DK176139B1

DK176139B1 - Sepn. of plasma proteins, esp. factor-VIII - by chromatography on moderately ionic anion-exchange resin

Info

Publication number: DK176139B1
Application number: DK200400872A
Authority: DK
Inventors: Thierry Burnouf; Myriana Burnouf
Original assignee: Ct Regional De Transfusion San
Priority date: 1988-06-07
Filing date: 2004-06-03
Publication date: 2006-09-25
Also published as: DK200400872A

Abstract

Sepn. of human or animal plasma proteins is effected by chromatographing a solubilised cryoprecipitate fraction on a moderately ionic anion-exchange resin, such that very large mols. may be retained and hydrophobic interactions come into play, and recovering each of the proteins selectively by increasing the ionic strength of the elution buffer.

Description

DK 176139 B1DK 176139 B1

Den foreliggende opfindelse angår et koncentrat af von Willebrands faktor til terapeutisk anvendelse opnåeligt ved fremgangsmåden ifølge DK 175 322 B1.The present invention relates to a concentrate of von Willebrand's factor for therapeutic use obtainable by the method of DK 175 322 B1.

5 Ansøgningen er afdelt af DK 175 322 B1.5 The application is divided by DK 175 322 B1.

DK 175 322 B1 angår separation af proteiner fra en fraktion af humant plasma eller dyreplasma ved ionbytningskromatografi under anvendelse af en teknik, som gør det muligt i et enkelt trin at opnå en meget høj oprensnings-10 grad, navnlig for faktor VIII, fibrinogen og von Willebrands faktor.DK 175 322 B1 relates to the separation of proteins from a fraction of human plasma or animal plasma by ion exchange chromatography using a technique which enables in a single step to achieve a very high purification rate, especially for factor VIII, fibrinogen and von Willebrands factor.

Tilvejebringelsen af blodproteiner til terapeutiske formål nødvendiggør anvendelsen af oprensningsmetoder, som gør det mulig at opnå produkter, der er meget rene og fuldstændigt frie for kontaminerende forbindelser, navnlig 15 andre proteiner eller substanser af fremmed oprindelse, såsom antistoffer.The provision of blood proteins for therapeutic purposes necessitates the use of purification methods which enable products to be obtained which are very pure and completely free of contaminants, in particular other proteins or substances of foreign origin, such as antibodies.

Ved behandling af f.eks. hæmofili A er det vigtigt at råde over faktor VIII-koncentrater af meget høj renhed; patienten får talrige gentagne injektioner af faktor Vlll-koncentrater og samtidig væsentlige mængder af fibrinogen og 20 immunoglobuliner, som kan inducere uønskede immunsvar. Gentagne injektioner af utilstrækkeligt oprenset faktor VIII kan derfor kun udføres med plasmakoncentrater fra den samme gruppe for at undgå typiske transfusionsuheld på grund af forskelle i blodgruppe og fremkaldt ved tilstedeværelsen af immunoglobuliner.In the treatment of e.g. haemophilia A it is important to have very high purity factor VIII concentrates; the patient is given numerous repeated injections of factor VIII concentrates and at the same time substantial amounts of fibrinogen and 20 immunoglobulins which can induce unwanted immune responses. Therefore, repeated injections of insufficiently purified factor VIII can only be performed with plasma concentrates from the same group to avoid typical transfusion accidents due to differences in blood group and induced by the presence of immunoglobulins.

25 - Faktor Vlll-koncentrater fremstilles oftest ud fra en fraktion af cryopræcipite- ret humanplasma. Renheden af faktor Vlll-koncentrater, som almindeligvis opnås fra centre, der fremstiller humanplasma i industriskala, er ofte af størrelsesordenen i international enhed/mg og overstiger almindeligvis ikke 30 grænserne fra 10 til 20 internationale enheder/mg. Traditionelle fremstillingsmetoder gør brug af præcipiteringstrin, hvorved man forsøger, ofte meget utilstrækkeligt, at eliminere proteinkontaminanter, såsom fibrinogen, fibronec-tin og immunoglobuliner. Disse metoder kan anvende eller kombinere præci- 2 DK 176139 B1 pitering ved lav temperatur (10 °C) eller tilsætningen af proteinpræcipiterende midler, hydrofile polymerer, såsom PEG (Newman et al., Br. J. Haematol, 21: 1-20, 1971, Hao et al., i Methods of Plasma Protein Fractionation, Academic Press, 1980, s. 57-74), polyvinylpyrrolidon (Casillas og Simonetti, Br. Haeina-5 to, 50: 665-672, 1982), dextran, Ficoll, Percoll, hydroxyleret stivelse og albumin er således blevet foreslået som faktor Vlll-præcipiterende midler (Farru-gia et al., Thromb Haemostas, 51: 338-342,1984). Det samme gælder anvendelsen af glycin og natriumchlorid anbefalet af Thorell og Blomback. Nogle forfattere (Ng et al., Thrombosis Res., 42: 825-834,1986) har med held 10 kombineret tre præcipiteringsmidler, nemlig: PEG, glycin og natriumchlorid, til opnåelse af faktor VI Il-koncentrater med en specifik aktivitet på mellem 10 og 16 internationale enheder/mg.25 - Factor VIII concentrates are most often prepared from a fraction of cryoprecipitated human plasma. The purity of factor VIII concentrates commonly obtained from industrial scale human plasma centers is often of the order of international unit / mg and generally does not exceed the limits of 10 to 20 international units / mg. Traditional manufacturing methods use precipitation steps, which attempt, often very inadequately, to eliminate protein contaminants such as fibrinogen, fibronecin and immunoglobulins. These methods may use or combine low temperature (10 ° C) precipitation or the addition of protein precipitating agents, hydrophilic polymers such as PEG (Newman et al., Br. J. Haematol, 21: 1-20, 1971, Hao et al., In Methods of Plasma Protein Fractionation, Academic Press, 1980, pp. 57-74), polyvinylpyrrolidone (Casillas and Simonetti, Br. Haeina-5, 50: 665-672, 1982), dextran, Thus, Ficoll, Percoll, hydroxylated starch and albumin have been proposed as factor VIII precipitating agents (Farrugia et al., Thromb Haemostas, 51: 338-342,1984). The same applies to the use of glycine and sodium chloride recommended by Thorell and Blomback. Some authors (Ng et al., Thrombosis Res., 42: 825-834,1986) have successfully combined three precipitants, namely: PEG, glycine and sodium chloride, to obtain factor VI II concentrates with a specific activity of between 10 and 16 international units / mg.

Der er også blevet anvendt stensk eksklusionskromatografi eller gelfiltrering, 15 metoder, som er beregnet til indvinding af en fraktion med høj molekylevægt indeholdende faktor VIII:C-von Willebrands faktorkompleks delvis fri for fibrinogen. Med denne teknik tilvejebringes med en lav output-hastighed et produkt, hvis specifikke aktivitet ikke overstiger 30 internationale enheder/mg, og som nødvendiggør tilsætning af albumin som en stabilisator (hvilket fører til 20 fald i specifik aktivitet til ca. 3 til 5 internationale enheder/mg. Denne teknik har en række problemer med hensyn til tilpasning til produktion i stor skala, eftersom det er vanskeligt at holde opløsningsevnen i industrielle gelfiltreringssøjler over en tidsperiode.Stone exclusion chromatography or gel filtration has also been used, 15 methods, which are intended to recover a high molecular weight fraction containing factor VIII: C-von Willebrand factor complex partially free of fibrinogen. With this technique, at a low output rate, a product whose specific activity does not exceed 30 international units / mg is provided and which requires the addition of albumin as a stabilizer (leading to 20 decreases in specific activity to about 3 to 5 international units This technique has a number of problems in adapting to large scale production since it is difficult to maintain the solubility in industrial gel filtration columns over a period of time.

25 Der er også blevet produceret faktor VIIl-koncentrater ved i produktionsprogrammet at inkorporere kontakt med mikrokugler af porøs siliciumdioxid udformet til at indfange proteinkontaminanter med lav molekylevægt (Margolis et al., Vox Sang., 46: 341-348, 1984). Den specifikke aktivitet af produktet forbliver forholdsvis lille: 1 international enhed/mg.Factor VII1 concentrates have also been produced by incorporating in the production program contact with porous silica microspheres designed to capture low molecular weight protein contaminants (Margolis et al., Vox Sang., 46: 341-348, 1984). The specific activity of the product remains relatively small: 1 international unit / mg.

Der er for nylig fremkommet nye metoder til fremstilling af meget rene faktor VIIl-koncentrater. Hyland- og Travenol-firmaerne har f.eks. foreslået at opnå koncentrater ved at anvende immunaffinitetskromatografimetoder (Zimmer- 30 3 DK 176139 B1 man og Fuicher, Thrombosis Res., suppl. VII, s. 58, 1987, Berntorp og Nilsson, Thrombosis Res., suppl. VII, s. 60,1987, Levine et al., Thrombosis Res., suppl. VII, 1987). Disse metoder omfatter oprensning af faktor VIII med i antistoffer mod faktor VIII:C eller von Willebrands faktor immobiliseret på et 5 kromatografisk medium. Disse metoder fungerer godt, men nødvendiggør anvendelsen af drastiske opløsninger til at desorbere faktor VIII fra enten dets antistoffer eller fra von Willebrands faktor. Et yderligere ultrafiltreringstrin, som har til hensigt at fjerne de uønskede kemiske midler, er således påkrævet, men det kan være ødelæggende for den biologiske aktivitet af 10 faktor VIII. Den specifikke aktivitet af faktor VIII kan nå fra 1.000 til 3.000 in ternationale enheder/mg i løbet af produktionen, men dens ustabilitet nødvendiggør tilsætning af et stabiliseringsmiddel, såsom albumin, før frysetørringstrinnet, hvilket nedsætter den specifikke aktivitet af faktor VIII til fra 3 til 5 internationale enheder/mg. Den vigtigste ulempe ved oprensning ved im-15 munaffinitet er imidlertid tilstedeværelsen af resterende antistoffer; da disse stammer fra mus, kan de medføre et immunsvar i patienterne rettet mod disse proteiner, som er fremmede for den humane organisme.New methods have been recently developed for the preparation of very pure factor VII1 concentrates. The Hyland and Travenol companies, for example. proposed to obtain concentrates by using immunoaffinity chromatography methods (Zimmer- 30 DK 176139 B1 Man and Fuicher, Thrombosis Res., Supp. VII, p. 58, 1987, Berntorp and Nilsson, Thrombosis Res., Supplement VII, p. 60, 1987, Levine et al., Thrombosis Res., Suppl VII, 1987). These methods include purification of factor VIII with antibodies against factor VIII: C or von Willebrand factor immobilized on a chromatographic medium. These methods work well but necessitate the use of drastic solutions to desorb factor VIII from either its antibodies or from von Willebrand's factor. Thus, an additional ultrafiltration step, which intends to remove the undesirable chemical agents, is required, but may be detrimental to the biological activity of 10 factor VIII. The specific activity of factor VIII may reach from 1,000 to 3,000 international units / mg during production, but its instability necessitates the addition of a stabilizer, such as albumin, before the freeze-drying step, which reduces the specific activity of factor VIII to from 3 to 5. international units / mg. However, the main disadvantage of purification by immunoaffinity is the presence of residual antibodies; as these are derived from mice, they may cause an immune response in patients targeting these proteins that are foreign to the human organism.

lonbytningskromatografimetoder er også blevet anvendt, men på grund af 20 kompleksiteten af driftsprocedurerne og de opnåede lave udbytter er disse metoder begrænset til laboratoriet.Lon exchange chromatography methods have also been used, but due to the complexity of the operating procedures and the low yields obtained, these methods are limited to the laboratory.

I en artikel af J.J. Morgenthaier (Throinb. Haemostas., Stuttgart, 47 (2) 124-127 (1982)), diskuteres f.eks. oprensningen af faktor VIILC under anvendelse 25 af et polyethylenglycolpræcipitat ved passage gennem en modificeret Sepha-rose-harpiks. Der er ingen oplysninger om udbyttet eller reproducerbarheden ved de forskellige undersøgte metoder.In an article by J.J. Morgenthaier (Throinb. Haemostas. Stuttgart, 47 (2) 124-127 (1982)) is discussed, e.g. the purification of factor VIILC using a polyethylene glycol precipitate when passing through a modified Sepha rose resin. There is no information on the yield or reproducibility of the various methods investigated.

Det er således absolut nødvendigt at råde over nye fremgangsmåder til op-30 nåelse af proteinkoncentrater og navnlig faktor VIII, hvilke metoder kan anvendes i industriskala og give meget rene produkter fuldstændigt frie for proteiner af fremmed oprindelse, såsom antistoffer af animalsk oprindelse.Thus, it is imperative to have new methods for obtaining protein concentrates, and in particular Factor VIII, which can be used on an industrial scale and render very pure products completely free of proteins of foreign origin, such as antibodies of animal origin.

4 DK 176139 B14 DK 176139 B1

Ansøgeren har derfor udviklet en oprensningsmetode under anvendelse af anionbytningskromatografi, hvilken metode takket være det passende valg af den anvendte resin muliggør, at de proteiner, som har interesse, separeres med en enkelt kromatografisøjle under betingelser, som er hensigtsmæssigt 5 udformet, så det er muligt at klare sig uden yderligere bearbejdning, såsom ultrafiltrering, hvilket forøger processens kompleksitet og nedsætter aktiviteten af de oprensede protein.The applicant has therefore developed a purification method using anion exchange chromatography, which, thanks to the appropriate choice of the resin used, allows the proteins of interest to be separated by a single chromatography column under conditions which are conveniently designed so as to be possible. without further processing such as ultrafiltration, which increases the complexity of the process and decreases the activity of the purified protein.

DK 175 322 B1 angår således en fremgangsmåde til separering af plasma-10 proteiner, og navnlig faktor VIII, fibrinogen, fibronectin og von Willebrands faktor, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at en opløst fraktion af et cryopræcipitat af humanplasma udsættes for en kromatografisk behandling på en anionbytningsresin af en forholdsvis moderat ionisk natur, og som også tillader forekomsten af hydrofobe vekselvirkninger, hvilken resin ikke 15 adsorberer visse proteiner og binder andre, der derefter elueres specifikt ved at forøge ionstyrken af pufferen.Thus, DK 175 322 B1 relates to a method for separating plasma proteins, and in particular to factor VIII, fibrinogen, fibronectin and von Willebrand factor, which is characterized in that a dissolved fraction of a cryoprecipitate of human plasma is subjected to a chromatographic treatment of an anion exchange resin of a relatively moderate ionic nature, which also allows for the occurrence of hydrophobic interactions, which resin does not adsorb certain proteins and binds others which are then specifically eluted by increasing the ionic strength of the buffer.

Fremgangsmåden kan også anvendes med et plasma af animalsk oprindelse, frå svin f.eks., til specielle tilfælde med hæmofili-patienter med hæmmen-20 de serum, hvilke patienter ikke kan behandles med faktor VIII af human oprindelse.The method can also be used with a plasma of animal origin, from pigs, for example, for special cases with hemophilia patients with inhibitory serum, which patients cannot be treated with factor VIII of human origin.

Som en udgangsfraktion kan man således anvende en fraktion af et cryo-præcipiteret plasma, som kan have været underkastet en foroprensningsbe-25 handling. Denne forbehandling kan f.eks. bestå af præcipitering med alumi-niumoxidgel og/eller præcipitering ved lav temperatur i overensstemmelse med de traditionelle metoder til behandling af sådanne fraktioner.Thus, as a starting fraction, one can use a fraction of a cryoprecipitated plasma which may have been subjected to a pre-purification treatment. This pretreatment may e.g. consist of precipitation with alumina gel and / or low temperature precipitation in accordance with the traditional methods of treating such fractions.

Ved undersøgelsen af de forskellige resiner til kromatografisk separation blev 30 det observeret, at de mest tilfredsstillende resultater blev opnået med DEAE-grupper fastgjort på en vinylpolymergel, såsom Fractogel TSK. En resin af denne type kan fås kommercielt under navnet Fractogel TSK-DEAE 650 (M) (Merck). Dette kromatografiske medium har givet langt bedre resultater end 5 DK 176139 B1 de resultater, der blev opnået med de andre undersøgte geler, såsom DEAE-Sepharose CL-6B, DEAE Sepharose CL-6B Fast-Flow (Pharmacia), DEAE-Sepharose 4B eller DEAE-Trisacryl LS (IBF).In examining the various resins for chromatographic separation, it was observed that the most satisfactory results were obtained with DEAE groups attached to a vinyl polymer gel such as Fractogel TSK. A resin of this type is commercially available under the name Fractogel TSK-DEAE 650 (M) (Merck). This chromatographic medium has yielded far better results than the results obtained with the other gels studied, such as DEAE-Sepharose CL-6B, DEAE Sepharose CL-6B Fast-Flow (Pharmacia), DEAE-Sepharose 4B or DEAE-Trisacryl LS (IBF).

' 5 Anvendelsen af en gel, som ligner Fractogel-TKS-DEAE (M), er beskrevet af Y. Kato et al., (J. Chromato., 245, 1982, 193-211), og anbefales til kromatografisk separation af meget store proteiner i industriskala. Denne gels reten-tions-elueringskapacitet er baseret på en lav ionbytningskapacitet og en stor porestørrelse.The use of a gel similar to Fractogel-TKS-DEAE (M) is described by Y. Kato et al. (J. Chromato., 245, 1982, 193-211) and is recommended for chromatographic separation of very large scale industrial proteins. The retention elution capacity of this gel is based on a low ion exchange capacity and a large pore size.

1010

Ansøgeren har vist, at denne type gel gjorde det muligt fortrinsvis at adsorbe-re de meget store komplekser, som dannes mellem faktor VIII og von Wil-lebrands faktor. Ved valg af påsætnings- og elueringspuffer har ansøger endvidere undersøgt de let hydrofobe bindinger, som dannes på grund af den 15 forlængede retention af de store komplekser på polyvinylmediet. Denne fordel ved gelen er ikke tidligere blevet belyst.The applicant has shown that this type of gel preferably allowed the very large complexes formed between factor VIII and von Wil-lebrand's factor to be adsorbed. In addition, when selecting application and elution buffer, applicant has investigated the slightly hydrophobic bonds formed due to the extended retention of the large complexes on the polyvinyl medium. This advantage of the gel has not been previously elucidated.

Ved at anvende en sådan resin til at behandle en fraktion af plasma indeholdende faktor VIII, f.eks. en foroprenset opløsning af cryopræcipitatet, opnåe-20 de vi under passende pufferbetingelser et faktor VIII koncentrat af meget høj renhed og hvis kvalitet kan sammenlignes med den for et plasmakoncentrat af en enkelt gruppe ved en koncentration på størrelsesordenen 50 internationale enheder/mg (specifik aktivitet højere end 100 internationale enhe-der/mg), uden at der er behov for et ultrafiltreringstrin, og med høj stabilitet, 25 dvs., det ikke er nødvendigt at tilsætte et stabiliseringsmiddel af proteintypen.By using such a resin to treat a fraction of plasma containing factor VIII, e.g. a purified solution of the cryoprecipitate, we obtained, under appropriate buffer conditions, a very high purity factor VIII concentrate and the quality of which is comparable to that of a single group plasma concentrate at a concentration of about 50 international units / mg (specific activity higher than 100 international units / mg), without the need for an ultrafiltration step, and with high stability, i.e., it is not necessary to add a protein-type stabilizer.

Ved den samme kromatografi er det også muligt at opnå fibrinogen-, fibro-nectin- og von Willebrands faktorberigede fraktioner, som opfylder de fysiske kemiparametre, der tilfredsstiller kravene for terapeutiske formål og for anvendelsen som et reagens. Endvidere kan fibrinogenet koncentreres til brug 30 som en biologisk lim i overensstemmelse med europæisk patentansøgning nr. 88 401961.3.By the same chromatography, it is also possible to obtain fibrinogen, fibronectin, and von Willebrand factor-enriched fractions that meet the physical chemistry parameters that meet the requirements for therapeutic purposes and for use as a reagent. Further, the fibrinogen can be concentrated for use as a biological adhesive in accordance with European Patent Application No. 88 401961.3.

6 DK 176139 B16 DK 176139 B1

Fremgangsmåden ifølge DK 175 322 B1 udføres på følgende måde. Plasmafraktionen, som er foroprenset og indeholder hoved proteinerne i cryopraecipi-tatet, dvs. fibrinogen, faktor VIII, fibronectin og von Willebrands faktor, føres over en anionbytningsresin, såsom den ovenfor specificerede; faktor VIII, von 5 Willebrands faktor (alt eller en væsentlig del afhængigt af mængden af det oprindelige materiale) og fibronectinet adsorberes på resinen, medens fibri-nogenet findes i filtratet med ikke-adsorberede proteiner.The process according to DK 175 322 B1 is carried out as follows. The plasma fraction which is pre-purified and contains the major proteins in the cryoprecipitate, i.e. fibrinogen, factor VIII, fibronectin and von Willebrand factor, are passed over an anion exchange resin such as the one specified above; factor VIII, von 5 Willebrand's factor (all or a substantial part depending on the amount of the original material) and the fibronectin are adsorbed on the resin, while the fibrin is found in the filtrate with non-adsorbed proteins.

Ved en første forøgelse af ionstyrken i pufferen elueres fibronectinet og en 10 væsentlig del af von Willebrands faktor.Upon a first increase in the ionic strength in the buffer, the fibronectin and a substantial part of von Willebrand's factor are eluted.

Ved en yderligere forøgelse af ionstyrken i pufferen elueres faktor VIII i nærværelse af små mængder af von Willebrands faktor og kan frysetørreis direkte, uden at der er behov for at tilsætte et stabiliseringsmiddel eller udsætte 15 det for et ultrafiltreringstrin.By further increasing the ionic strength in the buffer, factor VIII is eluted in the presence of small amounts of von Willebrand's factor and can be lyophilized directly without the need for a stabilizer or subjected to an ultrafiltration step.

Den anvendte puffer indeholder fordelagtigt lysin i en mængde på fra ca. 2 til 4 g/l såvel som glycin i en mængde på fra ca. 8 til 11 g/l. Anvendelsen af andre aminosyrer eller endog anvendelsen af kun én af disse to aminosyrer 20 giver langt mindre tilfredsstillende resultater.The buffer used advantageously contains lysine in an amount of from approx. 2 to 4 g / l as well as glycine in an amount of from approx. 8 to 11 g / l. The use of other amino acids or even the use of only one of these two amino acids 20 yields far less satisfactory results.

lonstyrken af pufferen forøges ved tilsætning af natriumchlorid. Anvendelsen af denne enkelte resin, der er moderat ionisk og let hydrofobisk, gør det muligt at anvende dette salt til at desorbere von Willebrands faktor, før faktor VIII 25 elueres, hvorved det er unødvendigt at anvende calciumchlorid, hvilket derefter skulle fjernes ved ultrafiltrering for at dissociere faktor VIII og von Willebrands faktor.The buffer strength of the buffer is increased by the addition of sodium chloride. The use of this single resin, which is moderately ionic and slightly hydrophobic, allows this salt to be used to desorb von Willebrand's factor before eluting Factor VIII 25, thereby eliminating the need to use calcium chloride, which should then be removed by ultrafiltration to dissociate factor VIII and von Willebrand factor.

Der kan selvfølgelig udføres en virusinaktiverende behandling under anven-30 delse af en kendt metode på et hvilket som helst trin i processen. Hvis der anvendes et kemisk virusinaktiverende middel, vil det være hensigtsmæssigt at udføre denne inaktivering umiddel bart før plasmafraktionen føres gennem 7 DK 176139 B1 resinen. På denne måde vil det kromatografiske trin effektivt fjerne de inakti-verende midler.Of course, a virus-inactivating treatment can be performed using a known method at any stage of the process. If a chemical virus inactivating agent is used, it will be convenient to perform this inactivation immediately before the plasma fraction is passed through the resin. In this way, the chromatographic step will effectively remove the inactivating agents.

Der er opnået gode resultater ved at anvende opløsningsmiddel-detergent-5 inaktiveringsmetoden, som er beskrevet i europæisk patentansøgning nr.Good results have been obtained by using the solvent-detergent inactivation method described in European Patent Application no.

0 131 740.0 131 740.

Til fremstilling af faktor VIII kan det kromatografiske trin udføres på en hvilken som helst proteinfraktion, som indeholder faktoren, f.eks. på en foroprenset, 10 cryopræcipiteret plasmafraktion, som har været udsat for en behandling med aluminiumgel, eventuelt efterfulgt af præcipitering ved lav temperatur, i overensstemmelse med de traditionelle metoder til produktion af faktor Vlll-kon-centrater, som er beskrevet i europæisk patentansøgning nr. 86 104297.6.For the preparation of factor VIII, the chromatographic step can be carried out on any protein fraction containing the factor, e.g. on a pre-purified, 10 cryoprecipitated plasma fraction which has been subjected to a treatment with aluminum gel, optionally followed by low temperature precipitation, in accordance with the traditional methods of producing Factor VIII concentrates described in European Patent Application no. 86 104297.6.

15 Den specifikke aktivitet af faktor VIII:C i den initielle fraktion kan være så lav som 0,1 internationale enheder/mg. Den opnåede oprensningsfaktor ved et enkelt anionbytningskromatografitrin ifølge den foreliggende opfindelse er af størrelsesordenen fra 400 til 700 gange. Udbyttet ved dette trin ligger mellem 75% og 90%.The specific activity of factor VIII: C in the initial fraction may be as low as 0.1 international units / mg. The purification factor obtained by a single anion exchange chromatography step of the present invention is on the order of 400 to 700 times. The yield at this stage is between 75% and 90%.

2020

Det opnåede faktor VIIl-koncentrat er af meget høj renhed, idet dets specifikke aktivitet er større end 100 internationale enheder/mg protein. Det er fri for fibrinogen og immunoglobuliner G, og det er væsentligt udtømt for fibronec-tin. Dette produkt er fri for humane blodgruppeantistoffer eller indeholder dem 25 kun i meget små mængder, og det kan således sammenlignes med en koncentrat af enkeltgruppekvalitet i overensstemmelse med de standarder, som anbefales af den europæiske farmakopé, selv når der som et initielt materiale anvendes en plasma, som ikke er udvalgt efter blodgruppe. Det kan således med stor fordel anvendes ved terapier og navnlig ved behandling af hæmofili 30 A, der nødvendiggør gentagne rutineinjektioner. Det kan også anvendes som et reagens ved en hvilken som helst test eller analyse, hvor der skal anvendes en meget rent faktor VIII.The obtained factor VII concentrate is of very high purity, with its specific activity being greater than 100 international units / mg protein. It is free of fibrinogen and immunoglobulins G and is substantially depleted of fibronecin. This product is free of human blood group antibodies or contains them only in very small quantities, and thus can be compared to a single group grade concentrate in accordance with the standards recommended by the European Pharmacopoeia, even when a plasma is used as an initial material. , which is not selected by blood type. Thus, it can be used with great advantage in therapies and in particular in the treatment of hemophilia 30 A, which necessitates repeated routine injections. It can also be used as a reagent in any test or analysis using a very pure factor VIII.

8 DK 176139 B18 DK 176139 B1

De andre fraktioner, som separeres med denne kromatografisøjle, har også interesse på grund af de proteiner, som de indeholder, nemlig på den ene side fibrinogen, der indvindes i det første filtrat, og på den anden side fibro-nectin og von Willebrands faktor, som elueres ved den første forøgelse af 5 ionstyrken i pufferen.The other fractions that are separated by this chromatography column are also of interest because of the proteins they contain, namely, on the one hand, fibrinogen which is recovered in the first filtrate and on the other hand fibronectin and von Willebrand factor, which is eluted by the first increase of 5 ionic strength in the buffer.

Den foreliggende opfindelse angår et koncentrat af von Willebrands faktor.The present invention relates to a concentrate of von Willebrand factor.

De efterfølgende eksempler illustrerer fremgangsmåden nærmere.The following examples further illustrate the process.

10 EKSEMPEL 1 A) Foroprensninq og virusinaktiverinq 15 Som et udgangsmateriale anvendtes et cryopræcipitat af humanplasma re-suspenderet i en vandig opløsning af natriumheparin (ved 2 enheder/ml) og indeholdende faktor VIII med en specifik aktivitet på mellem 0,6 og 1,1 internationale enheder/mg. Suspensionens pH-værdi blev indstillet til 7-7,1 med 0,1 M eddikesyre.EXAMPLE 1 A) Pre-purification and virus inactivation As a starting material, a human plasma cryoprecipitate resuspended in an aqueous solution of sodium heparin (at 2 units / ml) and containing factor VIII with a specific activity of between 0.6 and 1.1 was used. international units / mg. The pH of the suspension was adjusted to 7-7.1 with 0.1 M acetic acid.

2020

Denne suspension af cryopræcipitatet blev udsat for oprensning ved behandling med aluminiumoxidgel og kold præcipitering. Der blev tilsat aluminiumhydroxid til suspensionen (108 g 2% AI(OH)3 pr. 1 kg cryopræcipitat) under omrøring i 5 minutter ved omgivelsestemperatur. pH-værdien blev indstillet til 25 6,5-6,6 med 0,1 M eddikesyre, og suspensionen blev derefter afkølet til 14- 16 °C under omrøring. Så snart den ønskede temperatur var blevet nået, blev centrifugering udført ved 14-16 °C, supernatanten blev høstet, og den blev steriliseret ved filtrering.This suspension of the cryoprecipitate was subjected to purification by treatment with alumina gel and cold precipitation. Aluminum hydroxide was added to the suspension (108 g of 2% Al (OH) 3 per 1 kg of cryoprecipitate) with stirring for 5 minutes at ambient temperature. The pH was adjusted to 6.5-6.6 with 0.1 M acetic acid and then the suspension was cooled to 14-16 ° C with stirring. Once the desired temperature was reached, centrifugation was performed at 14-16 ° C, the supernatant was harvested and sterilized by filtration.

30 Denne foroprensede opløsning blev udsat for en virus-inaktiveringsbehand-ling under anvendelse af opløsningsmiddel-detergent i nærværelse af Tween-TNBP i overensstemmelse med den metode, som er beskrevet i europæisk patentansøgning nr. 0 131 740.This pre-purified solution was subjected to a virus inactivation treatment using solvent detergent in the presence of Tween-TNBP according to the method described in European Patent Application No. 0 131 740.

DK 176139 B1 i g iDK 176139 B1 in g i

B) Kromatografisk separation på Fractoael TSK-DEAEB) Chromatographic separation on Fractoael TSK-DEAE

Der blev fremstillet en kromatografisøjle med Fractogel TSK-DEAE 650 (M) (Merck) harpiks. Der blev anvendt 0,5 liter Fractogel pr. kg cryopræcipitat.A chromatography column was prepared with Fractogel TSK-DEAE 650 (M) (Merck) resin. 0.5 liters of Fractogel was used per day. kg of cryoprecipitate.

5 Søjlen blev vasket med 5 voluminer 0,1 M NaCI-opløsning og blev derefter balanceret med en puffer, som indeholdt: trinatriumcitrat (2,94 g/liter), cal-ciumchlorid (1 mM), natriumchlorid (0,11 M), glycin (9 g/liter) og lysin (3 g/liter). Den foroprensede cryopræcipitatopløsning beskrevet i A) blev sat på søjlen.The column was washed with 5 volumes of 0.1 M NaCl solution and then balanced with a buffer containing: trisodium citrate (2.94 g / liter), calcium chloride (1 mM), sodium chloride (0.11 M) , glycine (9 g / liter) and lysine (3 g / liter). The purified cryoprecipitate solution described in A) was placed on the column.

1010

Det efterfølgende filtrat og eluater blev opsamlet, og deres proteinindhold blev overvåget ved at måle absorption ved 280 nm (herefter kaldet OD).The subsequent filtrate and eluates were collected and their protein content monitored by measuring absorption at 280 nm (hereinafter called OD).

Det første filtrat viste en top af proteiner, som ikke blev adsorberet af søjlen, 15 hvilket hovedsageligt svarer til fibrinogen (se eksempel 3).The first filtrate showed a peak of proteins that were not adsorbed by the column, which is essentially similar to fibrinogen (see Example 3).

Efter at denne top havde passeret, og CD-værdien var faldet tilbage til basislinien, blev søjlen elueret med den samme puffer, hvis ionstyrke var blevet forøget en første gang ved tilsætning af NaCI til en slutkoncentration på 0,15 20 M. Denne puffer desorberer en proteintop indeholdende bulk-mængden af Von Willebrands faktor og fibronectin (se eksempel 4).After this peak had passed and the CD value had returned to baseline, the column was eluted with the same buffer whose ionic strength had been increased for the first time by adding NaCl to a final concentration of 0.15 20 M. This buffer desorbs a protein peak containing the bulk amount of Von Willebrand's factor and fibronectin (see Example 4).

Efter at denne top havde passeret, når OD-værdien var faldet tilbage til basislinien, blev ionstyrken af pufferen forøget en anden gang ved tilsætning af 25 NaCI til en slutkoncentration på 0,25 M. Under disse betingelser elueres faktor VIII ved en koncentration på fra 30 til 40 internationale enheder/mi.After this peak had passed when the OD value had fallen back to baseline, the ionic strength of the buffer was increased a second time by adding 25 NaCl to a final concentration of 0.25 M. Under these conditions, factor VIII was eluted at a concentration of 30 to 40 international units / mi.

EKSEMPEL 2 30 Fremstilling af faktor Vlll-koncentratetEXAMPLE 2 Preparation of the factor VIII concentrate

Den faktor Vlll-opløsning, der blev opnået ved den kromatografiske metode, som er beskrevet i eksempel 1, var tilstrækkelig ren og koncentreret til at bli 10 DK 176139 B1 ve anbragt direkte i flasker og frysetørret uden nogen yderligere ultrafiltreringstrin.The factor VIII solution obtained by the chromatographic method described in Example 1 was sufficiently pure and concentrated to be placed directly in bottles and freeze-dried without any additional ultrafiltration step.

Koncentrationen kan, om nødvendigt, justeres ved fortyndinger med den 5 samme elueringspuffer for at indstille den specifikke aktivitet pr. flaske i overensstemmelse med gældende legale standarder.The concentration can be adjusted, if necessary, by dilutions with the same elution buffer to set the specific activity per bottle in accordance with applicable legal standards.

Den gennemsnitlige sammensætning af de opnåede opløsninger er følgende: 10The average composition of the solutions obtained is as follows:

Proteiner (g/l) 0,16-0,25Proteins (g / L) 0.16-0.25

Faktor VIII:C (internationale enheder/ml) 30-4 5Factor VIII: C (International Units / ml) 30-4 5

Specifik aktivitet af faktor VIII:CSpecific activity of factor VIII: C

(internationale enheder/mg) 120-250(international units / mg) 120-250

Fibrinogen (g/l) < 0,1Fibrinogen (g / l) <0.1

Von Willebrands faktor: Ag (enhed/ml) 11-23Von Willebrand's factor: Ag (unit / ml) 11-23

Von Willebrands faktor: RCO (enhed/ml) 10-20Von Willebrand's factor: RCO (unit / ml) 10-20

Faktor VIII: Ag (enhed/ml) 35-60Factor VIII: Ag (unit / ml) 35-60

IgG (mg/ml) (nephelometri) < 0,011IgG (mg / ml) (nephelometry) <0.011

Naturlige og immune anti-A-antistoffer 0-2Natural and immune anti-A antibodies 0-2

Fibronectin (mg/l) 15-40Fibronectin (mg / L) 15-40

Efter frysetørring er produktet klart og øjeblikkeligt opløseligt. Mængden af faktor VIII:C er stabil over 24 timer ved omgivelsestemperatur.After freeze drying, the product is clearly and immediately soluble. The amount of factor VIII: C is stable over 24 hours at ambient temperature.

15 Injektioner i mennesker indicerer, at faktor VIII:C-indvinding er sammenlignelig med den, der opnås med mindre rene produkter. På lignende måde er halveringstiden ækvivalent med halveringstiden for de andre produkter.15 Injections in humans indicate that factor VIII: C recovery is comparable to that achieved with less pure products. Similarly, the half-life is equivalent to the half-life of the other products.

Dette koncentrat viser sig at være et produkt med meget stor terapeutisk 20 værdi, og det er navnlig egnet til de gentagne injektioner, som er nødvendige ved behandling af hæmofili A.This concentrate turns out to be a product of very high therapeutic value, and is particularly suitable for the repeated injections needed in the treatment of haemophilia A.

EKSEMPEL 3 11 DK 176139 B1EXAMPLE 3 11 DK 176139 B1

Oprensning af et fibrinoqen-koncentrat 5 Det første kromatografifiltrat på DEAE-Fractogel beskrevet i eksempel 1 indeholder hovedsagelig fibrinogen, men også albumin, immunoglobuliner og virusinaktiverende midler (Tween og TNBP).Purification of a fibrinogen concentrate 5 The first chromatography filtrate on DEAE-Fractogel described in Example 1 contains mainly fibrinogen, but also albumin, immunoglobulins and virus inactivating agents (Tween and TNBP).

Fibrinogenet oprenses fra denne opløsning ved et yderligere kromatografitrin 10 på en heparin-Sepharose resinsøjle.The fibrinogen is purified from this solution by a further chromatography step 10 on a heparin-Sepharose resin column.

Dette kromatografitrin udføres i den samme puffer som det foregående indstillet til 0,06 M NaCI, hvorved det undgås at udføre dialyse mellem de to kromatografitrin.This chromatography step is performed in the same buffer as the previous set to 0.06 M NaCl, thereby avoiding dialysis between the two chromatography steps.

1515

Filtratet fra det første kromatografitrin fortyndes til opnåelse af en osmolaritet på 280 mOsm ved en pH-værdi på 6,5, før det påsættes den anden søjle.The filtrate from the first chromatography step is diluted to give an osmolarity of 280 mOsm at a pH of 6.5 before applying it to the second column.

Det andet filtrat indeholder albumin, immunoglobuliner, Tween og TNBP. Fibrinogenet er adsorberet på søjlen.The second filtrate contains albumin, immunoglobulins, Tween and TNBP. The fibrinogen is adsorbed on the column.

20 Når filtratets OD-værdi er faldet tilbage til basislinien, elueres søjlen med den samme puffer, efter at dens ionstyrke er blevet forøget ved tilsætning af NaCI til en slutkoncentration på 0,16 M.When the OD value of the filtrate has dropped back to baseline, the column is eluted with the same buffer after its ionic strength has been increased by adding NaCl to a final concentration of 0.16 M.

25 Den opsamlede fibrinogenfraktion koncentreres derefter og dialyseres i et kassettesystem. Det koncentrerede produkt fyldes på flasker og frysetørres.The collected fibrinogen fraction is then concentrated and dialyzed in a cassette system. The concentrated product is filled into bottles and lyophilized.

Dette koncentrerede fibrinogen opfylder de kvalitetsstandarder, der kræves ifølge den europæiske farmakopé.This concentrated fibrinogen meets the quality standards required by the European Pharmacopoeia.

30 Endvidere kan det tjene som et substrat til fremstilling af biologisk lim ifølge europæisk patentansøgning nr. 88 401961.3.Further, it can serve as a substrate for the production of biological adhesive according to European Patent Application No. 88 401961.3.

EKSEMPEL 4 12 DK 176139 B1EXAMPLE 4 12 DK 176139 B1

Fremstilling af et koncentrat af von Willebrands faktor 5 Den eluerede fraktion opnået ved kromatografi med DEAE-Fractogel i nærværelse af 0,15 M NaCI, beskrevet i eksempel 1, er betragteligt beriget med von Willebrands faktor og fibronectin. Den indeholder stadig noget Tween og TNBP.Preparation of a concentrate of von Willebrand factor 5 The eluted fraction obtained by chromatography with DEAE-Fractogel in the presence of 0.15 M NaCl described in Example 1 is considerably enriched with von Willebrand factor and fibronectin. It still contains some Tween and TNBP.

10 Denne fraktion blev fortyndet til en osmolaritet på 385-390 mOsm med kro-matografibasispufferen (trinatriumcitrat, calciumchlorid, lysin, glycin, pH 7, osmolaritet 18 mOsm)This fraction was diluted to an osmolarity of 385-390 mOsm with the chromatography base buffer (trisodium citrate, calcium chloride, lysine, glycine, pH 7, osmolarity 18 mOsm)

Det påsættes derefter en anden søjle af DEAE-fractogel, ækvilibreret med 15 den samme puffer som før indeholdende NaCI ved en slutkoncentration på 0,11 M indstillet til pH 7 og 387 mOsm. Under disse betingelser kan Tween og TNBP fjernes meget effektivt.A second column of DEAE fractogel is then applied, equilibrated with the same buffer as before containing NaCl at a final concentration of 0.11 M adjusted to pH 7 and 387 mOsm. Under these conditions, Tween and TNBP can be removed very effectively.

Eftersom den initielle opløsning allerede indeholdt en meget høj koncentrati-20 on af von Willebrands faktor, fæstnes sidstnævnte i langt højere grad til søjlen end under passagen gennem den første søjle. Søjlens bindingskapacitet er mindst 160 enheder Ag/ml (antigenenhed af Von Willebrands faktor) eller 100 RCO/ml (ristocetin co-faktorenheder) 25 Den fraktion, som indeholder von Willebrands faktor, elueres ved tilsætning af NaCI til en slutkoncentration på 0,15 M til pufferen.Since the initial solution already contained a very high concentration of von Willebrand's factor, the latter is attached to the column to a much higher degree than during the passage through the first column. The binding capacity of the column is at least 160 units Ag / ml (antigen unit of Von Willebrand factor) or 100 RCO / ml (ristocetin co-factor units). The fraction containing von Willebrand factor is eluted by adding NaCl to a final concentration of 0.15 M to the buffer.

Den eluerede von Willebrands faktor er tilstrækkelig koncentreret til, at yderligere ultrafiltrering er nødvendig; den fyldes på flasker og frysetørres.The eluted von Willebrand factor is sufficiently concentrated that additional ultrafiltration is needed; it is filled into bottles and freeze dried.

3030

Det opnåede koncentrat er meget rent og har en specifik aktivitet på over 100 enheder RCO/mg. Det indeholder stadig noget fibronectin, men det er ikke ødelæggende for dets aktivitet.The concentrate obtained is very pure and has a specific activity of over 100 units of RCO / mg. It still contains some fibronectin, but it is not destructive to its activity.

EKSEMPEL 5 13 DK 176139 B1EXAMPLE 5 13 DK 176139 B1

Fremstilling af et fibronectinkoncentrat 5Preparation of a fibronectin concentrate 5

Et fibronectinkoncentrat kan også fremstilles ud fra det samme initielle eluat som i eksempel 4.A fibronectin concentrate may also be prepared from the same initial eluate as in Example 4.

Von Willebrands faktor og fibronectin kan faktisk adskilles på basis af forskel 10 i molekylevægt. Ved gelfiltrering på en søjle af Sephacryl S-400 (R) (Pharmacia) separeres f.eks. den første fraktion med høj molekylevægt indeholdende Von Willebrands faktor fra en fraktion indeholdende fibronectin, der kan fyldes direkte på flasker og frysetørres.Indeed, Von Willebrand's factor and fibronectin can be separated on the basis of difference 10 in molecular weight. By gel filtration on a column of Sephacryl S-400 (R) (Pharmacia), e.g. the first high molecular weight fraction containing Von Willebrand factor from a fraction containing fibronectin which can be directly loaded into bottles and lyophilized.

iin

Claims

DK 176139 B1 Concentrate of von Willebrand's factor for therapeutic use obtainable by the method of DK 175 322 B1, characterized in that it has a specific activity of at least 100 units of RCO / mg.