DK176139B1 - Fremgangsmåde til separation af plasmaproteiner og plasmaproteinkoncentrater opnået ved fremgangsmåden - Google Patents

Description

DK 176139 B1

Den foreliggende opfindelse angår et koncentrat af von Willebrands faktor til terapeutisk anvendelse opnåeligt ved fremgangsmåden ifølge DK 175 322 B1.

5 Ansøgningen er afdelt af DK 175 322 B1.

DK 175 322 B1 angår separation af proteiner fra en fraktion af humant plasma eller dyreplasma ved ionbytningskromatografi under anvendelse af en teknik, som gør det muligt i et enkelt trin at opnå en meget høj oprensnings-10 grad, navnlig for faktor VIII, fibrinogen og von Willebrands faktor.

Tilvejebringelsen af blodproteiner til terapeutiske formål nødvendiggør anvendelsen af oprensningsmetoder, som gør det mulig at opnå produkter, der er meget rene og fuldstændigt frie for kontaminerende forbindelser, navnlig 15 andre proteiner eller substanser af fremmed oprindelse, såsom antistoffer.

Ved behandling af f.eks. hæmofili A er det vigtigt at råde over faktor VIII-koncentrater af meget høj renhed; patienten får talrige gentagne injektioner af faktor Vlll-koncentrater og samtidig væsentlige mængder af fibrinogen og 20 immunoglobuliner, som kan inducere uønskede immunsvar. Gentagne injektioner af utilstrækkeligt oprenset faktor VIII kan derfor kun udføres med plasmakoncentrater fra den samme gruppe for at undgå typiske transfusionsuheld på grund af forskelle i blodgruppe og fremkaldt ved tilstedeværelsen af immunoglobuliner.

25 - Faktor Vlll-koncentrater fremstilles oftest ud fra en fraktion af cryopræcipite- ret humanplasma. Renheden af faktor Vlll-koncentrater, som almindeligvis opnås fra centre, der fremstiller humanplasma i industriskala, er ofte af størrelsesordenen i international enhed/mg og overstiger almindeligvis ikke 30 grænserne fra 10 til 20 internationale enheder/mg. Traditionelle fremstillingsmetoder gør brug af præcipiteringstrin, hvorved man forsøger, ofte meget utilstrækkeligt, at eliminere proteinkontaminanter, såsom fibrinogen, fibronec-tin og immunoglobuliner. Disse metoder kan anvende eller kombinere præci- 2 DK 176139 B1 pitering ved lav temperatur (10 °C) eller tilsætningen af proteinpræcipiterende midler, hydrofile polymerer, såsom PEG (Newman et al., Br. J. Haematol, 21: 1-20, 1971, Hao et al., i Methods of Plasma Protein Fractionation, Academic Press, 1980, s. 57-74), polyvinylpyrrolidon (Casillas og Simonetti, Br. Haeina-5 to, 50: 665-672, 1982), dextran, Ficoll, Percoll, hydroxyleret stivelse og albumin er således blevet foreslået som faktor Vlll-præcipiterende midler (Farru-gia et al., Thromb Haemostas, 51: 338-342,1984). Det samme gælder anvendelsen af glycin og natriumchlorid anbefalet af Thorell og Blomback. Nogle forfattere (Ng et al., Thrombosis Res., 42: 825-834,1986) har med held 10 kombineret tre præcipiteringsmidler, nemlig: PEG, glycin og natriumchlorid, til opnåelse af faktor VI Il-koncentrater med en specifik aktivitet på mellem 10 og 16 internationale enheder/mg.

Der er også blevet anvendt stensk eksklusionskromatografi eller gelfiltrering, 15 metoder, som er beregnet til indvinding af en fraktion med høj molekylevægt indeholdende faktor VIII:C-von Willebrands faktorkompleks delvis fri for fibrinogen. Med denne teknik tilvejebringes med en lav output-hastighed et produkt, hvis specifikke aktivitet ikke overstiger 30 internationale enheder/mg, og som nødvendiggør tilsætning af albumin som en stabilisator (hvilket fører til 20 fald i specifik aktivitet til ca. 3 til 5 internationale enheder/mg. Denne teknik har en række problemer med hensyn til tilpasning til produktion i stor skala, eftersom det er vanskeligt at holde opløsningsevnen i industrielle gelfiltreringssøjler over en tidsperiode.

25 Der er også blevet produceret faktor VIIl-koncentrater ved i produktionsprogrammet at inkorporere kontakt med mikrokugler af porøs siliciumdioxid udformet til at indfange proteinkontaminanter med lav molekylevægt (Margolis et al., Vox Sang., 46: 341-348, 1984). Den specifikke aktivitet af produktet forbliver forholdsvis lille: 1 international enhed/mg.

Der er for nylig fremkommet nye metoder til fremstilling af meget rene faktor VIIl-koncentrater. Hyland- og Travenol-firmaerne har f.eks. foreslået at opnå koncentrater ved at anvende immunaffinitetskromatografimetoder (Zimmer- 30 3 DK 176139 B1 man og Fuicher, Thrombosis Res., suppl. VII, s. 58, 1987, Berntorp og Nilsson, Thrombosis Res., suppl. VII, s. 60,1987, Levine et al., Thrombosis Res., suppl. VII, 1987). Disse metoder omfatter oprensning af faktor VIII med i antistoffer mod faktor VIII:C eller von Willebrands faktor immobiliseret på et 5 kromatografisk medium. Disse metoder fungerer godt, men nødvendiggør anvendelsen af drastiske opløsninger til at desorbere faktor VIII fra enten dets antistoffer eller fra von Willebrands faktor. Et yderligere ultrafiltreringstrin, som har til hensigt at fjerne de uønskede kemiske midler, er således påkrævet, men det kan være ødelæggende for den biologiske aktivitet af 10 faktor VIII. Den specifikke aktivitet af faktor VIII kan nå fra 1.000 til 3.000 in ternationale enheder/mg i løbet af produktionen, men dens ustabilitet nødvendiggør tilsætning af et stabiliseringsmiddel, såsom albumin, før frysetørringstrinnet, hvilket nedsætter den specifikke aktivitet af faktor VIII til fra 3 til 5 internationale enheder/mg. Den vigtigste ulempe ved oprensning ved im-15 munaffinitet er imidlertid tilstedeværelsen af resterende antistoffer; da disse stammer fra mus, kan de medføre et immunsvar i patienterne rettet mod disse proteiner, som er fremmede for den humane organisme.

lonbytningskromatografimetoder er også blevet anvendt, men på grund af 20 kompleksiteten af driftsprocedurerne og de opnåede lave udbytter er disse metoder begrænset til laboratoriet.

I en artikel af J.J. Morgenthaier (Throinb. Haemostas., Stuttgart, 47 (2) 124-127 (1982)), diskuteres f.eks. oprensningen af faktor VIILC under anvendelse 25 af et polyethylenglycolpræcipitat ved passage gennem en modificeret Sepha-rose-harpiks. Der er ingen oplysninger om udbyttet eller reproducerbarheden ved de forskellige undersøgte metoder.

Det er således absolut nødvendigt at råde over nye fremgangsmåder til op-30 nåelse af proteinkoncentrater og navnlig faktor VIII, hvilke metoder kan anvendes i industriskala og give meget rene produkter fuldstændigt frie for proteiner af fremmed oprindelse, såsom antistoffer af animalsk oprindelse.

4 DK 176139 B1

Ansøgeren har derfor udviklet en oprensningsmetode under anvendelse af anionbytningskromatografi, hvilken metode takket være det passende valg af den anvendte resin muliggør, at de proteiner, som har interesse, separeres med en enkelt kromatografisøjle under betingelser, som er hensigtsmæssigt 5 udformet, så det er muligt at klare sig uden yderligere bearbejdning, såsom ultrafiltrering, hvilket forøger processens kompleksitet og nedsætter aktiviteten af de oprensede protein.

DK 175 322 B1 angår således en fremgangsmåde til separering af plasma-10 proteiner, og navnlig faktor VIII, fibrinogen, fibronectin og von Willebrands faktor, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at en opløst fraktion af et cryopræcipitat af humanplasma udsættes for en kromatografisk behandling på en anionbytningsresin af en forholdsvis moderat ionisk natur, og som også tillader forekomsten af hydrofobe vekselvirkninger, hvilken resin ikke 15 adsorberer visse proteiner og binder andre, der derefter elueres specifikt ved at forøge ionstyrken af pufferen.

Fremgangsmåden kan også anvendes med et plasma af animalsk oprindelse, frå svin f.eks., til specielle tilfælde med hæmofili-patienter med hæmmen-20 de serum, hvilke patienter ikke kan behandles med faktor VIII af human oprindelse.

Som en udgangsfraktion kan man således anvende en fraktion af et cryo-præcipiteret plasma, som kan have været underkastet en foroprensningsbe-25 handling. Denne forbehandling kan f.eks. bestå af præcipitering med alumi-niumoxidgel og/eller præcipitering ved lav temperatur i overensstemmelse med de traditionelle metoder til behandling af sådanne fraktioner.

Ved undersøgelsen af de forskellige resiner til kromatografisk separation blev 30 det observeret, at de mest tilfredsstillende resultater blev opnået med DEAE-grupper fastgjort på en vinylpolymergel, såsom Fractogel TSK. En resin af denne type kan fås kommercielt under navnet Fractogel TSK-DEAE 650 (M) (Merck). Dette kromatografiske medium har givet langt bedre resultater end 5 DK 176139 B1 de resultater, der blev opnået med de andre undersøgte geler, såsom DEAE-Sepharose CL-6B, DEAE Sepharose CL-6B Fast-Flow (Pharmacia), DEAE-Sepharose 4B eller DEAE-Trisacryl LS (IBF).

' 5 Anvendelsen af en gel, som ligner Fractogel-TKS-DEAE (M), er beskrevet af Y. Kato et al., (J. Chromato., 245, 1982, 193-211), og anbefales til kromatografisk separation af meget store proteiner i industriskala. Denne gels reten-tions-elueringskapacitet er baseret på en lav ionbytningskapacitet og en stor porestørrelse.

10

Ansøgeren har vist, at denne type gel gjorde det muligt fortrinsvis at adsorbe-re de meget store komplekser, som dannes mellem faktor VIII og von Wil-lebrands faktor. Ved valg af påsætnings- og elueringspuffer har ansøger endvidere undersøgt de let hydrofobe bindinger, som dannes på grund af den 15 forlængede retention af de store komplekser på polyvinylmediet. Denne fordel ved gelen er ikke tidligere blevet belyst.

Ved at anvende en sådan resin til at behandle en fraktion af plasma indeholdende faktor VIII, f.eks. en foroprenset opløsning af cryopræcipitatet, opnåe-20 de vi under passende pufferbetingelser et faktor VIII koncentrat af meget høj renhed og hvis kvalitet kan sammenlignes med den for et plasmakoncentrat af en enkelt gruppe ved en koncentration på størrelsesordenen 50 internationale enheder/mg (specifik aktivitet højere end 100 internationale enhe-der/mg), uden at der er behov for et ultrafiltreringstrin, og med høj stabilitet, 25 dvs., det ikke er nødvendigt at tilsætte et stabiliseringsmiddel af proteintypen.

Ved den samme kromatografi er det også muligt at opnå fibrinogen-, fibro-nectin- og von Willebrands faktorberigede fraktioner, som opfylder de fysiske kemiparametre, der tilfredsstiller kravene for terapeutiske formål og for anvendelsen som et reagens. Endvidere kan fibrinogenet koncentreres til brug 30 som en biologisk lim i overensstemmelse med europæisk patentansøgning nr. 88 401961.3.

6 DK 176139 B1

Fremgangsmåden ifølge DK 175 322 B1 udføres på følgende måde. Plasmafraktionen, som er foroprenset og indeholder hoved proteinerne i cryopraecipi-tatet, dvs. fibrinogen, faktor VIII, fibronectin og von Willebrands faktor, føres over en anionbytningsresin, såsom den ovenfor specificerede; faktor VIII, von 5 Willebrands faktor (alt eller en væsentlig del afhængigt af mængden af det oprindelige materiale) og fibronectinet adsorberes på resinen, medens fibri-nogenet findes i filtratet med ikke-adsorberede proteiner.

Ved en første forøgelse af ionstyrken i pufferen elueres fibronectinet og en 10 væsentlig del af von Willebrands faktor.

Ved en yderligere forøgelse af ionstyrken i pufferen elueres faktor VIII i nærværelse af små mængder af von Willebrands faktor og kan frysetørreis direkte, uden at der er behov for at tilsætte et stabiliseringsmiddel eller udsætte 15 det for et ultrafiltreringstrin.

Den anvendte puffer indeholder fordelagtigt lysin i en mængde på fra ca. 2 til 4 g/l såvel som glycin i en mængde på fra ca. 8 til 11 g/l. Anvendelsen af andre aminosyrer eller endog anvendelsen af kun én af disse to aminosyrer 20 giver langt mindre tilfredsstillende resultater.

lonstyrken af pufferen forøges ved tilsætning af natriumchlorid. Anvendelsen af denne enkelte resin, der er moderat ionisk og let hydrofobisk, gør det muligt at anvende dette salt til at desorbere von Willebrands faktor, før faktor VIII 25 elueres, hvorved det er unødvendigt at anvende calciumchlorid, hvilket derefter skulle fjernes ved ultrafiltrering for at dissociere faktor VIII og von Willebrands faktor.

Der kan selvfølgelig udføres en virusinaktiverende behandling under anven-30 delse af en kendt metode på et hvilket som helst trin i processen. Hvis der anvendes et kemisk virusinaktiverende middel, vil det være hensigtsmæssigt at udføre denne inaktivering umiddel bart før plasmafraktionen føres gennem 7 DK 176139 B1 resinen. På denne måde vil det kromatografiske trin effektivt fjerne de inakti-verende midler.

Der er opnået gode resultater ved at anvende opløsningsmiddel-detergent-5 inaktiveringsmetoden, som er beskrevet i europæisk patentansøgning nr.

0 131 740.

Til fremstilling af faktor VIII kan det kromatografiske trin udføres på en hvilken som helst proteinfraktion, som indeholder faktoren, f.eks. på en foroprenset, 10 cryopræcipiteret plasmafraktion, som har været udsat for en behandling med aluminiumgel, eventuelt efterfulgt af præcipitering ved lav temperatur, i overensstemmelse med de traditionelle metoder til produktion af faktor Vlll-kon-centrater, som er beskrevet i europæisk patentansøgning nr. 86 104297.6.

15 Den specifikke aktivitet af faktor VIII:C i den initielle fraktion kan være så lav som 0,1 internationale enheder/mg. Den opnåede oprensningsfaktor ved et enkelt anionbytningskromatografitrin ifølge den foreliggende opfindelse er af størrelsesordenen fra 400 til 700 gange. Udbyttet ved dette trin ligger mellem 75% og 90%.

20

Det opnåede faktor VIIl-koncentrat er af meget høj renhed, idet dets specifikke aktivitet er større end 100 internationale enheder/mg protein. Det er fri for fibrinogen og immunoglobuliner G, og det er væsentligt udtømt for fibronec-tin. Dette produkt er fri for humane blodgruppeantistoffer eller indeholder dem 25 kun i meget små mængder, og det kan således sammenlignes med en koncentrat af enkeltgruppekvalitet i overensstemmelse med de standarder, som anbefales af den europæiske farmakopé, selv når der som et initielt materiale anvendes en plasma, som ikke er udvalgt efter blodgruppe. Det kan således med stor fordel anvendes ved terapier og navnlig ved behandling af hæmofili 30 A, der nødvendiggør gentagne rutineinjektioner. Det kan også anvendes som et reagens ved en hvilken som helst test eller analyse, hvor der skal anvendes en meget rent faktor VIII.

8 DK 176139 B1

De andre fraktioner, som separeres med denne kromatografisøjle, har også interesse på grund af de proteiner, som de indeholder, nemlig på den ene side fibrinogen, der indvindes i det første filtrat, og på den anden side fibro-nectin og von Willebrands faktor, som elueres ved den første forøgelse af 5 ionstyrken i pufferen.

Den foreliggende opfindelse angår et koncentrat af von Willebrands faktor.

De efterfølgende eksempler illustrerer fremgangsmåden nærmere.

10 EKSEMPEL 1 A) Foroprensninq og virusinaktiverinq 15 Som et udgangsmateriale anvendtes et cryopræcipitat af humanplasma re-suspenderet i en vandig opløsning af natriumheparin (ved 2 enheder/ml) og indeholdende faktor VIII med en specifik aktivitet på mellem 0,6 og 1,1 internationale enheder/mg. Suspensionens pH-værdi blev indstillet til 7-7,1 med 0,1 M eddikesyre.

20

Denne suspension af cryopræcipitatet blev udsat for oprensning ved behandling med aluminiumoxidgel og kold præcipitering. Der blev tilsat aluminiumhydroxid til suspensionen (108 g 2% AI(OH)3 pr. 1 kg cryopræcipitat) under omrøring i 5 minutter ved omgivelsestemperatur. pH-værdien blev indstillet til 25 6,5-6,6 med 0,1 M eddikesyre, og suspensionen blev derefter afkølet til 14- 16 °C under omrøring. Så snart den ønskede temperatur var blevet nået, blev centrifugering udført ved 14-16 °C, supernatanten blev høstet, og den blev steriliseret ved filtrering.

30 Denne foroprensede opløsning blev udsat for en virus-inaktiveringsbehand-ling under anvendelse af opløsningsmiddel-detergent i nærværelse af Tween-TNBP i overensstemmelse med den metode, som er beskrevet i europæisk patentansøgning nr. 0 131 740.

DK 176139 B1 i g i

B) Kromatografisk separation på Fractoael TSK-DEAE

Der blev fremstillet en kromatografisøjle med Fractogel TSK-DEAE 650 (M) (Merck) harpiks. Der blev anvendt 0,5 liter Fractogel pr. kg cryopræcipitat.

5 Søjlen blev vasket med 5 voluminer 0,1 M NaCI-opløsning og blev derefter balanceret med en puffer, som indeholdt: trinatriumcitrat (2,94 g/liter), cal-ciumchlorid (1 mM), natriumchlorid (0,11 M), glycin (9 g/liter) og lysin (3 g/liter). Den foroprensede cryopræcipitatopløsning beskrevet i A) blev sat på søjlen.

10

Det efterfølgende filtrat og eluater blev opsamlet, og deres proteinindhold blev overvåget ved at måle absorption ved 280 nm (herefter kaldet OD).

Det første filtrat viste en top af proteiner, som ikke blev adsorberet af søjlen, 15 hvilket hovedsageligt svarer til fibrinogen (se eksempel 3).

Efter at denne top havde passeret, og CD-værdien var faldet tilbage til basislinien, blev søjlen elueret med den samme puffer, hvis ionstyrke var blevet forøget en første gang ved tilsætning af NaCI til en slutkoncentration på 0,15 20 M. Denne puffer desorberer en proteintop indeholdende bulk-mængden af Von Willebrands faktor og fibronectin (se eksempel 4).

Efter at denne top havde passeret, når OD-værdien var faldet tilbage til basislinien, blev ionstyrken af pufferen forøget en anden gang ved tilsætning af 25 NaCI til en slutkoncentration på 0,25 M. Under disse betingelser elueres faktor VIII ved en koncentration på fra 30 til 40 internationale enheder/mi.

EKSEMPEL 2 30 Fremstilling af faktor Vlll-koncentratet

Den faktor Vlll-opløsning, der blev opnået ved den kromatografiske metode, som er beskrevet i eksempel 1, var tilstrækkelig ren og koncentreret til at bli 10 DK 176139 B1 ve anbragt direkte i flasker og frysetørret uden nogen yderligere ultrafiltreringstrin.

Koncentrationen kan, om nødvendigt, justeres ved fortyndinger med den 5 samme elueringspuffer for at indstille den specifikke aktivitet pr. flaske i overensstemmelse med gældende legale standarder.

Den gennemsnitlige sammensætning af de opnåede opløsninger er følgende: 10

Proteiner (g/l) 0,16-0,25

Faktor VIII:C (internationale enheder/ml) 30-4 5

Specifik aktivitet af faktor VIII:C

(internationale enheder/mg) 120-250

Fibrinogen (g/l) < 0,1

Von Willebrands faktor: Ag (enhed/ml) 11-23

Von Willebrands faktor: RCO (enhed/ml) 10-20

Faktor VIII: Ag (enhed/ml) 35-60

IgG (mg/ml) (nephelometri) < 0,011

Naturlige og immune anti-A-antistoffer 0-2

Fibronectin (mg/l) 15-40

Efter frysetørring er produktet klart og øjeblikkeligt opløseligt. Mængden af faktor VIII:C er stabil over 24 timer ved omgivelsestemperatur.

15 Injektioner i mennesker indicerer, at faktor VIII:C-indvinding er sammenlignelig med den, der opnås med mindre rene produkter. På lignende måde er halveringstiden ækvivalent med halveringstiden for de andre produkter.

Dette koncentrat viser sig at være et produkt med meget stor terapeutisk 20 værdi, og det er navnlig egnet til de gentagne injektioner, som er nødvendige ved behandling af hæmofili A.

EKSEMPEL 3 11 DK 176139 B1

Oprensning af et fibrinoqen-koncentrat 5 Det første kromatografifiltrat på DEAE-Fractogel beskrevet i eksempel 1 indeholder hovedsagelig fibrinogen, men også albumin, immunoglobuliner og virusinaktiverende midler (Tween og TNBP).

Fibrinogenet oprenses fra denne opløsning ved et yderligere kromatografitrin 10 på en heparin-Sepharose resinsøjle.

Dette kromatografitrin udføres i den samme puffer som det foregående indstillet til 0,06 M NaCI, hvorved det undgås at udføre dialyse mellem de to kromatografitrin.

15

Filtratet fra det første kromatografitrin fortyndes til opnåelse af en osmolaritet på 280 mOsm ved en pH-værdi på 6,5, før det påsættes den anden søjle.

Det andet filtrat indeholder albumin, immunoglobuliner, Tween og TNBP. Fibrinogenet er adsorberet på søjlen.

20 Når filtratets OD-værdi er faldet tilbage til basislinien, elueres søjlen med den samme puffer, efter at dens ionstyrke er blevet forøget ved tilsætning af NaCI til en slutkoncentration på 0,16 M.

25 Den opsamlede fibrinogenfraktion koncentreres derefter og dialyseres i et kassettesystem. Det koncentrerede produkt fyldes på flasker og frysetørres.

Dette koncentrerede fibrinogen opfylder de kvalitetsstandarder, der kræves ifølge den europæiske farmakopé.

30 Endvidere kan det tjene som et substrat til fremstilling af biologisk lim ifølge europæisk patentansøgning nr. 88 401961.3.

EKSEMPEL 4 12 DK 176139 B1

Fremstilling af et koncentrat af von Willebrands faktor 5 Den eluerede fraktion opnået ved kromatografi med DEAE-Fractogel i nærværelse af 0,15 M NaCI, beskrevet i eksempel 1, er betragteligt beriget med von Willebrands faktor og fibronectin. Den indeholder stadig noget Tween og TNBP.

10 Denne fraktion blev fortyndet til en osmolaritet på 385-390 mOsm med kro-matografibasispufferen (trinatriumcitrat, calciumchlorid, lysin, glycin, pH 7, osmolaritet 18 mOsm)

Det påsættes derefter en anden søjle af DEAE-fractogel, ækvilibreret med 15 den samme puffer som før indeholdende NaCI ved en slutkoncentration på 0,11 M indstillet til pH 7 og 387 mOsm. Under disse betingelser kan Tween og TNBP fjernes meget effektivt.

Eftersom den initielle opløsning allerede indeholdt en meget høj koncentrati-20 on af von Willebrands faktor, fæstnes sidstnævnte i langt højere grad til søjlen end under passagen gennem den første søjle. Søjlens bindingskapacitet er mindst 160 enheder Ag/ml (antigenenhed af Von Willebrands faktor) eller 100 RCO/ml (ristocetin co-faktorenheder) 25 Den fraktion, som indeholder von Willebrands faktor, elueres ved tilsætning af NaCI til en slutkoncentration på 0,15 M til pufferen.

Den eluerede von Willebrands faktor er tilstrækkelig koncentreret til, at yderligere ultrafiltrering er nødvendig; den fyldes på flasker og frysetørres.

30

Det opnåede koncentrat er meget rent og har en specifik aktivitet på over 100 enheder RCO/mg. Det indeholder stadig noget fibronectin, men det er ikke ødelæggende for dets aktivitet.

EKSEMPEL 5 13 DK 176139 B1

Fremstilling af et fibronectinkoncentrat 5

Et fibronectinkoncentrat kan også fremstilles ud fra det samme initielle eluat som i eksempel 4.

Von Willebrands faktor og fibronectin kan faktisk adskilles på basis af forskel 10 i molekylevægt. Ved gelfiltrering på en søjle af Sephacryl S-400 (R) (Pharmacia) separeres f.eks. den første fraktion med høj molekylevægt indeholdende Von Willebrands faktor fra en fraktion indeholdende fibronectin, der kan fyldes direkte på flasker og frysetørres.

i

Claims (1)

1. DK 176139 B1 Koncentrat af von Willebrands faktor til terapeutisk anvendelse opnåeligt ved fremgangsmåden ifølge DK 175 322 B1 .kendetegnet ved, at det har 5 en specifik aktivitet på mindst 100 enheder RCO/mg.