CN116179513A - 一种Cpf1蛋白及其在基因编辑中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种Cpf1蛋白及其在基因编辑中的应用，涉及生物技术领域。本发明提供了一种新型Cas12a核酸酶，命名为Cas12a‑68蛋白酶，它的PAM识别范围比传统的核酸酶更大，可以识别多种基因的靶点。利用本发明所述的新核酸酶在编辑核酸片段时，可以克服传统的Cas12a的不足，提高PAM的识别范围。这些优势使得本发明更加适用于范围更广的核酸片段编辑，在基因编辑应用中奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种Cpf1蛋白及其在基因编辑中的应用。
背景技术
基因编辑(gene editing)技术使得DNA序列定位点进行改造成为可能，比如第一代基因编辑工具锌指核酸酶(zinc finger nucleases，ZFNs)，第二代基因编辑工具类似转录激活的小型核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALENs)都可以用于改造靶向基因组，但是这些方法设计困难，不易制作，成本昂贵且普适性不强。
CRISPR-Cas系统最初来源于细菌的RNA引导的适应性免疫系统，用于抵御入侵细菌和古菌的核酸成分，CRISPR是指成簇的、规律间隔的短回文重复序列(clusteredregularly interspaced short palindromic repeats)，是由可以感染原核生物的噬菌体DNA片段衍生来的，它可以检测并摧毁能引起相似感染的其他噬菌体中相似的DNA，因此对原核生物抗噬菌体至关重要，所以该序列是许多原核生物的免疫系统。Cas蛋白是指CRISPR-associated蛋白，它是CRISPR系统中的相关蛋白。CRISPR基因座由一个编码Cas蛋白的操纵子及一个重复间隔序列(repeat spacer)构成，可以利用CRISPR序列中间隔序列(spacer)对应的RNA指引，识别并且切割特定与其序列互补的DNA链。CRISPR/Cas9系统属于2类CRISPR系统，由Cas9核酸酶、crRNA及tracrRNA组成，是目前使用最广泛的基因编辑工具；其简单高效，仅需要合成一段新的RNA就可以实现基因编辑，其设计简单以及操作容易的特性为最大的优点，使这项技术成为了调控和观察基因组的便捷、而且具备很强适应性的工具。这让它可以在广大领域中得到生物研究和生物技术方面的应用，包括基因调控、表观修饰、碱基编辑、基因成像等不同领域，且在微生物、植物、动物甚至人体内表现出了广泛的适用性。CRISPR-Cas工具极大地加快了科学研究的脚步，而基于Cas的生物技术的研发同样进步迅速。多项基于Cas9的临床试验正在或即将进行。这些临床试验的结果将指引未来体细胞基因编辑在体外和患者中的应用。
目前，CRISPR/Cas系统已从最初的CRISPR/Cas9发展到现在的CRISPR/Cas12a、CRISPR/Cas13a等多种基因编辑系统。其中，CRISPR-Cas12a是2类RNA引导的核酸内切酶，可用于编辑哺乳动物基因组的CRISPR系统。2015年9月，张锋团队(Zetsche B，Gootenberg JS，Abudayyeh O O，et al.Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2CRISPR-Cas system.Cell，2015，163(3)：759-771.)为CRISPR家族增添一个新成员——Cpf1，属于CRISPR-Cas系统2类V型，CRISPR/Cpf1系统属于Class2 Type V，其尺寸较小，同时具备RNA核酸内切酶和DNA核酸内切酶的能力，能够识别富含胸腺嘧啶(T)的PAM序列，扩展了CRISPR/Cas系统的可编辑范围。该系统不仅拥有较好的靶向切割DNA活性，同时还展现出显著区别于CRISPR-Cas9的编辑特点。Cas12a核酸酶扩大了基因编辑靶位点的选择范围，同时脱靶效应更低。相对于Cas9核酸酶，Cas12a核酸酶识别与crRNA间隔区互补的DNA靶序列，无需使用tracrRNA。并且，Cas12a蛋白酶分子量更小，更易进入细胞，编辑成功率更高。Cpf1蛋白的切割只需要单条RNA引导，此功能可以简化基因编辑工具的设计与使用。同时，Cpf1这一系统通过识别富含T的PAM并且在其靶向DNA序列留下粘性末端从而产生基因编辑的效果，Cpf1家族蛋白识别PAM的T/C偏好性扩展了CRISPR靶向编辑核酸的范围。但传统的Cas12a蛋白的基因编辑受前间区序列邻近基序(PAM)的限制，只能识别部分核酸靶点，如LbCas12a倾向于识别含有TTTV的PAM序列；国际上广泛使用的是氨基酸球菌属Cpf1(Acidaminococcus Cpf1，AsCpf1)和毛螺菌科Cpf1(Lachnospiraceae Cpf1，LbCpf1)，由于它们识别5′-TTTN-3′的前间区序列邻近基序的灵活性不足，限制了其在基因编辑领域的应用。因此需要发现或者改良现有的Cas12a蛋白(指crRNA依赖的内切酶，又称为Cpf1蛋白，它是CRISPR系统分类中V型(type V)的酶)，找到识别范围更广，更方便使用的新型Cas12a蛋白酶。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中Cas12a识别dsDNA靶标序列PAM范围受限的缺陷，本发明提供了一种新型Cas12a核酸酶，命名为Cas12a-68蛋白酶，它的PAM识别范围比传统的核酸酶更大，可以识别多种基因的靶点。
一种新型Cas12a核酸酶，即一种Cpf1蛋白，所述Cpf1蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
本发明还提供了一种编码所述Cpf1蛋白的多核苷酸。
Cpf1(Cas12a)可以在RNA的引导下识别DNA核酸序列，但是传统Cas12a蛋白PAM识别范围有限，如LbCas12a PAM为TTTV，而我们发现的新型Cas12a-68蛋白酶，识别PAM范围更广，扩大了识别的范围。
优选的，所述多核苷酸经密码子优化用于在目的细胞中的表达。
本发明还提供了一种包含所述多核苷酸的载体。
所述Cpf1蛋白为经过密码子优化的Cpf1蛋白，针对多种不同来源的Cpf1蛋白核酸序列进行原核密码子优化获得序列，构建到pET28a表达载体，进行低温诱导可溶蛋白表达，通过亲和纯化和分子筛纯化获得目的蛋白。
本发明还提供了一种V型CRISPR/Cas 12a基因编辑系统，包含所述的Cpf1蛋白或编码所述Cpf1蛋白的多核苷酸。
所述的V型CRISPR/Cas 12a基因编辑系统，还包含CRISPR RNA。所述CRISPR RNA的序列如SEQ ID NO.7～10所示的至少一种。
本发明还提供了所述的Cpf1蛋白、或所述的多核苷酸、或所述的载体、或所述的基因编辑系统在基因编辑中的应用。
所述应用为结合、目的切割或非目的切割DNA。
本发明还提供了一种基因编辑的方法，使用所述的基因编辑系统对靶标DNA进行编辑。
具体包括以下步骤：
(1)针对待编辑的靶标基因序列设计CRISPR RNA；
(2)构建包含CRISPR RNA的编码基因序列和所述多核苷酸的基因编辑载体；
(3)将步骤(2)中所述基因编辑载体导入待进行基因编辑的受体细胞中，筛选获得基因编辑后的转基因细胞。
本发明中，一旦靶标核酸、crRNA和Cas12a蛋白形成三元复合体时，Cas12a蛋白酶的切割活性就会被激活，靶标DNA就会被Cas12a切割。在合适的PAM存在下，通过设计不同的crRNA序列，可以靶向不同的靶标DNA片段，原理如图1所示。
本发明中，靶标DNA分子插入到pET-28a载体上，用EcoR V内切酶进行线性化处理。在基因编辑鉴定实验中，在Cas12a蛋白酶识别的PAM存在时，加入对应的crRNA，蛋白酶就会把靶标DNA分子从线性化载体中切割下来。反应体系在95℃加热5-10分钟，使Cas12a蛋白酶失活，然后进行琼脂糖凝胶电泳，观察切割下来的靶标DNA分子。此外，我们也分析发现新型Cas12a-68蛋白酶切割活性中心位点D897及E982，在Cas12a-68表达载体上做丙氨酸点突变实验，然后按照上述步骤，可鉴定突变体蛋白酶是否仍具有基因编辑活性。
术语解释：
术语crRNA是指CRISPR RNA，是短的引导Cas12a(Cpf1)到结合到靶标DNA序列的RNA。
术语CRISPR是指成簇的、规律间隔的短回文重复序列(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats)，该序列是许多原核生物的免疫系统。
术语Cas蛋白是指CRISPR-associated蛋白，它是CRISPR系统中的相关蛋白。
术语Cpf1(又称Cas12a)是指crRNA依赖的内切酶，它是CRISPR系统分类中V型(type V)的酶。
术语PAM是指前间区序列邻近基序(protospacer-adjacent motif)，是Cas12a切割所必须，FnCas12a的PAM为TTN序列，LbCas12a的PAM为TTTN序列。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种新型Cas12a核酸酶，命名为Cas12a-68蛋白酶，它的PAM识别范围比传统的核酸酶更大，可以识别多种基因的靶点。利用本发明所述的新核酸酶在编辑核酸片段时，可以克服传统的Cas12a的不足，提高PAM的识别范围。这些优势使得本发明更加适用于范围更广的核酸片段编辑，在基因编辑应用中奠定了基础。
附图说明
图1为可编程核酸酶的基因编辑原理图。
图2为可编程核酸酶在细胞内的表达检测图。
图3为可编程核酸酶切割双链DNA活性的检测图。
图4为不同PAM片段对可编程核酸酶在细胞内的基因编辑的影响图。
图5为不同核酸酶突变影响核酸酶切割双链的检测图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明中，常规试剂如Tris-Base(即Tris碱，中文名也称为三(羟甲基)氨基甲烷)、牛血清白蛋白(BSA)、NaCl、Tris-HCl(即Tris盐酸盐，中文别名：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)和甘油等购自国药公司；检测用核酸片段和RNA合成由北京擎科生物科技有限公司完成；转染哺乳细胞所用的转染试剂购买自上海李记生物科技有限公司；western-blot实验中所用FALG标签抗体购买自Cell Signaling Technology，Inc(CST)公司；实验中，二代测序实验由安诺优达基因科技(北京)有限公司完成；实验所用细胞分选仪为超速流式细胞分选系统(BD FACSAria III)。
本发明提供的可编程核酸酶的基因编辑原理如图1所示，具体为：在Cas蛋白酶识别PAM序列存在时，crRNA和Cas12a蛋白形成的复合物，靶向与crRNA碱基互补配对的DNA序列，DNA双链打开，crRNA与其中一条单链结合，即目标链(TS)，此时Cas12a蛋白酶的切割活性就会被激活，目标链(TS)和非目标链(NTS)就会被Cas12a蛋白酶切割。在合适的PAM存在下，通过设计不同的crRNA序列，可以靶向不同的靶标DNA片段。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：Cas12a-68蛋白酶的克隆和细胞内表达
为验证新型Cas12a-68蛋白酶在哺乳动物细胞内是否有基因编辑活性，首先验证了Cas12a-68在293细胞(人胚胎肾细胞293，是一个衍生自人胚胎肾细胞的细胞系)内是否有表达。
其中，293细胞具有：1)转染效率高；2)可悬浮培养用于大规模表达；3)表达蛋白结构最接近其在人体内构象；4)HEK293细胞在培养体系中能够快速增长，高密度培养等特点。293细胞中转入SV40T-antigen基因形成的高转衍生株，即为293T细胞系。这使得包含SV40ori的质粒能够在该细胞系中显著扩增，从而促进表达载体的扩增，促进蛋白的表达。
Cas12a-68蛋白酶在HEK293T细胞内的表达。
克隆基因片段(基因序列如SEQ ID NO.2)，实验中所用Cas12a-68的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。PCR扩展基因片段，pST1374(Addgene，#13426)载体经Not I酶切，然后在重组酶(诺唯赞，C112-01)的作用下重组基因片段和载体。测序鉴定重组质粒载体，然后提取质粒。使用EZ Trans细胞转染试剂(李记生物，AC04L091/AC04L092)转染质粒到293细胞内，37℃培养48-72小时。收集细胞，裂解，SDS-PAGE蛋白电泳后，进行Western-blot检测。
Western-blot检测的实验结果如图2所示，结果表明Cas12a-68蛋白在哺乳动物细胞内可以表达。
实施例2：Cas12a-68蛋白酶具有体外基因切割活性
1、准备核酸
crRNAs由北京擎科生物科技有限公司完成合成，合成的crRNAs序列如表1所示。
表1
2、基于CRISPR/Cas12a的体外基因切割活性检测
实验中crRNA由一个与Cas12a相互作用的21nt区域和一个用于目标DNA识别的23nt可编程引导区域组成。靶标DNA为MERS病毒基因片段(实验中所用序列如SEQ ID NO.3所示)，使用分别带有Nco I和EcoR I酶的正反向引物PCR扩展靶标DNA片段，然后再使用NcoI和EcoR I双酶切pET28a载体，酶切后的载体和PCR扩展产物在T4连接酶作用下进行重连，连接产物转化DH5α感受态细胞。挑选单克隆，摇菌，之后收集菌体提取质粒载体。提取后的质粒用EcoR V内切酶进行线性化处理，用于检测反应。
检测体系用400ng Cas12a-68，100ng靶标DNA片段(MERS病毒基因片段，序列如SEQID NO.3所示)，crRNA量为5pmol，反应的终体积为10μL。反应在37℃下孵育反应一个小时，95℃加热5-10分钟，使Cas12a蛋白酶失活，然后进行琼脂糖凝胶电泳，观察切割下来的靶标DNA分子，线性化的质粒经Cas切割后，会形成长度约4100bp和1400bp的两段DNA片段。
在基因编辑体系中，一旦crRNA介导Cas蛋白酶靶向靶标DNA分子，蛋白酶的切割活性会被激活，然后切割靶标DNA片段。具体实验结果如图3所示，从图3可以看到，在体外切割活性实验中，Cas12a-68能够切割双链DNA分子，表明Cas12a-68蛋白酶在体外具有基因编辑活性。
实施例3：Cas12a-68蛋白酶切割含有不同的PAM片段的效率
根据实施例1结果，Cas12a-68蛋白酶能够在哺乳动物细胞中表达，申请人鉴定蛋白酶是否在细胞内也有基因编辑能力，同时鉴定不同的PAM是否对Cas12a-68蛋白酶在细胞内的切割有影响。
实验中crRNA质粒有四个，即PAM序列中NNNN中的N分别为A、T、G、C的文库，4个质粒表达出的crRNA序列如表2所示，这里实验中crRNA由一个与Cas12a相互作用的21nt区域和一个用于目标DNA识别的20nt可编程引导区域组成。
表2
实验中所用细胞系含有不同PAM序列的质粒文库，如表3所示序列，PAM有TNNN和CNNN，而互补链上则有NNNA和NNNG的不同PAM序列，其中N代表任意碱基，即A、T、G、C。
表3
实验中所用的细胞系含有不同PAM序列的质粒文库，切割区域位于绿色荧光蛋白(GFP)基因前面，因为移码突变(frame shift mutation，是指DNA分子由于某位点碱基的缺失或插入，引起阅读框架变化，造成下游的一系列密码改变，使原来编码某种肽链的基因变成编码另一种完全不同的肽链序列)GFP不能表达，激光下也就无荧光。而细胞内，当Cas12a-68蛋白酶结合crRNA，靶向具有合适PAM序列的基因区域，Cas12a-68蛋白酶切割活性激活，切割靶标区域基因片段。理论上，因为切割随机性，切割反应有1/3的概率使GFP前面碱基序列in-frame，使得GFP表达，发出绿色荧光。
实验时，四个crRNA质粒文库分别和实施例1中构建得到的Cas12a-68pSTl374质粒分别共转染到含有不同PAM序列质粒文库的细胞中。加Puro抗生素(嘌呤霉素，一种蛋白质合成抑制剂)进行压力筛选，待细胞长满培养皿时(约6天)，收集细胞。然后进行细胞分选，收集能表达绿色荧光蛋白的细胞。之后破碎细胞，提取基因组，用四对不同引物进行切割区域片段扩展，引物序列如表4所示。PCR产物送安诺优达基因科技(北京)有限公司进行二代测序，之后分析测序结果。
表4
根据二代测序数据，我们分析了每个PAM序列下发生切割反应的个数，制作了热力图，颜色越深，代表切割效率越高。
结果如图4所示。根据实验结果看，除有LbCas12a TTTV的PAM序列外，Cas12a-68有更宽泛的PAM识别范围，如NYCC、TTCV、GTTR、AANT、CCGM等(R表示A+G；Y表示C+T；M表示A+C；N表示A+C+G+T；V表示A+C+G)。实验结果如图4所示，Cas12a-68蛋白酶能在哺乳动物细胞内发挥切割活性，且PAM识别范围更为广泛。
实施例4：Cas12a-68蛋白酶不同突变影响切割活性
分析序列保守性，我们找到了潜在的蛋白酶切割活性位点D897和E982，为了验证位点是否影响Cas12a-68蛋白酶的切割活性，我们在Cas12-68pET28a质粒载体的基础上分别构建了D897A和E982A的点突变质粒。合成点突变的PCR引物，引物序列如表5所示，然后以质粒载体为模板进行PCR反应，反应产物转化DH5α感受态细胞，挑选单克隆，之后送测序，鉴定位点是否正确突变。
表5
| 引物 | 序列(5’-3’) |
| 68_D897A-F | TGTGAACATTATCGGCATCGCTCGTGGCGAGCGTAATCT |
| 68_D897A-R | CGATGCCGATAATGTTCACATCAGAGCAGTCCTTCACG |
| 68_E982A-F | TAAGGCAATCGTGGTCCTTGCAAATTTAAACGTGGGGTT |
| 68_E982A-R | CAAGGACCACGATTGCCTTATACTTTACAATCATCTTG |
然后用两个单点突变质粒载体转化BL21(DE3)感受态细胞，提取含有点突变的蛋白。Cas12a-68点突变蛋白在大肠杆菌中表达，收集培养基中的细菌，超声裂解菌体，镍柱亲和层析纯化，使用不同浓度咪唑洗脱目的蛋白，收集洗脱液，使用脱盐柱进行脱盐处理后，可用于检测反应。
按照实施例2中的蛋白酶体外切割活性检测方法，即实验中crRNA由一个与Cas12a相互作用的21nt区域和一个用于目标DNA识别的23nt可编程引导区域组成。靶标DNA为MERS病毒基因片段(基因序列如SEQ ID NO.3所示)，使用分别带有Nco I和EcoR I酶的正反向引物PCR扩展靶标DNA片段，然后再使用Nco I和EcoR I双酶切pET28a载体，酶切后的载体和PCR扩展产物在T4连接酶作用下进行重连，连接产物转化DH5α感受态细胞。挑选单克隆，经测序鉴定片段正确插入到载体中，然后提取质粒载体，用EcoR V内切酶进行线性化处理，用于检测反应。
检测体系用400ng Cas12a-68-D897A或Cas12a-68-E982A(Cas12a-68-D897A为野生型Cas12a-68氨基酸序列第897位氨基酸由天冬氨酸突变为丙氨酸，氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示；Cas12a-68-E982A为野生型Cas12a-68氨基酸序列第982位氨基酸由谷氨酸突变为丙氨酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示)，100ng靶标DNA片段(MERS病毒基因片段，基因序列如SEQ ID NO.3所示)，crRNA量为5pmol，反应的终体积为10μL。反应在37℃下孵育反应一个小时，95℃加热5-10分钟，使Cas12a蛋白酶失活，然后进行琼脂糖凝胶电泳，观察切割下来的靶标DNA分子。验证位点突变蛋白酶是否有体外切割活性。
结论：实验结果如图5所示，D897A和E982A两个单点突变的蛋白酶失去了体外切割活性，说明D897和E982对于Cas12a-68蛋白酶的切割活性至关重要。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种Cpf1蛋白，其特征在于，所述Cpf1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种编码权利要求1所述Cpf1蛋白的多核苷酸。
3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸经密码子优化用于在目的细胞中的表达。
4.一种包含权利要求2或3所述多核苷酸的载体。
5.一种V型CRISPR/Cas 12a基因编辑系统，其特征在于，包含权利要求1所述的Cpf1蛋白或编码权利要求1所述Cpf1蛋白的多核苷酸。
6.如权利要求5所述的V型CRISPR/Cas 12a基因编辑系统，其特征在于，还包含CRISPRRNA。
7.如权利要求6所述的V型CRISPR/Cas 12a基因编辑系统，其特征在于，所述CRISPRRNA的序列如SEQ ID NO.7～10所示的至少一种。
8.权利要求1所述的Cpf1蛋白、或权利要求2或3所述的多核苷酸、或权利要求4所述的载体、或权利要求5～7任一项所述的基因编辑系统在基因编辑中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用为结合、目的切割或非目的切割DNA。
10.一种基因编辑的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)针对待编辑的靶标基因序列设计CRISPR RNA；
(2)构建包含CRISPR RNA的编码基因序列和权利要求2或3所述多核苷酸的基因编辑载体；
(3)将步骤(2)中所述基因编辑载体导入待进行基因编辑的受体细胞中，筛选获得基因编辑后的转基因细胞。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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