DD279546A1 - METHOD FOR IMMUNAFFINITECT CHROMATOGRAPHIC CLEANING OF HUMAN ALPHA INTERFERONS - Google Patents

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DD279546A1 DD29135686A DD29135686A DD279546A1 DD 279546 A1 DD279546 A1 DD 279546A1 DD 29135686 A DD29135686 A DD 29135686A DD 29135686 A DD29135686 A DD 29135686A DD 279546 A1 DD279546 A1 DD 279546A1
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Matthias Gaestel
Evelyn Eichmann
Frank Schneider
Alexander Makower
Franz Noll
Karin Leder
Emil Tonew
Jutta Fuchs
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Akad Wissenschaften Ddr
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Abstract

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur immunaffinitaetschromatographischen Reinigung von Human-alpha-Interferon zu entwickeln, das alpha-Interferon in hoher Reinheit und Konzentration liefert. Erfindungsgemaess werden gereinigte monoklonale Antikoerper gegen alpha-Interferon an geeignete Traegermaterialien gebunden und mit Glutaraldehyd vernetzt. Die so entstandenen Immunsorbentien werden mit vorgereinigten natuerlichen oder gentechnischen alpha-interferonhaltigen Loesungen beladen und das hochreine alpha-Interferon wird nach Waschungen und Vorelution bei einem p H-Wert von 2,5 eluiert.The invention has for its object to develop a method for immunaffinitaetschromatographischen purification of human alpha-interferon, which provides alpha-interferon in high purity and concentration. According to the invention, purified monoclonal antibodies against alpha-interferon are bound to suitable carrier materials and crosslinked with glutaraldehyde. The resulting immunosorbents are loaded with pre-purified natural or genetic alpha-interferon-containing solutions and the high-purity alpha-interferon is eluted after washing and pre-elution at a p H value of 2.5.

Description

Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur immunaffinitätschromatographischen Reinigung von natürlichen und gentechnisch erzeugten alpha-lnterferonen des Menschen, das in der biologisch-medizinischen Forschung, in der Biotechnologie und in der pharmazeutischen Industrie angewendet werden kann.The invention relates to a process for immunoaffinity chromatographic purification of natural and genetically engineered alpha interferons of humans, which can be used in biological medical research, in biotechnology and in the pharmaceutical industry.

Charakteristik der bekannten technischen LösungenCharacteristic of the known technical solutions

Das Prinzip der Immunaffinitätschromatographie beruht auf der selektiven Entfernung der za isolierenden Substanzen (Antigen) aus einem Rohpräparat durch spezifische Bindung an das für das Antigen spezifische Antikörper-Immunsorbens und nachfolgende Abspaltung des Antigens aus dem trägerfixierten Antigen-Antikörper-Komplex. Die Herstellung des Antikorper-Immunsorbens stellt hierbei einen der wesentlichen Schritte dar. Sie beruht auf der Fixierung funktionsaktiver, spezifischer Antikörper an feste Träger wie z. B. Agarose, Zellulose, Polyacrylamid oder poröse Gläser.The principle of immunoaffinity chromatography is based on the selective removal of the za isolating substances (antigen) from a crude preparation by specific binding to the antigen-specific antibody immunosorbent and subsequent cleavage of the antigen from the carrier-fixed antigen-antibody complex. The production of the antibody immunosorbent is one of the essential steps. It is based on the fixation of functionally active, specific antibodies to solid supports such. As agarose, cellulose, polyacrylamide or porous glasses.

Als weltweit meist eingesetzte Matrix für Immunsorbentien hat sich Agarose durchgesetzt. Das übliche Verfahren für die Aktivierung der Agarose zur Kopplung von Proteinen wie z. ü. Antikörpern ist die CNBr-Aktivierung (R. Axen et al.. Nature 214, 1302 [1967]). Die Herstellung und Verwendung von Antikörper-Immunsorbentien auf der Basis von monoklonalen Antikörpern (nriAK) zur Isolierung und Hochreinigung von alpha-lnterferonen des Menschen wurden seit 1980 von mehreren Arbeitsgruppen in der Welt beschrieben.As the world's most widely used matrix for immunosorbents, agarose has become established. The usual procedure for the activation of agarose for the coupling of proteins such. above sea level. Antibodies is CNBr activation (R. Axen et al., Nature 214, 1302 [1967]). The production and use of monoclonal antibody (nriAK) antibody immunosorbents for the isolation and high purification of human alpha interferons has been described since 1980 by several work groups in the world.

Dabei wurden verschiedene mAK, z. B. mAK„NK2" (D.S.Secher &D.C.Burke, Nature 285,446-450119801), mAK „HBA" (A. G. Laurent et al.. Develop. Biol. Standard. 57,305-310 [1984]), mAK „Hy 7", „Hy 23" und „Hy 74" (D. Novick et al., J. Immunol. 129,2244-2247(1982]), an verschiedene Trägermaterialien, z.B. CNBr-aktivierte Sepharose (D. S. Secher & D.C. Burke, Nature 285,446-450 [1980], A.G. Laurent et al., Develop. Biol. Standard. 57, 3U5-310 [1984], K.Berg, J. Interf. Res. 4,481-491 [1984]), Agarose-Polyacryl-Hydrazid (D. Novick et al., J. Immunol. 129, 2 244-2247 [1982]) und Äffi-Gel 10 (T. Staehelin et al., J. Biol. Chem. 256, 9750-9754 [1981 ]), gekoppelt. Bei der Durchführung der Immunaffinitätschromo.ocjraphie an diesen Trägern wurden unterschiedliche Beladungs-, Wasch- und Elutionsbedingungen gewählt.Various mAK, z. MAK "NK2" (DS Secher & D.C. Burke, Nature 285, 446-450119801), mAK "HBA" (AG Laurent et al., Develop. Biol. Standard, 57, 305-310 [1984]), mAK "Hy 7 Novig et al., J. Immunol., 129, 2424-2247 (1982)), to various support materials, eg CNBr-activated Sepharose (DS Secher & DC Burke, Nature Laurent, et al., Develop. Biol. Standard, 57, 3U5-310 [1984], K.Berg, J. Interf. Res., 4, 481-491 [1984]), agarose-polyacrylic Novel et al., J. Immunol., 129: 244-2247 (1982)) and Äffi gel 10 (Staehelin, T., et al., J. Biol. Chem. 256, 9750-9754 [1981]. In carrying out immunoaffinity chromatography on these slides, different loading, washing and elution conditions were chosen.

Der Nachteil dieser Verfahren besteht darin, daß die Reinheit der erhaltenen Interferonpräparate beim Einsatz von Immunsorbentien, die monoklonale Antikörper als Liganden tragen, durch die unspezifische Abspaltung dieser Antikörper bzw. von Antikörperfragmenten beeinträchtigt wird (T.Staehelin et al., J. Immunol. 129, 2244-2247 [1982]).The disadvantage of these methods is that the purity of the interferon preparations obtained when using immunosorbents which carry monoclonal antibodies as ligands, by the non-specific cleavage of these antibodies or antibody fragments is impaired (T. Staehelin et al., J. Immunol , 2244-2247 [1982]).

Ziel der ErfindungObject of the invention

Die Erfindung hat das Ziel, ein ökonomisches Verfahren zur immunaffinitätschromatographisc.rien Reinigung von natürlichen und gentechnisch erzeugten alpha-lnterferonen des Menschen bereitzustellen.The object of the invention is to provide an economical process for immunoaffinity chromatographic purification of natural and genetically engineered human alpha-interferons.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur imr.iunaff initätschromatographischen Reinigung zu entwickeln, das alpha-lnterferon in hoher Reinheit und Konzentration liefert.The invention has for its object to develop a process for imriunaff initätschromatographischen cleaning that provides alpha-interferon in high purity and concentration.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß gereinigte monoklonale Antikörper gegen alpha-lnterferone an als Matrix geeignete Trägermaterialien gebunden werden. Als monoklonale Antikörper werden ZIM-IIB2 und ZIM-IIG11 eingesetzt. Um eine zusätzliche Fixierung der mAK an den entsprechenden Trägern auch unter Elutionsbedingungen zu erreichen, wird eine anschließende Vernetzung der gebundenen mAK mit Glutaraldehyd vorgenommen. Dabei wird die Ausgangskonzentration von Glutaraldehyd so gewählt, daß trotz der Vernetzung der mAK deren biologische Aktivität erhalten bleibt.According to the invention the object is achieved in that purified monoclonal antibodies to alpha interferons are bound to support materials suitable as a matrix. The monoclonal antibodies used are ZIM-IIB2 and ZIM-IIG11. In order to achieve an additional fixation of the MAb to the corresponding carriers even under elution conditions, a subsequent crosslinking of the bound MAb with glutaraldehyde is carried out. The initial concentration of glutaraldehyde is chosen so that despite the cross-linking of the mAb their biological activity is maintained.

Es wird eine 0,1 bis 0,2%ige Glutaraldehydlösung verwendet. Die so präparierten Immunsorbentien werden dann mit vorgereinigten natürlichen oder gentechnischen alpha-lnterferon-haltigen Lösungen (spezifische Aktivität etwa 10s internationale Einheiten Interferon pro mg Protein der Lösung) beladen. Nach anschließenden Waschschritten und einer Vorelution bei pH3,0 wird hochreines Interferon (mehr als 1 χ 108 internationale Einheiten Interferon pro mg elutiertes Protein) bei einem pH-Wert von 2,5 eluiert. Die Eluatfraktionen enthalten weniger als 1 ng abgespaltene mAK pro ml (bei einer Interferonmerige von etwa 108 internationalen Einheiten = 0,2mg pro ml Eluat).A 0.1 to 0.2% glutaraldehyde solution is used. The thus prepared immunosorbents are then loaded with pre-purified natural or genetically engineered alpha-interferon-containing solutions (specific activity about 10 s international units of interferon per mg protein of the solution). After subsequent washes and pre-elution at pH 3.0, high purity interferon (greater than 1 × 10 8 international units of interferon per mg eluted protein) is eluted at pH 2.5. The eluate fractions contain less than 1 ng of cleaved mAbs per ml (with an interferon number of approximately 10 8 international units = 0.2 mg per ml of eluate).

Durch die verwendeten mAK ZIM-IIB2 bzw. ZIM-IIG11 gelingt bei der imrnunaffinitätschromatographischen Reinigung eine selektive Aufreinigung einzelner humaner alpha-lnterferone. Damit hat c'as erfinderische Verfahren wesentliche Vorteile gegenüber den bisher bekannten Methoden zur Hochroinigung von alpha-lnterferonen des Menschen.The mIM ZIM-IIB2 or ZIM-IIG11 used in the uninfinity chromatographic purification allows a selective purification of individual human alpha interferons. Thus c'as inventive method has significant advantages over the previously known methods for Hochroinigung of alpha interferons of man.

1. Möglichkeit zur selektiven Hochreinigung einzelner alpha-lnterferon-Subtypen (entsprechend der Subtypenspezifität der zur Präparation des Immunsorbens verwendeten nonoklonalen Antikörper ZIM-IIB2 bzw. ZIM-IIG11)1. Possibility of selective high purification of individual alpha interferon subtypes (corresponding to the subtype specificity of the non-clonal antibodies ZIM-IIB2 or ZIM-IIG11 used for the preparation of the immunosorbent)

2. Hohe Reinheit der bei den erfindungsgemäßen Verfahren elidierten alpha-lnterferone (weniger als 1 ng mAK/ml Elutionsp'jffer gegenüber etwa 200ng mAK/ml Elutionspuffer bei den bisher bekannten Methoden)2. High purity of alpha-interferons elicited in the methods of the invention (less than 1 ng mAK / ml elution peak versus about 200 ng ml / ml elution buffer in the previously known methods)

Die Erfindung soll an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.The invention will be explained in more detail using an exemplary embodiment.

AusführungsoeispielAusführungsoeispiel

Verfahren zur immunaffinitätschromatographischen Reinigung von natürlichen alpha-lnterferonen des Menschen aus vorgereinigten Kulturüberständen von Sendai-Virus-infizierten LeukozytenA method for immunoaffinity chromatographic purification of human natural alpha interferons from pre-purified culture supernatants of Sendai virus-infected leukocytes

1. Die mAK ZIM-IIB2 und ZIM-IIG11 wurden in Mausascites vermehrt und an Protein-A-Sepharose gereinigt (P. L. Ey et al., Immunchem. 15,429-436 [1978])1. mAb ZIM-IIB2 and ZIM-IIG11 were propagated in mouse ascites and purified on protein A-Sepharose (P.L. Ey et al., Immunochem., 15, 429-436 [1978])

2. Die gereinigten Antikörper wurden an CNBr-aktivierte Sepharose 4B nach bekannter Prozedur (Pharmacia Firmenschrift „Affinity Chromatography" 1979) gekoppelt (erreichte Ligandendichte 5-10 mg mAK/ml Träger)2. The purified antibodies were coupled to CNBr-activated Sepharose 4B according to a known procedure (Pharmacia company publication "Affinity Chromatography" 1979) (ligand density reached 5-10 mg mAb / ml carrier)

3. Zusätzliche Vernetzung der gekoppelten Liganden durch Inkubation der Immunsorbentien in 0,1 Glutaraldehydlösung für 2 h. Anschließende Waschi ng mit 10 Säulenvolumen phosphatgepufferter Kochsalzlösung (0,02 M Phosphat, 0,15 M NaCI, pH 7,3 [PBS]). Blockierung von gebundenen reaktiven Gruppen des Glutaraldehyds durch 2h Inkubation mit 10 Säulenvolumen 1 M Äthanolaminlösung pH8,0. Anschüepende Waschungen der Immunsorbentien mit PBS und Elutionspuffer (s. Punkt 4)3. Additional crosslinking of the coupled ligands by incubation of the immunosorbents in 0.1% glutaraldehyde solution for 2 h. Subsequent wash with 10 column volumes of phosphate buffered saline (0.02 M phosphate, 0.15 M NaCl, pH 7.3 [PBS]). Blocking of bound reactive groups of glutaraldehyde by 2h incubation with 10 column volumes of 1 M ethanolamine solution pH8.0. P Anschüe end washes the Immunsorbentien with PBS and elution buffer (s. Point 4)

4. Immunaffinitätschromatographie (vgl. Tabelle)4. Immunoaffinity chromatography (see table)

Die hergestellten Immunsorbentien werden mit PBS equilibriert und mit vorgereinigten natürlichen Interferonlösungen (Ausgang) bei einer Flußgeschwindigkeit von etwa80ml/cm2h und einem Gegendruck von max. 1atm bei 40C beladen (verwendetesTrägervolumen: 0,5ml je Immunsorbens).The immunosorbents produced are equilibrated with PBS and pre-purified with natural interferon solutions (output) at a flow rate of about 80ml / cm 2 h and a back pressure of max. 1atm at 4 0 C loaded (verwendetesTrägervolumen: 0.5 ml per immunosorbent).

Nach Waschungen mit je 10 Säulenvolumen PBS, 50%Äthylenglykol in PBS (1 M NaCI), 0,1 M Ammoniumazetatlösung pH 7,0 und Vorelutiün mit 0,1 M Ammoniumazetat/Ameisensäurelösung pH3,0 wird das gebundene alpha-lnterferon mit 0,1 M Ammoniumazetat/Ameisensäurelösung pH 2,5 eluiert.After washing with 10 column volumes PBS, 50% ethylene glycol in PBS (1 M NaCl), 0.1 M ammonium acetate solution pH 7.0 and vorelutiün with 0.1 M ammonium acetate / formic acid solution pH3.0, the bound alpha-interferon with 0, 1 M ammonium acetate / formic acid solution pH 2.5 eluted.

Eine Wiederfindung von nahezu 100% der Interferonaktivität des Ausgangs wird in den Elutionsfraktiopon einer Tandem-Immuniiffinitätschromatographie (In-Reihe-Beladung des ZIM-IIB2-Immunsorbens und des ZIM-IIG Ί 1-lmmunsorbens) erreicht (vgl. Tabelle). Eine 770fache Reinigung des Ausgangsinterferons bis zur Homogenität (nach den Kriterien der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese mit anschließender Protein-Silberfärbung) ist meßbar. Dabei tritt zusätzlich eine mehr als lOOfache Aufkonzentrierung des Ausgangsinterferons in den Elutionsfraktionen ein.Recovery of nearly 100% of the interferon activity of the output is achieved in the elution fracto-ion by tandem immuno-affinity chromatography (in-line loading of the ZIM-IIB2 immunosorbent and the ZIM-IIG Ί 1 immunosorbent) (see Table). A 770-fold purification of the starting interferon to homogeneity (according to the criteria of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis with subsequent protein silver staining) is measurable. In addition, a more than 100-fold concentration of the starting interferon in the elution fractions occurs.

5. Nach Gebrauch werden die Immunsorbentien mit f-BS 0,02% NaN3 equilibriert und können ohne merklichen Aktivitätsverlust der gebundenen mAK langer als ein halbes Jahr bei 4°C gelagert werden.5. After use, immunosorbents are equilibrated with f-BS 0.02% NaN 3 and can be stored at 4 ° C for longer than half a year without significant loss of activity of the bound mAbs.

Tabelle 1: Tandem-Immunaffinitätschromatographie von Human-Leukozyten-IFN an 0,5ml B2-Sepharose und 0,5ml G11-Sepharose2 TABLE 1 Tandem immunoaffinity chromatography of human leukocyte IFN on 0.5 ml B2 Sepharose and 0.5 ml G11 Sepharose 2

Probesample 11 Volumen (ml)Volume (ml) Proteinprotein IFN-Konzen-1 IFN Concentration 1 Spez.lFN-'Spez.lFN- ' Relative'relative ' 22 konzentrationconcentration trationtration Aktivitätactivity IFN-MengeIFN-quantity 33 (mg/ml)(Mg / ml) (IE/ml)(IU / ml) (lE/mgProt.)(IU / mgProt.) (%)(%) Ausgangexit 44 770770 0,150.15 2x105 2x10 5 1,3 x 10s 1.3 x 10 s 100100 Durchlaufpass 55 770770 0,150.15 103 10 3 6,6x103 6,6x10 3 0,50.5 2020 0,050.05 .O3 3 2,0x104 2,0x10 4 0,000130.00013 11 22 33 0,50.5 0,050.05 10'10 ' 2,0 x 10"2.0 x 10 " 3,23.2 44 0,50.5 0,10.1 5x10'5x10 ' 5,0x108 5,0x10 8 16,2 = 89,1%16.2 = 89.1% Waschungenwashings 55 0,50.5 0,150.15 106 10 6 6,6x108 6,6x10 8 32,532.5 pH-2,5-Elution:pH 2.5 Elution: 0,50.5 0,10.1 108 10 8 ΙΟ9 ΙΟ 9 32,532.5 B2-SäuleB2 column 0,50.5 0,050.05 2x10'2x10 ' 10°10 ° 6,46.4 Fraktionfraction 0,50.5 0,020.02 6x105 6x10 5 3,0x10'3.0x10 ' 0,190.19 0,50.5 0,050.05 6x106 6x10 6 1,2 x 108 1.2 x 10 8 1,91.9 0,50.5 0,10.1 1,5x10'1.5x10 ' 1,5 x 10"1.5 x 10 " 4,9 = 14,4%4.9 = 14.4% 0,50.5 0,050.05 1,5x10'1.5x10 ' 3,0 X 108 3.0 X 10 8 4,94.9 G11-SäuleG11 column 0,50.5 0,050.05 2,5x106 2,5x10 6 5,0x10'5.0x10 ' 0,80.8 Fraktionfraction 55 0,070.07 6,4x10'6,4x10 ' 4,0 χ 108 4.0 χ 10 8 103,5103.5

1 Biologische Testuiig auf MDBK-Zellen1 Biological test for MDBK cells

2 Resultierende Säulenkapazitäten: B2-Sepharoso 1,4 χ 108 IU/ml Gel2 Resulting column capacities: B2-Sepharoso 1.4 χ 10 8 IU / ml gel

G11-Sepharose2,0x 10'IU/ml GelG11-Sepharose 2.0x 10'IU / ml gel

Claims (5)

1. Verfahren zur immunaffinitätschromatographischen Reinigung von Human-alpha-lnterferonen mittels Immunsorbentien, dadurch gekennzeichnet, daß gereinigte monoklonal Antikörper gegen alpha-lnterferon an geeignete Trägermaterialien gebunden und ggf. mit Glutaraldehyd vernetzt werden, diese Immunsorbentien mit vorgereinigten natürlichen oder gentechnisch hergestellten interferonhaltigen Lösungen beladen werden und nach anschließenden Waschschniiten und Vorelution hochreines alpha-lnterferon eluiert wird.1. A method for immunoaffinity chromatographic purification of human alpha interferons using immunosorbents, characterized in that purified monoclonal antibodies to alpha interferon bound to suitable support materials and optionally crosslinked with glutaraldehyde, these immunoadsorbents are loaded with pre-purified natural or genetically engineered interferon-containing solutions and after subsequent washing and pre-elution, high purity alpha interferon is eluted. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als monoklonale Antikörper ZIM-IIB2 und ZtM-IIG 11 verwendet werden.2. The method according to item 1, characterized in that are used as monoclonal antibody ZIM-IIB2 and ZtM-IIG 11. 3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Vernetzung mit 0,1-0,2%iger Glutaraldehydlösung erfolgt.3. The method according to item 1, characterized in that the crosslinking is carried out with 0.1-0.2% glutaraldehyde solution. 4. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Elution des alpha-lnterferons bei einem pH-Wert zwischen 2,0-3,5 erfolgt.4. The method according to item 1, characterized in that the elution of the alpha-interferon takes place at a pH between 2.0-3.5. 5. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Vorelution bei einem pH-Wert zwischen 2,5 und 4,0 erfolgt.5. The method according to item 1, characterized in that a pre-elution at a pH between 2.5 and 4.0.
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