種々の薬用量（皮下、腹腔内、経口又はi.c.v.）で神経栄養化合物の投与によって調べる。６−ＯＨＤＡ注射３〜４週間後、ラットを深く麻酔し、１分間０．９％ＮａＣｌを用いて、ついで６分間０．１Ｍリン酸緩衝液中の４％パラホルムアルデヒドを用いて心臓経由で(transcardically) 潅流する。
【０１２４】
脳を切断し、３〜６時間ホルマリン中に入れ（postfixed)、ついで４８時間０．１Ｍリン酸緩衝液中の２５％ショ糖に移す。一連の４０μｍ切片を線条体及び黒質によるミクロトミーを凍結して得る。切片をマウス−ａｎｔｉ−ＴＨ（Chemicon, #MAB 318) を用いてチロシン ヒドロキシラーゼ（ＴＨ）免疫活性のために染色する。切片をＫＰＢＳ中で洗浄し、その後ＫＰＢＳ中の１０％メタノール＋３％過酸化水素を用いて急冷する。ＫＰＳＢ中の２％正常のウマ血清（ＮＨＳ）＋０．３％トリトンＸ−１００を用いて１時間予備インキュベートする。その後切片をＫＰＳＢ中のマウス−ａｎｔｉ−ＴＨ（Chemicon, #MAB 318) １：２０００＋２％ＮＨＳ＋０．３％トリトンＸ−１００中で一晩インキュベートする。ＫＰＢＳ中で洗浄した後、切片をＫＰＢＳ中の０．３％トリトンでビオチン化ウマ抗マウス（ベクター）１：２００中で２時間インキュベートする。ＫＰＢＳ中で洗浄した後、免疫活性をＡＢＣ反応（ベクターキット）によって、ついでＤＡＢ染色によって可視化する。６−ＯＨＤＡ−病変側及び−無傷側でのドパミン作動性ニューロンの生存を、フルオロゴールド蛍光を示す黒質中で反対に標識されたニューロンの数をステレオロジカリーに（stereologically)カウントし、そしてＴＨ免疫活性を示すニューロンの数をカウントしてブラインドリーに定量化する（quantified blindly) 。ある場合には、ニューロン生存度を、生存するドパミン作動性細胞分画に基づき各切片に１から５のスコアを割り当てて見積もる。上記分画はフルオロゴールド蛍光及び（又は）ＴＨ免疫組織化学（immunohistrochemistry)のために処理された切片を観察してブラインドリーに見積もられている。スコア“１”をすべてのニューロンが生存し、そして非病変ニューロンと形態学的に区別されない切片に割り当て、一方スコア“５”をニューロンが６−ＯＨＤＡ病変側で生存する切片に割り当てる。
Claims (11)
- パーキンソン病患者の治療、予防又は軽減に使用される薬剤を製造するために神経栄養活性を有する化合物少なくとも１個とアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニスト少なくとも１個を使用する方法。
- アデノシンＡ2AレセプターアンタゴニストがＫＷ−６００２，ＺＭ−２４１３８５、８ＦＢ−ＰＴＰ、ＳＣＨ−５８２６１、ＫＦ−１７８３７、ＣＧＳ−１５９４３、ＤＭＰＸ及びそれらの薬学的に許容し得る塩から選ばれる、請求項１記載の使用する方法。
- 神経栄養活性を有する化合物が、
５−（４−クロロフェニル）−８−メチル−６．７．８．９−テトラヒドロ−１−Ｈ−ピロロ［３．２−ｈ］イソキノリン−２，３−ジオン−３−オキシム；
５−（４−クロロフェニル）−６．７．８．９−テトラヒドロ−１−Ｈ−ピロロ［３．２−ｈ］ナフタレン−２，３−ジオン−３−オキシム；
ＧＤＮＦ；
ニューブラスチン(Neublastin)
及びそれらの薬学的に許容し得る塩より成る群から選ばれた化合物である、請求項１又は２記載の使用する方法。 - 神経栄養活性を有する化合物がＧＤＮＦであり、アデノシンＡ2AレセプターアンタゴニストがＳＣＨ−５８２６１又はＫＦ−１７８３７である、請求項１記載の使用する方法。
- 神経栄養活性を有する化合物少なくとも１個とアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニスト少なくとも１個の治療上有効な量を薬学的に許容し得るキャリヤー又は希釈剤少なくとも１個と共に含有する薬学的調合物。
- アデノシンＡ2AレセプターアンタゴニストがＫＷ−６００２，ＺＭ−２４１３８５、８ＦＢ−ＰＴＰ、ＳＣＨ−５８２６１、ＫＦ−１７８３７、ＣＧＳ−１５９４３、ＤＭＰＸ及びそれらの薬学的に許容し得る塩から選ばれる、請求項５記載の薬学的調合物。
- 神経栄養活性を有する化合物が、
５−（４−クロロフェニル）−８−メチル−６．７．８．９−テトラヒドロ−１−Ｈ−ピロロ［３．２−ｈ］イソキノリン−２，３−ジオン−３−オキシム；
５−（４−クロロフェニル）−６．７．８．９−テトラヒドロ−１−Ｈ−ピロロ［３．２−ｈ］ナフタレン−２，３−ジオン−３−オキシム；
ＧＤＮＦ；
ニューブラスチン
及びそれらの薬学的に許容し得る塩より成る群から選ばれた化合物である、請求項５又は６記載の薬学的調合物。 - パーキンソン病患者の治療、予防又は軽減に使用するための請求項５〜７のいずれかに記載の薬学的調合物。
- 治療用剤として使用される、神経栄養活性を有する化合物少なくとも１個とアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニスト少なくとも１個の組み合わせ物。
- パーキンソン病患者の治療、予防又は軽減方法において、この方法が神経栄養活性を有する化合物少なくとも１個とアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニスト少なくとも１個の治療上有効な組み合わせ物を上記患者に投与することを特徴とする、上記方法。
- 神経栄養活性を有する化合物少なくとも１個とアデノシンＡ2Aレセプターアンタゴニスト少なくとも１個から成るパーツを含むキット。
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