SK284945B6 - DNA kódujúca chinoloxidázu cytochrómu typu bd z Brevibacterium lactofermentum - Google Patents

DNA kódujúca chinoloxidázu cytochrómu typu bd z Brevibacterium lactofermentum Download PDF

Info

Publication number
SK284945B6
SK284945B6 SK771-99A SK77199A SK284945B6 SK 284945 B6 SK284945 B6 SK 284945B6 SK 77199 A SK77199 A SK 77199A SK 284945 B6 SK284945 B6 SK 284945B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
amino acid
cyda
seq
cytochrome
quinoloxidase
Prior art date
Application number
SK771-99A
Other languages
English (en)
Other versions
SK77199A3 (en
Inventor
Nobuhito Sone
Original Assignee
Ajinomoto Co., Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ajinomoto Co., Inc. filed Critical Ajinomoto Co., Inc.
Publication of SK77199A3 publication Critical patent/SK77199A3/sk
Publication of SK284945B6 publication Critical patent/SK284945B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C12N9/0038—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6) with a heme protein as acceptor (1.6.2)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Oligonukleotidy sú syntetizované na základe aminokyselinových sekvencií N-zakončenia podjednotky I a N-zakončenia chinoloxidázy podjednotky II cytochrómu typu bd Brevibacterium flavum. PCR je uskutočnená pomocou oligonukleotidov ako primérov a chromozomálnej DNA B. flavum ako templátu. Gén kódujúci cytochróm bd typ chinoloxidázy B. flavum je získaný z chromozómovej DNA knižnice Brevibacterium lactofermentum pomocou získaného amplifikačného fragmentu ako sondy.

Description

Tento vynález sa týka cytochrómu bd typu chinoloxidázy Brevibactérium lactofermentum a DNA, ktorá ho kóduje.
Doterajší stav techniky
Väčšina organizmov získava energiu nevyhnutnú pre životnú aktivitu respiráciou. U vyšších organizmov sú karbohydráty, proteíny a alifatické kyseliny degradované na acetyl-CoA v glykolitickej dráhe a β-oxidáciou v cytoplazme. Acetyl-CoA je potom degradovaný v cykle kyseliny citrónovej v mitochondriách a výsledná energia je uchovaná ako ubúdajúca energia NADH a FADH2. Nakoniec je NADH úplne oxidované na vodu následným transportným systémom elektrónov, ktorý prebieha na vnútorných membránach mitochondrií. Je vytvorený koncentračný gradient protónov v spojení s oxidáciou, ktorý slúži ako hnacia sila pre syntézu ATP.
Pretože bakteriálne dýchacie reťazce obvykle zahŕňajú rôzne funkčné enzýmové komplexy v závislosti od druhu a rastových okolností, schopnosť uchovávania energie sa môže veľmi meniť. Napríklad Escherichia coli obsahuje najmenej dva typy chinoloxidáz, typ bo a typ bd, ktoré fungujú ako terminálne oxidázy v dýchacích reťazcoch. Ak sa porovnáva rastový výnos v aeróbnej kultúre u kmeňa divého typu, ktorý má oba typy enzýmov, s mutantným kmeňom, ktorý má len bo typ a s mutantným kmeňom, ktorý má len bd typ, je rastový výnos najnižší u mutantného kmeňa s bd typom enzýmu, pričom závisí od typu terminálnej oxidázy a jej schopnosti uchovávať energiu (Abstrakt prednášky z konferencie Spoločnosti pre biovedu a bioinžinierstvo, Japonsko, 1995, téma číslo 357).
Koryneformné baktérie ako Brevibacterium lactofermentum a Brevibacterium flavum sú grampozitivne a aeróbne baktérie, ktoré sú priemyselne využívané na produkciu aminokyselín. Hoci boli terminálne oxidázy dýchacieho reťazca dobre preskúmané u protobaktérii, ktoré sú fylogenetický dosť vzdialené od koryneformných baktérií, a u Bacillus subtilis a termofilného Bacillus, čo sú tiež grampozitívne baktérie podobne ako koryneformné baktérie, ale fylogenetický trochu odlišné od nich, elektrónový transportný systém u koryneformných baktérií nebol podrobne preskúmaný. Pokladá sa za dôležité objasniť elektrónový transportný systém dýchacieho reťazca, ktorý je kľúčom k energetickému metabolizmu z pohľadu zhromažďovania podstatných informácií u koryneformných baktérií s cieľom zlepšiť produktivitu užitočných substancií. Ďalej, ak sú enzýmy z elektrónového transportného systému dýchacieho reťazca koryneformných baktérií a ich gény identifikované, môžu byť použité napríklad na vytvorenie kmeňov s vyššou energetickou schopnosťou.
Dodnes bolo publikované, že respirácia Brevibacterium lactofermentum je spájaná s transportom protónov a zahŕňa cytochróm a, b a c (Kawahara, Y., et. al. (1988) Agric. Biol. Chem., 52(8), 1979 až 1983). Cytochróm bd typ chinoloxidázy Brevibacterium flavum bol tiež purifikovaný a charakterizovaný (Kusumoto, Sone a Sakamoto, „Respirátory Chain of Amino Acid Fermenting Bacterium, Brevibacterium flavum, and Characteristics of Its Cytochrome bd Type Menaquinol Oxidase“, abstrakt z 23 sympózia Bioenergetickej pracovnej skupiny, 1997). Doteraz sa však žiadna publikácia netýkala génov kódujúcich cytochróm bd typ chinoloxidázy koryneformných baktérii.
Tento vynález bol uskutočnený z uvedeného hľadiska a jeho cieľom je získať gén, kódujúci cytochróm bd typ chinoloxidázy korenyformných baktérií a objasniť jeho štruktúru.
Autori vynálezu syntetizovali oligonukleotidy na základe aminokyselinovej sekvencie N-zakončenia podjednotky I a N-zakončenia podjednotky II cytochrómu bd typu chinoloxidázy Brevibacterium flavum. Uskutočnili PCR reakciu použitím oligonukleotidov ako primérov a chromozómovej DNA Brevibacterium flavum ako templátu na získanie amplifikovaného fragmentu. Ďalej skrínovali chromozomálnu DNA knižnicu zostrojenú z kmeňa divého typu Brevibacterium lactofermentum pomocou sondy, ktorú predstavoval amplifikovaný fragment a úspešne získali gén kódujúci cytochróm bd typ chinoloxidázy Brevibacterium lactofermentum.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je DNA fragment, kódujúci polypeptid, ktorý je definovaný (A) alebo (B), kde (A) je polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia je zobrazená v SEQ ID NO: 2 sekvenčného zoznamu, (B) je polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia zobrazená v SEQ ID NO: 2 sekvenčného zoznamu zahrnuje substitúciu, deléciu, inzerciu, adíciu alebo inverziu jedného alebo viacerých aminokyselinových zvyškov v aminokyselinovej sekvencii a ktorá môže vytvoriť proteín, vykazujúci aktivitu cytochrómu bd typu chinoloxidázy spolu s podjednotkou II cytochrómu bd typu chinoloxidázy, ktorej aminokyselinová sekvencia je zobrazená v SEQ ID NO: 4,
V inom uskutočnení je DNA fragment, kódujúci polypeptid, definovaný (C) alebo (D), kde (C) je polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia je zobrazená v SEQ ID NO: 4 sekvenčného zoznamu, (D) je polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia zobrazená v SEQ ID NO: 4 sekvenčného zoznamu zahrnuje substitúciu, deléciu, inzerciu, adíciu alebo inverziu jedného alebo viacerých aminokyselinových zvyškov v aminokyselinovej sekvencii a ktorá môže vytvoriť proteín vykazujúci aktivitu cytochrómu bd typu chinoloxidázy spolu s podjednotkou I cytochrómu bd typu chinoloxidázy, ktorej aminokyselinová sekvencia je zobrazená v SEQ ID NO: 2.
V ďalšom uskutočnení je DNA fragment, kódujúci polypeptid, definovaný (A) alebo (B) a (C) alebo (D), kde (A) je polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia je zobrazená v SEQ ID NO: 2 sekvenčného zoznamu, (B) je polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia zobrazená v SEQ ID NO: 2 sekvenčného zoznamu zahrnuje substitúciu, deléciu, inzerciu, adíciu alebo inverziu jedného alebo viacerých aminokyselinových zvyškov v aminokyselinovej sekvencii a ktorá môže vytvoriť proteín vykazujúci aktivitu cytochrómu bd typu chinoloxidázy spolu s podjednotkou II cytochrómu bd typu chinoloxidázy, ktorej aminokyselinová sekvencia je zobrazená v SEQ ID NO: 4, (C) je polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia je zobrazená v SEQ ID NO: 4 sekvenčného zoznamu, (D) je polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia zobrazená v SEQ ID NO: 4 sekvenčného zoznamu zahrnuje substitúciu, deléciu, inzerciu, adíciu alebo inverziu jedného alebo viacerých aminokyselinových zvyškov v aminokyselinovej sekvencii a ktorá môže vytvoriť proteín vykazujúci aktivitu cytochrómu bd typu chinoloxidázy spolu s podjednotkou I cytochrómu bd typu chinoloxidázy, ktorej aminokyselinová sekvencia je zobrazená v SEQ ID NO: 2.
DNA podľa vynálezu môže byť definovaná (a) alebo (b), kde (a) je DNA, ktorej nukleotidová sekvencia korešponduje s nukleotidovými číslami 933 až 2483 v nukleotidovej sekvencii zobrazenej v SEQ ID NO: 1 sekvenčného zoznamu; alebo (b) je DNA, ktorá je schopná hybridizovať s uvedenou nukleotidovou sekvenciou (a) za prísnych podmienok a ktorá kóduje polypeptid schopný vytvoriť proteín, vykazujúci aktivitu cytochrómu bd typu chinoloxidázy spolu s podjednotkou II cytochrómu bd typu chinoloxidázy, ktorej aminokysclinová sekvencia je zobrazená v SEQ ID NO: 4,
DNA podľa vynálezu môže byť definovaná (c) alebo (d), kde (c) je DNA, ktorej nukleotidová sekvencia korešponduje s nukleotidovými číslami 2476 až 3498 v nukleotidovej sekvencií zobrazenej v SEQ ID NO: 3 sekvenčného zoznamu; alebo (d) je DNA, ktorá je schopná hybridizovať s uvedenou nukleotidovou sekvenciou (c) za prísnych podmienok a ktorá kóduje polypeptid schopný vytvoriť proteín, vykazujúci aktivitu cytochrómu bd typu chinoloxidázy spolu s podjednotkou I cytochrómu bd typu chinoloxidázy, ktorej aminokyselinová sekvencia je zobrazená v SEQ ID NO: 2.
DNA podľa vynálezu môže zahŕňať DNA definovanú (a) alebo (b) a (c) alebo (d), kde (a) je DNA, ktorej nukleotidová sekvencia korešponduje s nukleotidovými číslami 933 až 2483 v nukleotidovej sekvencii zobrazenej v SEQ ID NO: 1 sekvenčného zoznamu; alebo (b) je DNA, ktorá je schopná hybridizovať s uvedenou nukleotidovou sekvenciou (a) za prísnych podmienok a ktorá kóduje polypeptid schopný vytvoriť proteín, vykazujúci aktivitu cytochrómu bd typu chinoloxidázy spolu s podjednotkou II cytochrómu bd typu chinoloxidázy, ktorej aminokyselinová sekvencia je zobrazená v SEQ ID NO: 4; a (c) je DNA, ktorej nukleotidová sekvencia korešponduje s nukleotidovými číslami 2476 až 3498 v nukleotidovej sekvencii zobrazenej v SEQ ID NO: 3 sekvenčného zoznamu; alebo (d) je DNA, ktorá je schopná hybridizovať s uvedenou nukleotidovou sekvenciou (c) za prísnych podmienok a ktorá kóduje polypeptid schopný vytvoriť proteín, vykazujúci aktivitu cytochrómu bd typu chinoloxidázy spolu s podjednotkou I cytochrómu bd typu chinoloxidázy, ktorej aminokyselinová sekvencia je zobrazená v SEQ ID NO: 2.
V ďalšom uskutočnení je definovaný DNA fragment, ktorého nukleotidová sekvencia zahŕňa nukleotidy s číslami 933 až 2483 v nukleotidovej sekvencií zobrazenej v SEQ ID NO: 1.
V ďalšom uskutočnení je definovaný DNA fragment, ktorého nukleotidová sekvencia zahŕňa nukleotidy s číslami 2476 až 3498 v nukleotidovej sekvencií zobrazenej v SEQ ID NO: 1, a
V inom uskutočnení je definovaný DNA fragment, ktorého nukleotidová sekvencia zahŕňa nukleotidy s číslami 933 až 3498 v nukleotidovej sekvencií zobrazenej v SEQ ID NO: 1.
V tomto opise cytochróm bd typ chinoloxidázová aktivita znamená aktivitu, ktorú vykazuje oxidoredukčné diferenciálne absorbčné spektrum cytochrómu b a cytochrómu d, ktoré je na oxidáciu redukovaného typu chinonónových zložiek (chinolov) so spotrebou kyslíka. DNA fragment, ktorý kóduje cytochróm bd typ chinoloxidázy alebo jej podjednotky bude označovaný ako „DNA podľa tohto vynálezu“.
Tento vynález bude podrobnejšie vysvetlený ďalej v texte.
DNA podľa tohto vynálezu sa dá získať z chromozomálnej DNA B. lactofermentum na základe čiastočnej aminokyselinovej sekvencie cytochrómu bd typu chinoloxidázy B. flavum. Presne je PCR uskutočnená pomocou oligonukleotidov ako primérov syntetizovaných na základe aminokyselinových sekvencií a chromozomálnej DNA B. flavum ako templátu na získanie čiastočnej sekvencie cytochróm bd typu chinoloxidázového génu B. flavum. Potom skríningom chromozomálnej DNA knižnice B. lactofermentum pomocou sondy, ktorú predstavuje získaná čiastočná sekvencia sa dá získať gén kódujúci cytochróm bd typ chinoloxidázy.
Chromozomálna DNA B. flavum a B. lactofermentum môže byť pripravená napríklad metódou Saita a Miura (Biochem. Biophys. Acta., 72, 619, (1963)) a metódou K. S. Kirbyho (Biochem. J., 64, 405, (1956)). Chromozomálna DNA knižnica sa dá získať čiastočným štiepením chromozomálnej DNA vhodným reštrikčným enzýmom, ligáciou každého zo získaných DNA fragmentov do vektora DNA schopného autonómnej replikácie v Escherichii coli s cieľom vytvoriť rekombinantnú DNA a zavedením DNA do E. coli. Typ vektora nie je obzvlášť vymedzený, pokiaľ je to vektor bežne používaný na genetické klonovanie a pokiaľ sú to plazmidové vektory ako pUC19, pUC18, pUC118, pUC119, fágové vektory ako lambda fág DNA a podobné.
Primér použitý na PCR môže byť napríklad oligonukleotid, ktorého nukleotidová sekvencia je zobrazená v SEQ ID NO: 8. Na potvrdenie, že získaný PCR produkt predstavuje požadovanú sekvenciu je možné sekvenovanim nukleotidov potvrdiť, že obsahuje sekvenciu korešpondujúcu sekvencií primérov alebo potvrdiť, že aminokyselinová sekvencia odvodená z nukleotidovej sekvencie obsahuje čiastočnú aminokyselinovú sekvenciu cytochrómu bd typu chinoloxidázy B. flavum.
Skrining chromozomálnej DNA knižnice B. lactofermentum použitím DNA fragmentu získaného metódou PCR ako sondy môže byť uskutočnený kolónovou hybridizáciou, ak sú na zhotovenie knižnice použité plazmidové vektory, alebo plakovov hybridizáciou, ak sú na zhotovenie knižnice použité fágové vektory. Nukleotidovým sekvenovanim DNA z pozitívneho hybridizačného klonu sa dá potvrdiť, žc obsahuje cytochróm bd typ chinoloxidázový gén. Je tiež možné predbežne uskutočniť Southemovu analýzu na hybridizáciu pozitívneho klonu pomocou sondy.
Nukleotidová sekvencia cytochróm bd typu chinoloxidázového génu B. lactofermentum ATCC 13869 kmeňa získaná v pracovnom príklade opísaným spôsobom je zobrazená v SEQ ID NO: 1. Predpokladané kódujúce oblasti kódujúce aminokyselinové sekvencie proteínov sú zobrazené v SEQ ID NOS: 1 až 4. Zhodnotenie kódujúcich oblastí a operónovej štruktúry, ako aj analýza homológie s chinoloxidázami cytochrómomu bd typu Bacillus stearothermophilus K1041 a Escherichie coli boli uskutočnené použitím GENETYX - Homology Version 2. 2. 2. (Software Development Co., Ltd).
Cytochróm bd typ chinoloxidázový gén má dva otvorené čítacie rámce (cydA a cvdB čítané z 5'-konca), ktoré kódujú podjednotku I cytochrómu bd typu chinoloxidázy (ďalej v texte spomínanú len ako „podjednotka I“) a podjednotku II (tiež ďalej v texte spomínanú len ako „podjednotka II“). Bolo určené, že cvdA má 1551 bp a cvdB 1023 bp, podjednotka I pozostáva z 517 aminokyselinových zvyškov a podjednotka II z 341 aminokyselinových zvyškov. Pravdepodobná promotorová sekvencia ležala poniže cydA, pravdepodobná SD sekvencia ležala povyše cvdA a cydB a pravdepodobná terminátorová sekvencia ležala poniže cvdB. Preto sa predpokladalo, že cydA a cydB tvoria cyd operón.
Ak kodón N-terminálneho aminokyselinového zvyšku podjednotky I je označený ako GTG a korešpondujúcou aminokyselinou je Val v sekvenčnom zozname, je to v skutočnosti Met. Je to pravdepodobne spôsobené tým, že GTG je rozpoznávaný ako iniciačný metionín. Takéto prípady boli v literatúre už opísané.
Obrázky 1 a 2 znázorňujú jednak výsledky hydropathy analýzy uskutočnenej s cieľom porovnať štruktúry cytochrómu bd typu chinoloxidázy tohto vynálezu a podjednotiek 1 Bacillus stearothermophilus a E. coli, ako aj zoradenie aminokyselinových sekvencii. Označenia I až VII znamenajú transmembránové hélixové oblasti, čím sa potvrdilo, že tu bolo najmenej sedem transmembránových hélixov. Z grafov je zrejmé, že sa navzájom všetky podobajú. Ďalej oblasť, obsahujúca chinolové väzbové miesto nazvané Q slučka sa nachádzalo medzi V a VI podjednotky I E. coli, zatiaľ čo tu nebola žiadna oblasť vykazujúca homológiu s druhou polovicou Q slučky u B. lactofermentum tak, ako u B. stearothermophilus cydA a preto bola Q slučková oblasť skrátená. S ohľadom na túto skutočnosť sa očakávalo, že štruktúra cytochrómu bd typu chinoloxidázy B. lactofermentum sa viac približuje štruktúre cytochrómu bd typu chinoloxidázy B. stearothermophilus ako E. coli. Porovnaním aminokyselinových sekvencii podjednotky I sa zistilo, že homológia medzi B. lactofermentum a B. stearothermophilus bola 24,7 % a medzi B. lactofermentum a E. coli bola okolo 38,6 %, teda sa predpokladalo, že pre podjednotku I ako celok má cytochróm bd typ chinoloxidáza B. lactofermentum štruktúru, ktorá sa viac približuje štruktúre cytochrómu bd typu chinoloxidázy E. coli ako B. stearothermophilus.
Boli opísané H19, Hl 86 a M393 pre E. coli cydA a Η21, H184 a M326 pre B. stearothermophilus cydA ako funkčne dôležité zvyšky ligandov hemu b558. Tieto aminokyseliny sú konzervované tiež v cydA u B. lactofermentum ako Hl8, H185 aM350.
Obrázok 3 zobrazuje zoradenie aminokyselinových sekvencii troch typov barteriálnych podjenotiek II. V podjednotke II vykazuje B. lactofermentum približne 25,9 % homológiu s B. stearothermophilus a s E. coli približne 34,8 % homológiu.
DNA podľa tohto vynálezu je DNA kódujúca podjednotku I, ktorá je kódovaná nukleotidovou sekvenciou SEQ ID NO: 2 a podjednotku II, ktorá je kódovaná nukleotidovou sekvenciou SEQ ID NO: 4, alebo cytochróm bd typ chinoloxidázový proteín, ktorý pozostáva z podjednotky I a podjednotky II. Podjednotka I, podjednotka II alebo cytochróm bd typ chinoloxidázový proteín sa dajú produkovať zavedením takejto DNA do vhodnej hostiteľskej bunky a kultiváciou získaných transformantov tak, aby sa mohla DNA exprimovať. DNA ktorej nukleotidová sekvencia zahŕňa nukleotidy s nukleotidovými číslami 933 až 2483 nukleotidovej sekvencie SEQ ID NO: 1 môže byť označovaná ako DNA kódujúca podjednotku I, DNA ktorej nukleotidová sekvencia zahŕňa nukleotidy s nukleotidovými číslami 2476 až 3498 ako DNA kódujúca podjednotku II a DNA, ktorej nukleotidová sekvencia zahŕňa nukleotidy s nukleotidovými číslami 933 až 3498 môže byť označovaná ako DNA kódujúca obidve podjednotky.
Produkovaný cytochróm bd typ chinoloxidázový proteín alebo jeho podjednotky môžu byť izolované a purifikované z kultúr pomocou bežne používaných metód na purifikáciu proteínov ako vysoľovanie, precipitácia rozpúš ťadlom, gélová filtračná chromatografia a ionexová chromatografia.
DNA podľa tohto vynálezu kódujúca podjednotku I môže buď kódovať polypeptid s aminokyselinovou sekvenciou zobrazenou v SEQ ID NO: 2, ktorá zahŕňa substitúciu, deléciu, inzerciu, adíciu alebo inverziu jedného alebo niekoľkých aminokyselinových zvyškov v aminokyselinovej sekvencii, alebo polypeptid, ktorý môže vytvoriť proteín vykazujúci cytochróm bd typ chinoloxidázovú aktivitu spolu s podjednotkou II.
DNA podľa tohto vynálezu kódujúca podjednotku II môže buď kódovať polypeptid s aminokyselinovou sekvenciou zobrazenou v SEQ ID NO: 4, ktorá zahŕňa substitúciu, deléciu, inzerciu, adíciu alebo inverziu jedného alebo niekoľkých aminokyselinových zvyškov v aminokyselinovej sekvencii, alebo polypeptid ktorý môže vytvoriť proteín vykazujúci cytochróm bd typ chinoloxidázovú aktivitu spolu s podjednotkou I.
Ďalej DNA, ktorá kóduje cytochróm bd typ chinoloxidázu a obsahuje mutácie v podjednotke I, v podjednotke II alebo v obidvoch podjednotkách je tiež zahrnutá do DNA podľa tohto vynálezu.
Označenie „niekoľko aminokyselinových zvyškov“ znamená 1 až 40, výhodnejšie 1 až 10 aminokyselinových zvyškov.
DNA kódujúcu v podstate rovnaký proteín, akým je podjednotka I a/alebo podjednotka II, ktoré sú opísané v texte, sa dá získať napríklad modifikáciou nukleotidovej sekvencie napríklad metódou cielenej mutagenézy takým spôsobom, že jeden alebo viac aminokyselinových zvyškov v špecifickom mieste je zahrnutých do substitúcie, delécie, inzercie, adície alebo inverzie. Takto modifikovanú DNA je možné získať konvenčné známym mutačným opracovaním. Mutačné opracovanie zahŕňa in vitro metódu úpravy DNA kódujúcej podjednotku 1 a/alebo podjednotku II, napríklad s hydroxylamínom a metódu úpravy mikroorganizmov, napríklad baktérií patriacich do rodu Escherichia, ktoré obsahujú DNA kódujúcu podjednotku I a/alebo podjednotku II, s ultrafialovým žiarením alebo mutačným činiteľom, akým je N-metyl-N'-nitro-N-nitrózoguanín (NTG) a kyselina dusitá obvykle používané na mutačné opracovanie.
Substitúcia, delécia, inzercia, adícia alebo inverzia nukleotidov, ktoré sú opísané v texte, tiež zahŕňajú mutáciu (mutant alebo variant), ktorá sa prirodzene vyskytuje napríklad na základe individuálnych rozdielov alebo rozdielov v rámci druhov alebo rodov koryneformných baktérií, ktoré majú cytochróm bd typ chinoloxidázy.
DNA kódujúcu rovnaký proteín, akým je podjednotka I a/alebo podjednotka II, je možné získať expresiou DNA s mutáciou, opísanou v texte, vo vhodnej bunke a preskúmaním aktivity exprimovaných produktov. DNA kódujúcu rovnaký proteín, ako je podjednotka I a/alebo podjednotka II, je možné tiež získať izoláciou DNA, ktorá je schopná hybridizovať s DNA obsahujúcou napríklad nukleotidovú sekvenciu korešpondujúcu nukleotidovým číslam 933 až 2483 nukleotidovej sekvencie zobrazenej v SEQ ID NO:1 a/alebo nukleotidovú sekvenciu korešpondujúcu nukleotidovým číslam 2476 až 3498 nukleotidovej sekvencie zobrazenej v SEQ ID NO:3 sekvenčného zoznamu za prísnych hybridizačných podmienok a ktorá kóduje proteín s aktivitou podjednotky I a/alebo podjednotky II, ďalej z DNA s mutáciou, ktorá kóduje podjednotku I a/alebo podjednotku II alebo z buniek, ktoré ju obsahujú.
Spomínané „prísne podmienky“ sú podmienky, pri ktorých sa vytvárajú len takzvané špecifické hybridy a nešpecifické hybridy sa netvoria. Je ťažké tieto podmienky pres ne vyjadriť pomocou akejkoľvek číselnej hodnoty. Ale napríklad prísne podmienky zahŕňajú podmienky, pri ktorých DNA s vysokou homológiou, napríklad DNA ktorých homológia nie je menšia než 50 % sú spolu hybridizované a DNA ktorých homológia je menšia, nie sú spolu hybridizované. Alebo sú prísne podmienky explifikované podmienkami, pri ktorých sú DNA spolu hybridizované v koncentrácii solí korešpondujúcej obvyklým podmienkam premývania pri Southemovej hybridizácii, ako sú 60 °C, 1 x SSC, 0,1 % SDS, vhodnejšie 0,1 x SSC, 0,1 % SDS.
Gén, ktorý je hybridizovateľný za uvedených prísnych podmienok, zahŕňa taký gén, ktorý má stop kodón vytvorený v kódujúcej oblasti génu a ktorý nemá aktivitu spôsobujúcu mutáciu aktívnych centier. Ale takéto nevýhody sa dajú ľahko odstrániť ligáciou génu s komerčne prístupným aktivitu exprimujúcim vektorom a preskúmaním aktivity cytochrómu bd typu chinoloxidázy.
Hostiteľmi vhodnými na expresiu DNA podľa tohto vynálezu môžu byť napríklad rôzne typy baktérií zahŕňajúc E. coli, koryneformné baktérie ako B. lactofermentum a B. flavum, eukaryotické bunky ako Saccharomyces cerevisiae a podobne. Na zavedenie DNA podľa tohto vynálezu do spomínaného hostiteľa môže byť hostiteľská bunka transformovaná rekombinantným vektorom, ktorý je vytvorený inzertovaním DNA podľa tohto vynálezu do vektora selektovaného na základe typu hostiteľa. Tieto procedúry môžu byť uskutočnené pomocou metód genetických rekombinácií, ktoré sú známe odborníkom v tejto oblasti.
Cytochróm bd typ chinoloxidáza alebo jej podjednotky a DNA podľa tohto vynálezu, ktorá ich kóduje, sa považujú za užitočné pri vysvetlení elektrónového transportného systému koryneformných baktérií. Očakáva sa tiež využite DNA podľa tohto vynálezu na vypestovanie koryneformných baktérií produkujúcich užitočné substancie s vysokou energetickou schopnosťou.
Tento vynález bude špecificky vysvetlený s odkazmi na nasledujúce príklady.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1 znázorňuje výsledky hydropathy analýzy podjednotiek I cytochrómu bd typu chinoloxidáz Brevibacterium lactofermentum, Bacillus stearothermophilus a Escherichie coli. Symbol označuje aminokyselinový zvyšok spoločný trom oxidázam.
Obrázok 2 znázorňuje aminokyselinovú sekvenciu podjednotiek I cytochrómu bd typu chinoloxidáz Brevibacterium lactofermentum, Bacillus stearothermophilus a Escherichie coli.
Obrázok 3 znázorňuje aminokyselinovú sekvenciu podjednotiek II cytochrómu bd typu chinoloxidáz Brevibacterium lactofermentum, Bacillus stearothermophilus a Escherichie coli.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Purifikácia cytochrómu bd typu chinoloxidázy Brevibacte rium flavum
Bakteriálne bunky (okolo 120 g mokrej váhy) B. flavum ATCC 14067 kmeňa, ktoré boli kultivované do konca stacionárnej fázy, boli suspendované v 200 ml pufra (0,5 % NaCl, lOmM fosforečnan sodný, pH 7,4) a hneď narušené rýchlym miešaním gorálkovej paličky (Biospec) v prítomnosti 0,5 mM sklenných častíc. Potom bola suspenzia roz rušených buniek centrifugovaná pri 5000 otáčkach/minútu 10 minút s cieľom odstránenia bakteriálnych buniek, ktoré sanerozrušili. Ďalej sa supematant centrifugoval pri 15 000 otáčkach/minútu 10 minút a výsledný supematant bol centrifugovaný pri 15 000 otáčkach/minútu 30 minút. Získané precipitáty z oboch centrifugácií boli spojené a suspendované v uvedenom pufri na získanie membránového preparátu.
Membránový preparát (5 mg/ml, 0,5 % NaCl, lOmM fosforečnan vápenatý, pH 7,4) bol homogenizovaný pomocou Teflon homogenizéra, centrifugovaný pri 40 000 otáčkach/minútu 20 minút a precipitáty boli pozbierané. K precipitátom bol pridaný 1,5 % cholát sodný, 0,5 % deoxycholát sodný, 0,1 % NaCl a lOmM fosforečnan sodný (pH 7,4), potom boli homogenizované a centrifugované pri 40 000 otáčkach/minútu 20 minút a precipitáty boli opäť zbierané. K precipitátom bol pridaný 10 mM fosforečnan sodný (pH 7,4). Precipitáty boli ďalej homogenizované a centrifugované pri 40000 otáčkach/minútu 20 minút s cieľom získať precipitáty.
Membránový preparát bol premytý v kyseline cholovej uvedeným spôsobom, bol suspendovaný v pufri obsahujúcom povrchové aktívne činidlá, n-nonanoyl-N-metylglukamid (MEGA-9) a dekanoyl-N-metylglukamid (MEGA-10), každý 1 %-ný. Táto suspenzia bola homogenizovaná na ľade, sonikovaná a centrifugovaná pri 40 000 otáčkach/minútu 20 minút s cieľom získať supematant.
Supematant získaný centrifugáciou bol absorbovaný na hydroxyapatitovej kolóne ekvilibrovanej s 1 % MEGA-9, 1 % MEGA-10, 10 % glycerolom a lOmM fosforečnanom sodným (pH 7,4) a frakcionalizovaný vymývaním postupne narastajúcou koncentráciou fosforečnanu sodného (0, 50, 150, 250 a 400 mM). Cytochrómy boli vo frakciách detegované pomocou redukčného mínusového oxidačnodiferenčného spektra. Výsledné boli cytochrómy c a b detekované vo frakcii eluovanej 50 mM fosforečnanom sodným, cytochrómy c, b a a vo frakcii eluovanej 150 mM fosforečnanom sodným a cytochrómy b a d vo frakcii eluovanej 250 mM fosforečnanom sodným.
Frakcia eluovaná 250 mM fosforečnanom sodným bola dialyzovaná proti 10 % glycerolu a 10 mM fosforečnanu sodnému (pH 7,4), potom absorbovaná DEAE-Toyopearl (Tohso) kolónou ekvilibrovanou rovnakým pufrom a frakcionalizovaná vymývaním postupne sa zvyšujúcou koncentráciou NaCl (0, 80, 100, 120, 140 a 300 mM). Cytochrómy boli vo frakciách detegované pomocou redukčného mínusového oxidačno-diferenčného spektra. Výsledné boli cytochrómy b a d detegované vo frakcii eluovanej 120 mM NaCl. Táto frakcia bola použitá ako preparát cytochrómu bd typu chinoloxidázového enzýmu.
Enzýmový preparát bol podrobený SDS-polyakrylamidovej gélovej elektroforéze v 13,5 % géli a blotovaný na PVDF membránu. Časti membrány korešpondujúce s podjednotkou I a podjednotkou II boli podrobené aminokyselinovej sekvenčnej analýze ne zistenie N-terminálnych aminokyselinových sekvencií. Aminokyselinové sekvencie sú zobrazené v SEQ ID NO: 5 (podjednotka I) a SEQ ID NO: 6 (podjednotka 11).
Príklad 2
Izolácia cytochrómu bd typu chinoloxidázového génu Brevibacterium lactofermentum
Skríning chromozomálnej DNA knižnice B. lactofermentum na klony, obsahujúce cytochróm bd typ chinoloxidázový gén bol uskutočnený kolónovou hybridizáciou.
Na základe uvedených čiastočných aminokyselinových sekvencií cytochrómu bd typu chinoloxidázy B. flavum boli syntetizované dva typy oligonukleotidov. Jeden bol pripravený na základe N-terminálnej aminokyselinovej sekvencie podjednotky I cytochrómu bd typu chinoloxidázy (bbdl: SEQ ID NO: 7) a druhý bol pripravený na základe N-terminálnej aminokyselinovej sekvencie podjednotky II (bbd2: SEQ ID NO: 8).
PCR bola uskutočnená pomocou uvedených primárov bbdl a bbd2 a chromozomálnej DNA kmeňa ATCC 14067 ako templátu. Čo sa týka podmienok reakcie po denaturácii pri 94 °C/1 minútu, cyklus zahrňoval denaturáciu pri 95 °C/45 sekúnd, annealing pri 50 °C/60 sekúnd a polymerizáciu pri 62 °C/90 sekúnd a opakoval sa 35-krát. Výsledkom boli fragmenty s dĺžkou 1500 bp, 800 bp a 100 bp. Na základe molekulovej hmotnosti podjednotky I, ktorá má 56,4 kD a bola určená z purifikovaného proteínu a na základe publikovaných molekulových hmotností podjednotiek I cytochrómu bd typu chinoloxidáz iných baktérii bol fragment s dĺžkou 1500 bp pokladaný za požadovaný PCR produkt. Preto bol PCR produkt elektroforeticky separovaný v 2 % agarózovom géli a časť s veľkosťou okolo 1,5 kbp fragmentu bola vyrezaná z gélu s cieľom extrakcie DNA.
Tento DNA fragment bol tupo zakončený pomocou DNA Blunting kitu (Takara Shuzo) a ligovaný do pUCl 18 vektora štiepeného Srna I a opracovaného alkalickou fosfatázou pomocou DNA ligačného kitu ver. 2 (Takara Shuzo). E. coli XL-1 Blue kmeň bol transformovaný so získaným rekombinantným primérom.
Plazmid bol pripravený zo získaného transformantu a bola určená inzertovaná nukleotidová sekvencia. Sekvenovanie nukleotidov bolo uskutočnené pomocou floresceínom označeného priméru M4 (Takara Shuzo, SEQ ID NO: 9) ako dopredu smerujúceho priméru a floresceínom označeného priméru RV-MF (Takara Shuzo, SEQ ID NO: 10) ako reverzného priméru podľa protokolu termo fluorescenčné značkovacieho sekvenčného kitu (Amersham Life Science). Bolo potvrdené, že cytochróm bd typ chinoloxidázový gén bol prítomný v plazmide, čo sa zistilo na základe homológie s primérom. Tento parciálny kloň bol označený ako BD1.
Tento BD1 bol PCR amplifikovaný pomocou hore uvedených primárov M4 a RV-M a sonda označená DIG (digoxigenínom) bola pripravená použitím DIG DNA značkovacieho kitu (Boehringer Mannheim).
Chromozomálna DNA knižnica B. lactofermentum bola skrínovaná uvedenou sondou. Knižnica bola získaná čiastočným štiepením chromozomálnej DNA B. lactofermentum ATCC 13869 s Sau3Al, inzertovaním produktov do BamHI miesta plazmidu pUC18 a transformáciou E. coli XL-1 Blue so získaným rekombinantným plazmidom. Kolónová hybridizácia bola uskutočnená na kolóniách transformantov pomocou DIG značenej sondy uvedenej v texte. Detekcia sondy bola uskutočnená pomocou DIG detekčného kitu (Boehringer Mannheim), ktorý používa anti-DIG protilátku značenú alkalickou fosfatázou.
Plazmid bol pripravený z pozitívnych hybridizačných kolónií, štiepený EcoRl a PstI a podrobený Southemovmu blotingu pomocou BD1 ako sondy. Výsledkom boli dva pozitívne klony. Inzertované fragmenty týchto pozitívnych klonov boli označené BD21 a BD31. BD21 má okolo 3,8 kbp a BD31 má okolo 9,0 kbp. Tieto klony boli subklonované a bola určená ich nukleotidová sekvencia. Výsledok je zobrazený v SEQ ID NO: 1. Očakávaná kódujúca oblasť, ktorá kóduje aminokyselinové sekvencie proteínov je zobrazená v SEQ ID NOS: 1 až 4.
Zoznam sekvencií <110> Ajinomoto Co., Inc.
< 12 □>; Cytochróm bd typu chinaloxicázy 3revibactenum lactofermentum <130> 0P852 <140>
<141>
<150> JP 10-164019 <151> 1998-06-11 <160> 10 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <2115 3936 <212> DNA <213) Brevibacterium lactofernentum <220>
<221) CDS <222> (933)..(2483) <400> 1
ggatcctctc tgttcaaaao agcacctact cttttactcc cgagttccga cgtgccctcg 60
acgaaagcct agaagtgacg gaccgagatg aggctgctca gaattttaag tttcacgtcc 120
aagacatcat cgaaactggg ttgtttatcg ccagaaataa tggattctgg caaggaaacc 180
tcgtcgttgg cgaaagatat tcccgacgag atgtctgccg aactctcaac tgggaacgaa 240
acaatgagag cacgatttat ggttacaaag tggacagcta cacatcgacg tgcccaatct 300
ttgtgaccta tcacaaggcc gatgatgtat ccgaagtact cgtcaccagg atgaactcgt 360
egatccgaat acccttcatc ggtattcccg cggcaaccga aagatcacgt ctaatgagat 420
caagcccatc gctgcgaatg tgtggatctt catgtttttg tgaagaagga cgatgccgaa 480
ggccttgatt cctcctacct tggtcaagcg cattcagaaa acagcaaaca gtcatcgatg 540
cccggaaaca aaggagttgt gcaaccggtg gtcacaatgg atctacagtt cgacacaccc 600
gtcgaacaaa gcctgtttga gtacctgagc acaaatctcg ccgtaacgga gtaaccaccg 650
caaccaagcg tcgaaaagea aaatcttttc gagtttttgg tgacttgtca acaagggggg 720
agcaaaatca gtcattgaca gggaaaggtt gaccacaatc SíSgttagcc tttctaaagt 780
taagctgtga gcgggaactt aggaataaac ttcaacgaca acctttaaga agetettatt 840
ggttcttcgt tttgtatcga taaatacaat cggtttcctg gctcaataag gctgttcctg 900
tcaatctgta aagaagagga aggggaccta gc gtg gat gtc gtt gac ; atc gcg 953
Val Asp I Val Val Asp c i íle Ala i
cgg tgg caa ttc gga acc acc acc gtc tat cac ttc att tct . gtc cca 1001
Arg Trp Gin Phe Gly íle Thr Thr Val Tyr His Phe íle Phe ; Val Pro
10 15 20
ctg acc att ggc tta gca ccg ctg gtc gcg atc atg caa acg ttt tgg 1049
Leu Thr Iii j Gly Leu Ala Pro Leu Val Ala íle Met Gin Thr • Phe Trp
25 30 35
caa gtt acc ggc aaa gag cac tgg tat cgg get acg aga ttt ttt ggc 1097
Gin Val Thr Gly Lys Glu His Trp Tyr Arg Ala Thr Arg Phe Phe Gly
•50 gtg
ccc atc tcc gcg gta gca acg ggc acc acc gtg ctg aac
acg aac
tcg cgi tcc
gaa tat cag ttc
ttc ggc
1241 acc gcg ttc get tcg :CC gag ggg
100
1289
10S
att cct gga tgg ctg cat act gcg tcc att, tgg atc gtt get act gcg
íle 1 Pro Gly ' Trp Leu His Thr Ala Ser íle Trp íle Val Ala íle Ala
120 125 130 135
acg aat att tet gcc tat ttc atc atc gtg gcc aac tcg ttt atg cag
Thr Asn íle Ser Ala Tyr Phe íle íle Val Ala Asn Ser Phe Met Gin
140 145 L50
cat ccg gtg ggt get gag tat aac cct gag act ggt cgg gcg gag ctt
His Pro Val Cly Ala Glu Tyr Asn Pro Glu Thr Gly Arg Ala Glu Leu
155 160 165
act gat ttc tgg get ctt ctc aca aac tcc acc gcg ctg get gcg ttc
Thr Asp Phe Trp Ala Leu Leu Thr Asn Ser Thr Ala Leu Ala Ala Phe
170 175 180
ccg cat get get gcc ggt ggt ttt tta aca get gga acc ccc gcc ctc
Pro His Ala Val Ala Gly Gly Phe Leu Thr Ala Gly Thr Phe Val Leu
185 190 195
gga att tcg ggt tgg tgg att att cgt gcg cac ege cag gcg aag aag
Giy íle Ser Glv Trp Trp íle íle Arg Ala His Arg Gin Ala Lys Lys
200 205 210 215
get gag gcg gaa atc gag tcg aag cat tca atg cac agg ccg gcg ttg
Ala Glu Ala Glu íle Glu Ser Lys His Ser Met His Arg Pro Ala Leu
220 225 230
tgg gtt ggt tgg tgg acc aca gtt gtc tet tcc gtg gca ctg ttc atc
Trp Val Gly Trp Trp Thr Thr val Val Ser Ser Val Ala Leu Phe íle
235 240 245
act ggc gat aca cag gcg aag ccc atg ttc gtg cag cag ccg atg aag
Thr Gly Asp Thr Gin Ala Lys Leu Met Phe Val Gin Gin Pro Met Lys
2S0 255 260
atg gcg tcg gcg gaa tcc ttg tgt gaa acc gcc aca gat cca aac ttc
Met Ala Ser Ala Glu Ser Leu Cys Glu Thr, Ala Thr Asp Pro Asn Phe
265 270 275
tcc att ctg aca att ggt acg cac aac aac tgc gat acg gta acc cac
Ser íle Leu Thr ILe Gly Thr His Asn Asn Cys Asp Thr Val Thr His
280 285 290 29ô
ctg atc gat gtt ccg ttt gtg ctt cca ttc ttg get gaa gga aaa ttc
Leu íle Asp Val Pro Phe Val Leu Pro Phe Leu Ala Glu Gly Lys Phe
300 305 310
acc ggt gtg act ttg cag ggc gta aac cag ctc caa get gca gcg gag
Thr Gly Val Thr Leu Gin Gly Val Asn GLn Leu Gin Ala Ala Ala Glu
315 320 325
caa gca tac ggt cct ggc aac tac tcc cct aac ttg ttt gtc acc tac
Gin Ala Tyr Cly Pro Gly Asn Tyr Ser Pro Asn Leu Phe Val Thr Tyr
330 335 340
1337
1433
1481
1625
1673
1721
1769
1817
1961
tgg tca ttc ege Phe Arg gca atg atc ggc cta atg ctt ggt tet ttg get atc 2009
Trp Ser 345 Ala Met íle 350 Gly Leu Met Leu Gly Ser 355 Leu Ala íle
get gcg att gcg tgg ctg ttg ctg cgt aag aag ege aca cca act gga 2057
Ala Ala íle Ala Trp Leu Leu Leu Arg Lys Lys Arg Thr Pro Thr Gly
360 365 370 375
aag att get cgt ctc ttc caa atc ggc age ctc att gcc att cca ttc 2105
Lys Íle Ala Arg Leu Phe Gin íle Gly Ser Leu Íle Ala íle Pro Phe
380 385 390
cca ttc ttg get aac tet get ggt tgg atc ttc acc gag atg ggc ege 2153
Pro Phe Leu Ala Asn Ser Ala Gly Trp íle Phe Thr Glu Met Gly Arg
395 400 405
cag cct tgg gtg gta cac ccg aat cct gaa tet gcc ggc gat gcc ega 2201
Gin Pro Trp Val Val His Pro Asn Pro Glu Ser Ala Gly Asp Ala Arg
410 415 420
aca gag atg atc cgg atg act gtt gat atg ggt gtg tet gat cat gcg 2249
Thr Glu Met íle Arg Met Thr Val Asp Het Gly Val Ser Asp His Ala
425 430 435
ccg tgg caa gtc tgg ctg act cta att ggc ttc acg att ctc tat ctc 2297
Pro Trp Gin Val Trp Leu Thr Leu íle Gly Phe Thr íle Leu Tyr Leu
440 445 450 455
atc ttg ttc gtg gtg tgg gtg tgg ctg att ege ege gca gtt ctg are 2345
íle Leu Phe Val Val Trp Val Trp Leu íle Arg Arg Ala Val Leu íle
460 465 470
gga cca cca gag gaa ggc get cca tcc gtg gag gca aag act gga ccg 2393
Gly Pro Pro Glu Glu Hy Ala Pro Ser Val Glu Ala Lys Thr Gly Pro
475 480 485
gca acc ccg att ggt tca gat atg ccc atg aca ccg ctg caa ttt acc 2441
Ala Thr Pro íle Gly Ser Asp Met Pro Met Thr Pro Leu GLn Phe Thr
490 495 500
gtg ccg ccc caa cca cac gtg aaa agg aat aac cat gga tet 2483
Val Pro Pro Gin Pro His Val Lys Arg Asn Asn His tlr Ser
505 510 515
taataccttt tggtttattc teategeatt tttgtttgcg ggaiactitc ccctcgaagg 2543
attcgacttc ggtgtcggaa tttcagcgcc gatcatcggt aaagattccg ccgctaaaaa 2603
cacgatcatc cgcaccatcg gccctgtctg ggacggaaat gaagtgtggc tgatcgtggc 2653
aggtggcgct ttgtttgctg cattccctga gtggtacgca acgatgttct ccggaatgta 2723
tctgccgctg ttcctcgtgc ttgtgtcgtt gatcatgcgc gtggtgggcc ttgaatggcg 2783
caagaaagtc gatgatcctc gttggcaaaa gtggtctgac cgggccatct ttattggttc 2843
ttggactcca ccgctgatgt ggggattcai cttcgccaat atttccaagc ttgcatgccc 2903
atcaaggcgg atcacaccat cgatgctgca gtggctctgc tgtgcaatgt tcaacgtctt 2963
cgccatcctg ggtgcacttg cattcactgc gccgttcgct cttcatggcc ttgcattcat 3023
ccgcctgaaa actgctggtc gggtgcgcac cgatgcggcg aaggcagctc cagtagtcgc 3083
acttcttgct gcggtgacCg gcggaccttt cgtgttgtgg gctgccatcg catacggccg 3143
ttcctggtcc tggatcctcg cagtgctgat catcgcagcg gttctcggtg gagetttege 3203
actgatcaaa gaccgcgacg gattaagctt cctgtccact tccgtcgctg tcatcggtgt 3263
agttgcactg ctgtttagtt ccctattccc caacgtcatg ccaacaacgc tcgccgatgg 3323
cgtgactgga catttggaac gcctccgcaa gccactacgc attgaccatc ctgacttgga 3383
ccgccactgt gatcgcaccg ctggtcgtcc cc taccaagg ctggacccae tgggcgttcc 3443 Phe Val Gin Gin Pro Met Lys Met Ala Ser Ala Glu Ser Leu Cys Glu
260 265 270
gcaaacgact tcacgccgag ccagtgtctg cctaaaagtt ggaaaaattg agtactaaat 3503
Thr Ala Thr Asp Pro Asn Phe Ser íle Leu Thr íle Gly Thr His Asn
ctgacgctcc ggctagtcgc cgcacaggcc ccgtcgatcc gcggcctttg cgcctatccc 3563 275 280 285
ctgctacccg ccgtcgggtg ataatcgcag gtgttctcac cgcgttgaaa actctcgcga 3623 Asn Cys Asp Thr Val Thr His Leu íle Asp Val Pro Phe Val Leu Pro
290 295 300
cagtcgcaat gggcctgctc atcggccaga tggcagcggg catcattgag gttcegggaa 3683
Phe Leu Ala Glu Gly Lys Phe Thr Gly Val Thr Leu Gin Gly Val Asn
gttctctgcc ccgaatggaa ctcatcgcgc tcgccatcac ggtggttgtg cgcggacttc 3743 305 310 315 320
ttgcgtgggc acaggatcgg ttcggagcgc gcatcgtccc aggtgactgt ggatcttcgg 3803 Gin Leu Gin Ala Ala Ala Glu Gin Ala Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Ser
325 330 335
gagaaaaccc tgcggcacct ggcacaaagc gatccccgca ccatcgatca agccttgtgg 3853
Pro Asn Leu Phe Val Thr Tyr Trp Ser Phe Arg Ala Met íle Gly Leu
cgcacccgtt tgacctctgg ccttgatggt ttggggcctt acctcaccgg atttttgccg uyzj
340 345 350
cactggccgc cac 3936
Met Leu Gly Ser Leu Ala íle Ala Ala íle Ala Trp Leu Leu Leu Arg
355 360 365
<210 2
<2U> 517 Lys Lys Arg Thr Pro Thr Gly Lys íle Ala Arg Leu Phe Gin Ue Gly
<212> PRT 370 375 380
<213> Brevibacterium lactofermentum
Ser Leu íle Ala íle Pro Phe Pro Phe Leu Ala Asn Ser Ala Gly Trp
<400> 2 385 390 395 400
Val Asp Val Val Asp íle Ala Arg Trp Gin Phe Gly íle Thr Thr Val
1 5 10 15
íle Phe Thr Glu Met Gly Arg Glr. Pro Trp Val Val His Pro Asn Pro
405 410 415
Tyr Hís Phe íle Phe Val Pro Leu Thr íle Gly Leu Ala Pro Leu Val
20 25 30
Glu Ser Ala Gly Asp Ala Arg Thr Glu Met íle Arg Met Thr Val Asp
Ala íle Met Gin Thr Phe Trp Gin Val Thr Gly Lys Glu Hi s Trp Tyr 42Q 425 430
35 40 45
Met Gly Val Ser Asp His Ala Pro Trp Cln Val Trp Leu Thr Leu íle
Phe Gly Thr Val Leu Leu íle Asn Phe Ala Val
435
440
445
Arg Ala Thr Arg Phe
50 55 60
Gly Val Ala Thr Gly íle Val Gin Glu Phe Gin Phe Ob- Met Asn Trp
65 70 75 80
Ser Glu Tyr Ser Arg Phe Val Gly Asp Val Phe Gly ci y Pro Leu Ala
85 90 95
Leu Glu Gly Leu íle Ala Phe Phe Leu Glu Ser Val Phe Leu Gly Leu
100 105 110
Trp íle Phe Gly Trp Gly Lys íle Pro Gly Trp Leu His Thr Ala Ser
115 120 125
íle Trp íle Val Ala íle Ala Thr Asn íle Ser Ala Tyr Phe íle ILe
130 135 140
Val Ala Asn Ser Phe Met Gin His Pro Val Gly Ala Glu Tyr Asn Pro
145 150 155 160
Glu Thr Gly Arg Ala Glu Leu Thr Asp Phe Trp Ala Leu Leu Thr Asn
163 170 175
Ser Thr Ala Leu Ala Ala Phe Pro His Ala Val Ala Gly Gly Phe Leu
180 185 190
Thr Ala Gly Thr Phe Val Leu Gly íle Ser Gly Trp Trp íle íle Arg
195 200 205
Ala His Arg Gin Ala Lys Lys Ala Clu Ala Glu íle Glu Ser Lys His
210 215 220
Ser Met His Arg Pro Ala Leu Trp Val Gly Trp Trp Thr Thr Val Val
225 230 235 240
Ser Ser Val Ala Leu Phe íle Thr «y Asp Thr Gin Ala L/s Leu Met
245
250
255
Clv íle
465
Val
Met
Phe
Thr
450
Arg Arg
Glu
Ala
Thr
Asn
Asn <2 L0>
<211>
<212>
<2 13>
<22O>
íle
Leu
Tyr
455
Phe
Val
Val
Trp
450
Val
Trp
Leu
Val
Leu íle
Gly Pro
Pro
GLu
Gly
Ala
Pro
Ser
470
475
480
Pro
Lys
Thr
Gly
485
His
515
3936
DNA
Leu
Gin
Phe
500
Gly
Ser
Pro
Thr
Ala Thr
Val Pro
50a
Brevibacterium lactofermentura <221>
<222>
<400>
Pro
490
Pro íle
Gly
Ser
Asp
Met
Pro
495
CDS (2476).. (3498) ggatcctctc acgaaagcct aagacatcat tcgtcgttgg acaatgagag
Gin Pro
His
Val
510 tgttcaaaac agcacctact agaagtgacg gaccgagatg cgaaactggg cgaaagata:
cacgattta:
Lys Arg cttttactcc cgagttccga cgtgccctcg aggctgctcä gaatťttaag ttgtttatcg tcccgaogag ggttacaaag :ttcacgtcc ccagaaataa tggattctgg caaggaaacc atgtctgccg aattctcaat tgggaacgaa tggacagcta cacatcgacg tgcccaatct
120
180
240
300
Ctgtgaccta tcacaaggct gatgatgtat ccgaagtact cgttaccagg atgaactcgt 360 cgatccgaat acccttcatt ggtattcccg cggcaaccga aagatcacgt ctaatgagat 420 caagcccatc gctgcgaatg tgtggatctc catgttctcg cgaagaagga cgacgccgaa 480 ggccttgatt tcttctacct tggtcaagcg cattcagaaa acagcaaaca gtcatcgatg 540 cccggaaaca aaggagttgt gcaaccggtg gtcacaatgg atctacagtt cgacacaccc 600 gtcgaacaaa gcctgtttga gtacctgagc acaaatctcg ccgtaacgga gtaaccaccg 660 caaccaagcg tcgaaaagca aaatcttttc gagtttttgg tgacttgtca acaagggggg 720 agcaaaatca gtcattgaca gggaaaggtc gaccacaatc ggggttagcc tttctaaagt 780 taagctgtga gcgggaactt aggaataaac ttcaacgaca acctttaaga agctcttatt 840 ggttcttcgt tttgtatcga taaatacaat cggtttcctg gctcaataag gctgttcctg 900 tcaatctgta aagaagagga aggggaccta gcgtggatgt cgttgacatc gcgcggtggc 960 aattcggaat taccaccgtc tatcacttca tttttgtccc actgaccatt ggcttagcac 1020 cgctggtcgc gatcatgcaa acgtcttggc aagttaccgg caaagagcac tggtatcggg1080 ctacgagatt ttttggcact gxgctgctca tcaacttcgc ggttggtgta gcaacgggca1140 ttgtgcagga gttccagttc ggtatgaact ggtcggaata ttcgcgtttc gtcggtgatg1200 ttttcggcgg accgctggct ttggaggggc tcatcgcgtc cccccttgag tctgtgttct1260 taggtctgtg gattttcgga tgggggaaga ttcctggatg gctgcatact gcgtccattt1320 ggatcgttgc tattgcgacg aatatttctg cctatttcat catcgtggcc aactcgttta1380 tgcagcatcc ggtgggtgct gagtataacc ctgagaccgg tcgggcggag cttactgatt1440 tctgggctct tctcacaaac tccaccgcgc tggctgcgtt cccgcatgct gctgccggcg 1500 gttttttaac agctggaact ttcgtcctcg gaatttcggg ttggtggatt attcgtgcgc 1560 accgccaggc gaagaaggct gaggcggaaa tcgagtcgaa gcattcaatg cacaggccgg 1620 cgctgtgggt tggttggtgg accacagttg tctcttccgt ggcactgttc atcactggcg 1680 atacacaggc gaagctcatg ttcgtgcage agccgatgaa gatggcgtcg gcggaatcct 1740 tgtgtgaaac cgccacagat ccaaacttct ccattctgac aattggtacg cacaacaacc 1800 gcgatacggt aacccacctg atcgacgttc cgtttgtgct tccattcttg gctgaaggaa 1860 aattcaccgg tgtgactttg cagggtgtaa accagctcca agctgcagcg gagcaagcat 1920 acggtcctgg caactactcc cctaacttgt ttgtcaccta ctggtcattc cgcgcaatga 1980 tcggcctaat gcttggttct ttggctatcg ctgcg^ttgc gtggctgttg ctgcgtaaga 2040 agcgcacacc sactggaaag actgctcgtc ccttccaaat cggcagcctc attgccattc 2100 cattcccatt cttggctaac tctgctggtt ggatcttcac cgagatgggc cgccagcct: 2160 gggtggtaca cccgaatcct gaatctgccg gcgatgcccg aacagagatg atccggatga 2220 ctgttgatat gggtgtgtct gaccatgcgc cgtggcaagt ctggctgaci ccaattggct 2280 tcacgattct ctatcicatc ttgttcgtgg tgtgggtgtg gctgattcgc cgcgcagttc 2340 tgatcggacc accagaggaa ggcgctccat ccgtggaggc aaagactgga ccggcaaccc 2400 cgattggttc agatatgccc atgacaccgc tgcaatttac cgtgccgccc caaccacacg 2460 tgaaaaggaa taacc acg gat cic aat acc ttc tgg ttt atc ctc atc gca 2511
Met Asp Leu Asn Thr Phe Trp Phe íle Leu íle Ala
5 10
ctc ttg ttt gcg gga tac ttt i ctc i ctc i gaa gga ttc ( jac i ttc | gg’ 1 gtc 2559
Phe 1 _eu : Phe . Ala i Gly ' Tvr 1 Phe 1 Leu 1 _eu ( Glu Gly Phe .· \sp E ’he Gly 1 /al
15 20 25
gga att tta gcg ccg atc atc ggt aaa gat tcc . gCC i gCC i aaa ; aac i acg 2507
Gly íle Leu Ala Pro íle íle GLy Lys , Asp ! Ser , Ala , Ala 1 Lys . Asn ' Thr
30 35 40
atc atc ege acc atc ggc cct gtc tgg gac i gga aat gaa gtg tgg ctg 2655
íle íle Arg Thr íle Gly Pro Val Trp Asp i Gly . Asn Glu Val ' Trp Leu
45 50 55 60
atc gtg gca ggt ggc get ttg ttt get gca ttc cct gag tgg tac gca 2703
íle Val Ala ciy Gly Ala Leu Phe Ala Ala I Phe Pro Glu Trp Tyr Ala
65 70 75
acg atg ttc tcc gga atg tat ctg ccg ctg ttc ctc gtg ctt gtg tcg 2751
Thr Met Phe Ser Gly Met Tyr Leu Pro Leu, Phe Leu Val Leu Val Ser
80 85 90
tcg atc atg ege gtg gtg ggc ctt gaa tgg ege aag aaa gtc gat gat 2799
Leu íle Met Arg Val Val Gly Leu Glu Trp Arg Lys Lys Val Asp Asp
95 100 105
cct cgt tgg caa aag tgg tet gac cgg gcc atc ttc act ggt cct tgg 2847
Pro Arg Trp Gin Lys Trp Ser Asp Arg Ala íle Phe ILe Gly Ser Trp
110 115 L20
act cca ccg ctg atg tgg gga ttc atc ttc gcc aat att ttc aag ctt 2895
Thr Pro Pro Leu Met Trp Gly Phe íle Phe Ala Asn íle Phe Lys Leu
125 130 135 140
gca tgc cca tca agg cgg atc aca cca tcg atg ccg cag tgg ctc tgc 2943
Ala Cys Pro Ser Arg Arg íle Thr Pro Ser Met Leu Gin Trp Leu Cys
145 150 155
tgt gca atg ttc aac gtc ttc gcc atc ctg ggt gca ctt gca ctc act 2991
Cys Ala Met Phe Asn Val Phe Ala íle Leu Gly Ala Leu Ala Phe Thr
160 16-5 170
gcg ctg ttc get ctt cac ggc ctt gca ttc atc ege ctg aaa acc get 3039
Ala Leu Phe Ala Leu His Gly Leu Ala Phe íle Arg Leu Lys Thr Ala
175 180 185
ggt cgg gtg ege acc gat gcg gcg aag gca get cca gta gcc gca ctt 3087
Gly Arg Val Arg Thr Asp Ala Ala Lys Ala Ala Pro Val Val Ala Leu
190 195 200
ctt get gcg gtg act ggt gga cct ttc gtg ttg tgg get gcc atc gca 3135
Leu Ala Ala Val Thr Gly Gly Pro Phe Val Leu Trp Ala Ala íle Ala
205 210 215 220
tac ggc cgt tcc tgg tcc tgg atc ctc gca gtg ctg atc atc gca gcg 3183
Tyr Cly Arg Ser Trp Ser Trp íle Leu Ala Val Leu íle íle Ala Ala
225 230 235
gtt ctc ggt gga get ttc gca ctg atc aaa gac ege gat gga tta age 3231
Val Leu Gly Gly Ala Phe Ala Leu íle Lys Asp Arg Asp Gly Leu Ser
240 245 250
ttc ctg tcc act tcc gtc get gtc atc ggt gta gtt gca ctg ccg ttt 3279
Phe Leu Ser Thr Ser Val Ala Val íle Gly Val Val Ala . Leu Leu Phe
255 260 265
agt CCC c ta ttc CCC aac gtc atg cca aca acg ctt gcc gat ggc gtg 3327
Ser Ser Leu Phe Pro Asn Val Met Pro Thr Thr Leu Ala . Asp Gly Val
270 275 280
act gga tat ttg gaa ege ctc ege aag cca cca Ggc att . gac cac CCC 3375
Thr Gly Tyr Leu Glu Arg Leu Arg : Lys Pro Leu Arg : Ue i Asp 1 His . Pro
285 290 295 300
gac ttg : gac ege . cac tgt gat . ege : acc get ggt • tgt . cct ; cta i cca i agg 3423
Asp Leu Asp Arg His Cys Asp Arg Thr Ala Gly Cys Pro Leu Pro Arg
305 310 315
ctg gac cta ctg ggt gtt ccg caa acg act cca cgc ega gcc ag*. gtc 3471
Leu Asp Leu Leu Gly Val Pro Gin Thr Thr Ser Arg Arg Ala Ser Val
320 323 330
tgc cla aaa gtt gga aaa ect gag cac taaatctgac gctccggcta 3518
Cys Leu Lys Val Gly Lys íle Glu Tyr
335 340
gtcgccgcac aggecccgtc gatccgeggc gggtgataat cgcaggtgtt ctcaccgcgt tgctcatcgg ccagatggca gcgggcatca tggaactcat cgcgctcgcc atcacggtgg atcggttcgg agcgcgcatc gtcccaggtg cacctggcac aaagcgatcc ccgcaccatc tctggccttg atggtttggg gccttacctc tUtgcgcct atcccctgct acccgccgtt 3578 tgaaaactct cgcgacagcc gcaatgggct 3638 ttgaggtttc gggaagttct ttgccccgaa 3698 ttgtgcgcgg acttcttgcg tgggcacagg 3758 actgtggatc ttcgggagaa aaccctgcgg 3818 gatcaagcct tgtggcgcac ccgtttgacc 3878 accggatttt tgccgcactg gccgocac 3936
Trp Ser Trp Ue Leu Ala Val Leu Ue íle Ala Ala Val Leu Gly Gly
225 230 235 240
Ala Phe Ala Leu Ue Lys Asp Arg Asp Gly Leu Ser Phe Leu Ser Thr
245 250 255
Ser Val Ala Val Ue Gly Val Val Ala Leu Leu Phe Ser Ser Leu Phe
260 265 270
Pro Asn Val Met Pro Thr Thr Leu Ala Asp Gly Val Thr Gly Tyr Leu
275 280 2S5
Glu Arg Leu Arg Lys Pro Leu Arg íle Asp His Pro Asp Leu Asp Arg
290 295 300
His Cys Asp Arg Thr ALa Gly Cys Pro Leu Pro Arg Leu Asp Leu Leu
305 310 315 320
Gly Val Pro Gin Thr Thr Ser Arg Arg Ala. r Ser Val Cys Leu Lys Val
325 330 335
Gly Lys íle Glu Tyr
340 <21O> 4 <211> 341 <212> PRT <213> Brevibaccerium laccofernientuo
C400> 4
Met A· »p Le íu As n Th r PL· » Trp Phe ! íle Leu íle Ala Phe Leu Phe i Ila
1 5 10 15
Gly Ti /r Pl ie Le u Le □ Gl· u Gly Phe • Asp Phe Gly Val Gly íle Leu Ala
2 0 25 30
Pro Ue Ue GU Lys Asp Ser Ala Ala Lys Asn Thr Ue Ue Arg Thr
35 40 45
ILe Gly Pre Val Trp Asp Gly Asn Glu Val Trp Leu íle Val Ala Gly
50 55 60
Gly Ala Leu Phe Ala Ala Phe Pro Glu Trp Tyr Ala Thr Met Phe Ser
65 70 5 80
Gly Met Tyr Leu Pro Leu Phe Leu Val Leu Val Ser Leu íle Met Arg
85 90 95
Val Val Gly Leu Glu Trp Arg Lys Lys Val Asp Asp Pro Arg Trp Gin
100 105 110
Lys Trp Ser Asp Arg Ala íle Phe íle Gly Ser Trp Thr Pro Pro Leu
115 120 125
Met Trp Gly Phe íle Phe Ala Asn íle Phe Lys Leu Ala Cys Pro Ser
130 135 140
Arg Arg Ue Thr Pro Ser Met Leu Gin Trp Leu Cys Cys Ala Met Phe
145 150 155 160
Asn Val Phe Ala íle Leu Gly Ala Leu Ala Phe Thr Ala Leu Phe Ala
165 170 175
Leu His Gly Leu Ala Phe Ue Arg Leu Lys Thr Ala Gly Arg Val Arg
180 185 190
Thr Asp Ala Ala Lys Ala Ala Pro Val Val Ala Leu Leu Ala Ala Val
195 200 205
Thr G’y Gly Pro Phe Val Leu Trp Ala Ala íle Ala Tyr Gly Arg Ser
210 215 220
<210> 5 <2U> L9 <212> PRT <213> Brevibacterium lactofermentum <22O>
C22l> UNSURE <222> (18) <400> 5
Met Asp Val Val Asp íle Ala Arg Trp Gin Phe Gly íle Thr Ala Val 15 10 15
Tyr Xaa Phe <210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> Brevibacterium lactofermentum <22O>
<221> UNSURE <222> (16,17) <400> 6
Met Asp Leu Asn Thr Phe Trp Phe Ue Leu íle Ala Phe Leu Phe Xaa
Xaa Tyr Phe Leu <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22O>
<223) Opis umelej sekvencie: primér pre PCR <22O>
<22L> tnisc_feature <222) (9, 12) <223> n=a or c or g or t <400) 7 atggaygtng tngayatygc 20 <2lO> 8 <21l> 20 <212) ONA <213) Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: primér pre PCR <4OO> 8 caraargtrt tvarrtccat 20 <21O> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22O>
<223> Opis umelej sekvencie: primér pre PCR <400> 9 cgccagggtt ttcccagtca cgac 24 <210> 10 <21l> 24 <212> DNA <213> Umelá sekvencía <22O>
<223> Opis umelej sekvencie: primér pre PCR <400> 10 gagcggataa caatttcaca cagg 24

Claims (9)

1. DNA fragment, kódujúci polypcptid, ktorý je definovaný (A) alebo (B), kde (A) je polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia je zobrazená v SEQ ID NO: 2 sekvenčného zoznamu, (B) je polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia zobrazená v SEQ ID NO: 2 sekvenčného zoznamu zahrňuje substitúciu, deléciu, inzerciu, adíciu alebo inverziu jedného alebo viacerých aminokyselinových zvyškov v aminokyselinovcj sekvencii a ktorá môže vytvoriť proteín, vykazujúci aktivitu cytochrómu bd typu chinoloxidázy spolu s podjednotkou II cytochrómu bd typu chinoloxidázy, ktorej aminokyselinová sekvencia je zobrazená v SEQ ID NO: 4.
2. DNA fragment, kódujúci polypeptid, ktorý je definovaný (C) alebo (D), kde (C) je polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia je zobrazená v SEQ ID NO: 4 sekvenčného zoznamu, (D) je polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia zobrazená v SEQ ID NO: 4 sekvenčného zoznamu zahrnuje substitúciu, deléciu, inzerciu, adíciu alebo inverziu jedného alebo viacerých aminokyselinových zvyškov v aminokyselinovej sekvencii a ktorá môže vytvoriť proteín, vykazujúci aktivitu cytochrómu bd typu chinoloxidázy spolu s podjednotkou I cytochrómu bd typu chinoloxidázy, ktorej aminokyselinová sekvencia je zobrazená v SEQ ID NO: 2.
3. DNA fragment, kódujúci polypeptid, ktorý je definovaný (A) alebo (B) a (C) alebo (D), kde (A) je polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia je zobrazená v SEQ ID NO: 2 sekvenčného zoznamu, (B) je polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia zobrazená v SEQ ID NO: 2 sekvenčného zoznamu zahrnuje substitúciu, deléciu, inzerciu, adíciu alebo inverziu jedného alebo viacerých aminokyselinových zvyškov v aminokyselinovej sekvencii a ktorá môže vytvoriť proteín, vykazujúci aktivitu cytochrómu bd typu chinoloxidázy spolu s podjednotkou II cytochrómu bd typu chinoloxidázy, ktorej aminokyselinová sekvencia je zobrazená v SEQ ID NO: 4, (C) je polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia je zobrazená v SEQ ID NO: 4 sekvenčného zoznamu, (D) je polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia zobrazená v SEQ ID NO: 4 sekvenčného zoznamu zahrnuje substitúciu, deléciu, inzerciu, adíciu alebo inverziu jedného alebo viacerých aminokyselinových zvyškov v aminokyselinovej sekvencii a ktorá môže vytvoriť proteín, vykazujúci aktivitu cytochrómu bd typu chinoloxidázy spolu s podjednotkou I cytochrómu bd typu chinoloxidázy, ktorej aminokyselinová sekvencia je zobrazená v SEQ ID NO: 2.
4. DNA podľa nároku 1, ktorá je definovaná (a) alebo (b), kde (a) je DNA, ktorá má nukleotidovú sekvenciu korešpondujúcu s nukleotidovými číslami 933 až 2483 v nukleotidovej sekvencii zobrazenej v SEQ ID NO: 1 sekvenčného zoznamu; alebo (b) je DNA, ktorá je schopná hybridizovať s nukleotidovou sckvenciou (a) za prísnych podmienok a ktorá kóduje polypeptid schopný vytvoriť proteín, vykazujúci aktivitu cytochrómu bd typu chinoloxidázy spolu s podjednotkou II cytochrómu bd typu chinoloxidázy, ktorej aminokyselinová sekvencia je zobrazená v SEQ ID NO: 4.
5. DNA podľa nároku 2, ktorá je definovaná (c) alebo (d), kde (c) je DNA, ktorej nukleotidová sekvencia korešponduje nukleotidovým číslam 2476 až 3498 v nukleotidovej sekvencii zobrazenej v SEQ ID NO: 3 sekvenčného zoznamu; alebo (d) je DNA, ktorá je schopná hybridizovať s nukleotidovou sekvenciou (c) za prísnych podmienok a ktorá kóduje polypeptid schopný vytvoriť proteín, vykazujúci aktivitu cytochrómu bd typu chinoloxidázy spolu s podjednotkou I cytochrómu bd typu chinoloxidázy, ktorej aminokyselinová sekvencia je zobrazená v SEQ ID NO: 2.
6. DNA podľa nároku 3, ktorá je definovaná (a) alebo (b) a (c) alebo (d), kde (a) je DNA, ktorej nukleotidová sekvencia korešponduje s nukleotidovými číslami 933 až 2483 v nukleotidovej sekvencii zobrazenej v SEQ ID NO: 1 sekvenčného zoznamu; alebo (b) je DNA, ktorá je schopná hybridizovať s nukleotidovou sekvenciou (a) za prísnych podmienok a ktorá kóduje polypeptid schopný vytvoriť proteín, vykazujúci aktivitu cytochrómu bd typu chinoloxidázy spolu s podjednotkou II cytochrómu bd typu chinoloxidázy, ktorej aminokyselinová sekvencia je zobrazená v SEQ ID NO: 4; a (c) je DNA, ktorej nukleotidová sekvencia korešponduje s nukleotidovými číslami 2476 až 3498 v nukleotidovej sekvencii zobrazenej v SEQ ID NO: 3 sekvenčného zoznamu; alebo (d) je DNA, ktorá je schopná hybridizovať s nukleotidovou sekvenciou (c) za prísnych podmienok a ktorá kóduje polypeptid schopný vytvoriť proteín, vykazujúci aktivitu cytochrómu bd typu chinoloxidázy spolu s podjednotkou I cytochrómu bd typu chinoloxidázy, ktorej aminokyselinová sekvencia je zobrazená v SEQ ID NO: 2.
7. DNA fragment podľa nároku 1, ktorého nukleotidová sekvencia zahŕňa nukleotidy s nukleotidovými číslami 933 až 2483 v nukleotidovej sekvencií zobrazenej v SEQ ID NO: 1.
8. DNA fragment podľa nároku 2, ktorého nukleotidová sekvencia zahŕňa nukleotidy s nukleotidovými číslami 2476 až 3498 v nukleotidovej sekvencií zobrazenej v SEQ ID NO: 1.
9. DNA fragment nároku 3, ktorého nukleotidová sekvencia zahŕňa nukleotidy s nukleotidovými číslami 933 až 3498 v nukleotidovej sekvencií zobrazenej v SEQ ID NO: 1.
3 výkresy
SK 284945 Β6
3 r J. cydA
8.st cydA
E.co cydA
1;M---OWOIARWQFGITTVYHFIFVPLTIGLAPLVAIMQTFWOVTGKEHWYRATRFFG 55
1:M--IOIVELSRLOFALTAMYHFLFVP|.TLGMAFLLAIMET/YVISGÍ<OIYKDMT:<FWG 56
.....b595 · I
8r.l cydA 56:TVLLINFAVGVATGIVQEFQFGMNWSEY$RFVG0VFGGPLALEGLIAFŕLESVFLGLWIŕ 115
B.st cydA 59:RGFVITVAVGWTGTAIGLQLSLLWPNFMQLAGQVISLPLFMET-FAFFFEAIFLGIYLY 117
E.co cydA 57:KLFGINFALGVATGlTMEFQFGTNWSYYSHYVG0IFGAPLAIEGLMAFŕLES~FVGLF.-F 115
Br.l cydA 116.GWGKI-PGWLHTASIWIVAIATNISAYFIIVANSFMQHPVGAEYNPETGRAELTDFWALL 174
B.st cydA 118;IWORFENQK'KHLLLLIPVAIGSSASAHVYYOGERVYEYAAR--FEĽKNGELVNIOPIVAM 175
E.co cydA 117:GWORl-GKVOFMCVTWLVALGSNLSALWILVANGWMONPlASDFNFETMRMEMVSŕSELV 175 III
Br. 1 cydA 175 :TNSTALAAFPHAVAGGFLTAGTFVLGISGWWIIRAHRQAKKAEAEIE5KHSMHRPALWVG 234
8. st cydA 174:FNPAMPTKVA^VLAT5YMTSAFVLA5IAAWHLWKGNRHIYHRKALHLTMKTAŕIFSVASA 235
E.co cydA 176:LNPVAOVKFVňTVASGYVTGAMFILGISAWYMLKGRDLAFAKRSFAlAASFGMAAVlSVI 235 • · · » ·y b558
Br.l cydA 235:WWTTWSSVALFITGOTQAKLMFVQQPMKMASAESLCETATOPNFSILTIGTHNNCOTV 293
8,st cydA 236:LVGOL............SGKFLAEYQPEKLAAAE--WHF ET 5$ HAP LIIFGT.lEEDNEV. 280
E.co cydA 236:VLGDE............SGYEMGOVQKTKLAAIEAEWETQPAPAAFTLFGIPOQEEETN 282
Br.I cydA 294:THLIOVPFVLPFLAEGKFTGVTLQGVNQLOAAAEQAYGPG-333
B.st cydA 281:&YALEIPYALSRAH-NHPAAVVTGINOI-PEDERPPL316
E.co cydA 283:KFAIQIPYALGIIAT-R5V0TPVIGLKELMVQHEERIRNGHKAYSLLEQLRSG$TDQAVR00.FNS345
Br Λ cydA 334:...............................NYSPNLFVTYWSFRjMIGLMLGSLAIAAI 362
8.st cydA 317:.....................................YIHYL-FO\&TIGVFIMWAAV 338
E.co cydA 347:MKKOLGYGLLLKRYTPNVADATEAOIOOATKDSIPRVAPLYFAFR^VACG-FLLLAIIA 405 ’ ’ ’bôáS VI
Br.l cydA 363:AWLLLRKKRTPľGKlARLFQIGSlIAIPFPFLANSAGWIFTEMGRQPWWHPNPESA 419
B.st cydA 339:YWLGSIFRWK--WTAKNWFFGLI'VAGGPLAMIAIEAGWYIAEVGRQPWILRGYMKTA 393
E.co cydA 4a6:LSFWSVIRNR-IGEKKWLLRAALYGIPLPYIIAVEAGWPVAEYGR0PWAIGeVLPTA 450
8r.l cydA 420:GOARTEMIRMTVDMGVSOHAPWQVWLTLIGFTIIYLILFWWWLIRRAVLIGPPEEGAP 479
B.st cydA 394.;EGATTSAHVOTML-VL-FCLLYIVLVIASATVLIRMFRRNP-VERELEERANRGEVAP 44g
E.co cydA 461:VANSSLTAG0LIF5MVLICGLYTLFLVAELFLMFKFARLG?SSLKTGRYHFE0SSm0P 520 VII
Br.l cydA 480:SVEAKTGPATPIGSOMPMTPLQFTVPPQPHVKRNNHCS 517
B.st cydA
E.co cydA 521:AR 522
Obr. 2
Br.I cyd8 1:M.....DLNTFWFILIAFLFAGYFLLEGFDFGVGILAPIIGKDSAAKNTIIRTIGPV 52
B.st cydB
E.CO cydB 1:MIDYEVL-RFIWWLLVGVLLIGFAVTDGFDMGVGMLTRFLGRNOTERRIMINSIAPH 56 * · * j * *
Br. I cydB 53 :WDGNEVWLIVAGGALFAAFPEWYATMFSGMYLPLFLVLVSLIMRWGLEWRKKVDDPRWQ 112
B.st cydB 56:WEVTNVFLVFFFVGIVGFFPKTAYYYGSILLVPASIAIVLLAIRGSYYAFH-TYGETER- 113
E.co cydB 57:WDGNQVWLITAGGALFAAWPMVYAAAFSGFYVAMILVLASLFFRPVGFDYRSKIEETRWR 116 * * * * li · *
Br.I cydB 113;KWSDRAIFIGSWTPPLMWGFIFANIFKLACPSRRITPSMLQWLCCAMFNVFAILGALAFTA173
B.st cydB 114:-NWYLLAYGLTGlFIPA5LSIVLTISE-GGFVE^AA.Gy.AlD.YGKLFA$P.l.SWSWlLSVT172
E.co cydB 117:NMWDWGIFIGSFVPPLVIGVAFGNLLO-GVPFNVDEYLRLYYTGNFFQILNPFGLLAGWS176
IIIIV
Br.l cydB 174:LFALHGLAFIRLKTAGRVRTOAAKAAPWALLAAVTGGPFVLWAAIAYGRSW225
B.st cydB 173:SVLYISAVFLTYYAOAAGDEQARALLRRYALLWSGPTMLSALLIIYQLRYHN224
E.co cydB 177:VGMIIT0GATYL0MRTVGELHLRTRATA(7/AALVTLVCFALAGVWVMYGIDGYWKSTMD 236
V
Br.l cydB 226:......----------------------SWILAVLIIAAVLGGAFALIKOROGLSFLS 255
B. st cydB 225:......................PEHYDNLWNVAWMLVISFLFFVITVWLIGRQRRFGW260
E.co cyd8 237:HYAASNPLNKEVVREAGAWIVNFNNTPILWAIPALGWLPILTILTARMDKAAWAFVF 294 *VI
Br.l cydB 256:TSVAVIGVVAILFSSLFPNVMPTTLADGVTGYLERLRKPLRIDHPDLORHCDRTAGCPLP 315
B.st cydB 261:AFIALLFQYAFAFYAYGISHYPYLLYPY-LTIYDGFTNETMAMALIVAFIAGLLLLIP- 317
E.co cydB 295:5SLTLACIILTAGIAMFPFVMPS5ŤWNASLTMWDATSSQLTLNVMWAWLVPIILLY 354
VII *VIII
Br.l cydB 316:RLOLLGVPQTTSRRASVCLKVGKIEY 341
B.st cydB 318.-SLYLLMRLFLFNKAYVKGKWEGGKG 342
E.co cydB 355:TAWCYWKMFGRITKEDIERNTHSLY 379
Obr. 3
Koniec dokumentu
SK771-99A 1998-06-11 1999-06-09 DNA kódujúca chinoloxidázu cytochrómu typu bd z Brevibacterium lactofermentum SK284945B6 (sk)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP10164019A JPH11346776A (ja) 1998-06-11 1998-06-11 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼ遺伝子

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK77199A3 SK77199A3 (en) 2000-05-16
SK284945B6 true SK284945B6 (sk) 2006-03-02

Family

ID=15785252

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK771-99A SK284945B6 (sk) 1998-06-11 1999-06-09 DNA kódujúca chinoloxidázu cytochrómu typu bd z Brevibacterium lactofermentum

Country Status (13)

Country Link
US (1) US6156886A (sk)
EP (1) EP0967282B1 (sk)
JP (1) JPH11346776A (sk)
KR (1) KR100629091B1 (sk)
CN (1) CN1160459C (sk)
AU (1) AU749069B2 (sk)
BR (1) BR9902248A (sk)
DE (1) DE69926691T2 (sk)
ID (1) ID22875A (sk)
MY (1) MY114645A (sk)
PE (1) PE20000759A1 (sk)
PL (1) PL195017B1 (sk)
SK (1) SK284945B6 (sk)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11346776A (ja) * 1998-06-11 1999-12-21 Ajinomoto Co Inc ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼ遺伝子
JP4380029B2 (ja) * 2000-07-05 2009-12-09 味の素株式会社 微生物を利用した物質の製造法
JP2002078490A (ja) * 2000-09-06 2002-03-19 Ajinomoto Co Inc コリネ型細菌の呼吸鎖酵素遺伝子
WO2002022799A2 (de) * 2000-09-14 2002-03-21 Forschungszentrum Jülich GmbH Verfahren zur mikrobiellen herstellung von stoffwechselprodukten, polynukleotide aus coryneformen bakterien sowie deren verwendung
US6977162B2 (en) 2002-03-01 2005-12-20 Ravgen, Inc. Rapid analysis of variations in a genome
US7727720B2 (en) 2002-05-08 2010-06-01 Ravgen, Inc. Methods for detection of genetic disorders
US7442506B2 (en) 2002-05-08 2008-10-28 Ravgen, Inc. Methods for detection of genetic disorders
US7026233B2 (en) * 2003-08-06 2006-04-11 Taiwan Semiconductor Manufacturing Company, Ltd. Method for reducing defects in post passivation interconnect process

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW256842B (sk) * 1991-12-17 1995-09-11 Takeda Pharm Industry Co Ltd
TW293827B (sk) * 1992-04-20 1996-12-21 Takeda Pharm Industry Co Ltd
TW293022B (sk) * 1992-07-27 1996-12-11 Takeda Pharm Industry Co Ltd
DE4411864A1 (de) * 1994-04-08 1995-10-12 Basf Schwarzheide Gmbh Verfahren zur Herstellung von harten bis zähharten Polyurethanschaumstoffen mit erhöhtem Anteil an offenen Zellen und vermindertem Schrumpf
DE4418507A1 (de) * 1994-05-27 1995-11-30 Bayer Ag Verfahren zur Herstellung offenzelliger Polyurethan-Hartschaumstoffe und ihre Verwendung als Isoliermaterial in Paneelen und als Isolierschaumstoffe
DE19545165A1 (de) * 1995-12-04 1997-06-05 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von offenzelligen Polyurethan-Schaumstoffen
US5721284A (en) * 1996-12-20 1998-02-24 The Dow Chemical Company Open-celled rigid polyurethane foam
DE19742013A1 (de) * 1997-09-24 1999-03-25 Basf Ag Offenzellige Hartschaumstoffe auf Isocyanatbasis
JPH11346776A (ja) * 1998-06-11 1999-12-21 Ajinomoto Co Inc ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼ遺伝子

Also Published As

Publication number Publication date
DE69926691D1 (de) 2005-09-22
CN1160459C (zh) 2004-08-04
DE69926691T2 (de) 2006-06-14
MY114645A (en) 2002-11-30
EP0967282A3 (en) 2001-12-05
SK77199A3 (en) 2000-05-16
ID22875A (id) 1999-12-16
KR20000006104A (ko) 2000-01-25
EP0967282A2 (en) 1999-12-29
AU3392699A (en) 1999-12-23
JPH11346776A (ja) 1999-12-21
KR100629091B1 (ko) 2006-09-28
CN1239142A (zh) 1999-12-22
PL195017B1 (pl) 2007-08-31
EP0967282B1 (en) 2005-08-17
AU749069B2 (en) 2002-06-20
PL333692A1 (en) 1999-12-20
PE20000759A1 (es) 2000-08-29
BR9902248A (pt) 2000-05-02
US6156886A (en) 2000-12-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Arias et al. Characterization and modelling of VanT: a novel, membrane‐bound, serine racemase from vancomycin‐resistant Enterococcus gallinarum BM4174
JP4471402B2 (ja) 非調節スレオニンデヒドラターゼを用いて組換え微生物によるｌ−イソロイシンの生成方法
Ignatova et al. Unusual signal peptide directs penicillin amidase from Escherichia coli to the Tat translocation machinery
KR20190034628A (ko) 아데노신 핵염기 편집제 및 그의 용도
Picossi et al. Nitrogen-regulated genes for the metabolism of cyanophycin, a bacterial nitrogen reserve polymer: expression and mutational analysis of two cyanophycin synthetase and cyanophycinase gene clusters in the heterocyst-forming cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120
JP6940690B2 (ja) Ｃａｍｐ受容タンパク質変異体及びそれを用いたｌ−アミノ酸の製造方法
CZ174697A3 (en) Gene encoding lysinedecarboxylase, micro-organism and process for preparing l-lysine
Seo et al. Modulation of oxidative phosphorylation of human kidney 293 cells by transfection with the internal rotenone-insensitive NADH–quinone oxidoreductase (NDI1) gene of Saccharomyces cerevisiae
DK200900060U3 (da) Nukleotidsekvenser fra coryneforme bakterier som koder for proteiner der deltager i L-serinstofskiftet
Kabus et al. Role of cytochrome bd oxidase from Corynebacterium glutamicum in growth and lysine production
JP2020505914A (ja) 新規ポリペプチド及びこれを用いたｉｍｐの生産方法
Eichler et al. The fix Escherichia coli region contains four genes related to carnitine metabolism
Dahm et al. The role of isochorismate hydroxymutase genes entC and menF in enterobactin and menaquinone biosynthesis in Escherichia coli
SK284945B6 (sk) DNA kódujúca chinoloxidázu cytochrómu typu bd z Brevibacterium lactofermentum
CN111485008A (zh) 顺式-5-羟基-l-六氢吡啶甲酸的生物学制备方法
KR20010112232A (ko) 코리네박테리움 글루타미컴 유래의 피루베이트 카르복실라제
KR102303662B1 (ko) 화합물을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 화합물의 생산 방법
JP2003289868A (ja) 酢酸耐性遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法
JP3330670B2 (ja) アルケンモノオキシゲナーゼ、これをコードする遺伝子及び形質転換微生物並びにアルケンのエポキシ化方法
ZA200501158B (en) Nucleotide sequences that encode deregulated phosphoglycerate dehydrogenases of coryneform bacteria and method for producing L-serine
JP2003189863A (ja) アスパラギン酸アミド並びにその誘導体の製造方法
Wang et al. Synthesis of the Caulobacter ferredoxin protein, FdxA, is cell cycle controlled
JP2002078490A (ja) コリネ型細菌の呼吸鎖酵素遺伝子
MXPA99005412A (en) Gene of quinol oxidase of the cytochrome type bd of brevibacterium lactofermen
CN114540262A (zh) 构建产l-缬氨酸的重组微生物的方法及其所用核酸分子和生物材料