KR20020010921A - 정맥투여용 면역 글로불린에 대한 제조 방법 및 결과물 - Google Patents

Abstract

바이러스 비활성화를 위한 감마 글로불린 용액의 열처리, 원하는 감마 글로불린의 침전 없이 불순물이 없는 감마 글로불린 용액을 얻기 위한 분획화, 정제된 감마 글로불린 용액을 더욱 바이러스 비활성화를 시키기 위해 용매-세제 처리에 의해 실질적으로 바이러스로 오염되지 않은 정맥투여용 감마 글로불린 용액을 위한 연속적 제조방법. 부분적으로 정제된 감마 글로불린 고체는 개시된 생산법으로 처리시 중간 산물로서 회수되지 않는다.

Description

정맥투여용 면역 글로불린에 대한 제조 방법 및 결과물{Manufacturing method for intravenous immune globulin and resultant product}

배경기술

인간 혈장의 콘 분획(Cohn fraction)으로부터 유래되는 출발물질로부터 정맥 내 투여 가능한 감마 글로불린( γ-globulin) 용액을 수득하는 다양한 공정들이 알려져 있다. 어떤 콘 분획은 다른 것들보다 훨씬 높은 감마 글로불린 역가를 가지고 있다. 일반적인 감마 글로불린 용액 제조용 출발물질은 콘 분획 II 또는 콘 분획 II + III이다.

선행기술 공정이 다양한 분리법 및 멸균기술을 이용하지만, 최종 산물의 순도, 안전성 및 전체 수율을 증진시키기 위해 공정의 변경이 끊임없이 요구된다.

많은 상업적 공정이 바이러스 비활성화를 위해 용매/세제(detergent) 단계 또는 열처리 단계를 이용한다. 현재까지, 선행기술은, 효율적이고 고수율의 감마 글로불린 제조공정의 부분으로서, 콘 분획 II 반죽(paste)또는 콘 분획 II + III 반죽(paste)로부터 출발하는 두 가지의 서로 다른 바이러스 비활성화 공정을 포함한 다단계 공정을 제공하고 있지 않다.

카메야마(Kameyama) 등의 미합중국특허 제 5,151,499호는 단백질 혼합물을 용매/세제에 처리하여 외피(envelope) 바이러스에 대한 비활성화 및 단백질 혼합물을 열처리하여 비외피(nonenvelope) 바이러스에 대해 비활성화시키는 바이러스 비활성화된 단백질 혼합물의 생산공정에 관한 것이다. 상기 특허는 바람직하게 프로테아제(protease) 억제제 존재하에 용매/세제 단계를 먼저 수행하고, 열처리를 바로 뒤에 하는 것을 개시한다. 액체 상태에서 열처리 수행시, 단백질은 열처리 전에 이온교환 컬럼에 흡착시켜 용매/세제로부터 먼저 회수된다. 액체 열처리는 당, 당 알코올 또는 아미노산 안정화제의 존재하에 수행될 수 있다. 상기 특허가 면역글로불린을 포함하는 많은 출발 단백질 조성물을 열거하였지만, 주요 생산예는 Factor IX, 트롬빈, 피브리노오겐 및 파이브로넥틴이다. 또한, 분획화 과정 중 열처리 단계에서 생긴 변성된 단백질의 제거를 고려하지 않았다.

유키(Yuki) 등의 미합중국특허 제 5,371,196호는 분비형 면역글로불린 A의 정제법에 관한 것이다. 바이러스 비활성화를 위해 액체 열처리 또는 액체 열처리와 용매처리의 다양한 조합을 기술하고 있다. 폴리에틸렌 글리콜 분획화가 마지막 단계로서 항상 각 단계의 뒤에 사용된다. 상기 특허는 높은 감마 글로불린 역가의 면역 혈청 글로불린에 관한 것은 아니다.

정맥주사용 감마 글로불린 용액 생산을 위한 일부 선행기술 공정은 콘 분획 II + III 반죽으로 시작하는 다단계 정제공정에서 소비톨(sorbitol) 열안정화제의 존재하에 수행되는 액제 열처리 단계의 도입을 기술하고 있다. 히라오(Hirao) 등의 미합중국 특허 제 4,845,199호에서, 단백질 안정화제인 소비톨 존재하의 액체 열처리 전에, 콘 분획 II + III는 폴리에틸렌 글리콜(이후부터, "PEG"라고 명명) 분획(8% w/v PEG 처리 후 12% w/v PEG 처리) 처리되고, 그 다음 이온교환 크로마토그래피(DEAE-Sephadex) 및 인간 혈액형 항체의 제거 단계를 겪는다. 반면, 히라오 등의 미합중국 특허 제 4,876,088호의 실시예 1은 콘 분획 II + III 반죽을 물에 현탁시키고, 이것의 pH를 5.5로 조정 및 원심분리하고, 후에 여기서 획득한 상등액을 바이러스 비활성화를 위해 33% w/v 소비톨의 존재하에 열처리한 후 열변성된 단백질을 제거하기 위한 PEG 분획(6%/ 12%) 처리한 후 DEAE-Sephadex 이온교환 크로마토그래피를 포함하는 다른 정제 단계를 거치는, 콘 분획 II + III 반죽으로부터 정맥주사용 감마 글로불린 용액의 제조법을 기술한다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 콘 분획 공정으로부터 고순도의 감마 글로불린 용액을 생산하는 완전하고 상업적으로 이용가능한 공정을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 열에 민감한 모든 바이러스를 포함하여, 외피 및 비외피 바이러스 모두가 제거된 매우 순수한 정맥 투여용 감마 글로불린 용액을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 두번째 바이러스 비활성화 단계에 우선하여 열처리 멸균 과정 동안에 생성된 변성된 단백질의 제거를 가능케하는 상업적인 감마 글로불린 제조공정을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 열처리 멸균 단계, PEG 분획 단계, 및 용매-세제로 바이러스를 비활성화 단계 순으로 수행하는 과정에서 감마 글로불린 단백질의 중간 회수 단계의 필요성이 없는 연속적인 상업적인 감마 글로불린 제조공정을 제공하는 것이다.

상기 외에 당업계의 전문가에게 명백한 다른 목적들은 본 발명에 의해 제공되는데, 본 발명에서는, 부분적으로 정제 가능한 감마 글로불린이 풍부한 알코올성 콘 분획을 바이러스 비활성화를 위해 열안정화제의 존재하에 수성 배지에서 열처리하고 상기 열처리된 용액을 그 후 먼저 PEG 분획 처리하고, 그 후에 감마 글로불린의 중간 회수 단계 없이 외피 바이러스의 파괴를 위해 용매, 바람직하게는 용매/세제 혼합물 존재 하에 두 번째 바이러스 비활성화 처리를 한 후, 용매 또는 용매-세제 혼합물로부터 분리한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 용매 또는 용매-세제 바이러스 비활성화 단계 전에 벤토나이트(bentonite)를 수집된 PEG 분획 산물과 함께 부가적인 바이러스 제거를 위해 혼합한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 소비톨은 열안정화제이며 트리알킬 포스페이트(trialkyl phosphate)는 용매이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 열처리로 매우 순수한 감마 글로불린의 제공을 위한 두 번째 바이러스 비활성화 전에 바이러스 비활성화를 위한 열처리 단계에서의 변성된 산물을 PEG 분획으로 제거한다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 용매-세제 처리 전에 존재하는 입자들을 제거한다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 감마 글로불린 용액은 음이온 교환수지로 처리된다.

본 발명의 또 바람직한 구현예에서, 감마 글로불린 침전없이 한 단계의 폴리에틸렌글리콜 분획화 단계를 행한다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 완전한 바이러스 비활성화 후에 감마 글로불린 용액을 양이온 교환수지로 또는 투석여과(diafiltration) 및/또는 탄젠셜 플로우 여과(tangential flow filtration)로 처리한다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 열 및 용매-세제로 멸균화되고 정맥투여에 적합한 감마 글로불린이 제공된다.

본 발명은 주성분으로 IgG (γ-globulin)을 함유하는 정맥주사용 면역 글로불린의 완전하고 상업적 다단계 생산 공정에 관한 것이다.

여기에 개시된 제조 방법은 콘 분획 II + III 반죽과 같은 면역글로불린을 함유하는 순수하지 않은 출발 분획의 일정량(a quantity)으로 시작하는 공정 차원에서의 연속적인 공정인데 상기 공정은 공정이 완전해질 때(즉, 결과물로 고도로 정제된 감마 글로불린을 제공하는 단계)까지 부분적으로 정제된 감마 글로불린 고체의 중간 회수 단계 없이 진행된다. 주목할 것은 여기에 개시된 공정의 폴리에틸렌 글리콜 분획 단계 중에 부분적으로 정제된 감마 글로불린 반죽을 중간 산물로서 회수하지 않는다는 점이다.

면역글로불린을 포함하는 분획이 출발물질로 사용된다. 상기 분획은 그것이 인간혈장으로부터 유래하고 면역글로불린 분획을 포함하는 한 특별히 제한되지는 않는다. 면역글로불린 포함 분획의 특정적 예로는 콘(Cohn)의 에탄올 분획법에 의해 획득된 분획 II + III과 분획 II 및 그것에 등가적인 면역글로불린 포함분획의 반죽형태이다. 다른 출발물질은 분획 I + II + III, 분획 II + IIIw 및 분획 III 반죽이다. 출발물질은 인간 혈액형 항체, 플라스미노오겐, 플라스민, 칼리크레인, 프리칼리크레인 활성인자, IgM, IgA, IgG 중합체 등(이후로 "응집물"이라고 명명)의 불순물을 포함할 수 있다.

바람직한 출발물질은 콘 분획 II+ III 또는 콘 분획 II 반죽이다. 콘 분획 II + III 반죽이 사용될 때는, 그대로 출발물질로 사용할 수도 있고, 또는 먼저 상기 분획을 예비 세척하여 콘 분획 II + IIIw를 만들고 이것을 본 발명의 공정에 사용할 수도 있다. "분획 II + IIIw"는 인산이나트륨(disodium phosphate) 용액으로 세척된 콘 분획 II + III 침전이다.

분획 II + IIIw는 약 20배 부피의 물에 약 1kg의 분획 II + III 반죽을 사용하는 비율로 차가운 주사용 물에 분획 II + III 침전을 현탁시킴으로써 획득할 수 있다. 지질, 지질단백질 및 알부민을 용해시키기 위해 약 0.003M 인산나트륨 최종 농도가 되도록 인산나트륨 용액을 첨가한다. 최종 농도가 20%가 되도록 차가운 알코올을 첨가한다. 알코올 첨가 중에, 온도를 점차적으로 -5±1℃로 낮추고 pH는 예를 들어, 아세트산 완충액이나 묽은 수산화나트륨을 사용하여 7.2±0.1로 유지되거나 조정된다. 분획 II + IIIw의 형성된 침전을 온도를 -5±1℃로 유지하면서 원심분리 및/또는 여과에 의해 수득한다.

본 발명의 첫 번째 바이러스 비활성화 단계에 앞서, 다양한 예비 정제 및/또는 응집물 감소 단계를 수행할 수 있다. 예를 들어, 약 20%의 알코올을 포함하는분획 II + IIIw 반죽이 사용되고, 존재하는 단백질의 70% 이상이 IgG일 때, 분획 II + IIIw 반죽을 3 내지 20배 부피, 바람직하게는 10 내지 15배 부피의 차가운 물에 0 내지 5℃의 온도에서 pH 4.0 아세트산 완충액 또는 염산을 사용하여 pH를 4.5 내지 6.0, 바람직하게는 5.0 내지 5.5가 되도록 조정하면서 현탁시킬 수 있다. 모든 감마 글로불린이 용액속으로 흩어지도록 2 내지 15시간 동안 혼합물을 교반한다. 그 후, 알부민 및 α-globulin 등의 녹지 않은 단백질을 원심분리 및/또는 여과에 의해 제거할 수 있다.

분획 II + III 반죽을 출발 물질로 사용하는 경우, 분획 II + III 반죽의 각각의 킬로그램을 3내지 20㎏, 바람직하게는 13 내지 17kg의 찬물에 현탁시킨다. 현탁액의 pH를 4.5 내지 6.0, 바람직하게는 4.8 내지 5.4로 조정한다. 상기 현탁액을 1 내지 20 시간, 바람직하게는 2 내지 10시간 동안, 0 내지 25℃, 바람직하게는 0 내지 10℃로 혼합한다. 그 후 비용해성 물질을 깊이 여과기(depth filter)를 사용한 여과 또는 원심분리로 제거한다. 여과를 하는 경우, 약 1 내지 5w/w% 여과 기구를 분리 전에 장치한다. 원심분리 또는 여과를 하는 경우 막 여과기를 사용하면 좀 더 정제할 수 있다. 정제된 용액을 10,000 내지 100,000 분자량 컷 오프(molecular weight cut off: MWCO) 막을 사용한 한외여과(ultrafiltration)로 약 1 내지 12%, 바람직하게는 4 내지 8%의 단백질로 농축시킬 수 있다.

다른 콘 분획을 출발물질로 사용할 때는, 추가적으로 처리될 IgG를 많이 함유하는 분획을 획득하기 위한 예비 정제를 수행하기 위해 공정의 초기 단계 또는 단계들을 원하는 곳에서 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 콘 분획 II(95% 이상의 IgG를 포함하는)를 콘 분획 III로부터 분리하고, 콘 분획 II는 추가적인 공정을 필요로 할 때, 초기 단계는 우에무라(Uemura) 등의 미합중국 특허 제 4,371,520호에 개시된 바와 같이, 항-상보적 활성(anti-complementary activity, ACA)을 지니고 있다고 알려진 면역 글로불린 응집물을 면역 글로불린 단일체(monomer) 및 이합체(dimer)로 나누기 위해, 산성 pH 3.2 내지 5.0 바람직하게는 3.8 내지 4.2이다. 선택적으로, 콘 분획 II + III 출발물질에 대한, 우에무라 등의 특허에 개시된 낮은 pH 처리는 상기 기술된 초기 정제 단계 후에 그리고 바이러스 비활성화하는 열처리 단계 전에 부가적 단계로서 수행될 수 있다.

열멸균화 단계 동안, 분획 II + III반죽의 정제 여과액 같은 상기에 기술된 부분적 정제로부터 수집된 수용성 혼합물의 형태에서의 면역글로불린 단백질은 그대로 또는 1 내지 12%, 바람직하게는 4 내지 8% 단백질로 한외여과에 의해 농축되고 당, 당알콜 및/또는 아미노산 열 안정화제를 첨가한 상태로 사용될 수 있다. 열 안정화제는 슈크로스(sucrose), 말토스(maltose), 소비톨(sorbitol) 또는 마니톨이 바람직하고, 가장 바람직한 것은 소비톨이다. 최종 농도가 약 25 내지 50 w/w%, 포화시까지, 바람직하게는 30 내지 40 w/w%가 되도록 공급하기 위해 당 또는 당알콜을 면역글로불린용액에 분말로 첨가하거나 또는 먼저 소량의 물과 혼합하고 그 후에 첨가한다. 이 시점에서, 면역글로불린의 수용성 용액은 충분한 물을 포함하므로 상기 용액은 약 1 내지 8%의 총 단백질을 함유하는데 이는 1kg의 반죽 당 약 300g의 단백질을 가지는 전형적인 분획 II + III 출발 물질이다.

열안정화제의 첨가 후에, 상기 용액의 pH를 4.5 내지 6.5, 바람직하게는 5.0내지 6.0으로 조정하고 상기 혼합물을 약 50 내지 70℃로 약 1 내지 20시간, 바람직하게는 약 60℃에서 10 내지 11 시간 동안 열에 민감한 바이러스의 비활성화를 위해 가열한다. 열처리 단계는 바이러스를 비활성화하는 것 뿐만 아니라, 열처리 중 단백질 변성 효과를 통해 우선적으로 원하지 않는 단백질, 즉 프리칼리크레인(prekallikrein), 플라스민, 플라스미노겐 및 IgA 같은 콘 분획 II + III 와 일반적으로 결합하는 단백질의 양을 감소시킬 수 있다.

열처리 후, 상기 용액을 직접 사용하거나 또는 찬물로 상기 열처리된 용액 부피의 5배까지 희석한다. 상기 용액을 그 후 0 내지 10℃, 바람직하게 0 내지 5℃로 냉각시킨다.

다음, PEG 분획화를 열처리된 용액 상에 행한다. PEG 분획화는 IgG 응집물 및 혈장단백질 분획에 자연적으로 발생하는 불순물로부터 원하는 IgG 단일체 및 이합체를 분리하기 위하여 면역글로불린 정제 기술에 잘 알려진 공정이다. 그러나 본 제조 공정에서는, PEG 분획화는 또한 원하는 IgG 단일체 및 이합체와 열처리에 의해 생긴 원하지 않은 변성된 단백질 산물을 분리한다. 이러한 변성된 단백질 산물은 변성된 프리칼리크레인 활성인자, 플라스미노겐, 플라스민, IgA, IgM 및 응집물들이다.

원하는 IgG 단일체 및 이합체를 용액 속에 남게 하는 반면 응집물 같은 원하지 않는 단백질은 용액 밖으로 침전되게 하는 PEG 농도 및 pH를 선택하는한, 선행기술에 문서화된 어떤 PEG 분획화 공정도 사용될 수 있다. 원하는 PEG 농도를 제공하기 위하여 PEG를 분말, 박편(flake), 또는 약 50%의 용액으로 직접 열처리된용액으로 첨가한다.

예를 들어, 약 5.0 내지 7.5 pH, 분획 II + IIIw 반죽이 출발물질로 사용될 때는 바람직하게 약 6.0 내지 7.5 pH에서, 분획 II + III 반죽이 출발물질로 사용될 때는 바람직하게 5.5 내지 6.0 pH에서, 약 4 내지 8%의 PEG 농도, 분획 II + IIIw 반죽이 출발물질로 사용될 때는 바람직하게 약 4 내지 6%에서, 분획 II + III 반죽이 출발물질로 사용될 때는 바람직하게 6 내지 8%의 PEG 농도로 상기 PEG 분획화를 수행할 수 있다. 온도를 약 0 내지 2℃로 유지하면서, 상기 PEG 분획화를 약 1 내지 8시간동안 수행하고, 그 후 침전을 원심분리 또는 여과로 제거한다.

선택적 바이러스 제거 단계로서, 벤토나이트를 원심분리 또는 여과물에 최종 농도가 약 0.05 내지 2.0 w/w%, 바람직하게 0.1 내지 1.0w/w%이 되도록 첨가하고, 상기 혼합물을 1 내지 5시간 동안 혼합하고, 그 후 벤토나이트 반죽을 여과로 제거한다.

본 발명의 마지막 필수 단계는 용매 혹은 용매-세제 혼합물을 사용하는 두 번째 바이러스 비활성화 과정을 수행하는 것이다. 하기된 바와 같이, 추가적인 정제공정, 특히 이온교환수지의 사용을 포함하는 공정을 용매-세제 처리 전 및/또는 후에 수행할 수 있다.

한가지 선택은, 알부민, 트랜스퍼린(transferrin) 및 프리칼리크레인 활성인자를 좀 더 제거하기 위해 용매-세제 바이러스 비활성화 이전에 음이온 교환처리를 하는 것이다. 바람직한 구현예에서, 양이온 교환처리를 용매-세제 바이러스 비활성화 후에 행한다. 이 공정에 의해서, 인간 혈장에서 발견되는 원하지 않은 단백질물질(예를 들어, IgA, IgM 및 알부민) 및 PEG를 용매-세제 처리에서 사용된 잔류 시약과 함께 IgG로부터 양이온 교환과정을 통해 제거할 수 있다.

전체 공정 동안에 달리 달성되지 않는다면, 용매-세제 처리될 용액을 변성된 단백질을 포함하는 모든 입자 물질을 제거하기 위해 처리해야 한다. 따라서, 용매-세제 첨가 전에 1 미크론(micron) 또는 더 미세한 필터로 용액을 여과하는 것이 바람직하다. 이 단계는 또한 커다란 입자 내에 존재하는 바이러스가 용매-세제에 대한 노출을 회피할 가능성을 감소시킨다.

여과액을 투석여과(diafilter) 및/또는 약 12%, 바람직하게 5 내지 10%의 단백질이 되도록 농축하고, 그 후 용매 또는 용매-세제 처리를 한다.

오늘날, 외피 바이러스 비활성화용으로 바람직한 용매는 트리알킬 포스페이트(trialkyl phosphate)이다. 본 발명에 사용되는 트리알킬 포스페이트는 특별히 제한된 것은 아니나, 바람직하게는 트리(n-부틸)포스페이트(이후로, "TNBP"라고 명명)를 사용한다. 다른 사용가능한 트리알킬 포스페이트는 트리(ter-부틸)포스페이트, 트리(n-헥실)포스페이트, 트리(2-에틸헥실)포스페이트 등이다. 2 또는 그 이상의 서로 다른 트리알킬 포스페이트의 혼합물을 사용하는 것도 가능하다.

트리알킬 포스페이트는 0.01 내지 10(w/w)%, 바람직하게는 0.1 내지 3(w/w)% 사이의 양으로 사용된다.

트리알킬 포스페이트는 세제(detergent) 또는 계면활성제(surfactant)의 존재 또는 비존재하에 사용될 수 있다. 세제와 조합하여 트리알킬 포스페이트를 사용하는 것이 바람직하다. 세제는 면역글로불린 혼합물 내 바이러스의 트리알킬 포스페이트와의 접촉을 증가시키는 기능을 한다.

세제의 예로는 지방산의 폴리옥시에틸렌 유도체; 폴리소베이트 (polysorbate) 80(상품명: Tween 80 등) 및 폴리소베이트 20(상품명: Tween 20 등) 등의 무수 소비톨의 부분 에스테르; 및 옥시에틸렌화 알킬페놀(oxyethylated alkylphenol, 상품명: Triton X 100 등) 등의 비이온성 오일목욕 린스제(oil bath rinsing agent)를 포함한다. 즈비터(Zwitter) 이온 세제 등의 다른 계면활성제 및 세제도 포함된다.

세제를 사용할 때는. 그것은 임계량(critical amount)으로 첨가되지 않는다; 예를 들어, 0.001% 내지 10%, 바람직하게는 0.01% 내지 3%의 비율로 세제를 사용할 수 있다.

본 발명에서, 면역글로불린 포함 혼합물의 트리알킬 포스페이트 처리를 20 내지 35℃, 바람직하게는 25 내지 30℃에서, 1시간 이상, 바람직하게는 5 내지 8시간 동안 수행한다.

트리알킬 포스페이트 처리 동안, 면역글로블린은 액체 배지에서 5 내지 10% 단백질 용액으로 존재한다.

용매-세제 처리 전에 음이온 교환 처리를 수행하지 않았다면, 용매-세제 처리 된 면역글로불린에 음이온 교환 처리를 할 수 있다. 바람직하게는, 용매-세제 처리된 산물에 적어도 한 번의 양이온 교환 처리를 한다. 이온 교환 처리는 일반적으로 4.5 내지 6.5의 pH를 가지고 IgG의 최대흡착을 위해 낮은 이온화 세기(ionic strength)를 가지는 용매(또는 용매-세제) 공정으로부터의 면역글로불린 수용액에 대해 수행된다. 단백질 농도는 일반적으로 1 내지 15(w/v)%의 범위, 보다 바람직하게는 3 내지 10(w/v)% 내의 범위에 있다. 음이온 교환기를 사용된 것과 같은 수성 용매로 평형시킨다.

면역글로불린 용액을 이온 교환기의 1 ml 당 약 10 내지 100ml의 비율로 음이온 교환기의 컬럼(column)으로 통과시키고, 그리고 흡착되지 않은 분획을 회수함으로써 연속 시스템을 수행할 수 있다.

사용되는 음이온 교환기는 예를 들어, 불용성 담체에 결합된 음이온 교환 그룹을 포함한다. 음이온 교환 그룹은 디에틸아미노에틸(diethylaminoethyl, DEAE), 쿼터나리 아미노에틸(quaternary aminoethyl, QAE)기 등을 포함하며 불용성 담체는 아가로오스, 셀룰로오스, 텍스트란, 폴리아크릴아마이드 등을 포함한다. 1 그램의 DEAE Sephadex A-50 수지를 0.4%의 염화나트륨 용액에 20 내지 30 그램의 젖은 중량(wet weight)으로 부풀린다(swell).

사용가능한 양이온 교환기의 예로는 카르복시 메틸 세파덱스(CM-Sephadex), CM-cellulose, SP-Sephadex, CM-Sepharose 및 SP-Sepharose 등이다. 전처리된 양이온 교환기(예를 들어, 1g의 CM-Sephadex C-50 수지를 0.4% 염화나트륨 용액에 25 내지 35g으로 부풀린다)를 용매(또는 용매-세제)공정으로부터의 면역글로불린 용액을 연속적 공정에서 약 0 내지 5℃에서 통과시키는 컬럼 베드(column bed)로 사용한다.

상기 기술된 조건이 양이온 교환기에 사용될 때는, IgG가 흡착되고, 그 후 단백질이 흡착된 양이온 교환 수지를 세척한 후, 예로 1.4N 염화나트륨 용액으로IgG를 용출시킬 수 있다.

이온 교환 처리를 사용하지 않을 때, 용매-세제 및 PEG 제거를 위해 용매(용매-세제) 처리된 용액을 여과투석(diafilter) 시키고, 그리고 탄젠셜 플로우 여과로 농축시킨다. 최종 산물에서 매우 낮은 수준의 용매-세제 및 PEG을 원하는 경우, 바람직한 공정은 탄젠셜 플로우 여과 전에 양이온 교환기로 처리하는 것이다.

상기 단계의 공정 후, IgG를 정화하고, 투석여과하고 필요한 농도로 농축한다. 원한다면, D-소비톨과 같은 안정화제를 첨가하고, 약 pH 5.4의 약 50mg/ml 내지 100mg/ml IgG 및 50mg/ml D-소비톨의 조성을 갖는 용액이 되도록 최종 조정을 한다. 부가적인 바이러스의 제거를 위해, 상기 용액을 35 나노미터 또는 보다 세밀한 필터로 여과시킬 수 있다. 상기 안정화되고 선택적으로 나노여과된 용액을 그 후 멸균된 유지 필터(retentive filter)를 통해 멸균여과하고 바이알에 채운다.

하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이나, 여기에 한정되는 것은 아니다.

정맥투여용 면역글로불린 및 결과물에 대한 제조 방법

분획 II + III 반죽 1800g을 15kg의 찬물에 현탁시켰다. 한 시간 동안 0 내지 5℃에서 혼합한 후, 현탁액의 pH를 약 5.0 이 되도록 묽은 아세트산으로 조정했다.

약 3시간동안 현탁액을 혼합한 후, 여과 보조 물질인 산 세척된 셀라이트(celite)를 약 900g을 첨가했고, 그리고 약 45분 동안 혼합했다. 셀라이트와 함께 비용해성 물질을 여과시켜 제거했다. 여과액을 정제하고 그 후 100,000 분자량 컷 오프(MWCO)막을 사용하여 한외여과 시켜 단백질 농도가 약 6% 되게 농축했다.

D-소비톨을 최종 농도 33 w/w%이 되도록 농축된 단백질 용액으로 첨가했고, 그리고 모든 소비톨이 용해될 때까지 pH 5.0에서 혼합했다. 상기 용액을 60℃에서 10시간 동안 가열했다.

상기 가열된 용액을 10℃보다 낮은 온도에서 냉각 및 같은 무게의 찬물로 희석시켰다. 희석된 용액의 pH를 묽은 수산화나트륨으로 5.7이 되게 했고 그 후 최종 농도가 6 w/w%가 되게 50% 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 3550을 첨가한다. 그 후 약 2시간 동안 pH 5.7에서, 형성된 침전을 3% w/w로 첨가된 산 세척된 셀라이트 여과 보조 물질로 여과시켜 제거했다. 약 3.5kg의 6% PEG 여과액을 다른 실험을 위해 분리해 놓았다. pH4.9가 되도록 잔존 6% PEG 여과액을 조정한 후, 벤토나이트를 여과액 1kg 당 1g의 양으로 첨가했고, 그리고 약 pH 5.1이 되도록 했다. 2시간 혼합한 후 상기 현탁액을 벤토나이트를 제거하기 위해 여과시켰다. 상기 여과액을 그 후 농축시키고, 그리고 100,000 MWCO 막을 사용한 한외여과에 투석여과시켰다.

용액의 pH를 묽은 수산화나트륨으로 약 6.5로 조정했고, 그 후 약 0.4kg의 미리 부풀려진(pre-swollen) DEAE Sephadex A-50 수지를 상기 용액에 첨가했다. 수지와 상기 단백질을 혼합한 후, 상기 수지를 여과하여 제거했다. 트리-n-부틸포스페이트(TNBP) 및 폴리소베이트 80의 혼합물을 함유하는 용매-세제(SD) 용액을 최종 농도가 각각 0.3 w/w% 및 1.0 w/w% 되도록 상기 여과액에 첨가하였다. 6시간 동안 27℃에서 SD를 함유하는 용액을 배양한 후, 상기 용액을 0 내지 5℃로 냉각시키고, 전도율을 염화나트륨 용액으로 약 7mS/cm되게 조정하고, 그리고 pH 5.8이 되게 조정했다. 약 2.7kg 전처리된 Cm Sephadex C-50 수지를 용액으로 첨가 및 혼합한 후 수지를 유지하기 위해 여과시켰다. 흡착된 IgG를 함유하는 상기 수지를 0.3% 염화나트륨 용액으로 세척하고, 그 후 1.4M 염화나트륨 용액으로 흡착된 IgG를 용출시켰다. 용출물을 정제, 농축 및 찬물로 투석여과 시켰다. D-소비톨을 첨가하고, 그리고 약 100mg/ml의 IgG 및 50mg/ml D-소비톨을 함유하는 조성물의 용액을 pH가 약 5.4가 되도록 산출하기 위해 최종 조정을 했다. 최종 조정 후, 상기 용액을 멸균 여과하고 유리 바아일에 채운다. 결과 산물의 시험 결과는 다음의 표에 나타나 있다.

표

실시예 산물의 시험 결과

시험 매개변수	결과
단백질	99.2
IgG 순도	100
분자 분포(molecular distribution):(by HPLC)단일체(%)이합체(%)	8911
프리칼리크레인 활성인자(% CBER Ref. Lot No. 3)	<2.5
항-상보적 활성(CH50U/mg IgG)	0.2

본 발명의 변형은 당업계의 전문가에게 명백할 것이다.

Claims (21)

1. 하기 각 단계를 포함하는 정맥투여용 감마 글로불린 용액의 연속적 제조방법:

   (a) 열에 민감한 바이러스를 비활성화시키기에 충분한 시간 및 온도 조건 하에서 불순물이 섞인 감마 글로불린을 열처리하는 단계;

   (b) 회수 단계 없이, 정제된 감마 글로불린 용액을 획득하기 위해 원하는 감마 글로불린의 침전을 유발하지 않고 열처리된 감마 글로불린 용액을 폴리에틸렌 글리콜 분획화 처리하는 단계; 및

   (c) 회수 단계 없이, 외피 바이러스를 비활성화시키기 위해 정제된 감마 글로불린을 유기용매로 처리하는 단계.
2. 제 1항에 있어서, 상기 불순물이 섞인 감마 글로불린 용액은 콘(Cohn) 분획 I + II + III, 콘 분획 II + III반죽, 콘 분획 II + IIIw 또는 콘 분획 II을 함유하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 불순물이 섞인 감마 글로불린 용액은 콘 분획 II + III 반죽으로부터의 단백질을 함유하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
4. 제 1항에 있어서, 단계 (a)의 열처리 이전에 불순물이 섞인 감마 글로불린용액을 적어도 하나의 정제 단계를 거치도록 하는 것 및 중간 회수 단계 없이 부분적으로 정제된 용액을 열처리 단계(a)를 밟도록 하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
5. 제 1항에 있어서, 단계 (a)의 열처리는 약 10 내지 20 시간 동안 약 50 내지 70℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
6. 제 5항에 있어서, 단계 (a)의 열처리는 약 10 내지 11시간 동안 약 60℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 정맥투여용 감마 글로불린 용액의 제조방법.
7. 제 1항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜 분획을 불순물을 침전시켜 제거하고 원하는 감마 글로불린을 용액 중에 남아있게 하는 과정을 적어도 하나 이상 포함하는 단일 단계에서 수행하는 제조방법.
8. 제 6항에 있어서, 상기 불순물이 섞인 감마 글로불린 용액은 콘 분획 II + III 반죽으로부터의 단백질을 함유하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
9. 제 1항에 있어서, 단계 (c)에 사용되는 유기용매는 알킬 포스페이트(alkyl phosphate)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
10. 제 7항에 있어서, 단계 (c)에 사용되는 유기용매는 알킬 포스페이트(alkyl phosphate)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
11. 제 10항에 있어서, 상기 알킬 포스페이트는 트리-n-부틸 포스페이트(tri-n-butyl phosphate)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
12. 제 1항에 있어서, 상기 유기용매는 세제(detergent)를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
13. 제 11항에 있어서, 상기 유기용매는 세제(detergent)를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
14. 제 1항에 있어서, 단계 (c) 후에 감마 글로불린 용액은 회수단계 없이 양이온 교환 수지 처리되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
15. 제 7항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜 분획화 후에 수득된 감마 글로불린 용액에 대해 벤토나이트(bentonite) 정화 단계를 수행하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
16. 제 15항에 있어서, 상기 벤토나이트 처리 된 용액을 음이온 교환 수지로 처리하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
17. 제 1항에 있어서, 단계(b) 후에 상기 감마 글로불린 용액을 음이온 교환 수지로 처리하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
18. 제 14항에 있어서, 양이온 교환 처리 뒤에 상기 감마 글로불린 용액을 탄젠셜 플로우 여과(tangential flow filtration)로 농축시키는 것을 특징으로 하는 제조방법.
19. 제 1항에 있어서, (c)단계 후에 상기 감마 글로불린 용액을 회수단계 없이 탄젠셜 플로우 여과(tangential flow filtration)로 농축시키는 것을 특징으로 하는 제조방법.
20. 제 1항의 제조방법에 의해 생산된 정맥투여용 감마 글로불린 용액.
21. 제 18항의 공정에 의해 생산된 정맥투여용 감마 글로불린 용액.