JP2007236203A - 酢酸菌の増殖促進機能に関与する遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法 - Google Patents
酢酸菌の増殖促進機能に関与する遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】 酢酸菌の菌体破砕液を高濃度酢酸存在下にさらし後、不溶化しなかった可溶性のタンパク質の遺伝子を取得することにより、酢酸存在下での酢酸菌の増殖を促進する機能を有する遺伝子を取得する方法により、グルコンアセトバクター属に属する実用酢酸菌から増殖促進機能を実用レベルで向上させる機能を有する新規な遺伝子をクローニングした。該遺伝子を酢酸菌に導入した形質転換株においては、酢酸及びエタノール存在下で培養した場合、顕著な増殖促進効果が確認された。
【選択図】 なし
Description
また、本発明は、上記本発明の食酢の製造方法により得られる食酢にも関する。
(1)酢酸安定タンパク質の同定
グルコンアセトバクター・エンタニイ(Gluconacetobacter entanii)の1株であるアセトバクター・アルトアセトゲネスMH−24(Acetobacter altoacetigenes MH-24)株(FERM BP−491として寄託)の菌体をフレンチプレスにて破砕を行ない、破砕液は遠心分離(7,500×g、10分)により未破砕菌体などを取り除き、上清液を得た。上清液から酢酸に対して安定なタンパク質を抽出する為に、pH4.0に調整した酢酸を最終濃度1Mになるように上清に添加し、酢酸の添加により不溶性となったタンパク質を遠心分離(7,500×g、10分)により除去し、酢酸存在下でも可溶性で、酢酸に対して安定なタンパク質を含有する上澄液を得た。
グルコンアセトバクター・エンタニイの1株であるアセトバクター・アルトアセトゲネスMH−24株(FERM BP−491)を6%酢酸、4%エタノールを添加したYPG培地(3%グルコース、0.5%酵母エキス、0.2%ポリペプトン)で30℃にて振とう培養を行なった。培養後、培養液を遠心分離(7,500×g、10分)し、菌体を得た。得られた菌体より、染色体DNA調製法(例えば、特開昭60−9489号公報参照)により、染色体DNAを調製した。
1.スポットAAR1について
上記のクローン化されたSau3AI断片をpUC19のBamHI部位に挿入し、該断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法よって決定した結果、配列番号1に記載した塩基配列が決定された。配列決定は両方のDNA鎖の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。
上記のクローン化されたSau3AI断片をpUC19のBamHI部位に挿入し、該断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法よって決定した結果、配列番号5に記載した塩基配列が決定された。配列決定は両方のDNA鎖の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。
上記のクローン化されたSau3AI断片をpUC19のBamHI部位に挿入し、該断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法よって決定した結果、配列番号9に記載した塩基配列が決定された。配列決定は両方のDNA鎖の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。
上記のクローン化されたSau3AI断片をpUC19のBamHI部位に挿入し、該断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法よって決定した結果、配列番号13に記載した塩基配列が決定された。配列決定は両方のDNA鎖の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。
上記のクローン化されたSau3AI断片をpUC19のBamHI部位に挿入し、該断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法よって決定した結果、配列番号17に記載した塩基配列が決定された。配列決定は両方のDNA鎖の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。
上記のクローン化されたSau3AI断片をpUC19のBamHI部位に挿入し、該断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法よって決定した結果、配列番号21に記載した塩基配列が決定された。配列決定は両方のDNA鎖の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。
上記のクローン化されたSau3AI断片をpUC19のBamHI部位に挿入し、該断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法よって決定した結果、配列番号25に記載した塩基配列が決定された。配列決定は両方のDNA鎖の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。
(1)アセトバクター・アセチへの形質転換
上記のようにしてクローン化されたアセトバクター・アルトアセトゲネスMH−24株(FERM BP−491)由来のDNA断片のうち、スポットAAR1において得られたDNAをKOD−Plus−(東洋紡績社製)を用いてPCR法により増幅し、増幅したDNA断片を酢酸菌−大腸菌シャトルベクターpGI18の制限酵素SmaI切断部位に挿入したプラスミドpPPIを作製した。プラスミドに挿入された増幅断片の概略を図1に示す。
上記のようにして得られたプラスミドを有するアンピシリン耐性の形質転換株を、酢酸を添加したYPG培地での生育について、シャトルベクターpGI18のみを導入した元株と比較した。
スポットAAR2において得られたDNAを用い、プライマーとしてプライマー3(その塩基配列を図7に示す)及びプライマー4(その塩基配列を図8に示す)を用いる以外は実施例2と同様に行い、プラスミドpSODを作製した。プラスミドに挿入された増幅断片の概略を図5に示す。
スポットAAR3において得られたDNAを用い、プライマーとしてプライマー5(その塩基配列を図11に示す)及びプライマー6(その塩基配列を図12に示す)を用いる以外は実施例2と同様に行い、プラスミドpUNKを作製した。プラスミドに挿入された増幅断片の概略を図9に示す。
(1)アセトバクター・アセチへの形質転換
スポットAAR4において得られたDNAを用い、プライマーとしてプライマー7(その塩基配列を図15に示す)及びプライマー8(その塩基配列を図16に示す)を用いる以外は実施例2と同様に行い、プラスミドpYBHを作製した。プラスミドに挿入された増幅断片の概略を図13に示す。
スポットAAR5において得られたDNAを用い、プライマーとしてプライマー9(その塩基配列を図19に示す)及びプライマー10(その塩基配列を図20に示す)を用いる以外は実施例2と同様に行い、プラスミドpAHRを作製した。プラスミドに挿入された増幅断片の概略を図17に示す。
スポットAAR6において得られたDNAを用い、プライマーとしてプライマー11(その塩基配列を図23に示す)及びプライマー12(その塩基配列を図24に示す)を用いる以外は実施例2と同様に行い、プラスミドpUNK2を作製した。プラスミドに挿入された増幅断片の概略を図21に示す。
スポットAAR7において得られたDNAを用い、プライマーとしてプライマー13(その塩基配列を図27に示す)及びプライマー14(その塩基配列を図28に示す)を用いる以外は実施例2と同様に行い、プラスミドpUNK3を作製した。プラスミドに挿入された増幅断片の概略を図25に示す。
Claims (27)
- 以下の(A)、(B)又は(C)に示されるタンパク質。
(A)配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(B)配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質
(C)配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列と少なくとも85%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質 - 以下の(A)、(B)又は(C)に示されるタンパク質をコードするDNA。
(A)配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(B)配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加又は逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質
(C)配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列と少なくとも85%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質 - 以下の(A)、(B)、(C)又は(D)に示されるDNA。
(A)配列表の配列番号1に示される塩基配列のうち、塩基番号213〜764の塩基配列からなるDNA
(B)配列表の配列番号1に示される塩基配列のうち、塩基番号213〜764の塩基配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするDNA
(C)配列表の配列番号1に示される塩基配列のうち、塩基番号213〜764の塩基配列の一部から作製したプライマー又はプローブとしての機能を有する塩基配列からなるDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするDNA
(D)配列表の配列番号1に示される塩基配列のうち、塩基番号213〜764の塩基配列において、1若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加又は逆位された塩基配列からなり、かつ酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするDNA - 以下の(A)、(B)又は(C)に示されるタンパク質。
(A)配列表の配列番号6に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(B)配列表の配列番号6に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質
(C)配列表の配列番号6に示されるアミノ酸配列と少なくとも85%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質 - 以下の(A)、(B)又は(C)に示されるタンパク質をコードするDNA。
(A)配列表の配列番号6に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(B)配列表の配列番号6に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質
(C)配列表の配列番号6に示されるアミノ酸配列と少なくとも85%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質 - 以下の(A)、(B)、(C)又は(D)に示されるDNA。
(A)配列表の配列番号5に示される塩基配列のうち、塩基番号231〜836の塩基配列からなるDNA
(B)配列表の配列番号5に示される塩基配列のうち、塩基番号231〜836の塩基配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするDNA
(C)配列表の配列番号5に示される塩基配列のうち、塩基番号231〜836の塩基配列の一部から作製したプライマー又はプローブとしての機能を有する塩基配列からなるDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするDNA
(D)配列表の配列番号5に示される塩基配列のうち、塩基番号231〜836の塩基配列において、1若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加又は逆位された塩基配列からなり、かつ酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするDNA - 以下の(A)、(B)又は(C)に示されるタンパク質。
(A)配列表の配列番号10に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(B)配列表の配列番号10に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質
(C)配列表の配列番号10に示されるアミノ酸配列と少なくとも85%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質 - 以下の(A)、(B)又は(C)に示されるタンパク質をコードするDNA。
(A)配列表の配列番号10に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質
(B)配列表の配列番号10に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質
(C)配列表の配列番号10に示されるアミノ酸配列と少なくとも85%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質 - 以下の(A)、(B)、(C)又は(D)に示されるDNA。
(A)配列表の配列番号9に示される塩基配列のうち、塩基番号201〜578の塩基配列からなるDNA
(B)配列表の配列番号9に示される塩基配列のうち、塩基番号201〜578の塩基配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするDNA
(C)配列表の配列番号9に示される塩基配列のうち、塩基番号201〜578の塩基配列の一部から作製したプライマー又はプローブとしての機能を有する塩基配列からなるDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするDNA
(D)配列表の配列番号9に示される塩基配列のうち、塩基番号201〜578の塩基配列において、1若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加又は逆位された塩基配列からなり、かつ酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするDNA - 以下の(A)、(B)又は(C)に示されるタンパク質。
(A)配列表の配列番号14に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(B)配列表の配列番号14に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質
(C)配列表の配列番号14に示されるアミノ酸配列と少なくとも85%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質 - 以下の(A)、(B)又は(C)に示されるタンパク質をコードするDNA。
(A)配列表の配列番号14に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(B)配列表の配列番号14に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質
(C)配列表の配列番号14に示されるアミノ酸配列と少なくとも85%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質 - 以下の(A)、(B)、(C)又は(D)に示されるDNA。
(A)配列表の配列番号13に示される塩基配列のうち、塩基番号240〜731の塩基配列からなるDNA
(B)配列表の配列番号13に示される塩基配列のうち、塩基番号240〜731の塩基配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするDNA
(C)配列表の配列番号13に示される塩基配列のうち、塩基番号240〜731の塩基配列の一部から作製したプライマー又はプローブとしての機能を有する塩基配列からなるDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするDNA
(D)配列表の配列番号13に示される塩基配列のうち、塩基番号240〜731の塩基配列において、1若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加又は逆位された塩基配列からなり、かつ酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするDNA - 以下の(A)、(B)又は(C)に示されるタンパク質。
(A)配列表の配列番号18に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(B)配列表の配列番号18に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質
(C)配列表の配列番号18に示されるアミノ酸配列と少なくとも85%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質 - 以下の(A)、(B)又は(C)に示されるタンパク質をコードするDNA。
(A)配列表の配列番号18に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質
(B)配列表の配列番号18に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質
(C)配列表の配列番号18に示されるアミノ酸配列と少なくとも85%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質 - 以下の(A)、(B)、(C)又は(D)に示されるDNA。
(A)配列表の配列番号17に示される塩基配列のうち、塩基番号201〜761の塩基配列からなるDNA
(B)配列表の配列番号17に示される塩基配列のうち、塩基番号201〜761の塩基配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするDNA
(C)配列表の配列番号17に示される塩基配列のうち、塩基番号201〜761の塩基配列の一部から作製したプライマー又はプローブとしての機能を有する塩基配列からなるDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするDNA
(D)配列表の配列番号17に示される塩基配列のうち、塩基番号201〜761の塩基配列において、1若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加又は逆位された塩基配列からなり、かつ酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするDNA - 以下の(A)、(B)又は(C)に示されるタンパク質。
(A)配列表の配列番号22に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(B)配列表の配列番号22に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質
(C)配列表の配列番号22に示されるアミノ酸配列と少なくとも85%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質 - 以下の(A)、(B)又は(C)に示されるタンパク質をコードするDNA。
(A)配列表の配列番号22に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質
(B)配列表の配列番号22に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質
(C)配列表の配列番号22に示されるアミノ酸配列と少なくとも85%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質 - 以下の(A)、(B)、(C)又は(D)に示されるDNA。
(A)配列表の配列番号21に示される塩基配列のうち、塩基番号193〜642の塩基配列からなるDNA
(B)配列表の配列番号21に示される塩基配列のうち、塩基番号193〜642の塩基配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするDNA
(C)配列表の配列番号21に示される塩基配列のうち、塩基番号193〜642の塩基配列の一部から作製したプライマー又はプローブとしての機能を有する塩基配列からなるDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするDNA
(D)配列表の配列番号21に示される塩基配列のうち、塩基番号193〜642の塩基配列において、1若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加又は逆位された塩基配列からなり、かつ酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするDNA - 以下の(A)、(B)又は(C)に示されるタンパク質。
(A)配列表の配列番号26に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(B)配列表の配列番号26に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質
(C)配列表の配列番号26に示されるアミノ酸配列と少なくとも85%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質 - 以下の(A)、(B)又は(C)に示されるタンパク質をコードするDNA。
(A)配列表の配列番号26に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質
(B)配列表の配列番号26に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質
(C)配列表の配列番号26に示されるアミノ酸配列と少なくとも85%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質 - 以下の(A)、(B)、(C)又は(D)に示されるDNA。
(A)配列表の配列番号25に示される塩基配列のうち、塩基番号228〜773の塩基配列からなるDNA
(B)配列表の配列番号25に示される塩基配列のうち、塩基番号228〜773の塩基配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするDNA
(C)配列表の配列番号25に示される塩基配列のうち、塩基番号228〜773の塩基配列の一部から作製したプライマー又はプローブとしての機能を有する塩基配列からなるDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするDNA
(D)配列表の配列番号25に示される塩基配列のうち、塩基番号228〜773の塩基配列において、1若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加又は逆位された塩基配列からなり、かつ酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするDNA - 請求項2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20及び21に記載のDNAの中から選ばれる1又は2以上のDNAを含む組換えベクター。
- 請求項22に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
- 請求項2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20及び21に記載のDNAの中から選ばれる1又は2以上のDNAの細胞内でのコピー数が増幅されたことにより、酢酸存在下での増殖促進機能が増強された微生物。
- 微生物がアセトバクター属、又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌であることを特徴とする請求項24に記載の微生物。
- 請求項24又は25に記載の微生物を、アルコールを含有する培地で培養し、該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
- 請求項26に記載の方法により得られる食酢。
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