DD279546A1 - Verfahren zur immunaffinitaetschromatographischen reinigung von human-alpha-interferonen - Google Patents
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Abstract
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur immunaffinitaetschromatographischen Reinigung von Human-alpha-Interferon zu entwickeln, das alpha-Interferon in hoher Reinheit und Konzentration liefert. Erfindungsgemaess werden gereinigte monoklonale Antikoerper gegen alpha-Interferon an geeignete Traegermaterialien gebunden und mit Glutaraldehyd vernetzt. Die so entstandenen Immunsorbentien werden mit vorgereinigten natuerlichen oder gentechnischen alpha-interferonhaltigen Loesungen beladen und das hochreine alpha-Interferon wird nach Waschungen und Vorelution bei einem p H-Wert von 2,5 eluiert.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur immunaffinitätschromatographischen Reinigung von natürlichen und gentechnisch erzeugten alpha-lnterferonen des Menschen, das in der biologisch-medizinischen Forschung, in der Biotechnologie und in der pharmazeutischen Industrie angewendet werden kann.
Das Prinzip der Immunaffinitätschromatographie beruht auf der selektiven Entfernung der za isolierenden Substanzen (Antigen) aus einem Rohpräparat durch spezifische Bindung an das für das Antigen spezifische Antikörper-Immunsorbens und nachfolgende Abspaltung des Antigens aus dem trägerfixierten Antigen-Antikörper-Komplex. Die Herstellung des Antikorper-Immunsorbens stellt hierbei einen der wesentlichen Schritte dar. Sie beruht auf der Fixierung funktionsaktiver, spezifischer Antikörper an feste Träger wie z. B. Agarose, Zellulose, Polyacrylamid oder poröse Gläser.
Als weltweit meist eingesetzte Matrix für Immunsorbentien hat sich Agarose durchgesetzt. Das übliche Verfahren für die Aktivierung der Agarose zur Kopplung von Proteinen wie z. ü. Antikörpern ist die CNBr-Aktivierung (R. Axen et al.. Nature 214, 1302 [1967]). Die Herstellung und Verwendung von Antikörper-Immunsorbentien auf der Basis von monoklonalen Antikörpern (nriAK) zur Isolierung und Hochreinigung von alpha-lnterferonen des Menschen wurden seit 1980 von mehreren Arbeitsgruppen in der Welt beschrieben.
Dabei wurden verschiedene mAK, z. B. mAK„NK2" (D.S.Secher &D.C.Burke, Nature 285,446-450119801), mAK „HBA" (A. G. Laurent et al.. Develop. Biol. Standard. 57,305-310 [1984]), mAK „Hy 7", „Hy 23" und „Hy 74" (D. Novick et al., J. Immunol. 129,2244-2247(1982]), an verschiedene Trägermaterialien, z.B. CNBr-aktivierte Sepharose (D. S. Secher & D.C. Burke, Nature 285,446-450 [1980], A.G. Laurent et al., Develop. Biol. Standard. 57, 3U5-310 [1984], K.Berg, J. Interf. Res. 4,481-491 [1984]), Agarose-Polyacryl-Hydrazid (D. Novick et al., J. Immunol. 129, 2 244-2247 [1982]) und Äffi-Gel 10 (T. Staehelin et al., J. Biol. Chem. 256, 9750-9754 [1981 ]), gekoppelt. Bei der Durchführung der Immunaffinitätschromo.ocjraphie an diesen Trägern wurden unterschiedliche Beladungs-, Wasch- und Elutionsbedingungen gewählt.
Der Nachteil dieser Verfahren besteht darin, daß die Reinheit der erhaltenen Interferonpräparate beim Einsatz von Immunsorbentien, die monoklonale Antikörper als Liganden tragen, durch die unspezifische Abspaltung dieser Antikörper bzw. von Antikörperfragmenten beeinträchtigt wird (T.Staehelin et al., J. Immunol. 129, 2244-2247 [1982]).
Die Erfindung hat das Ziel, ein ökonomisches Verfahren zur immunaffinitätschromatographisc.rien Reinigung von natürlichen und gentechnisch erzeugten alpha-lnterferonen des Menschen bereitzustellen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur imr.iunaff initätschromatographischen Reinigung zu entwickeln, das alpha-lnterferon in hoher Reinheit und Konzentration liefert.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß gereinigte monoklonale Antikörper gegen alpha-lnterferone an als Matrix geeignete Trägermaterialien gebunden werden. Als monoklonale Antikörper werden ZIM-IIB2 und ZIM-IIG11 eingesetzt. Um eine zusätzliche Fixierung der mAK an den entsprechenden Trägern auch unter Elutionsbedingungen zu erreichen, wird eine anschließende Vernetzung der gebundenen mAK mit Glutaraldehyd vorgenommen. Dabei wird die Ausgangskonzentration von Glutaraldehyd so gewählt, daß trotz der Vernetzung der mAK deren biologische Aktivität erhalten bleibt.
Es wird eine 0,1 bis 0,2%ige Glutaraldehydlösung verwendet. Die so präparierten Immunsorbentien werden dann mit vorgereinigten natürlichen oder gentechnischen alpha-lnterferon-haltigen Lösungen (spezifische Aktivität etwa 10s internationale Einheiten Interferon pro mg Protein der Lösung) beladen. Nach anschließenden Waschschritten und einer Vorelution bei pH3,0 wird hochreines Interferon (mehr als 1 χ 108 internationale Einheiten Interferon pro mg elutiertes Protein) bei einem pH-Wert von 2,5 eluiert. Die Eluatfraktionen enthalten weniger als 1 ng abgespaltene mAK pro ml (bei einer Interferonmerige von etwa 108 internationalen Einheiten = 0,2mg pro ml Eluat).
Durch die verwendeten mAK ZIM-IIB2 bzw. ZIM-IIG11 gelingt bei der imrnunaffinitätschromatographischen Reinigung eine selektive Aufreinigung einzelner humaner alpha-lnterferone. Damit hat c'as erfinderische Verfahren wesentliche Vorteile gegenüber den bisher bekannten Methoden zur Hochroinigung von alpha-lnterferonen des Menschen.
1. Möglichkeit zur selektiven Hochreinigung einzelner alpha-lnterferon-Subtypen (entsprechend der Subtypenspezifität der zur Präparation des Immunsorbens verwendeten nonoklonalen Antikörper ZIM-IIB2 bzw. ZIM-IIG11)
2. Hohe Reinheit der bei den erfindungsgemäßen Verfahren elidierten alpha-lnterferone (weniger als 1 ng mAK/ml Elutionsp'jffer gegenüber etwa 200ng mAK/ml Elutionspuffer bei den bisher bekannten Methoden)
Die Erfindung soll an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.
Ausführungsoeispiel
Verfahren zur immunaffinitätschromatographischen Reinigung von natürlichen alpha-lnterferonen des Menschen aus vorgereinigten Kulturüberständen von Sendai-Virus-infizierten Leukozyten
1. Die mAK ZIM-IIB2 und ZIM-IIG11 wurden in Mausascites vermehrt und an Protein-A-Sepharose gereinigt (P. L. Ey et al., Immunchem. 15,429-436 [1978])
2. Die gereinigten Antikörper wurden an CNBr-aktivierte Sepharose 4B nach bekannter Prozedur (Pharmacia Firmenschrift „Affinity Chromatography" 1979) gekoppelt (erreichte Ligandendichte 5-10 mg mAK/ml Träger)
3. Zusätzliche Vernetzung der gekoppelten Liganden durch Inkubation der Immunsorbentien in 0,1 Glutaraldehydlösung für 2 h. Anschließende Waschi ng mit 10 Säulenvolumen phosphatgepufferter Kochsalzlösung (0,02 M Phosphat, 0,15 M NaCI, pH 7,3 [PBS]). Blockierung von gebundenen reaktiven Gruppen des Glutaraldehyds durch 2h Inkubation mit 10 Säulenvolumen 1 M Äthanolaminlösung pH8,0. Anschüepende Waschungen der Immunsorbentien mit PBS und Elutionspuffer (s. Punkt 4)
4. Immunaffinitätschromatographie (vgl. Tabelle)
Die hergestellten Immunsorbentien werden mit PBS equilibriert und mit vorgereinigten natürlichen Interferonlösungen (Ausgang) bei einer Flußgeschwindigkeit von etwa80ml/cm2h und einem Gegendruck von max. 1atm bei 40C beladen (verwendetesTrägervolumen: 0,5ml je Immunsorbens).
Nach Waschungen mit je 10 Säulenvolumen PBS, 50%Äthylenglykol in PBS (1 M NaCI), 0,1 M Ammoniumazetatlösung pH 7,0 und Vorelutiün mit 0,1 M Ammoniumazetat/Ameisensäurelösung pH3,0 wird das gebundene alpha-lnterferon mit 0,1 M Ammoniumazetat/Ameisensäurelösung pH 2,5 eluiert.
Eine Wiederfindung von nahezu 100% der Interferonaktivität des Ausgangs wird in den Elutionsfraktiopon einer Tandem-Immuniiffinitätschromatographie (In-Reihe-Beladung des ZIM-IIB2-Immunsorbens und des ZIM-IIG Ί 1-lmmunsorbens) erreicht (vgl. Tabelle). Eine 770fache Reinigung des Ausgangsinterferons bis zur Homogenität (nach den Kriterien der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese mit anschließender Protein-Silberfärbung) ist meßbar. Dabei tritt zusätzlich eine mehr als lOOfache Aufkonzentrierung des Ausgangsinterferons in den Elutionsfraktionen ein.
5. Nach Gebrauch werden die Immunsorbentien mit f-BS 0,02% NaN3 equilibriert und können ohne merklichen Aktivitätsverlust der gebundenen mAK langer als ein halbes Jahr bei 4°C gelagert werden.
Tabelle 1: Tandem-Immunaffinitätschromatographie von Human-Leukozyten-IFN an 0,5ml B2-Sepharose und 0,5ml G11-Sepharose2
| Probe | 1 | Volumen (ml) | Protein | IFN-Konzen-1 | Spez.lFN-' | Relative' |
| 2 | konzentration | tration | Aktivität | IFN-Menge | ||
| 3 | (mg/ml) | (IE/ml) | (lE/mgProt.) | (%) | ||
| Ausgang | 4 | 770 | 0,15 | 2x105 | 1,3 x 10s | 100 |
| Durchlauf | 5 | 770 | 0,15 | 103 | 6,6x103 | 0,5 |
| 20 | 0,05 | .O3 | 2,0x104 | 0,00013 | ||
| 1 | ||||||
| 2 | ||||||
| 3 | 0,5 | 0,05 | 10' | 2,0 x 10" | 3,2 | |
| 4 | 0,5 | 0,1 | 5x10' | 5,0x108 | 16,2 = 89,1% | |
| Waschungen | 5 | 0,5 | 0,15 | 106 | 6,6x108 | 32,5 |
| pH-2,5-Elution: | 0,5 | 0,1 | 108 | ΙΟ9 | 32,5 | |
| B2-Säule | 0,5 | 0,05 | 2x10' | 10° | 6,4 | |
| Fraktion | ||||||
| 0,5 | 0,02 | 6x105 | 3,0x10' | 0,19 | ||
| 0,5 | 0,05 | 6x106 | 1,2 x 108 | 1,9 | ||
| 0,5 | 0,1 | 1,5x10' | 1,5 x 10" | 4,9 = 14,4% | ||
| 0,5 | 0,05 | 1,5x10' | 3,0 X 108 | 4,9 | ||
| G11-Säule | 0,5 | 0,05 | 2,5x106 | 5,0x10' | 0,8 | |
| Fraktion | 5 | 0,07 | 6,4x10' | 4,0 χ 108 | 103,5 | |
1 Biologische Testuiig auf MDBK-Zellen
2 Resultierende Säulenkapazitäten: B2-Sepharoso 1,4 χ 108 IU/ml Gel
G11-Sepharose2,0x 10'IU/ml Gel
Claims (5)
1. Verfahren zur immunaffinitätschromatographischen Reinigung von Human-alpha-lnterferonen mittels Immunsorbentien, dadurch gekennzeichnet, daß gereinigte monoklonal Antikörper gegen alpha-lnterferon an geeignete Trägermaterialien gebunden und ggf. mit Glutaraldehyd vernetzt werden, diese Immunsorbentien mit vorgereinigten natürlichen oder gentechnisch hergestellten interferonhaltigen Lösungen beladen werden und nach anschließenden Waschschniiten und Vorelution hochreines alpha-lnterferon eluiert wird.
2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als monoklonale Antikörper ZIM-IIB2 und ZtM-IIG 11 verwendet werden.
3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Vernetzung mit 0,1-0,2%iger Glutaraldehydlösung erfolgt.
4. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Elution des alpha-lnterferons bei einem pH-Wert zwischen 2,0-3,5 erfolgt.
5. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Vorelution bei einem pH-Wert zwischen 2,5 und 4,0 erfolgt.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD29135686A DD279546A1 (de) | 1986-06-17 | 1986-06-17 | Verfahren zur immunaffinitaetschromatographischen reinigung von human-alpha-interferonen |
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| DD279546A1 true DD279546A1 (de) | 1990-06-06 |
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|---|---|
| DD (1) | DD279546A1 (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7910707B2 (en) | 2001-02-22 | 2011-03-22 | Genentech, Inc. | Anti-interferon-α antibodies |
-
1986
- 1986-06-17 DD DD29135686A patent/DD279546A1/de not_active IP Right Cessation
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7910707B2 (en) | 2001-02-22 | 2011-03-22 | Genentech, Inc. | Anti-interferon-α antibodies |
| US8349331B2 (en) | 2001-02-22 | 2013-01-08 | Genentech, Inc. | Anti-interferon-α antibodies |
| US8557967B2 (en) | 2001-02-22 | 2013-10-15 | Genentech, Inc. | Anti-interferon-α antibodies |
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