CZ20014456A3

CZ20014456A3 - Způsob přípravy intravenózního immunoglobulinu a přípravku, který jej obsahuje

Info

Publication number: CZ20014456A3
Application number: CZ20014456A
Authority: CZ
Inventors: Raja R. Mamidi; Andranik Bagdasarian; Gorgonio Canaveral
Original assignee: Alpha Therapeutic Corporation
Priority date: 1999-06-15
Filing date: 2000-06-06
Publication date: 2002-05-15
Also published as: AU5722400A; IL146433A0; JP2003501480A; AU756071B2; WO2000076534A1; KR20020010921A; CA2375560A1; PL352910A1; ZA200110168B; EP1185290A4; EP1185290A1; HK1048252A1; BR0011648A; CN1358100A

Description

Způsob přípravy intravenózního imunoglobulinu a přípravku, který jej obsahuje

Oblast techniky

Vynález se týká integrálního vícestupňového komerčního způsobu přípravy imunoglobulinu vhodného pro intravenózní podávání obsahujícího IgG (γ-globulin) jako hlavní složku.

Dosavadní stav techniky

Je známa řada způsobů přípravy roztoků γ-globulinu vhodných pro intravenózní podávání z materiálů, které vycházejí z Cohnovy frakcionace lidské plazmy. Některé Cohnovy frakce obsahují vyšší titr γ-globulinu než jiné. Obvyklým výchozím materiálem pro roztok γ-globulinu jsou Cohnovy frakce II nebo frakce II + III.

Ačkoliv způsoby z dosavadního stavu techniky zahrnují řadu separačních a sterilizačních technik, neustále se hledají nové modifikace pro zlepšení jak čistoty a stability konečného produktu, tak i celkového výtěžku.

Mnoho komerčních způsobů zahrnuje buď krok s použitím rozpouštědla/ detergentů, nebo krok s použitím vysoké teploty, které mají sloužit pro inaktivaci virů. V dosavadním stavu techniky není znám vícestupňový způsob, který by vycházel z Cohnovy frakce II, nebo frakce II + III a zahrnoval by dva různé kroky pro inaktivaci virů jako součást účinného kontinuálního způsobu přípravy γ-globulinu ve vysokém výtěžku.

Americký patent 5 151 499 (Kameyama a kol.) je řízen na způsob přípravy virově inaktivovaných proteinových přípravků, které jsou podrobeny inaktivaci cílené na obalené viry za použití rozpouštědla/ detergentů a inaktivaci cílené na neobalené viry za použití vysoké teploty. Podle tohoto způsobu je s výhodou krok s použitím rozpouštědla/ detergentů aplikován jako první v přítomnosti inhibitoru proteas a krok s použitím vysoké teploty následuje potom. V případě, že je krok s použitím vysoké teploty prováděn v kapalném stavu, protein je nejprve získán z rozpouštědla/ detergentů adsorpcí na sloupec pro iontově výměnnou chromatografií, než je aplikován krok s použitím vysoké teploty.

Krok s použitím vysoké teploty lze v kapalné fázi provádět v přítomnosti stabilizátoru na bázi cukru, cukerného alkoholu nebo aminokyseliny. Přestože patent 5 151 499 uvádí mnoho výchozích proteinových přípravků včetně imunoglobulinu, uvedené příklady přípravy zahrnují faktor IX, thrombin, fibrinogen a fíbronektin. Není dále uváženo odstranění proteinu denaturovaného při kroku s použitím vysoké teploty frakcionací.

Americký patent 5 371 196 je řízen na purifikaci sekretovaného imunoglobulinu A. Jsou v něm popsány způsoby inaktivace vysokou teplotou v kapalné fázi nebo různé kombinace inaktivace vysokou teplotou a rozpouštědlem. Po každém kroku a též jako poslední krok je aplikována frakcionace polyethylenglykolem.V tomto patentu není zmínka o titru imunoglobulinu nebo vysokém titru γ-globulinu.

Některé způsoby přípravy roztoků γ-globulinu vhodných pro intravenózní podávání z dosavadního stavu techniky popisují zahrnutí kroku s použitím vysoké teploty v kapalné fázi v přítomnosti tepelného stabilizátoru na bázi sorbitolu ve vícestupňovém purifikačním postupu vycházejícím z Cohnovy frakce II + III. V americkém patentu 4 845 199 (Hirao a kol.) jsou Cohnovy frakce II + III podrobeny frakcionaci polyethylenglykolem (dále označován jako PEG), a to napřed 8 obj. % PEG a pak 12 obj. % PEG, dále iontově výměnné chromatografii (DEAE-Sephadex) a odstranění protilátek lidských krevních skupin před krokem s použitím vysoké teploty v kapalné fázi v přítomnosti tepelného stabilizátoru na bázi sorbitolu.

Příklad 1 v americkém patentu 4 876 088 (Hirao a kol.) naproti tomu popisuje přípravu roztoku γ-globulinu vhodných pro intravenózní podávání vycházející z Cohnovy frakce II + III. Tímto způsobem jsou kašovité frakce suspendovány ve vodě, pH je upraveno na 5,5, frakce jsou centrifugovány, přičemž je supernatant podroben inaktivaci virů vysokou teplotou v přítomnosti 33 obj. % sorbitolu, a následuje frakcionace PEG (6 obj. %/ 12 obj. %), která odstraní protein denaturovaný teplem, a další purifíkační kroky včetně iontově výměnné chromatografíe na DEAE-Sephadexu.

Podstata vynálezu

Vynález se týká integrálního komerčně využitelného způsobu přípravy vysoce čistého roztoku γ-globulinu vycházejícího z Cohnovy frakcionace.

444* ·· ·· ·· ·· • · · ··'*· *444

4 4 4 · · · * · * • 4 4 4 4 · * · * · • · « · · · · · «·*· *·* 4« ···· 4* ····

Vynález se dále týká přípravy roztoku vysoce čistého γ-globulinu vhodného pro intravenózní podání, který by neobsahoval obalené, neobalené viry ani viry citlivé na teplotu.

Dalším předmětem vynálezu je komerční způsob přípravy γ-globulinu, který zahrnuje odstranění jakéhokoliv denaturovaného proteinu vzniklého při sterilizaci za vysoké teploty před druhým krokem inaktivace virů.

Vynález se dále týká kontinuálního komerčního způsobu přípravy γ-globulinu bez nutnosti izolace γ-globulinového proteinu v průběhu sterilizace vysokou teplotou, frakcionace PEG a inaktivace virů s použitím rozpouštědla/ detergentu.

Vynález se týká těchto a dalších předmětů, které jsou z popisu zřejmé odborníkům. Podle tohoto vynálezu je alkoholická Cohnova frakce, která je někdy částečně purifikována, ale je bohatá na γ-globulin, vystavena působení vysoké teploty v kapalném mediu v přítomnosti tepelného stabilizátoru pro inaktivaci virů; roztok ošetřený vysokou teplotou je pak frakcionován PEG a bez izolace γ-globulinového proteinu je vystaven druhé inaktivaci virů v přítomnosti rozpouštědla, s výhodou směsi rozpouštědla a detergentu, čímž jsou inaktivovány obalené viry; následuje separace z rozpouštědla nebo směsi rozpouštědla a detergentu.

Ve výhodném provedení podle vynálezu je k spojenému produktu frakcionace PEG přidán bentonit, aby byly odstraněny další viry, předtím než dojde k inaktivaci virů rozpouštědlem nebo směsí rozpouštědla a detergentu.

Ve výhodném provedení podle vynálezu je tepelným stabilizátorem sorbitol a rozpouštědlem je trialkylfosfát.

V dalším výhodném provedení podle vynálezu jsou produkty denaturované při inaktivaci virů s použitím vysoké teploty odstraněny frakcionací PEG před druhou inaktivaci virů pro dosažení zvláště čistého γ-globulinu ošetřeného vysokou teplotou.

V dalším výhodném provedení podle vynálezu jsou jakékoliv přítomné částice odstraněny před aplikací rozpouštědla/ detergentu.

Ve výhodném provedení podle vynálezu je roztok γ-globulinu purifikován na pryskyřici pro výměnu aniontů.

Ve výhodných provedeních podle vynálezu je jednostupňový krok frakcionace PEG proveden bez precipitace požadovaného imunoglobulinu.

• 9 • 9 9 9

V jiném výhodném provedení podle vynálezu je roztok γ-globulinu purifikován na pryskyřici pro výměnu kationtů nebo diafiltrací a/ nebo filtrací tangenciálním tokem a následnou inaktivací virů.

V jiném provedení podle vynálezu se připraví γ-globulin sterilizovaný tepelně a systémem rozpouštědlo/ detergent, který je vhodný pro intravenózní podání.

Detailní popis vynálezu

Způsob podle vynálezu je kontinuální v tom smyslu, že když se jednou začne s určitým množstvím znečištěné výchozí frakce s obsahem imunoglobulinu, např. Cohnovy frakce II + III, probíhá až do konce (za získání vysoce purifíkovaného γ-globulinu jako výsledného produktu) bez izolace meziproduktů v podobě částečně purifikovaných γglobulinových částic.

Výchozím materiálem je frakce s obsahem imunoglobulinu. Tato frakce není zvláště omezena původem z lidské plazmy a obsahuje imunoglobulinovou frakci. Specifické příklady takových frakcí obsahujících imunoglobulin jsou frakce II + III a frakce II získané Cohnovou ethanolovou frakcionací a odpovídající kašovité frakce obsahující imunoglobulin. Dalšími výchozími materiály jsou kašovité frakce I + II + III, frakce II + III a frakce III. Výchozí materiál obsahuje někdy nečistoty, např. lidské protilátky krevních skupin, plasminogen, plasmin, kallikrein, aktivátor prekallikreinu, polymery IgM, IgA, IgG (označovány i jako „agregáty“) atd.

Výhodným výchozím materiálem jsou kašovité Cohnovy frakce II + III nebo frakce II. Kašovitou Cohnovu frakci II + III lze použít jako výchozí materiál přímo, nebo po předcházejícím promytí za vzniku „frakce II + IIIw“, která je pak použita způsobem podle vynálezu. „Frakce II + III“ je precipitát Cohnovy frakce II + III promytý roztokem hydrogenfosforečnanu sodného.

Frakci II + IIIw lze získat suspendováním precipitátu frakce II + III ve studené vodě v poměru 1 kg kašovité frakce II + III na 20 objemových ekvivalentů vody. Roztok hydrogenfosforečnanu sodného se přidá tak, aby výsledná koncentrace byla 0,003 M, což umožňuje solubilizaci lipidů, lipoproteinů a albuminu. Dále se přidá vychlazený ethanol tak, aby výsledná koncentrace alkoholu byla 20 obj. %. Během přidávání alkoholu je teplota

·· ····

•9 · · · · postupně snižována na-5 ± 1 °C a pH je udržováno nebo upraveno na 7,2 ±0,1, např. pomocí acetátového pufru nebo zředěného hydroxidu sodného. Vzniklý precipitát frakce II + IIIw je izolován centrifugací a/ nebo filtrací při teplotě -5 ± 1 °C.

Před prvním krokem inaktivace virů podle vynálezu lze provést různé předběžné purifikační kroky a/ nebo kroky snižující množství agregátů. Když se např. používá frakce II + IIIw, která typicky obsahuje 20 obj. % alkoholu a více než 70 hmotn. % proteinu ve formě IgG, je suspendována ve 3 až 20 objemových ekvivalentech, s výhodou v 10 až 15 objemových ekvivalentech studené vody při teplotě 0 až 5 °C a při pH upraveném na 4,5 až 6,0, s výhodou 5 až 5,5, za použití acetátového pufru o pH 4,0 nebo kyseliny chlorovodíkové. Směs se míchá 2 až 15 hodin, aby všechen γ-globulin přešel do roztoku. Nerozpuštěné proteiny jako albumin a α-globuliny lze pak odstranit centrifugací a/ nebo filtrací.

Pokud je výchozím materiálem kašovitá frakce II + III, 1 kg této frakce je suspendován ve 3 až 20 kg, s výhodou 13 až 17 kg studené vody. pH suspenze je upraveno na 4,5 až 6,0, s výhodou na 4,8 až 5,4. Suspenze se míchá 1 až 20 hodin, s výhodou 2 až 10 hodin, při teplotě 0 až 25 °C, s výhodou 0 až 10 °C. Nerozpustný materiál je pak odstraněn filtrací hustým filtrem nebo centrifugací. Při aplikaci filtrace se před separací někdy přidává pomocný filtrační prostředek v množství 1 až 5 obj. %. Materiál po centrifugací nebo filtraci lze dále purifikovat membránovým filtrem. Purifikovaný roztok lze zakoncentrovat na koncentraci 1 až 12 hmotn. %, s výhodou 4 až 8 hmotn. % proteinu ultrafiltrací za použití membrán s hranicí propustnosti 10 000 až 100 000.

Pokud je výchozím materiálem jiná Cohnova frakce, může být prvním krokem nebo kroky v případě potřeby předběžná purifíkace, kterou se získá frakce s vysokým obsahem IgG, která je pak dále zpracována. Např. pokud je Cohnova frakce II (obsahuje více než 95 hmotn. % IgG) oddělena od Cohnovy frakce III a je dále zpracována, první zpracování může probíhat při kyselém pH 3,2 až 5,0, s výhodou 3,8 až 4,2, jak popisuje Uemura a kol. (americký patent 4 371 520), aby došlo k rozbití imunoglobulinových agregátů na imunoglobulinové monomery a dimery, protože je známo, že tyto agregáty mají antikomplementární aktivitu (ACA). Alternativně lze při použití Cohnovy frakce II + III jako výchozího materiálu aplikovat nízké pH (Uemura a kol., americký patent 4 371 520) jako další krok následující po počátečním purifikačním kroku, jak je popsáno výše, a předcházející kroku inaktivace virů s použitím vysoké teploty.

• 9 ♦ · • · · · · · « · • · • ··· · · • · · · · · · · ······ · ·

9 9

9

9999

Pro krok tepelné sterilizace je imunoglobulinový protein ve formě vodné směsi získaný z předchozí částečné purifíkace, např. jako filtrát z kašovité frakce II + III, použit tak, jak je, nebo je zakoncentrován na 1 až 12 hmotn. %, s výhodou 4 až 8 hmotn. % proteinu ultrafiltrací a přidá se k němu tepelný stabilizátor na bázi cukru, cukerného alkoholu a/ nebo aminokyseliny. Tepelný stabilizátor je s výhodou sacharosa, maltosa, mannitol nebo sorbitol, nej výhodněj i sorbitol. K imunoglobulinovému roztoku se cukr nebo cukerný alkohol přidává ve formě prášku, nebo je nejprve smíšen s malým objemem vody a pak přidán pro dosažení výsledné koncentrace 25 až 50 obj. % až do nasycení, s výhodou 30 až 40 hmotn. %. V tomto stadiu obsahuje vodný roztok imunoglobulinu dostatečné množství vody, takže celková koncentrace proteinu je 1 až 8 hmotn. %, přičemž typický výchozí materiál frakce II + III obsahuje asi 300 g proteinu na 1 kg suspenze.

Po přídavku tepelného stabilizátoru je pH roztoku upraveno na 4,5 až 6,5, s výhodou 5,0 až 6,0 a směs je zahřívána na 50 až 70 °C po dobu 1 až 20 hodin, s výhodou na 60 °C po dobu 10 až 11 hodin, aby byly inaktivovány viry citlivé na vysokou teplotu. Krok s použitím vysoké teploty nejen inaktivuje viry, ale díky denaturačnímu účinku na proteiny s výhodou snižuje množství určitých nežádoucích proteinů běžně přítomných v Cohnových frakcích II + III, jako např. prekallikrein, plasmin, plasminogen a IgA.

Po kroku s použitím vysoké teploty se roztok buď přímo dále zpracovává, nebo je zředěn studenou vodou až do 5násobku objemu původního roztoku. Roztok je pak ochlazen na 0 až 10 °C, s výhodou na 0 až 5 °C.

Pak je na tepelně sterilizovaný roztok aplikována frakcionace PEG, což je způsob dobře známý z dosavadního stavu techniky o purifikaci imunoglobulinu, který slouží k separaci požadovaného IgG monomeru a dimeru od agregátu IgG a od dalších nečistot, které se běžně vyskytují ve výchozí proteinové frakci plazmy. Ve způsobu podle vynálezu se pomocí frakcionace PEG dosahuje též separace požadovaného IgG monomeru a dimeru a nežádoucích denaturovaných proteinových produktů vzniklých při tepelné sterilizaci. Tyto denaturované proteinové produkty jsou denaturovaný aktivátor prekallikreinu, plasminogen, plasmin, IgA, IgM a agregáty.

Ve způsobu podle vynálezu lze uplatnit kterýkoliv z způsobů frakcionace PEG uvedených v dosavadním stavu techniky, pokud jsou koncentrace PEG a pH vybrány tak, že požadovaný monomer a dimer IgG zůstanou v roztoku, zatímco nežádoucí proteiny jako agregáty se vysrážejí z roztoku. PEG se přidává ve formě prášku, vloček nebo jako 50% >9 9999 ·· 9· ·· ♦*

9 · 99*9 9999

9999 99 9 99 9 roztok přímo k tepelně sterilizovanému roztoku v takovém množství, aby bylo dosaženo požadované koncentrace PEG.

Frakcionaci PEG lze provádět při pH 5,0 až 7,5, s výhodou 6,0 až 7,5, když je výchozím materiálem kašovitá frakce II + IIIw, a s výhodou 5,5 až 6,0, když je výchozím materiálem kašovitá frakce II + III, přičemž koncentrace PEG je 4 až 8 hmotn. %, s výhodou 4 až 6 hmotn. % při použití kašovité frakce II + IIIw, nebo 6 až 8 hmotn. % při použití kašovité frakce II + III. Při teplotě 0 až 2 °C lze frakcionaci PEG provádět po dobu 1 až 8 hodin; precipitát je pak odstraněn filtrací nebo centrifugách

Jako volitelný krok pro odstranění virů je k roztoku po centrifugaci nebo filtraci přidán bentonit ve výsledné koncentraci 0,05 až 2,0 obj. %, s výhodou 0,1 až 1,0 obj. %, směs je míchána po dobu 1 až 5 hodin a bentonitová kaše je odstraněna filtrací.

Konečným nezbytným krokem podle vynálezu je druhý krok inaktivace virů s použitím rozpouštědla nebo směsi rozpouštědlo/ detergent. Jak je popsáno níže, lze provést další purifikační kroky, zvláště kroky zahrnující použití iontově výměnných pryskyřic; tyto kroky lze aplikovat před, nebo po inaktivaci virů s použitím směsi rozpouštědlo/ detergent. Jednou možností je krok založený na výměně aniontů, který předchází inaktivaci virů s použitím směsi rozpouštědlo/ detergent, čímž se dále odstraní albumin, transferrin nebo aktivátor prekallikreinu. Ve výhodném provedení podle vynálezu se krok založený na výměně kationtů provádí po inaktivaci virů s použitím směsi rozpouštědlo/ detergent. Tímto krokem se odstraní z IgG určité nežádoucí proteinové materiály (jako IgA, IgM a albumin), které jsou přítomny v lidské plazmě, a PEG a na zbylé reagenty se aplikuje krok s použitím rozpouštědla/ detergentu.

Pokud toho není dosaženo jinak během celého procesu, z roztoku je před krokem s použitím rozpouštědla/ detergentu třeba odstranit všechny pevné částice, které jsou tvořeny denaturovaným proteinem. Proto je výhodné před přidáním rozpouštědla/ detergentu zfiltrovat roztok filtrem s propustností 1 μιη nebo jemnějším. Tento krok sníží též pravděpodobnost výskytu viru ve velké částici, který by nebyl vystaven působení rozpouštědla-detergentu.

Filtrát lze diafiltrovat nebo zakoncentrovat až na 12 hmotn. % proteinu, s výhodou 5 až 10 hmotn. % proteinu, a pak ho vystavit působení rozpouštědla nebo rozpouštědla/ detergentu.

Rozpouštědlem výhodným pro inaktivaci virů je trialkylfosfát. Trialkylfosfát podle vynálezu není předmětem zvláštního omezení, je ale výhodné použít tri(n-butyl)fosfát (dále

0000 44 44 * 4 0 0 0 0 · • 400 · · * < 0 0 4 0 *

0 0 4 0

0040 04* ·· *···

00 0 4· 0

0 ·

0 0

0 0 <0 4000 jako „TNBP“). Dalším výhodným trialkylfosfátem je tri(terc. butyl)fosfát, tri(n-hexyl)fosfát, tri(2-ethylhexyljfosfát atd. Je možné použít směs 2 a více různých trialkylfosfátů.

Tri alkyl fosfát se používá v množství 0,01 až 10 obj. %, s výhodou 0,1 až 3 hmotn. %.

Trialkylfosfát lze použít v přítomnosti detergentu nebo povrchově aktivní látky, nebo bez. nich. Je výhodné jej použít v kombinaci s detergentem. Detergent působí tak, že zvyšuje kontakt virů v imunoglobulinovém roztoku s trialkylfosfátem.

Příklady detergentu zahrnují polyoxyethylenové deriváty mastných kyselin, některé estery bezvodého sorbitolu jako polysorbát 80 (obchodní název Tween 80 atd.) a polysorbát 20 (obchodní název Tween 20 atd.) a dále zahrnují neiontová činidla do promývací lázně jako oxyethylovaný alkylfenol (obchodní název Triton X-100 atd.). Příklady zahrnují další povrchově aktivní látky a detergenty jako zwitteriontové detergenty atd.

Pokud se používá detergent, nepřidává se v kritickém množství; používá se např. v koncentracích 0,001 až 10 hmotn. %, s výhodou 0,01 až 3 hmotn. %.

Aplikace trialkylfosfátů na přípravek s obsahem imunoglobulinu se provádí při 20 až 35 °C, s výhodou při 25 až 30 °C po dobu více než 1 hodiny, s výhodou 5 až 8 hodin.

Během tohoto krokuje imunoglobulin přítomen v množství 5 až 10 hmotn. % proteinu ve vodném mediu.

Nebyl-li volitelný krok založený na výměně aniontů proveden před krokem s použitím rozpouštědla/ detergentu, lze jej provést i po něm. Na produkt po kroku s použitím rozpouštědla/ detergentu se s výhodou aplikuje alespoň krok založený na výměně kationtů. Iontově výměnné způsoby se aplikují na vodné roztoky imunoglobulinu po kroku s použitím rozpouštědla, nebo rozpouštědla/ detergentu, které mají pH obecně 4,5 až 6,5 a v případě potřeby nízkou iontovou sílu pro maximální adsorpci IgG. Koncentrace proteinu se s výhodou pohybuje v rozmezí 1 až 15 obj. %, výhodněji 3 až 10 obj. %. Nosič pro iontovou výměnu se ekvilibruje se stejným vodným rozpouštědlem, jaké se jinak v postupu používá.

Kontinuální systém se realizuje tak, že roztok imunoglobulinu prochází sloupcem s nosičem pro iontovou výměnu v poměru 10 až 100 ml na 1 ml nosiče a neadsorbovaná frakce se jímá.

Používané nosiče pro výměnu aniontů zahrnují skupiny pro výměnu aniontů navázané na nerozpustný nosič. Skupiny pro výměnu aniontů zahrnují diethylaminoethyl (DEAE), kvarterní aminoethyl (QAE) atd. a nerozpustné nosiče zahrnují agarosu, celulosu, dextran,

ΦΦ ΦΦ ·· ♦·

ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ φ φ ΦΦΦ φ φ φ φ φ φ φ · φ φ φ φ φ φ φφ ΦΦΦΦ φφ ΦΦΦΦ •Φ ΦΦΦΦ φ φ φ

ΦΦΦΦ φ φ polyakrylamid atd. 1 gram pryskyřice DEAE-Sephadexu A-50 nabobtná v 0,4% roztoku chloridu sodného na 20 až 30 g mokré hmotnosti.

Vhodné nosiče pro výměnu kationtů zahrnují karboxymethylovaný Sephadex (CMSephadex), CM-celulosu, SP-Sephadex, CM-Sepharosu a SP-Sepharosu. Nabobtnalý nosič (např. 1 g CM-Sephadexu C-50 nabotná v 0,4% roztoku chloridu sodného na 25-35 g mokré hmotnosti) se používá jako stacionární fáze ve sloupci, jímž prochází kontinuálně při teplotě 0 až 5 °C roztok imunoglobulinu po kroku s použitím rozpouštědla, nebo rozpouštědla/ detergentu.

Když se za výše uvedených podmínek použije nosič pro výměnu kationtů, adsorbuje se IgG. který se po promytí nosiče s adsorbovaným proteinem eluuje např. 1,4M chloridem sodným.

Pokus se v postupu nepoužije kroku založeného na iontové výměně, roztok po kroku s použitím rozpouštědla, nebo rozpouštědla/ detergentu je diafiltrován a zakoncentrován filtrací tangenciálním tokem, aby byly odstraněny rozpouštědlo/ detergent a PEG. V případě, že je ve výsledném produktu požadován velmi nízký obsah rozpouštědla-detergentu a PEG, výhodným krokem je aplikace výměny kationtů a následná filtrace tangenciálním tokem.

Po všech výše uvedených krocích potupu podle vynálezu je IgG vyčiřen, diafiltrován a zakoncentrován do potřebné míry. Pokud je to vhodné, lze přidat stabilizátor jako D-sorbitol a po konečných úpravách získat roztok přípravku s obsahem 50 až 100 mg/ml IgG a 50 mg/ml D-sorbitolu s pH asi 5,4. Pro další odstranění virů lze tento roztok zfiltrovat filtrem o velikosti pórů 30 nm nebo menších. Tento stabilizovaný a volitelně nanofiltrovaný roztok je pak sterilně zfiltrován sterilizovaným filtrem zadržujícím bakterie a převeden do ampulek.

Následující příklad slouží k ilustraci způsobu podle vynálezu, není však v žádném směru omezující.

Příklady podle vynálezu

Příklad 1

1800 g kašovité frakce II + III bylo suspendováno v 15 kg studené vody. Po hodinovém míchání při teplotě 0 až 5 °C bylo pH suspenze upraveno zředěnou kyselinou octovou na 5,0. Po míchání po dobu 3 hodin bylo do roztoku přidáno 900 g pomocného filtračního prostředku (celit promytý kyselinou) a směs byla míchána 45 minut. Nerozpustný • 9 »·♦· • 9 9 · ·· • 9 9 • · ♦ · · · * • 9 · • 99 • 99 ·« 9999

99

9 9 9 • · · • 99 ·

9 9

9999 materiál byl spolu s celitem odstraněn filtrací. Filtrát byl vyčiřen a pak zakoncentrován ultrafiltrací na membráně s propustností 100 000, takže výsledná koncentrace proteinu byla 6 hmotn. %.

Ke koncentrovanému proteinovému roztoku byl přidán D-sorbitol do výsledné koncentrace 33 obj. % a roztok byl míchán při pH 5,0, dokud se všechen sorbitol nerozpustil. Roztok byl dále zahříván na 60 °C po dobu 10 hodin. Zahřátý roztok byl pak ochlazen na méně než 10 °C a zředěn stejným dílem studené vody. pH zředěného roztoku bylo upraveno na 5,7 zředěným roztokem hydroxidu sodného a pak byl přidán 50% roztok PEG 3350 do výsledné koncentrace 6 obj. %. Po míchání po dobu 2 hodin při pH 5,7 byl vzniklý precipitát odstraněn filtrací s pomocným filtračním prostředkem (celit promytý kyselinou) v množství 3 obj. %. Asi 3,5 kg 6% filtrátu PEG bylo dáno stranou pro další experimenty. U zbylého 6% filtrátu PEG bylo pH upraveno na 4,9, byl přidán bentonit v množství 1 g na 1 kg filtrátu; pH přitom vzrostlo na 5,1. Po 2 hodinách míchání byla suspenze zfiltrována, aby byl bentonit odstraněn. Filtrát byl pak zakoncentrován a diafiltrován ultrafiltrací na membránách s hranicí propustnosti 100 000.

pH roztoku bylo upraveno na 6,5 zředěným hydroxidem sodným a pak bylo přidáno 0,4 kg předem nabotnalé pryskyřice DEAE-Sephadex A-50. Po smíchání proteinového roztoku s pryskyřicí byla pryskyřice odstraněna filtrací. K filtrátu byl přidán roztok rozpouštědla-detergentu (SD) s obsahem směsi tri(n-butyl)fosfátu (TNBP) a polysorbátu 80 do výsledné koncentrace 0,3 obj. % a 1,0 obj. % (v tomto pořadí). Po inkubaci s SD při 27 °C po dobu 6 hodin byl roztok ochlazen na 0 až 5 °C, vodivost byla roztokem chloridu sodného upravena na 7 mS/cma pH bylo upraveno na 5,8. K roztoku bylo přidáno 2,7 kg předem nabobtnalé pryskyřice CM-Sephadexu C-50, suspenze byla zamíchána a pak zfiltrována, aby byla pryskyřice izolována. Pryskyřice s adsorbovaným IgG byla promyta 0,3% chloridem sodným a adsorbovaný IgG byl eluován 1,4M chloridem sodným. Eluát byl vyčiřen, zakoncentrován a diafiltrován studenou vodou. Byl přidán D-sorbitol a po konečných úpravách byl získán roztok přípravku s obsahem 100 mg/ml IgG a 50 mg/ml D-sorbitolu a s pH 5,4. Po konečných úpravách byl roztok sterilně zfiltrován a převeden do skleněných ampulek. Výsledky testů konečného produktu jsou uvedeny v následující tabulce:

*« ♦ «·· ► 9 9

999

Výsledky testů konečného produktu

Parametr testu	Výsledek
Protein (mg/ml)	99,2
Čistota IgG (%)	100
Distribuce molekul (HPLC):
Monomer (%)	89
Dimer (%)	11
Aktivátor prekallikreinu (% CBER ref. č.3)	<2,5
Antikomplementární aktivita (CH50 U/mg IgG)	0,2

Možné modifikace způsobu podle vynálezu jsou zřejmé odborníkům.

Průmyslová využitelnost

Claims

PATENTOVENAROKY

E Kontinuální způsob přípravy roztoku γ-globulinu vhodného pro intravenózní podávání, vyznačující se t i m, že zahrnuje:

a) aplikaci kroku s použitím vysoké teploty na roztok znečištěného γ-globulinu za takových časových a teplotních podmínek, aby byly inaktivovány viry citlivé na teplotu

b) aplikaci frakcionace polyethylenglykolem na roztok tepelně ošetřeného γ-globulinu bez jeho předchozí izolace, aniž by došlo k jeho precipitaci, aby byl získán purifíkovaný roztok γ-globulinu

c) aplikaci organického rozpouštědla na roztok purifikovaného γ-globulinu bez jeho předchozí izolace, aby byly inaktivovány obalené viry.
2. Způsob podle nároku l, v y z n a č u j i c i se t i m, že roztok znečištěného γ-globulinu obsahuje Cohnovu frakci I + II + III, kašovitou Cohnovu frakci II + III, Cohnovu frakci II + Illw nebo Cohnovu frakci II.
3. Způsob podle nároku 1, v y z n a č u j i c í se t i m, že roztok znečištěného γ-globulinu obsahuje proteiny z kašovité Cohnovy frakce II + III.
4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že na roztok znečištěného γglobulinu je aplikován alespoň jeden purifikační krok před krokem s použitím vysoké teploty (a) a že na roztok částečně purifikovaného γ-globulinu je aplikován krok s použitím vysoké teploty (a), aniž by došlo k jeho předchozí izolaci.
5. Způsob podle nároku 1, v y z n a č u j i c i se t i m, že krok s použitím vysoké teploty (a) se provádí při teplotě 50 až 70 °C po dobu 10 až 20 hodin.
6. Způsob podle nároku 5, v y z n a č u j i c i se t i m, že krok s použitím vysoké teploty (a) se provádí při teplotě 60 °C po dobu 10 až 11 hodin.

•V 9999 • · * • ··· • 9 • · • · · · 9 9 · · • · · · · * • · · » · · · • « « · · ·

9 9 · fc·· * · *** ·
7. Způsob podle nároku 1, v y z n a č u j í c í se t i m, že frakcionace polyethylenglykolem se provádí v jedné fázi zahrnující alespoň jeden krok, při němž jsou odstraněny nečistoty jako precipitát a při němž požadovaný γ-globulin zůstane v roztoku.
8. Způsob podle nároku 6, v y z n a č u j i c i se t í m, že roztok znečištěného γ-globulinu obsahuje proteiny z kašovité Cohnovy frakce II + 111.
9. Způsob podle nároku 1, v y z n a č u j i c i se t i m, že organické rozpouštědlo použité v kroku (c) je alkylfosfát.
10. Způsob podle nároku 7, v y z n a č u j í c i se t í m, že organické rozpouštědlo použité v kroku (c) je alkylfosfát
11. Způsob podle nároku 10, v y z n a č u j i c i se t i m, že alkylfosfát je tri(n-butyl)fosfát.
12. Způsob podle nároku 1, v y z n a č u j i c i se t i m, že organické obsahuje detergent.
13. Způsob podle nároku 11, v y z n a č u j i c i se t i m, že organické rozpouštědlo obsahuje detergent.
14. Způsob podle nároku 1, v y z n a č uj i c i se t i m, že po kroku (c) je na roztok γglobulinu bez jeho předchozí izolace aplikována pryskyřice pro výměnu kationtů.
15. Způsob podle nároku 7, v y z n a č u j i c i se t i m, že se na roztok γ-globulinu po frakcionaci polyethylenglykolem aplikuje krok vyčiření bentonitem.
16. Způsob podle nároku 15, v y z n a č u j i c i se t i m, že se na roztok γ-globulinu po vyčiření bentonitem aplikuje pryskyřice pro výměnu aniontů.
17. Způsob podle nároku 1, v y z n a č u j í c i se t i m, že po kroku (b) je na roztok γglobulinu aplikována pryskyřice pro výměnu aniontů.

·« ···« • · >

• ··* • · · • * »··· 999 r

·« • 9 · • · • 9

9 9

9999

99 99

9 · · · » · · • · · • · · ·*·»
18. Způsob podle nároku 14, v y z n a č u j í c í se t í m, že roztok γ-globulinu je po aplikaci pryskyřice pro výměnu kationtů zakoncentrován filtrací tangenciálním tokem.
19. Způsob podle nároku 1, v y z n a č u j í c í se t í m, že po kroku (c) je roztok γ-globulinu bez jeho předchozí izolace zakoncentrován filtrací tangenciálním tokem.
20. Roztok γ-globulinu vhodný pro intravenózní podávání, vyznačující se t í ni, že je připraven způsobem podle nároku 1.
21. Roztok γ-globulinu vhodný pro intravenózní podávání, vyznačující se t í m, že je připraven způsobem podle nároku 18.