JPS59146591A - 複合プラスミドの造成法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は複合プラスミド、特に組換えＤ　Ｎ’　Ａ、を
選択するためｅこ、容易に選別てきるマーカーをもつ複
合プラスミドの造成法ンこ関する。

−＜　フタ−に要求される条件の中で重要なものは、宿
主となる微生物が、そのベクターを保有していることを
容易ンこ選択することが出来ろ性質、つまリマーカーを
持′）ことである。このマーカーの性Ｙ′ｊとしては抗
生物質等の薬剤への耐性、重金属塩への耐性、糖類等の
資化能などが知られている。

大腸菌や枯草ｍ等の組換えＤＮＡ／ステムが確５゛／。

されている微生物ではマーカーをもつプラスミドやファ
ージなどが有効に活用されている。−力、大部分の微生
物では、組換えＤ　ＮＡ／ステムはほとんど未確立であ
るが、その大きな原因の１つをまこれらのマーカーのあ
るベクターがないことで、このことが大きな障害となっ
ている現状である。

所望の微生物で、マーカーのあるベクターが造成出来れ
ば微生物利用工業ンこはかり知れない大きな効果をもた
らすものである。

−−方多くの６＆　生物は、マーカーのないプラスきド
つまりクリブテイノクブラ７・ミ　ドを１呆有している
ことは多くの細光て証明されている。

クリブチインクプラスミドが特定の微生物の中で増殖で
きる、ということは、クリプティノクプラスミドリドラ
イブユニノト（複製領域）をもっことを意味する。従っ
てこのクリブチインクプラスミドにマーカーとなる性質
を導入することが出来れば、それぞれの宿主となる微生
物での組換えＤＮＡ技術に使えるベクターとなりうるは
ずである。このような方法として、宿主となる微生物以
外の異種の微生物が保有するマーカーをもつプラスミド
あるいは染色体のマーカーの性質を司る遺伝子領域を制
限酵素て切り出してクリプテインクプラスミ１′に導入
する方法が考えられる。

従来こ（′）ような試みとしては放線菌のクリプテイッ
クプラスミトンこ犬ｎ易菌のプラスミドのクロラムフェ
ニコール耐性遺伝子領域を組み換え法で導入した例（１
，Ｌ、　５ｃｈｏｔｔｃｌら＋　Ｊ、　ＢａＣＬｅｒ！
Ｏｆ、＋二土且、　　３６０（１９８＋））がある。ま
たトランスボッ゛ンを介して放線菌のクリブチインクプ
ラスミドンこ大腸菌のカナアイ７ノ耐性のマーカーラ尊
大した例もあるり、　Ａ、　Ｓｈｅ’ｒｍａｎ　’；）
　（Ｊ、　１３ａｃｔｅｒｉｏ１．＋、Ｌ二り刃、　１
１０（１９８２））。しかしく子息のマーツノ−を高い
頻度てとり出ず方法は１）＜知られてなかった。

本発明者ら４゛Ｌ簡１史て広範囲ｔこ応用できろクリプ
テイックプラスミドへのマーカーの導入θ、？こつぎ研
９°ヒした結果、マーカーをもつプラスミド又は染色体
のＤＮＡを６塩基を認識する制限酵素て切断して得たＤ
ＮＡ断片（Ａ）と各種の微生物から得られたクリブテイ
ノクブラ７、ミドな上記６塩基認識制限酵素の切１ぢｒ
末端と相補性のあるり１′０１末、、；ｉ、ｊを生じる
４塩基認識の制限酵素て切断した＠　Ｄ＋＜Ａ断片（Ｉ
３）を連結して造成した複合プラスミド混合物の中゛か
ら少なくともＩ）　Ｎ　Ａ断片い）のマーンＪ−の遺伝
子領域とＤ　Ｎ　Ａ断片（Ｂ）のドライブユニット領域
を含む複合プラスミドを所望の微生物？こ尋人してその
中で増殖し、かつマーカー遺伝子の性質がう′ｃ視する
ものを選択することンこより、１．１的のマーカーのつ
いたプラスミドが高い頻度で街られること夕発見１〜で
本発明を完成した。

本発明に使用されるクリプテイックプラスミドは、通常
の微生物の多くのものはクリプテイックプラスミドを保
持しているといわれる〔飯野徹雌ほか［−細胞質ｌス１
子とその）ｌｌＪＪ’１１−１１１．　　！　６　　共
立出版（１９１ｄｌ））如く、どの微生物からも採取利
用出来る。そのｉｉｉ列採取ａ、は６貨）°１．されて
いる常法ｉこ従って行なうことが出来る。クリブチイン
クプラスミドとしては数多くの報告があるが、たとえば
次のようなものがある。

ｐＡＭ　　３３０　　ブレビバクテリウム・ラクトフェ
ルメンタムｐ　＋（Ｍ　Ｉ　５１９　　コリネバクテリ
ウム・グルタミクムｐＴＡＩＯ１５バチルス・ズブチリ
ス 〃　１０２０　　）・チルス・ズブチリス／／＋０３０
　　バチルス・ズブチリス／／＋０５０　　バチルス・
ズブグーリスノｌ　１０６０　バチルス・ズブチリスｐ
ＬＳＩ５　　　／チルス・ズブチリスｐＬＳ　　２８　
　　バチルスΦズブチリスｐ１５Δ　　　　エンエリヒ
ア・フリ ｐｓＬ］７、Ｉ−レブトコノカス・ラベンデュレ２ミク
ロンＩ）ＮΔ　　ザノカロミセス・セレヒシエ一方マー
カーとなる性質は染色体ＤＮＡから、あるいはマーカー
をもつプラスミドが数多く知られているのでこれらを利
用することか出来る。特ンこプラスミドは、マーカーの
１生質が明らかンこされ、かつ制限酵素ンこよる切断部
位も示され、しかもその調製法も確立されているのでマ
ーカーの拐訓としては使用し易い。

これらのものとしては、たとえばエンエリヒア・コリの
ものとして、アンビンリン耐性を−・・−カーンこもつ
ものとしてＲ３Ｆ２＋２４、ｐ　Ｋ　’ｉ’　２２８９
など、テトラサイクリン耐性をも′つものとしてｐＭ＋
３９、ｐＫ１３］５８、ｐｓｃｌｏ＋、りＲＫ２４８な
ど、カナマイノン耐性をもつものとしてｐ　ＣＲ−１な
ど、アンビンリンとデトラサイクリン１ｆｉｉＪ性をも
つものとしてｐ　Ｂ　Ｒ３１３、ｌ）　、１３　Ｒ３２
２など、アンビンリン、テトラサイクリン、クロラノ、
フェニコールの３つの耐性をもつものとしてｐ　１３　
Ｒ３２５、ｐ　Ｂ　Ｒ３２８ナト、アンビンリンとカナ
７１７７面」（生をもつものとしてｐＡＣＹＣ＋　７７
なと゛が知られている〔これらの詳細は木４；ｌら蛋白
質・核酸・酵素　旦、　　４３５（１９８＋）：］。

また枯草菌系のものとしてはスタフィロコッカス由来の
ナトラサイクリン耐１ト１夕もＱ　ｌ）　Ｔ　ｌ　２７
、ｐ　ｉ”　ｌ）　５なと゛、　クロラムフェニコール
向」性をもつｐｃ＋９４．ｐｃ２２＋、ｐＵＢ１１２な
ど、カナマイン／耐性をもつｐＵＩ３．１１Ｏなど、ス
トレントマイノン耐性ヲモつｐｓＡ６５０１、エリスロ
マインノ耐性をもつＩ）　Ｅ　］　９４などがある　〔
魚住ら、蛋白Ｔ１・核酸・酵素　ユ、　　４６４（１９
８１））。

またサツカロ−ｌイセス酵母の系統のものとして、ナト
う→ノ゛イクリン耐性をもつｐＪＤＢ２’１９、アンヒ
ビ／リン向」（）１をもつｐＹｃｌ、”ｌ’　ｌ　ｐ　
］　、アアンビンリンテトラサイクリン耐性をもつＹＥ
ｐ１３、’ｌ’　Ｒｐ’　、７などがある　〔東江、蛋
白質・核酸・酵素二、　　４７６（１９８＋））。

その他り述のごとく、微生物の染色体上？こも広く存在
ずろマーカーも利用できることは言うまでもない。

次にこれらのマーカーをもつＤＮＡは」二ご己のような
プラスミドからあるいは染色体から常法？こ従つて調製
し、それぞれマーカーの領域を切断しないｂ」盆基認詭
の制限酵素を選んで処理すればマーカーをケ、える側の
材才゛（は容易ｌこＳｉ製することが出来る。そして、
」二記の６塩基認識制限酵素の切断末端と相補性のある
切断末端を生じる・１塩基認識の制限酵素てクリブチ・
ｒノクプラスミｉ”　ｌ）　Ｎ八を処理すれば、ｌ−ラ
イブユニットをもつＤ　Ｎ　Ａ　断）ｉの拐２１１をよ
り高い頻度て得ることか出来る。

本発明ンこ使用する６塩基認識と４塩基認識のそれぞれ
の制限酵素の組合せはたとえば、次のＪ：うなものであ
る（次表−１）。

表　　−１ −１−のようｌこ共通の塩基配列を認識して切断する制
限酵素を選ひ出して組み合わせて使用すればよいの−Ｃ
ある。

ここて特にこクリブチインクプラスミドのトライフユニ
ノ１−領域を切り出ず手段ｅこ４塩基認識酵素を用いる
ノリノドを説明する。

本発明の趣旨は、クリブチインクプラスミドのドライブ
ユニットの領域を有効かつ確実１ことり出し、てマーカ
ー？こ連結すること？こあるが、一般的ンこＱよりリフ
゛ティックプラスミドのこのトライフ゛コーニノ１−は
と゛こンこ（ｉン１買するかは不唄」であるから、この
領ｊ或をとり出１冒こけ、プラスミドＤＮＡを汗註Ｅこ
リリ出した後てスクリーニングする方法しかない。

従って出来る限り多くの可能性を調べられることＱよメ
リットの大きいことて、４塩）、（認識制限１イ素の」
り川は有利である。つまり確率的にはｌ）　Ｎ　Ａ七Ｖ
こは４′つまり２５６　ｂｐ当９１ケ所のこの配列かあ
るはずて、特ビこ部分分解の処理をすれば多様な断片が
得られるはずである。

一方６塩基認識酵素を使用すれば、４１″　即ち４０９
６ｂｐｒこ約１ケ所切断個所か存在−する。

マーカー領域の遺伝子をもつＤ　Ｎ　Ａ断片とクリブチ
インクプラスミド領域の遺伝子なもつＤ　Ｎ　Ａ断片の
連結法は特１こ限定することはなく、通常の組換えＤＮ
Ａの技術で行なわれる、つまり両者を混合しアニーリン
グさぜたのち、リガーゼて反応して行なえばよい。この
複合ブラスミ１゛を選択する方法も特ンこ限定するとこ
ろはない。つまり上のようｅこして得た腹合プラスミド
を含む反応液を、所望の微生物へ形１１転換（トう／ス
ホーメー／ヨ／）すればよい。その方法としては一所望
の微生物をリッチ−ｊ、処理してプＩ：＋１−ブラスト
とし、このノ１コ］−ソラストへ形１′−↓転換し、し
がる後ンこプロトＣ１り７９）〕あるいは枯草菌で用い
られているような所望の微生物をコンピテント細胞とし
て形質１９２’　”　　　　　（５ｅｐｅ− 転換する方法（Ｃ，Ｈ，Ｄｕｎｃａｇｔａｌ、＋　出嬉
］　＋１５３（１９７７）、　　１．Ｍａｈｌｅｒ　　
ａｎｄ　　ｌ（，０゜１−１ｃＩｌｖｏｒｓｏｎ、＋　
　　Ｊ、　　　Ｂａｃｔ、　　　］−三３１．　　３７
４（１９７７）。

Ｓ、　Ｄ、　Ｅｈｒｌｉｃｈ、＋　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ＋エユ、　　１（
ｉ８０（＋９７７））あるいは大腸菌て用いられるよう
な、カルンウムイオン溶液中で形質１１１入換する方ａ
１〔Ｍ、　Ｍａｒｄｅｌ　ａｎｄΔ　Ｈｉｇａ、　Ｊ、
　Ｍｏｌ。

＋３＋ｏｌ＋　上１’　　１５９（＋９７０）〕などが
ある。

それぞれ培養し２てコロニーを形成させ、しかる後マー
カーの性質を発現していることを証明する抗生物？２１
等の蘂剤等を添加した培地上で生育可能なフ「」ニ一つ
まり形質転換株として選択することか出来る。これらの
形質転換株ては分子力１．がマーカーの遺伝子領域をと
りこんだ部分大きくなった複合ブラスミｌ’　、’：し
て検出される。

つまりクリプテイックプラスミドの複製機能、ドライブ
ユニットて増殖し、且つマーカーの機能を発現１〜でい
ることを示している。

マーカーの１牛質をり−える拐才斗としてソ°ラスミ］
・を用いる場合ンこは、出来た複合プラスミドＱよマー
カー領域と共Ｖこ、６塩基酵素でドライブユニットを切
断しないものを選べば、もとの宿主−〔のドライブユニ
ット領域も含んでいるはすである。従って複合ブラスミ
ドシま２つのドライブユニットを持つことを１強味する
、つまり本発明は／ヤトルベクターの造成法１こもなり
うる。

以上のように本発明は広い範囲の微生物のベク・グーの
造成法ンこ適用てきるものてあり、従来ベクターの開発
されていない、たとえば、抗生物質の生Ｊ２ｒ能を有す
るス、トレブトミセス属の放線菌、アミノ酸生産能を有
するコリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ア
ルスルバククー属、ミクロハクゾリウム属の細菌、アミ
ラーゼ、プロテアーゼや核酸関連物質生産能を有するバ
チルス属の細菌、乳酸の生産能を有す、るラクトバチル
ス属の細菌侶゛？こ応い応用が考えられる。

以１匂こ実旋例を示ず。

）’ｓｌ厄１り１］１ 制限酵素ＣＩ；ｉｌはＤＮＡ」二ノ核酸配列Ａｉ−ＣＧ
　Ａ　Ｔを認識し、’ｐｃ間て４う″異的ンこ切断する
６塩基認識制限酵素てあり、Ｔａｑ　ｌは１’　ＣＧ　
Ａを認識し、ＴＣ間てりｌＩ′Ｊ「する・１塩基認識制
限酵素である。従って各々の酵素で処理したｌ）　Ｎ　
Ａは相補的な化Ａ１末端を持ち、これらをリガーゼを用
いて連結することか出来る。本発明者らは大腸菌由来の
プラスミド、ｐ　Ｂ　Ｒ３２５を１ケ所切断する制限酵
素Ｃ１ａ　ｌて完全分解し、一方、ブレビバクテリウム
・ラクトフェルメンクツ＼ΔＴＣＣ１３８６９山来のク
リブチインクプラスミドｐΔＭ　３３０を１’ａｑ　ｌ
で部分分解後、両者馨連結した腹合プラスミドを造成し
、本プラスミドかプレヒ／ミクテリ１ンムーラクトフエ
ルメノタム中で増殖し、かつｐＢＲ３２５山来のクロラ
ムフェニコール耐性の性質が発現することをＵ、］にン
こ証明した。

（１）　　利才Ｉプラスミドの調製 （１）　　プラスミドｐＢＲ３２５はエンエリヒア・コ
リ内てアンピノリ／、クロラムフェニコール、ナトラザ
イクリノ１１１ｊｊ性を発現する分子ｈ′・３６メガダ
ルトンのベクターフラスミ１−てあろ（ＢＯＩ！Ｖｅｒ
＋　Ｆ、　Ｇｅｎｅ＋　　３　＋　　　］　２　］（１
９７８）：Ｉ、、。

実験ｉこ使用したプラスミドｌ）　’、ａ　Ｒ３２５は
ヘセスダ・リサーチ・ラホラトリー（＋３　ＲＬ　）か
ら１崩入した。

（ｉｉ）　　プラスミドｐＡへ４３３０はブレビ／・ク
テリウム・ラクトフェルメンタムΔＴにＣｌ　３８６９
から新たンこ我々が分ｉｌｌした分子量３０メカダルト
ンのプラスミドであり、第１図にこその制限酵素切断地
図を示した。プラスミドｐＡＭ３３０１）　Ｎ　Ａは次
の様１こして調製した。

蒸留水１ｔあたりベブ）／ｌｏｆ、粉末酢ｆＪエギスｌ
Ｏ！／、塩化すｌ・リウノ、５ｆ、グルコ−７，５２を
含むＣＮＩＧ鳥地（ｐＨ７，２）　ｌｔ中ンこ＋！Ｍｊ
　度３０　ｉＣてブレビバクテリウム・ラクトフェルメ
ンタムＡＴＣＣ＋　３８６９　ヲ’ＡＪ数増殖期後期ま
て培養し、菌体を集めた。得られたｉ、＋′、＋体を、
リノチームとＳ　ｌ）　Ｓ　Ｐこより溶菌させる簡便法
ンこより溶菌せしめた後、３０．０００×ｙて３０分間
遠心分１浦し６４ｍｆｆの−に澄液なｆ４ｊだ。−［−
澄液中のフラスミ１゛ＤＮＡは、−Ｌ澄液ンこホリエナ
レングリコール（最終７ａ度１０・冶）を添加し沈降し
沈降させた後、ｌ０ｍ１！のＴ　［５Ｎ緩行ｉＪｉ＆ン
こ溶解した。

１）　Ｎ　Ａをリボヌクレアーゼで処理した後′（リボ
ヌクレアーゼＩ　　５０　ｐ　？　／ｍｌて３７Ｃ１３
０゛分間反応）、フェノール抽出し、ついで２　（ｕ　
１１ｉ−、）工９　／　−ルを加え−２０’ＣてＤ　Ｎ
　Ａを沈、；りさせ、沈澱を１．　ｍｅのＴＥＮ緩衝緩
衝液溶解シタ。このｌ）　Ｎ　Ａ溶液なアカローフ・ゲ
ル電気泳動ンこかけ、ケルから約７１１１１７の純粋な
プラスミドＩ）　ＮＡを分＋１！シた。

（２）　　複合プラスミド液の調製 （ｉ）　　ｐＢ’Ｒ３２５の１）べ１Δ（，３７，ｉｙ
）は制限酵素Ｃ１ａ　ｌ　（＋３ＲＬ社製）６ユニント
を使用して３７　Ｃンこ　て　１　２０　分　て　完全
ンこＬＪＪｌｌノ丁　し　た　。

（ｌｉ）　　ｐ　Ａ　Ｍ３３０のＩ）ＮＡ　（１６／１
９　）は１ｂｌｌぽ巳Ｙ素Ｔａｑ　Ｉ　、（Ｂ　ＲＬ社
製）１，５ユ＝ノドを使用して６４ＭＣｌ３分反び３０
分て部分的ンこＩ）Ｊ　ｌｔｌ’＋した。

（ｉｉｉ）　　（ｉ　）と（１１）で得たｌ）　Ｎ　Ａ
ン混合し制限酵素を不活化するため６５Ｃて１０分間熱
処理した後、Δｉ’　Ｉ）とンチオスレイト−ル存在下
２２ｃｍＣ９ヒや ２　＋＋、）間０．０１ユニノＩの１’　４　　Ｄ　：
４　Ａリカーゼを作用さぜた。’１”ｋＡ　９カーゼを
６５ｃ１１０分間の処理で不活化し、２倍１１１のエフ
ノールを加えた後、１５．０００ｇ　１５分間の遠心分
間１によりＤＮＡを回収した。

このようにして得た腹合プラスミド調製液ヲ次項で述ヘ
ルトランスフオーメーンヨ／（４）ンこ使用し７た。

（Ｊ）トランスホーメーノヨン形’Ｍ　転換ａのＡ　Ｊ
Ｒ及び複合プラスミド同定 プレヒハクテリウム・ラクトフェルメンタムＡＴＣＣｌ
　３８６　！Ｊ　を親株とする三重栄養要求（リシン、
メナオニ乙スレオニン）　突然Ｖ　ｈ’ｔ　ｎ　７’レ
ヒハクブ−リ１ンム・ラクトフェルメンタム６４なｌ）
　ＮΔ受容菌として実験ｒこ用し・た。

（ｉ）　　ブレビ／・クテリウム・ラフ１フエルメンク
ツ、＋６．６　１１（　ＡＴＣＣ３　９　１　３　４　
）を５　ｍｅ　（７）Ｃ：ＭＧｊ’−地てえｊ数増殖期
の初期まて培養し、−＼二／す／Ｇ？最終濃度０６ユニ
ノ）・／　ｍｅ　’ｔこなる１う添加後、さらンこｌ　
、　５　ｌｌ：」間１１ｉ。盪培養し、遠心分ｊ４１ｆ
　ｇこより菌体を集め、菌体を０５Ｍ／ニークロース、
２０ｍＭ７レイン酸、２０ｈＭ＋盆化マダイ・ノウム、
３．５％ベナノセイフ′ロス（　１）ｉｆｃｏ　）から
なるＳ　Ｍ　Ｍ　Ｐ　培地（ｐＨ、６．５　）　（１，
５ｒｉ／て洗浄した。次でＩ　Ｏｍ９　／　ｍｅのす７
チームを含むＳ　Ｍ　Ｍ　Ｐ　ｉ宮地？こ懸濁し　３０
Ｃて２０時間プロトプラス１−化を図った。

６０００　ｒ　　Ｉ　Ｏ分間遠心分部（後、プロトプラ
ストなＳ　Ｍ　ｌｖｌ　Ｐで洗浄し０．５　ｎｑｅ　（
Ｊ）　Ｓ　ＩＶＩＭ　Ｐ　ｒこ再度＊ｌｌ、鉤　し　ｌ
Ｓ。

（１１）得られたブＩ−１ドブラス）・を、（，３）で
ｘｒｈ製した複合プラスミド調製液と浪合し、ポリエチ
レングリフールを最終濃度が３０％になるように協力１
）シた後、ＤＮＡをプロ［・プラス１に取１）込ませる
ためｌこ’４Ｘ　ｎ６旨こ２分間放置した。ｉｎ胞なＳ
　Ｍ　Ｍ　Ｉ）　培地１　ｍｌで洗浄後、ｌ）　Ｎ　、
１〜’ｅ　Ｉｌ’ｌり込んだプロトプラスＩ・をＳ　Ｍ
　Ｍ　Ｐ培地１　ｍｅ　「１−＋Ｖこ再懸濁し、薬剤耐
性を発現さぜるため２こ、３０Ｃて３時間培養した。こ
の培イシ液な１）１１７．０のプロトプラスト プロトプラスト再生培地シま／：へ留水１ｔあたりトリ
ス（ヒト■コシーンメチル）アミ７メクン１２７、ＫＣ
Ｉ　　Ｏ．５ｆ／、グルコ７−　１　０　’　１Ｎうｇ
ｃｌ．ｌ・６０２０　　８．１　？、ＣａＣ　１２・２
　Ｈ２Ｏ　２．２２、ヘプトン４７、粉末酵母エギス４
２、カザミノ酸（　Ｄｉｆｃｏ社）Ｉｒ、Ｋ，、ＩＰｏ
，　　０．２　ｆ、コハク酸すトリウム１３５１ｉ’、
寒天８２及びクロラムフェニコール５μｙ　／ｍｅ　ヲ
含す。

１ｊｆ生培地上で３０Ｃ１０日間培養し、プラスミド１
ン／＼Ｍ　３　３　０を制限酵素１’ａｑ　ｌで１５分
間処理した区分から１０個、３０分処理した区分から５
個のコロニーか得ら．ｈた。ｐＡＭ３３０、ｐ１３Ｒ３
２５いずれか又は両方のＤ　Ｎ　Ａを除いた区分ではコ
ロニーは得られなかった。

にでｔｌｌられたコロニーの内、ＡＪ］＋９７４の１株
を代表として選び、これらがいずれもり１コラムフエニ
フール耐性である、つマリマーカーの１ノ１質を発現し
ていることを次の表＝２で確認ｌ−だ。

表　　−　　２ 表−２の結果は上記菌株をに　％Ｉ　Ｇ寒天培地で３　
Ｏ　ｒ２　４時間培養して得た菌体な細胞数が約１　０
５７ｍｌとなるように４　ｍｅの各濃度のり１コラムフ
エニフールを含むＧ　Ｍ　Ｇ　ｉ＆　体培地ンこ植えつ
け３０Ｃ，２４時間培養し、そのＩ’：　Ｗをクロラム
フェニコールを含まないｉ．ｌ」の値ヲ１００とした相
対値で示したものである。

次ンこ謬閣■園■＝１、ＡＪ　＋　１９７４の中に保有
されているプラスミドが、ブレビバクテリウム・ラクト
フエルメンクＪの中て増殖シ、つ１，リブラスミドｐＡ
Ｍ３３０のドライブユニット ｐ　Ｉ３　Ｒ　３　２　５、ｐＡＭｊ３０　以」二の複
合プラスミドであることを示すためンこ常法に従い、Δ
Ｊ１１９７４株からプラスミＦ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｐＡＪ
＋００４　）を抽出し、Ｓｈａｒｐら（　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓＬｒｙ＋＋２．　　３０５５（１９７３））の方
法による電気泳動を行った。

標準標品との比較から求めたｐΔＪ　１００４の分’Ｆ
　量’ｌよ６４６メガダルＩ・ンてあった。ｐΔＪ１　
０　０　／ｌの制限酵素地図を第２図１こ示す。

尚、プラスミドｐＡＪ１００４を保有するブレビバクテ
リウム身うクトフエルメンクムＡｌｌｌ’１７４はＦ　
Ｅ　ＩマＭＰ６’７４２として寄託されている。

実施例２ 制限酵素１３ａ　ｍ　Ｈ　ｌは塩基配列ＧＧΔＴＣＣ　
を認識し、ＧＡの間を切ｕノｉする６塩基認識の制限酵
素でＭｌ）Ｏ　ＩはＧΔ′１゛Ｃを認識１２、ＧＡの間
を′，５断する４塩ノ．（認識の制限酵素である。従っ
て各々の酵素で処理したＩ）ＮΔは相補的な伺着末端を
もつことがわかる。

、大腸菌由来のプラスミドｐＢ、Ｒ：　’３”、”１２
”’、’：５を、木プラスミドの１ケ所切断酵素Ｂ’ａ
　１ｎｊ（１で充分に分解し、プレヒバクテリウｌトラ
クトフェルノンク、人由来のブラフ・ミ・、ドｐＡＭ３
３．０をＭｂｏｌで部分的分解し、両者を連結して造成
した複合プラスミドがブレビバクテリウム・ラクトフェ
ルメンタムの中で増殖し、ｐＢＲｊ２５山来のクロラム
フェニコール１Ａｉｔ　Ｉ生遺伝子の性質が発現するこ
とを次ンこ証明した。

１）旧料プラスミドの調製 １）プラスミドｐＢＲ，３２，５は実施例１とｌ１ｉｉ
ｌじものをイ吏用した。

１１）プラスミドｐΔＭ　３３．０は実施例１と同様ｔ
こＸＩ！ｌ製した。

２）複合プラスミドの調製 １）プラスミド の制限酵素１３ａｍＩ−＋　　ｌ　（　ＢＲＬから購入
）を３７Ｃで６００分間反応せ、ＤＮＡを充分分角イし
た。

１１）プラスミドｐ　ＡＭ　３　３　（１　　２．、／
１．ｆ　’ｂ−　’０．３’　、＝　＝．７１・・の制
限酵素Ｍｂｏ．’．．Ｉを３７Ｃで１５分間反応させ、
ｌ）ｊｊＡを部分分解した。

ｉｉｉ）　　ｉ）と１１）で得た標品を実施例１と同様
に処理し最終的？こクロラムフェニコール耐性のトラン
スホーマントを得た。

３０Ｃで１０し１間町生培養し．て冑られた５個のコロ
ニーから１株Ａ　Ｊ　Ｉ　、１　９　７．、５を選び出
した。またｐΔＭ　３　３　０、ｐ　１３　Ｒ　３　２
　５のいずれか一方又は両方のＩ）　ＮΔを加えない区
分では形質転換株は得られなかった。

上記株はクロラムフェニコール耐性を示すことな、りｌ
コラムフエニフール含有Ｃ　Ｍ　Ｇ　培地ヲ用いて実施
例１と同様１こして確認した。

このｊ：うにへＪ’１１９７５株？こ保有されているプ
ラスニドｌ〕ΔＪ　１００７はｐＡｌｖ１３３０とｐ　
Ｂ　Ｒ　３　２　５からなる複合プラスミドでｐＡＭ３
３０に由来するドライブユニットをもち、かつｐＢＲ３
２５に由来するクロラムフェニコール耐性を発現してい
ることが示された。ｐＡＪＩＱＯ７の分子量は６．６メ
ガダル］・ンであった。

尚、ｐΔＪ１７を保有する菌株ΔＪｌ’ｌ”９７５＆ま
１ｉ　１Ｅ　Ｉい４−１）６７４３として寄託されてい
る。

実施例３ 本実施例ではＴ３　Ｓ系由来プラスミドのｐｌＪ１３１
１．０を６塩基認識制限酵Ｍｉ（３ａｒＷ４’　ｌ’　
）で完全消化しｌ）ΔＭ’３３０を４塩基認識制限酵素
（　Ｍｌ）Ｏ　ｌ　）で部分消化した両標品を混合後リ
ガーゼで連結させて造成ｌまた複合ブラフ、ミドｐＡＪ
’１００９がフ゛レビノくクテリウム・ラクトフェルメ
ンタムＡＴＣＣ　１　３　８　６　９内で腹製しｐΔＪ
　］　Ｏ’Ｃ１９　Ｊ二のｐＵＢＩＩＯ　ｖこ由来する
カナマイ７ノ耐性遺伝子マーカーが発現することな示す
。

（１）Ａ号オーｌプラスミドの調製 ｉ）　　プラスミドｐ［ＪＩ３］１０はスクフイ．ロコ
ノツノス・オーレウス由来の分子１ｒ，、　”３　、　
Ｑメガダｌしトンのプラスミドでバチルススフ 増殖しカナーＪインン耐性を示す（　Ｋｅｇｇｉｎｓ＋
に．Ｍ．ＬｏｕｅｔＬ＋Ｐ．、’Ｓ．ａｎｄＤｕｖａ’
ｌ’ｌ＋Ｅ．Ｊ．＋Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ
’．　Ｓｃｉ．＋　　１　ｉｉ　、　　１４　２　３（
１９７８）〕。

ｉｉ）’　　ｐ　Ａ　Ｍ　３３ｏの調製法株実施例１に
示しである。

（２）　　複合プラスミドか調製 ｊ）　　ｐｔＪ１３１１０のＤＮＡ（１．０μ７）は制
限酵素Ｂａｍ’ｔｌ　　Ｉ　　２ユニントを使用して３
７０６０分間反応費ぜ完全／’．ｉ化した。

ｉｔ）　　ｐＡＭ３３０ノＤＮＡ　（　２．４　ｉｔｆ
　）は制限酵素Ｍｂｏｌ　　’０．４ユニットを使用し
て３７ｔＴ１５分間反応させ部分消化した。

ｉｉｉ）　　酵素的切断した両ＤＮＡ標品を混合し実施
例口こ従い、連結させた。このようンこして得た腹合フ
ラスミド液を次項で述べる］・ランスホーメーンヨンｅ
こ使用した。

（３１　　トランスホーマントの選択及び複合プラスミ
ドの同定 前述のブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム八’
］”ＣＣＩ３８６９　を受容菌として、実施例口こ従い
、プロトプラスト化し上記複合プラスミドを用いて形質
転換を行った。３０１Ｚ’で１０１］間再生培養後出現
したコロニ□二２株□が得られ、こｈ　らをｌ　Ｏ，０
μ９／ｒｉｔｅのカナマイノンを含むＣ１１４Ｇ培地て
培養し、本薬剤耐性株であることを確認した。更に形質
転換株を溶菌し、ブラスミＦ存在の確認のため、その標
品のγカ゛ロー；・電気泳動を行った。ｐＡＪ１００９
は菌株Ａ」１’１９７６より採取されたことより、　本
プラスミドがブレビバクテリウム・ラフＩ・フエルノノ
クムΔＴＣＣ１３８６，９内で複製していたことが判る
。プラスミドの分子蛍は６．０メカダル］・ンてあった
。

尚、’Ｉ）　Ａ　Ｊ　Ｉ　００９　を保有するブレビバ
クゾリウム・ラクトフェルノンタムＡＪＩ１９７６＆：
！Ｆ　Ｅ　ＲＭ　−Ｐ　６７４　ｌＩ　　として寄託し
である。

実施例４ 本実施例てはＥ　Ｋ系由来プラスミドｐ　Ｂ　Ｒ３”２
５全６塩基認識制限酵素（Ｉ３ａｍＨＩ　）で完全ｉ’
ｌ’ｉ化し、コリネバクテリウム・グルクミクムΔＴＣ
Ｃ１３０５８山来のクリブデインクプラスミドｐＨλ４
１’５１’９ヲ４塩基認識制限酵素（Ｍｂｏ　Ｉ　）で
部分消化した両標品を混合連結させて造成した複合プラ
スミドｐ　Ｓ”Ｒ８’　２０　’５がコリ不バ□クテリ
ウム・グルタミクム中て増殖し本プラスミド上のＩ）Ｂ
Ｒ３２５由来の抗生物質削性マーカ・−か発現すること
を示す。

（１）　　利料プラスミドの調□製 １）プラスミドｐ■３Ｒ３２５は実施例Ｉと同じものを
使用した。

ｉｉ）ｐＨＭＩ５’１９はコリネバクテリウムーグルク
ミクムＡＴＣＣＩ　３０５８　　から新しく分離された
分子１’、５．’　”　Ｉ　＋　８メガダル）・ンのプ
ラスミドてその制限１！１１素切断地図は第３図Ｐこ示
しである。

コリイ・バクテリウム・グルタミクムＡ　Ｔ　Ｃ’　Ｃ
ｌ３０５８から実施例１と同様の方法トこより約１２！
１１ｔ９のｌ）　ＨＭ　１５　’Ｉ”’９１）　Ｎ　Ａ
を１ｉ１１夷１１シた。

（２）　　複合プラスミドの訳ｊ製 ：）ｐ１３Ｒ３２５ＤＮＡ　（１μ２）は６塩基認誠制
限酵素１３ａｍｌ−］　　１　２　ユ＝　７１・を使用
して、３７ＣＪ２０分完全消化した。

ｉｔ）　　ｐＨ旧５１゛９　ＤＮＡ（２μ２）は４塩基
認識制限１１イ素Ｍｌ＋ｏ　’Ｉ　　Ｏ，３ユニーノｌ
を使用して′づ７　（、、ｌ　５　’ｒｊ部分分１’ｉ
・（′シた。

ｉｈｉ）　　ｉ）　ｉｉ）てｆ、ＩＪＩた反応液を実施
イタ・１ｊ１と同様に連Ｘ１（１後、形デ″ｊ１１１Ｌ
ζ換反応を？〕い、　、、３０　Ｃ，７，１Ｉｌｌｊ）
ｊｔ１′１づｌ′εし、タロラムフェニコール耐性の形
質ｒｌ’ｔ（換株ｌＯ株を得、この内、１、す、Ｓｌセ
８２０５を選択した。尚、１）Ａ；剋３３０．ｐ、１．
ｊＲ３２５のいずれか一方又を才両方のＪ）ＮＡを加刈
ｌ記い区分てＳ、）、形質転換株は円ら、１′Ｌなかっ
た。

ｐｓＲ８２ｔ）５ｉ信、　コリイノ・クテリウム・タル
クミクムΔＴＣＣＩ３０６８細胞内てＪ＋；＜’（り；
ｌ′１、する−とか又ぎ、その分−ｊ、’、ｆｉ’、　
’（ｆ　５　、　ａノカクル：ンてあつｔこ。

以＋２からプラスミド１）８１≧１３２０５．１・、）
トロＸＱ　ｌ　５１　！ｉから成る組合ヅラスミｌ−て
、ｐＢＲ３２５由来のりＪｊうｌ、フェニコール耐性を
示’Ｉ−，ｐ　ｔ（〜目５１９　由来の１ライフユニン
トを採つことが示された。

７ラスミ）’４）Ｓ　Ｒ８２Ｑ°５を保イ１ずろコリネ
バクテリウム・クルクミカム５Ｒ８２０５は八゛１”Ｃ
Ｃ３９２５７どして寄託されている。

実施例５ 本実施例て１ｊＢ　Ｓ系プラスミドｐＵＢｌｌＯの１）
　ＮＡを６塩ノ、（認識制限酵素（１う＋ｎｎ１ｌ　　
ｌ　）て完全９ｊ１オノｊ　　ｌ＝　　、　　　２　１
）　　不　・・　り　テ　リ　　・ン　ノ、　・　　り
　ル　り　　ミ　　り　！・ＡＴＣＣ，ｌ　３０５’８
山来のシラス：　ｌ’ｐＨＭＩ５１９のＩ〕ＮΔを・）
塩ノｌ！ｉ　ｉｉＫ識制限酵素（、へ什０［）て部分４
”１化１−２た両（シ、“品を、イ昆合連紀１させて造
ｌ父した複合プラス：’ｊ；（〕５Ｒ８２０６が、：ゴ
リイ・／・クテリＴンノ、中クルタＳ〃ノ、ＡＴＣＣｌ
　３０５８中て↓田植し本プラ”く、ｉｔの髪己Ｊ　Ｈ
ｌ　ｌ　Ｏｔ：ｌＩ兎の抗生物質ｉｆ１．ｉ＋ｌ（生−
ンー力−がゴｔ−リ、−１−乙ことな示す、１、ｔい　
（１）　　プラス、ｉ’　１）ＬＪ１３　＋　１０　’
ｖｊ″Ｊ、極側３と同じもの・２イ吏川しまた。

（１１）　　シラス：Ｆｐ＋（へ・日３１９は９、極側
４と同１、（ｒ　＋こ、ｇ１″１見堡グした。

（′２）　　腹合ソノスミ１−シバ、ｉｈ　ｉｌＩ！グ
１）ｌノ１Ｊ１３＋１０のＤ　ＮＡ（１，０／ノン）は
６塩基１、ｅ、識制限酵素１扁ｍｌ−１１２＝１−二ソ
１−を使用して、３７Ｃ１２０分完全消化した。

ｉｉ）　、　ｌ）　１１　ｈ４１５．、　ｌ　９のＩ）
　ＮＡ（２，４７ｚ！／　）　　は４塩ｊ昌下１；′１
１（：１．１１：・１↓ζ１ｐ　；’、４　　Ｎ１１）
（ｌ　　Ｉ　　　　　Ｏ，４−１二　　）　］　　ろで
　１史　ｊ目）−−Ｃ、’＋　７　Ｃ：、１５分部分う
、ｉ′庁ｉ′シた。

ｌ１ｌ）　　ｉ　、）　Ｎ　）　　Ｃ（’Ｊ　ｊ、：反
応ｖｒ＞な実ルＱｉイク：ｊ　＋　（ニー同様〕操１１
　て　）中　’ＤＩ’、ｌ交二　、　　ｊ膨１ｉ、’Ｉ
ｌ・ム］１１．！　ノにＩＣ、イ＋：　　ｉｇ’　　ｂ
・　、　　リＪ　、）ｉリ　例　３から代表とｊて僅１
（ユ、）ｌｉｉ　９　’ａゴ１（」冒、二０．尚、ｌ）
　１１　Ｍｌ　５１　り）、ｐ　Ｌｌ　１３１１０のい
−・１」しか−カメ（・１両−ノブ　・））Ｉ）　　人
　Ａ　　’、ｆ　　７川　・ニー　な　い　］ネ　・η
′　−Ｑ　：よ　、　　ｊ：手　聞″１　中ム１嬰］宋
：よ　ｌｉｊ、　　’ｊ＋　ハ　・ＩＣ、つ・−）、・
′二、　１　山）１・Ｔｃ１ｌ　　を宋：、ｉ　′ノ、
事例　３、−１・１１１求７・、ニーシー（１：”Ｉ：
１’、）＼、カッ−−−′１′、・／ｌＯ／ｌ＋、＋７
．Ｔ！ｌｆ′１−１１ｒ’Ｃ，ｉＣ：Ｍ（−・ｔ（′（
、、ＮｔｚてメＩ；、ｉＪ’ｔ−Ｊ−二）、′（ニカ暑
）／バール）１と−１さ１−・ン一：＋１．１．．．Ｉ
−・・′・ラーリウノ・・、ノルタ、シｌ、へｌ’ｃｃ
１３０５ｅ＋中Ｃ’　ｆＨｉ’ｉノラ−・、：　：’　
□Ｓ　ｌぐ）も）００７ノハ（＋（ｒＨりｌｉｊ　ｌ、
、、、−（いと：レニ、にがわが一′つｒ、、：　、、
、　Ｊ−１２）−ノラス、１の分子：１１は、→８ツカ
！ノー１．′、二　、月　ｉ’、ｊ’、　　（ｆ、　　
３１　　だ−。

１゛Ｊ、−１Ｈ、＋、　　’、＋　　）ｌ＼　ソ　う！
　ン、　’、　　　：’　　１１　　と）Ｉぐ　８　２
　０　　（ン　　／ハ＋）　Ｉ−Ｉ　Ｂ　ｌ　ｉ　Ｏ、
＝　１．１１−１＼Ｉ　ｌ　３１９　久）？某台−／″
１２人、１−こｐ　Ｌ、ｌ　１も１１０山」（のカッ−
’　４　、・□　□ｉ　：ｌ１１ｐｉイ、ざ小し、＋１
　ＩＩＭ　ｉ　！ｉ　Ｉ　９の１ライフ＝＋−：：、　
、７　ｊをも−）ごとか小さＪｊな８、 ［が）　　Ｒ８２０６へ・　保　不ｊ　ず　７．、−１
　　リ　不　ハ　り　う゛　リ　ラム、　Ｚ’　、Ｌ、
　７ミカＡ　Ｓ　Ｒ８２０６はＡ　ＴＣＣ３９２、’１
８と［−て：、、）託さ」ｔ〔７いイ〕。

図面σ−）筒中な０、）ｌ！明 ９′３１Ｌズ１（・Ｙ、クリ−ノブ−イノクツラス　Ｉ
ζ））−例てあ６　＋１ＸＮ日；３０のｉｌ；１」限酵
素地図であく）５、第２１Ｋｌ　ｉ、ｉ　、ＩＩ）　Ａ
　ｊ　ｌ　Ｏ０４ノ：１ｊｌｌｌｌＸｌ”ｌｋ素地Ｉメ
Ｉてあへ：　、’（ｌ＜：Ｂ、ｌ　、　　クリ−ノブ−
イノクツラス、ｌ々月−・例−Ｃ、イ禿）１、・　１ｕ
ｌｌ　　λ・ｌ　　ｌ　　５　１　９　　ｔ′つ　；１
ｕｌｌ　１１％　＋仔　素　」（１）　Ｉメト（て　、
（リ　イ′）、、１’、’＋、、’ｌ出：・：・１！ｋ
　　　　味　（））ダ）、４末　式　公　？ｌｐｊ’！
　　１　　ｚ］ −４７：

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｌ　マーカーとなりうる遺伝子領域をもっブラフ□１１
   、ッ１よ染。体計ＮＡヤ６１７ｉＸ店１．１□、１．夜
   ；ｆｉｌ　＋い。 累で切断して得たＩ）１１Δ断片（Ａ）とマーカーのな
   いクリプテイックプラスミドを」二記６塩基認識制限酵
   素の切断末端と相補性のある切１１ｊｉ末端を生じる４
   塩基認識の制限酵不て！；７Ｉ１１シ「シたクリブチイ
   ンクプラスミドのＤ　Ｎ、Ａ断片（１３）とを調製し、
   Ｄ　Ｎ　’Ａ断片（Ａ）とｌ）　Ｎ　Ａ断片（１３）と
   を連結して造成口なプラスミドで、少なくとも導入した
   ブーカーの性質を１１」る遺伝子領域とクリプテイ７タ
   ブラ７．．キトのドライブユニット かつマーソＪ−の性質を発現する複合プラスミドを遼択
   することよ１２なる複合シラスミドのノ吉成乙とむ。 ２、　マーカーとなりうる遺伝子領域をもつブチｙ．　
   ミ　　ドが、Ｒ　Ｓ　Ｐ’２’ｌ　２　４、ｐ　Ｋ　Ｙ
   　２　２　８　９、ｐＬｉＢ９　　、　　ｐ　　＋＜、
   　　Ｂ　　Ｉ　　５　　８　　、　　ｐｓｃ１０＋　　
   、　　ｐ　　’Ｒ　　Ｋ２４８、’ｐＣＲ−１、ｐ　Ｂ
   　Ｒ　３　２　’２、ｐ　Ｂ　ｒ＜３２５、ｐ　Ｂ　、
   Ｒ　３　２　８又はｐ’Ａ．ｃＹｃ１７７である牛島許
   請求の範囲第１項記載の複合プラスミドの造成法。 ３　クリプテイックシラスミドがｐΔＭ３３０又はｐ’
   ＨＭ　Ｉ　５　１　９である特許請求の範囲第１項記・
   敗の複合プラスミドの造成法。 ４　宿−１：、となる微生物がプレヒバクテリウム・ラ
   フ１−ツエルメンタム又はコリネ尻りテリウ・・・グ・
   ・り１・り・雫あるＩＩ曽，目Ｉ・求の範囲第１Ｊ’）
   ｊｊ記載の複合プラスミドの造成法。 ５　６塩基認識制限酵素がＢ’ａｍ’ｉ（　　Ｉ　、’
   　１３ｇ　ｌ　　ＩＩ又はＢｃｌであり、４塩基認識制
   限酵素がＭｂ。 Ｉ、、。。。ｌ、ＦｎｕＥ　ｌ又６１’！ｌｌｉａｕ　
   　３　Ａ　’１ニーあ６＃４’　：Ｍ：請求の範囲第１
   □′項記載の複合プラスミドの造成法。　　　　　　　
   　　　　′