PL195017B1 - Gen kodujący oksydazę hydrochinonową typu cytochromu bd z Brevibacterium lactofermentum - Google Patents

Abstract

1. Fragment DNA kodujacy polipeptyd okreslony punktami (A) lub (B) (A) polipeptyd posiadajacy sekwencje aminokwasowa przedstawiona Sek Id Nr 2 w Zestawieniu Sekwencji; (B) polipeptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej Sek Id Nr 2 w Zestawieniu Sekwen- cji obejmujacy podstawienie, delecje, insercje, addycje lub inwersje jednej lub wielu reszt aminokwa- sowych w sekwencji aminokwasowej, i mogacy tworzyc bialko wykazujace aktywnosc oksydazy hy- drochinonowej cytochromu typu bd wraz z podjednostka II oksydazy hydrochinonowej cytochromu typu bd, posiadajacy sekwencje aminokwasowa przedstawiona Sek Id Nr 4. 4. DNA wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze DNA okreslone jest punktem (a) lub (b): (a) DNA o sekwencji nukleotydowej odpowiadajacej nukleotydom od 933 do 2483 w sekwencji nukleotydowej przedstawionej Sek Id Nr 1 w Zestawieniu Sekwencji; (b) DNA zdolny do hybrydyzacji z sekwencja nukleotydowa wedlug (a) w warunkach scislych, który koduje polipeptyd tworzacy bialko wykazujace aktywnosc oksydazy hydrochinonowej cytochro- mu typu bd wraz z podjednostka II oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd posiadajacy sekwencje aminokwasowa przedstawiona Sek Id Nr 4. PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Zakres wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest oksydaza hydrochinonowa cytochromu bd z Brevibacterium lactofermentum i DNA kodującego wymieniony enzym.

Podstawa wynalazku

Większość organizmów uzyskuje energię niezbędną do aktywności życiowej w wyniku oddychania komórkowego. Organizmy wyższe degradują węglowodany, białka i kwasy alifatyczne, do acetylo-CoA poprzez glikolizę i b-oksydację w cytoplazmie, a następnie katabolizują acetylo-CoA w cyklu kwasów trikarboksylowych w mitochondriach. Wytwarzana w tych procesach energia magazynowana jest w postaci siły redukcyjnej NADH i FADH2. Ostatecznie NADH ulega całkowitemu utlenieniu do wody w wyniku transportu elektronów poprzez łańcuch oddechowy zlokalizowany w wewnętrznej błonie mitochondrialnej, z jednoczesnym wytworzeniem gradientu protonowego towarzyszącego utlenianiu, i służącego za źródło energii do syntezy ATP.

Ponieważ bakteryjny łańcuch oddechowy obejmuje zasadniczo różnorodne funkcjonalne kompleksy enzymatyczne, w zależności od gatunku bakterii i warunków ich wzrostu, wydajność uzyskiwanej w wyniku oddychania komórkowego energii może się znacznie wahać. Na przykład Escherichia coli posiada co najmniej dwa rodzaje oksydazy hydrochinonowej, typu bo i bd, oba tworzące ostatnie oksydazy łańcucha oddechowego. Gdy szczep dziki niosący oba typy enzymu, szczep zmutowany niosący tylko typ bo oksydazy i szczep zmutowany niosący tylko typ bd enzymu porównać między sobą pod względem wydajności wzrostu w warunkach hodowli tlenowej, wydajność wzrostu jest najmniejsza w przypadku szczepu zmutowanego niosącego jedynie typ bd oksydazy, i zależy od rodzaju oksydazy tworzącej ostatnie ogniwo łańcucha oddechowego (Lecture Abstract for The Conference of The Society for Bioscience and Bioengineering, Japan 1995, Subject No 357).

Bakterie maczugowate (korynebakterie), takie jak Brevibacterium lactofermentum i Brevibacterium flavum to bakterie tlenowe, Gram-dodatnie wykorzystywane przemysłowo do produkcji aminokwasów. Jakkolwiek oksydazy tworzące ostatnie ogniwo łańcucha oddechowego były intensywnie badane u proteobacterii, filogenetycznie odległych od bakterii maczugowatych, jak również u Bacillus subtilis i u termofilnych bacilli, które choć Gram-dodatnie jak bakterie maczugowate, są od nich filogenetycznie odmienne, nie badano dotychczas dokładnie oddechowego systemu transportu elektronów w bakterii maczugowatych. Zbadanie systemu transportu elektronów tworzącego łańcuch oddechowy bakterii maczugowatych jest istotne, ze względu na możliwość usprawnienia wydajności przemysłowego otrzymywania pożądanych substancji. Ponadto, jeżeli zostaną zidentyfikowane enzymy zaangażowane w oksydacyjny transport elektronów u bakterii maczugowatych, jak również odpowiadające im geny, możliwe będzie na przykład wytworzenie szczepów w zwiększonej wydajności uzyskiwania energii.

Dotychczas donoszono, iż oddychanie komórkowe Brevibacterium lactofermentum sprzężone jest z transportem protonów i że uczestniczą w nim cytochromy a, b i c (Kawahara Y i wsp (1988) Agric Biol Chem, 52 (8), 1979-1983). Z komórek Brevibacterium flavum wyizolowano, oczyszczono i scharakteryzowano również oksydazę hydrochinonową typu bd (Kusumoto, Sone, Sakamoto, „Respiratory chain of amino acid fermenting bacterium, Brevibacterium flavum, and characteristics of its cytochrome bd type menaquinol oxidase, Abstracts of the 23th Symposium of Bioenergy Study Group, 1997). Nie opublikowano jednak żadnych doniesień dotyczących genów kodujących oksydazę hydrochinonową typu bd z bakterii maczugowatych.

Opis wynalazku

Wynalazek opiera się na wyartykułowanym powyżej założeniu i jego celem jest uzyskanie genu kodującego oksydazę hydrochinonową cytochromu bd z bakterii maczugowatej oraz wyjaśnienie jej struktury.

Wynalazcy zaprojektowali oligonukleotydy opierając się na sekwencji aminokwasowej końca N podjednostki I i końca N podjednostki II oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd z Brevibacterium flavum i przeprowadzili reakcję PGR z uzyskanymi oligonukleotydami jako starterami, stosując jako matrycę chromosomalny DNA z Brevibacterium flavum w celu uzyskania DNA amplimeru. Ponadto przeszukali bibliotekę chromosomalnego DNA otrzymaną ze szczepu dzikiego Brevibacterium lactofermentum stosując jako sondę uzyskany fragment PCR, otrzymując w rezultacie gen kodujący oksydazę hydrochinonową cytochromu cd z Brevibacterium lactofermentum.

Wynalazek obejmuje:

1. fragment DNA kodujący polipeptyd określony w podpunktach (A) i (B)

A. polipeptyd o sekwencji aminokwasowej określonej Sek Id Nr 2 w Zestawieniu Sekwencji

PL 195 017 B1

B. polipeptyd o sekwencji aminokwasowejprzedstawionejSek I dNr2w ZestawieniuSekwencji obejmujący onSotswisoid, Sslscję, iooszcję, sSSycję lub iowszoję jdSosj lub wislu zsoet smiookwsoowych w oskwsocji smiookwsoowsj, i mogący twozeyć białko wykseującs sktywoość okoySsey hySzochioooowsj cytochzomu typu bS wzse e eoSjsSoootką II okoySsey hySzochioooowdj cytochzomu bS OooisSsjący oskwsocję smiookwsoową ozesSotswiooą Ssk IS Nz 4.

2. fzsgmsot DNA koSujący eoliesotyS okzsślooy ouoktsm (C) lub (D) ;

C. pelipedtyypekiaSsjąccsekwencjęaminckweseo/aprzedstawioneSek i dNr4 w Zektawieniu Sskwsocji;

D. pelipeprydo sekwencji aminckwesewejprzedstawionejSek I dNr4 w ZektawieniuSekwencji obsjmujący ooSotswisois, Sslscję, iooszcję, sSSycję lub iowszoję jsSosj lub wislu zsoet smiookwsoowych w oskwsocji smiookwsoowsj, i mogący tworzyć bisłko wykseującs sktywoość okoySsey hySzochioooowsj cytochzomu tyou bS wzse e ooSjsSoootką I okoySsey hySzochioooowsj cytochzomu bS OooisSsjący oskwsocję smiookwsoową ozesSotswiooą Ssk IS Nz 2,

3. frz^c^rm^r^t DNA kkolującc poIlpepOyy okreklonc punktem (A) lut) (B), i poIlpepOyy określono Ouoktsm (C) lub (D);

A. polipopryd pekiaSsjąccsekwencjęaminckweseo/aprzedstawione SeS I dNr2 w Zektawieniu Sskwsocji

B. polipopryd o sekwencji aminckweseo/ejprzedstawionejSek I dNr2 w ZektawieniuSekwencji obsjmujący ooSotswisois, Sslscję, iooszcję, sSSycję lub iowszoję jsSosj lub wislu zsoet smiookwsoowych w oskwsocji smiookwsoowsj, i mogący twozeyć bisłko wykseującs sktywoość okoySsey hySzochioooowsj cytochzomu tyou bS wzse e ooSjsSoootką II okoySsey hySzochioooowsj cytochzomu bS OooisSsjący oskwsocję smiookwsoową ozesSotswiooą Ssk IS Nz 4,

C. polipopryd wekiaSsjąccsekwencjęaminckweseo/aprzedstawioneSek I dNr4 w Zektawieniu Sskwsocji

D. polipoprydo sekwencji aminckwesewejprzedstawionejSek I dNr4 w ZektawieniuSekwencji obsjmujący ooSotswisois, Sslscję, iooszcję, sSSycję lub iowszoję jsSosj lub wislu zsoet smiookwsoowych w oskwsocji smiookwsoowsj, i mogący twozeyć bisłko wykseującs sktywoość okoySsey hySzochioooowsj cytochzomu tyou bS wzse e ooSjsSoootką I okoySsey hySzochioooowsj cytochzomu bS OooisSsjący oskwsocję smiookwsoową ozesSotswiooą Ssk IS Nz 2,

4. DNA wsSług 1., któzy jsot DNA okzsślooym osotęoującymi ouoktsmi (s) lub (b):

s. DNA o oskwsocji ouklsotySowsj oSoowisSsjącsj ouklsotySom oS 933 So 2483 w oskwsocji ouklsotySowsj ozesSotswioosj Ssk IS Nz 1 w esotswisoiu Sskwsocji;

b. DNA eSoloy So hybzySyescji e oskwsocją ouklsotySową wsSług (s) w wszuoksch ściołych, i któzy koSujs ooliosotyS twozeący bisłko wykseującs sktywoość okoySsey hySzochioooowsj cytochzomu tyou bS wzse e ooSjsSoootką II okoySsey hySzochioooowsj cytochzomu bS OooisSsjący oskwsocję smiookwsoową ozesSotswiooą Ssk IS Nz 4.

5. DNA wsSług (2), któzy jsot DNA okzsślooym ouoktsmi (c) lub (S):

c. DNA o oskwsocji ouklsotySowsj oSoowisSsjącsj ouklsotySom oS 2476 So 3498 w oskwsocji ouklsotySowsj ozesSotswioosj Ssk IS Nz 3 w esotswisoiu Sskwsocji;

5. DNA eSoloy So hybzySyescji e oskwsocją ouklsotySową wsSług (c) w wszuoksch ściołych, i któzy koSujs ooliosotyS twoizący bisłko wykseującs sktywoość okoySsey hySzochioooowsj cytochzomu tyou bS wzse e ooSjsSoootką I okoySsey hySzochioooowsj cytochzomu bS OooisSsjący oskwsocję smiookwsoową ozesSotswiooą Ssk IS Nz 2.

6. DNA wsSług (3), obsjmujący DNA okzsślooy ouoktsmi (s) lub (b), i DNA okzsślooy ouoktsmi (c) lub (dS:

s. DNA o wekwencji nobIernyyswej oOsewiaSsjąccj nobIernyysm oo 993 do W248 w wekwencji ouklsotySowsj ozesSotswioosj Ssk IS Nz 1 w esotswisoiu Sskwsocji; lub

b. DNA zeSlno do hyb(zysyesji z sekwencją nobIernty:lswą wedłub (a) w werznCtsh ścieo/ch, i któzy koSujs ooliosotyS twozzący bisłko wykseującs sktywoość okoySsey hySzochioooowsj cytochzomu tyou bS wzse e ooSjsSoootką II okoySsey hySzochioooowsj cytochzomu bS OooisSsjący oskwsocję smiookwsoową ezzdSotswiooą Ssk IS Nz 4; i

c. DNA w sekwencji dobIedtyyso/ejdOsewiaSs)ącej dobIedtyysm wo 2247 dS d349 w sekwencji ouklsotySowsj ozesSotswioosj Ssk IS Nz 3 w esotswisoiu Sskwsocji; lub

S. DNA zeSli-o do hyb(zysyesjj z sekwencją nobIncnyyswą wedłub (c) w we)znCtsh ścistycjΊ, i któzy koSujs ooliosotyS twozzący bisłko wykseującs sktywoość okoySsey hySzochioooowsj cdeochzo4

PL 195 017 B1 mu typu bd wraz z podjednostką I oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną Sek Id Nr 2.

7. fragment DNA punktem (1) o sekwencji nukleotydowej obejmującej nukleotydy od

933 do 2483 w sekwencji nukleotydowej przedstawionej Sek Id Nr ),

8. fragme^ DNA określony (2) o sekwencj nukleotydowej obejm^ącej nukleotydy od

2476 do 3498 w sekwencji nukleotydowej przedstawionej Sek Id Nr ),

9. fragmen DNA określony punkkem (3) o sekwencj nukleooydowej ob^jj^m^u^⁽^^j nukleotydy od 933 do 3498 w sekwencji nukleotydowej przedstawionej Sek Id Nr ),

W opisie termin aktywność oksydazy hydrochinonowej cytochromu typu bd oznacza aktywność wykazującą spektrum różnicowej absorbancji oksydoredukcyjnej cytochromu b i cytochromu d, niezbędną do utlenienia zredukowanych związków typu hydrochinonu (chinony) z wykorzystaniem tlenu. Fragment DNA kodujący oksydazę hydrochinonową cytochromu typu bd lub jej podjednostkę oznaczany będzie dalej jako „DNA według wynalazku”.

Krótki opis figur

Figura ) przedstawia wynik badania hydropatii podjednostki I cytochromu typu bd:oksydazy hydrochinonowej. Symbolem „*” oznaczono reszty aminokwasowe wspólne dla wymienionych oksydaz.

Figura 2 przedstawia zestawienie sekwencji aminokwasowych podjednostek I cytochromu typu bd:oksydaz hydrochinonowych z Brevibacterium lactofermentum, Bacillus stearothermophilus i Escherichia coli.

Figura 3 przedstawia sekwencji aminokwasowych podjednostek II cytochromu typu bd:oksydaz hydrochinonowych z Brevibacterium lactofermentum, Bacillus stearothermophilus i Escherichia coli.

Szczegółowy opis wynalazku

Wynalazek zostanie szczegółowo wyjaśniony poniżej.

DNA według wynalazku można uzyskać z chromosomalnego DNA B.lactofermentum w oparciu o znajomość części sekwencji aminokwasowej oksydazy hydrochinonowej:cytochromu typu bd z B.flavum. Konkretnie, prowadzi się reakcję PCR z oligonukleotydowymi starterami zsyntezowanymi w oparciu o znaną sekwencją aminokwasową enzymu i chromosomalnym DNA B.flavum jako matrycą w celu uzyskania częściowej sekwncji genu oksydazy hydrochinonowej:cytochromu bd z B.flavum. Następnie można uzyskać gen oksydazy hydrochinonowej:cytochromu bd z B.lactofermentum przeglądając bibliotekę chromosomalnego DNA wykorzystując otrzymaną częściową sekwencję genu jako sondę molekularną.

Chromosomalny DNA z B.flavum i B.lactofermentum można uzyskać na przykład metodą Saito i Miury (Bioch Bioph Acta 72, 6)9, )963) i metodą Kirbiego (Biochem J 64, 405, )956). Bibliotekę chromosomalnego DNA można uzyskać poprzez częściowe strawienie chromosomalnego DNA użytecznym enzymem restrykcyjnym, ligację otrzymanych fragmentów DNA z DNA wektora replikującego się autonomicznie w komórkach E.coli w celu przygotowania zrekombinowanego DNA, i wprowadzenie uzyskanego zrekombinowanego DNA do komórek E.coli. Rodzaj wektora nie jest ograniczony w szczególny sposób, o ile jest to wektor używany zwyczajowo do klonowania DNA, i stosować można plazmidy takie, jak wektory plazmidowe: pUC) 9, pUC)8, pUC)) 8 i pUC))9, wektory fagowe, takie jak DNA faga lambda i podobne.

Starter wykorzystywany do reakcji PGR może być na przykład oligonukleotydem o sekwencji przedstawionej Sek Id Nr 7 lub Sek Id Nr 8. W celu potwierdzenia, że uzyskany produkt PGR ma pożądaną sekwencję, można potwierdzić poprzez sekwencjonowanie, stwierdzając iż posiada sekwencję odpowiadającą sekwencji startera lub stwierdzając iż wyprowadzona sekwencja aminokwasowa obejmuje częściową sekwencję aminokwasowa oksydazy hydrochiononowej cytochromu bd z B.flavum.

Przeszukiwanie biblioteki chromosomalnego DNA z B.lectofermentum z wykorzystaniem jako sondy molekularnej fragmentu DNA uzyskanego w reakcji PCR można prowadzić techniką hybrydyzacji kolonijnej, gdy jako wektor do przygotowania biblioteki stosowano wektor plazmidowy, lub techniką hybrydyzacji łysinkowej, gdy jako wektor do przygotowania biblioteki stosowano wektor fagowy. Specyficzność klonów hybrydyzujących z sondą można potwierdzić poprzez sekwencjonowanie DNA wyizolowanego z klony, w celu potwierdzenia, że klony te zawierają sekwencję genu oksydazy hydrochinonoiwej cytochromu bd. Możliwe jest również przeprowadzenie wstępnej hybrydyzacji typu Southerna z klonami pozytywnymi.

Sekwencja nukleotydowa oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd z B.lactofermentum szczep ATC )3869 uzyskana w sposób podany w przykładzie przedstawiona jest Sek Id Nr ). Przewidywane regiony kodujące i wyprowadzona sekwencja aminokwasowa białka przedstawiona jest Sek

PL 195 017 B1

Id Nr 1-4. Oszacowanie regionów kodujących oraz struktura operonu i analiza homologii oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd z B.stearothermophilus szczep K1041 i E.coli przeprowadzono wykorzystując program GENETYK, Homology ver. 2.2.2 (Software Devel Ltd).

Gen kodujący oksydazę hydrochinonową cytochromu bd obejmuje dwie otwarte ramki odczytu (cydA i cydB, zapisując od końca 5'), i kodujące odpowiednio podjednostkę I oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd (dalej określaną jako „podjednostka I”) oraz podjednostkę II oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd (dalej określaną jako „podjednostka II”). Określono iż cydA i cydB obejmują odpowiednio 1551 pz i 1023 pz, podjednostka I składa się z 517 reszt aminokwasowych, podjednostka II obejmuje 341 rest aminokwasowych. Sekwencja podobna do promotorowej obecna jest w kierunku 5' od cydA, a w kierunku 5' od cydA i cydB obecna jest sekwencja typu SD, w kierunku 3' od cydB zlokalizowano sekwencję podobną do terminatorowej. Uznano zatem, iż cydA i cydB tworzą łącznie operon cyd.

Choć kodon N-końcowego aminokwasu podjednostki określono jako GTG, a zatem odpowiadającym mu aminokwasem jest Va1 w Zestawieniu Sekwencji, w rzeczywistości jest nim Met. Uznano, że jest to spowodowane rozpoznawaniem kodonu GTG jako kodującego początkową metioninę. Przypadki takie są dobrze znane.

Figury 1 i 2 przedstawiają wyniki badania hydropatii przeprowadzone dla porównania struktury oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd według wynalazku i podjednostki I B.stearothermophilus i E.coli oraz zestawienie sekwencji aminokwasowych. Oznaczenia I-VII przedstawiają regiony helisy transmembranowej i potwierdzono, że w strukturze enzymu istnieje co najmniej siedem helis transmembranowych. Ze struktury rysunku wynika, że są one do siebie podobne. Ponadto region obejmujący miejsce wiązania hydrochinonu (pętla Q) obecny jest pomiędzy helisą V i VI podjednostki I z E.coli, podczas gdy nie istnieje region wykazujący homologię z dalszą częścią pętli Q w cydA B.stearothermophilus podobnym do B.lactofermentum, stąd pętla Q jest skrócona. Uwzględniając tę obserwację można oczekiwać że oksydaza hydrochinonowa cytochromu bd z B.lactofermentum posiada strukturę bardziej przypominającą oksydazę hydrochinonową cytochrom bd z B.stearothermophilus niż oksydazę E.coli. Porównanie sekwencji aminokwasowej podjednostki I wykazało iż enzym B.lactofermentum posiada 24,7% homologii do enzymu B.stearothermophilus i około 38,6% homologii do enzymu E.coli, co pozwala przypuszczać, że podjednostka I jako całość, oksydaza hydrochinonowa cytochromu bd B.lactofermentum posiada strukturę bardziej przypominającą oksydazę hydrochinonową cytochromu bd E.coli niż oksydazę B.stearothermophilus.

Reszty H19, H186 i M393 cydA E.coli i H21, H184 i M326 cydA B.stearothermophilus uznane zostały za reszty istotne funkcjonalnie ze względu na wiązanie hemu b558. Wspomniane reszty aminokwasowe są konserwowane ewolucyjnie również w przypadku cydA B.lactofermentum (pozycje: H18, H185 i M350).

Figura 3 przedstawia zestawienie sekwencji aminokwasowych trzech rodzajów bakteryjnej podjednostki II. Jak w przypadku podjednostki II B.lactofermentum wykazuje około 25,9% homologii do B.stearothermophilus i około 34,8% homologii do E.coli.

DNA według wynalazku jest DNA kodującym podjednostkę I, kodowaną przez nukleotydy przedstawione Sek Id Nr 2, podjednostkę II, kodowaną przez nukleotydy przedstawione Sek Id Nr 4 lub białko oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd obejmujące wspomniane podjednostki I i II. Podjednostka I, podjednostka II lub białko oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd można wytwarzać wprowadzając taki DNA do użytecznego gospodarza, i hodując uzyskanego transformanta, tak by DNA uległo ekspresji. DNA o sekwencji nukleotydowej obejmującej nukleotydy o numerach od 933 do 2483 w sekwencji nukleotydowej przedstawionej Sek Id Nr 1 można określić jako DNA kodujący podjednostkę I; DNA o sekwencji nukleotydowej obejmującej nukleotydy o numerach od 2476 do 3498 można określić jako DNA kodujący podjednostkę II; DNA o sekwencji nukleotydowej obejmującej nukleotydy o numerach od 933 do 3498 można określić jako DNA kodujący obie podjednostki.

Wytworzone białko oksydazy hydrochinonowe : cytochromu bd lub jej podjednostkę można zebrać i oczyścić z pożywki hodowlanej sposobami stosowanymi zwykle w celu oczyszczania białek, takimi jak wysalanie, wytrącanie rozpuszczalnikiem, filtracja żelowa czy chromatografia jonowymienna.

DNA według wynalazku kodujący podjednostkę I może być albo DNA kodującym polipeptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej Sek Id Nr 2, obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję lub inwersję jednego lub wielu aminokwasów w sekwencji aminokwasowej lub polipeptydem tworzącym białko wykazujące aktywność oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd w połączeniu z podjednostką II.

PL 195 017 B1

DNA według wynalazku kodujący podjednostkę II może być albo DNA kodującym polipeptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej Sek Id Nr 2, obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję lub inwersję jednego lub wielu aminokwasów w sekwencji aminokwasowej lub polipeptydem tworzącym białko wykazujące aktywność oksydazy hydrochinonowej:cytochromu bd w połączeniu z podjednostką I.

Ponadto DNA kodujący oksydazę hydrochinonową cytochromu bd zawierający mutacje w podjednostce I, podjednostce II lub obu podjednostkach jest również DNA według wynalazku.

Określenie „w wielu resztach aminokwasowych” oznacza korzystnie 1-40, korzystniej 1-10 reszt aminokwasowych.

DNA kodujący zasadniczo to samo białko, co podjednostka I i/lub podjednostka II, jak przedstawiono to powyżej, można uzyskać na przykład techniką mutagenezy kierunkowej, tak by jedna lub więcej reszt aminokwasowych w konkretnych miejscach uległo podstawieniu, delecji, insercji, addycji lub inwersji. Tak zmodyfikowany DNA można uzyskać standardowymi metodami wprowadzania mutacji. Standardowe metody wprowadzania mutacji obejmują technikę traktowania DNA kodującego podjednostkę I i/lub II na przykład hydroksylaminą, i sposób traktowania bakterii należącej do rodzaju Escherichia niosącej DNA kodujący podjednostkę I i/lub podjednostkę II promieniowaniem ultrafioletowym lub czynnikiem mutagennym, takim jak N-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyna (NTG) i kwasem azotowym, zwykle używanym do mutagenezy.

Podstawienie, delecja, insercja, addycja lub inwersja nukleotydu jak przedstawiono to powyżej obejmuje mutację (mutację lub wariant polimorficzny) występującą naturalnie, na przykład, z powodu indywidualnych różnic lub różnic gatunkowych lub dotyczących rodzaju bakterii maczugowatej posiadającej oksydazę hydrochinonową cytochromu bd.

DNA kodujący białko zasadniczo identyczne z podjednostką I i/lub podjednostką II można uzyskać poprzez ekspresję DNA niosącego wymienione wyżej mutacje, w użytecznej komórce i dalsze określanie aktywności uzyskanego produktu. DNA kodujący białko zasadniczo identyczne z podjednostką I i/lub podjednostką II można uzyskać poprzez izolowanie DNA hybrydyzującego z DNA o sekwencji nukleotydowej na przykład odpowiadającej nukleotydom od 933 do 2483 sekwencji nukleotydowej przedstawionej Sek Id Nr 1 i/lub DNA o sekwencji nukleotydowej na przykład odpowiadającej nukleotydom od 2476 do 3498 sekwencji nukleotydowej przedstawionej Sek Id Nr 3 w Zestawieniu Sekwencji w warunkach ścisłych, i który koduje białko posiadające aktywność podjednostki I i/lub podjednostki II, z DNA kodującego podjednostkę I i/lub podjednostkę II niosącą mutację lub z komórki niosącej wymienione DNA.

„Warunki ścisłe” oznaczają warunki w których tworzona jest tzw. specyficzna hybryda, i nie są tworzone hybrydy niespecyficzne. Trudno wyrazić warunki podając konkretne wartości liczbowe. Jednak, na przykład warunki ścisłe obejmują warunki, w których dwie cząsteczki DNA o stopniu homologii nie mniejszym niż 50% hybrydyzują ze sobą, a cząsteczki DNA o homologii mniejszej niż 50% nie hybrydyzują ze sobą. Inaczej, warunki ścisłe przedstawia przykład warunków, w których cząsteczki DNA hybrydyzują ze sobą w roztworze o stężeniu soli odpowiadającym zwykłym warunkom płukania w technice Southerna, to jest 60°C, 1 x SSC, 0,1% SDS, korzystnie 0,1 x SSC, 0,1% SDS.

Gen hybrydyzujący z sondą w warunkach ścisłych, jak to przedstawiono powyżej, obejmuje geny posiadające kodon stop utworzony w obrębie sekwencji kodującej genu, i geny nie wykazujące aktywności ze względu na mutację centrum aktywnego kodowanego enzymu. Można jednak takie niedogodności łatwo obejść poprzez zligowanie genu z handlowo dostępnym wektorem ekspresyjnym i badanie aktywności eksprymowanej oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd.

Komórka gospodarza dla ekspresji DNA według wynalazku obejmuje na przykład różne rodzaje bakterii włączając w to E.coli, korynebakterie, takie jak B.lactofermentum i B.flavum, komórki eukariotyczne takie jak Saccharomyces cerevisiae i podobne. W celu wprowadzenia DNA według wynalazku do komórki gospodarza, takiej jak wymienione powyżej, można stosować technikę transformacji komórki gospodarza zrekombinowanym wektorem uzyskanym przez wprowadzenie DNA według wynalazku do wektora wybranego w zależności od rodzaju używanej komórki gospodarza, w której dokonuje się ekspresja DNA według wynalazku. Dokonać tego można sposobami inżynierii genetycznej, dobrze znanymi specjalistom.

DNA według wynalazku i oksydaza hydrochinonowa cytochromu bd lub jej podjednostki kodowane przez DNA według wynalazku są ważne w wyjaśnianiu szczegółów oddechowego systemu transportu elektronów w komórkach korynebakterii. Oczekuje się, że DNA według wynalazku będzie

PL 195 017 B1 używane z polepszania jakości bakterii maczugowatych wytwarzających użyteczne substancje z wysoką sprawnością energetyczną.

Najwłaściwszy sposób wykonania wynalazku

Wynalazek wyjaśniony będzie na konkretnych przykładach.

<1> Oczyszczenie oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd z Brevibacterium flavum

Komórki bakteryjne (około 120 g mokrej masy) B.flavum szczepu ATCC 1406 namnożonych do końca fazy stacjonarnej, zawieszono w 200 ml buforu (0,5% NaCl, 10 mM fosforan sodowy, pH 7,4) i natychmiast homogenizowano poprzez mieszanie w homogenizatorze kulkowym (Biospec) na wysokich obrotach w obecności 0,5 mM kuleczek szklanych. Następnie zawiesinę zhomogenizowanych komórek żwirowano przy 5000 rpm przez 10 minut w celu usunięcia nie rozbitych komórek bakteryjnych, a supernatant wirowano przy 15000 rpm przez 10 minut, następnie supernatant wirowano ponowanie przy 15000 przez 30 minut. Precypitaty uzyskane z obu wirowań połączono i zawieszono w buforze o składzie podanym powyżej, w celu uzyskania preparatu błon komórkowych.

Otrzymany tak preparat błon komórkowych (5 mg/ml, 0,5% NaCl, 10 mM fosforan sodowy pH 7,4) homogenizowano w homogenizatorze Teflona i wirowano przy 40000 rpm przez 20 minut w zebrano precypitat. Precypitat uzupełniono 0,5% deoksycholanem sodu, 0,1% NaCl i 10 mM fosforanem sodu (pH 7,4), następnie homogenizowano i wirowano przy 40000 rpm przez 20 minut i zebrano precypitat. Precypitaty uzupełniono 10 mM fosforanem sodowym (pH 7,4), homogenizowano i wirowano przy 40000 rpm przez 20 minut w celu uzyskania precypitratu.

Preparat błon komórkowych przemyto następnie kwasem cholowym jak podano poprzednio i zawieszono w buforze zawierającym czynnik aktywny powierzchniowo, n-nonanoilo-N-metyloglukamid (MEGA-9) i decanoilo-N-metyloglukamid (MEGA-10), każdy w stężeniu 1%. Zawiesinę homogenizowano na lodzie, sonikowano i wirowano przy 40000 przez 20 minut w celu uzyskania spernatantu.

Tak otrzymany supernatant absorbowano na kolumnie z hydroksyapatytu, zrównoważonej 1% MEGA-9, 1% MEGA-10, 10% glicerolem i 10 mM fosforanem sodowym (pH 7.4) i frakcjonowano poprzez elucję schodkowym gradientem stężeń fosforanu sodowego (0, 50, 150, 250 i 400 mM). Cytochromy w kolejnych frakcjach wykrywano badając różnicę spektrum zredukowanego i utlenionego. Ostatecznie cytochromy c i b wymywano z kolumny przy 50 mM fosforanie sodowym, cytochromy c, b i a wykrywano we frakcji eluowanej 150 mM fosforanem sodowym, a cytochromy b i d we frakcji eluowanej 250 mM fosforanem sodowym.

Frakcja eluowana przy stężeniu fosforanu sodowego wynoszącym 250 mM była dializowana wobec 10% glicerolu i 10 mM fosforanu sodowego (pH 7,4), następnie absorbowana na kolumnie DEAE-Toyopearl (Tosho) zrównoważonej tym samym buforem, a następnie frakcjonowana schodkowym gradientem NaCl (0, 80, 100, 120, 140 i 300 mM). Cytochromy w kolejnych frakcjach wykrywano badając różnicę spektrum zredukowanego i utlenionego. Ostatecznie cytochromy bid wymywano z kolumny przy 120 mM NaCl. Tę frakcję stosowano jako preparat oksydazy hydrochiononowej cytochromu bd.

Wspomniany powyżej preparat enzymatyczny poddano elektroforezie PAGE-SDS w 13,5% żelu i następnie przeniesiono na membranę PVDF. Fragmenty membrany w miejscach odpowiadających położeniu prążków podjednostki I i podjednostki II poddano analizie sekwencyjnej w celu określenia sekwencji N końca polipeptydu. Sekwencje aminokwasową przedstawia odpowiednio Sek Id Nr 5 (podjednostka I) i Sek Id Nr 6 (podjednostka II).

<2> Izolacja genu kodującego oksydazę hydrochinonową cytochromu bd z Brevibacterium lactofermentum.

Przeszukanie biblioteki chromosomalnego DNA B.lactofermentum w celu identyfikacji klonów zawierających gen kodujący oksydazę hydrochinonową cytochromu bd przeprowadzono techniką hybrydyzacji kolonijnej.

Zsyntezowano dwa rodzaje oligonukleotydów w oparciu o częściową sekwencje aminokwasową oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd B.flavum. Pierwszy rodzaj przygotowany został w oparciu o sekwencję N końca podjednostki I oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd (bbd1: Sek Id Nr 7), drugi przygotowany został w oparciu o sekwencję N końca podjednostki II oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd (bbd1: Sek Id Nr 8).

PCR prowadzono wykorzystując wspomniane wyżej startery (bbd1 i bbd2) i chromosomalny DNA ze szczepu ATCC 14067 jako matrycą. Profil 35 cyklicznych zmian temperatury po wstępnej denaturacji w 94°C przez 1 minutę, przedstawiał się następująco: denaturacja w 94°C przez 45 sekund, przyłączanie starterów w 50°C przez 1 minutę i wydłużanie w 62°C przez 90 sekund. W rezultacie

PL 195 017 B1 uzyskano fragmenty wielkości około 1500 pz, 800 pz i 100 pz. Opierając się na oszacowanej masie cząsteczkowej podjednostki I (56,4 kDa), otrzymanej dla oczyszczonego białka i znanej z literatury masie cząsteczkowej podjednostki I oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd z innych rodzajów bakterii, przyjęto iż fragment o wielkości 1500 pz jest właściwym. Następnie produkt PCR rozdzielono w 2% żelu agarozowym, fragment o wielkości 1500 pz wycięto z żelu w celu wyizolowania DNA.

Fragment ten uzupełniono do tępych końców wykorzystując DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) i wprowadzono do wektora plazmidowego pUC118 strawionego uprzednio enzymem Smal i traktowanego alkaliczną fosfatazą, stosując DNA Ligation Kit ver 2 (Takara Shuzo). Uzyskanym zrekombinowanym plazmidem transformowano szczep XL-1 E.coli.

Z otrzymanego transformata uzyskano plazmid i określono następnie sekwewncje nukleotydową insertu. Sekwencjonowanie przeprowadzono wykorzystując Fluorescein Labeled Primer M4 (Takara Shuzo, Sek Id Nr 9) jako primer od końca 5' oraz Fluorescein Labeled Primer RV-MF (Takara Shuzo Sek Id Nr 10) jako starter od strony 3' wstawki, zgodnie z zaleceniami producenta zestawu do fluorescencyjnego sekwencjonowania cyklicznego Termo Sequenase Kit (Amersham Life Science). W wyniku sekwencjonowania potwierdzono, iż wstawka obejmuje gen kodujący oksydazę hydrochinonową cytochromu bd. Klon określono jako BD1.

BD1 powielono w reakcji PGR z wykorzystaniem wspomnianych starterów M4 i RV-MF i przygotowano następnie sondę wykorzystując zestaw do znakowania DIG Lebelling Kit (Boehringer Mannheim).

Bibliotekę chromosomalnego DNA B.lactofermentum przeszukiwano następnie tak uzyskaną sondą. Bibliotekę otrzymano poprzez częściowe trawienie chromosomalnego DNA B.lactofermentum szczep ATCC 13869 enzymem Sau3A1, wprowadzenie uzyskanego fragmentu do miejsca BamH1 plazmidu pUC18 i transformowanie komórki E.coli uzyskanym zrekombinowanym plazmidem. Przeprowadzono następnie hybrydyzację kolonijną wobec kolonii transformantów stosując sondę wyznakowaną digoksygeniną (zestaw DIG Lebelling Kit), jak podano to wyżej. Wykrywanie związanej sondy prowadzono wykorzystując zestaw DIG Detection Kit (Boehringer Mannheim), w którym wykorzystywane są przeciwciała przeciwdigoksyeninowe sprzężone z alkaliczną fosfatazą.

Plazmid otrzymano następnie z kolonii hybrydyzujących z sondą, strawiono enzymami EcoRI i PstI i poddano hybrydyzacji typu Sutherna, stosując BD1 jako sondę. W rezultacie uzyskano dwie kolonie hybrydyzujące z sondą. Wstawki uzyskane z hybrydyzujących z sondą kolonii oznaczono jako BD21 i BD31. BD21 obejmuje około 3,8 kpz, a BD31 9,0 kpz. Uzyskane klony poddano subklonowaniu i oznaczono ich sekwencję nukleotydową. Wyniki przedstawia Sek Id Nr 1. Oczekiwane regiony kodujące białko oraz sekwencję aminokwasową przedstawiają Sek Id Nr 1-4.

Zestawienie Sekwencji <110> Ajinomoto Co, Lnc <120> Gen kodujący oksydazę hydrochinoinową cytochromu bd Brevibacterium lactofermentum <130> OP852 <140>

<141>

<150> JP 10-164019 <151> 1998-06-11 <160> 10 <170> Patentln ver 2.0 <210) 1 <211> 3936 <212> DNA <213> Brevibacterium lactofermentum <220>

<221> sekwencja kodująca <222> (9933) ··· (2483) <400> 1 ggatcctctc tcjttc^^^^^ci agcacctact cttttactcc gaagttcga a cgtgccctcg 60 acgaaagcct agaagtgacg gaccgagatg aggctgctca gaattttaag tttcacgtcc 120 aagacatcat cgaaactggg ttgtttatcg ccagaaaaaa tgaattctgg caaggaaacc 180 tcatcgttgg cgaaagatat tcccgacgag atgccigccg aattctcaat tgggaacgaa 240

PL 195 017 B1

acaatgagag	cacgatttat	ggttacaaag	tgggcactta	cacatttacg	tgtttaatct	300
ttgtgaccta	tcacaaggct	gatgatgtac	ccc^^aat	cgttcttatg		360
cgatccgaat	acccttcatt	ggtatttccc	cc^a^ccg	acLgatc<t;gt	ctaatgagtt	420
caagcccatc	gctgcgaatg	tgtggatctt	c^g^^ig	tgaagaagga	cgatgccgaa	480
ggccttgatt	tcttctacct	tggttaaacc	c^icag^a	acagcaittca	ggcatcgatg	540
cccggaaaca	aaggagttgt	gcaaccggtg	CtcacaaCgg	atctacagu	osacccc^c	600
gtcgaacaaa	gcctgtttga	gtacctggct	ccccc^^	ccgtaatgta	gtaaccaccg	660
caaccaagcg	tcgaaaagca	aaatcttttt	tatUU^g		acaagggggg	720
agcaaaatca	gtcattgaca	gggaaaggU	gaccaccatc	gggtttatcc	tttttttagt	780
taagctgtga	gcggg^tctt	aggaaΐacac	ttcaacgaca		agttctt.att	840
ggttcttcgt	ttttgtatcgc	tacccacaat	cggUtcctg	gcttcatact		900
tcaatctgta	aagaagagga	atttftacctc	gc gtg gat	gtc gtt gcc atc gcg	953
			Val Asp 1	Val Val Asp Ile Ala 5
cgg tgg caa ttc gga atc acc acc	gtc tat ccc	ttc att ttt gtc cca	1001
Arg Trp Gln Phe Gly Ile Thr Thr	Val Tyr His	Phe Ile Phe Val Pro
10	15		20
ctg acc att ggc tta gca ccg ctg	gtc gcg atc	atg ccc acg ttt tgg	1049
Leu Thr Ile Gly Leu Ala Pro Leu	Val Alt Ile	Met Gln Thr Phe Trp
25		30		35
caa gtt acc ggc aaa gag cac tgg	tat cgg gct	ccg agc ttt ttt ggc	1097
Gln Val Thr Gly Lys Glu His Trp Tyr Arg Ala	Thr Arg Phe Phe Gly

PL 195 017 Β1

45 50 55

act gtg ctg

ctc atc aac

ttc gcg gtt ggt gta gca acg ggc att gtg

1145

Thr

Val Leu

Leu

Ile 60

Asn

Phe

Ala

Val

Gly 65

Val

Ala

Thr

Gly

Ile 70

Val

cag

gag

ttc

cag

ttc

ggt

atg

aac

tgg

tcg

gaa

tat

tcg

cgt

ttc

gtc

1193

Gin

Glu

Phe

Gin

Phe

Gly

Met

Asn

Trp

Ser

Glu

Tyr

Ser

Arg

Phe

Val

75

80

85

ggt

gat

gtt

ttc

ggc

gga

ccg

ctg

gct

ttg

gag

ggg

ctc

atc

gcg

ttc

1241

Gly

Asp

Val

Phe

Gly Gly

Pro

Leu

Ala

Leu Glu

Gly

Leu

Ile

Ala

Phe

90

95

100

ttc

ctt

gag

tct

gtg

ttc

tta

ggt

ctg

tgg

att

ttc

gga

tgg

ggg

aag

1289

Phe

Leu

Glu

Ser

Val

Phe

Leu

Gly

Leu

Trp

Ile

Phe

Gly Trp

Gly Lys

105

110

115

att

cct

gga

tgg

ctg

cat

act

gcg

tcc

att(

tgg

atc

gtt

gct

att

gcg

1337

Ile

Pro

Gly Trp

Leu

His

Thr

Ala

Ser

Ile

Trp

Ile

Val

Ala

Ile

Ala

120

125

130

135

acg

aat

att

tct

gcc

tat

ttc

atc

atc

gtg

gcc

aac

tcg

ttt

atg

cag

1385

Thr

Asn

Ile

Ser

Ala

Tyr Phe

Ile

Ile

Val

Ala

Asn

Ser

Phe

Met

Gin

140

145

150

cat

ccg

gtg

ggt

gct

gag

tat

aac

cct

gag

act

ggt

cgg

gcg

gag

ctt

1433

His

Pro

Val

Gly

Ala

Glu

Tyr

Asn

Pro

Glu

Thr

Gly Arg

Ala

Glu

Leu

155

160

165

act

gat

ttc

tgg

gct

ctt

ctc

aca

aac

tcc

acc

gcg

ctg

gct

gcg

ttc

1481

Thr

Asp

Phe

Trp

Ala

Leu

Leu Thr

Asn

Ser Thr

Ala

Leu

Ala

Ala

Phe

170

175

180

ccg

cat

gct

gtt

gcc

ggt

ggt

ttt

tta

aca

gct

gga

act

ttc

gtc

ctc

1529

Pro

His

Ala

Val

Ala

Gly GLy

Phe

Leu

Thr Ala

Gly

Thr

Phe

Val

Leu

185

190

195

PL 195 017 Β1

gga Gly 200

att tcg ggt

tgg tgg att att cgt gcg cac cgc cag gcg aag aag

1577

Ile

Ser Gly

Trp

Trp 205

Ile

Ile Arg

Ala

His Arg Gln Ala Lys Lys

210

215

gct

gag

gcg

gaa

atc

gag

tcg

aag

cat

tca

atg

cac

agg

ccg

gcg

ttg

1625

Ala

Glu

Ala

Glu

Ile

Glu

Ser

Lys

His

Ser

Met

His

Arg Pro

Ala

Leu

220

225

230

tgg

gtt

ggt

tgg

tgg

acc

aca

gtt

gtc

tct

tcc

gtg

gca

ctg

ttc

atc

1573

Trp

Val

Gly

Trp Trp

Thr

Thr

Val

Val

Ser

Ser

Val

Ala

Leu

Phe

Ile

235

240

245

act

ggc

gat

aca

cag

gcg

aag

etc

atg

ttc

gtg

cag

cag

ccg

atg

aag

1721

Thr

Gly Asp

Thr

Gln

Ala

Lys

Leu

Met

Phe

Val

Gln

Gln

Pro

Met

Lys

250

255

260

atg

gcg

tcg

gcg

gaa

tcc

ttg

tgt

gaa

acc

gcc

aca

gat

cca

aac

ttc

1769

Met

Ala

Ser

Ala

Glu

Ser

Leu Cys

Glu

Thr,

Ala Thr Asp Pro

Asn

Phe

265

270

275

tcc

att

ctg

aca

att

ggt

acg

cac

aac

aac

tgc

gat

acg

gta

acc

cac

1817

Ser

Ile

Leu

Thr

Ile

Gly

Thr

His

Asn

Asn

Cys Asp

Thr

Val

Thr

His

280

285

290

295

ctg

atc

gat

gtt

ccg

ttt

gtg

ctt

cca

ttc

ttg

gct

gaa

gga

aaa

ttc

1865

Leu

Ile

Asp

Val

Pro

Phe

Val

Leu

Pro

Phe

Leu

Ala

Glu

Gly

Lys

Phe

300

305

310

acc

ggt

gcg

act

ttg

cag

ggt

gta

aac

cag

ctc

caa

gct

gca

gcg

gag

19L3

Thr

Gly

Val

Thr

Leu

Gln

Gly

Val

Asn

Gln

Leu

Gln

Ala

Ala

Ala

Glu

315

320

325

caa

gca

tac

ggt

cct

ggc

aac

tac

tcc

cct

aac

ttg

ttt

gtc

acc

tac

1961

Gln

Ala Tyr

Gly

Pro

Gly

Asn

Tyr

Ser

Pro

Asn

Leu

Phe

Val

Thr Tyr

330 335 340

PL 195 017 Β1

tgg tca Trp Ser

ttc cgc

gca Ala

atg atc ggc

eta atg ctt ggt tct ttg gct atc

2009

Phe

Arg

Met

Ile Gly 350

Leu

Met

Leu

Gly Ser 355

Leu

Ala

Ile

345

gct

gcg

att

gcg

tgg

ctg

ttg

ctg

cgt

aag

aag

cgc

aca

cca

act

gga

2057

Ala

Ala

Ile

Ala

Trp

Leu

Leu

Leu

Arg Lys

Lys

Arg

Thr

Pro

Thr

Gly

360

365

370

375

aag

att

gct

cgt

ctc

ttc

caa

atc

ggc

age

ctc

att

gee

att

cca

ttc

2L05

Lys

Ile

Ala

Arg

Leu

Phe

Gin

Ile

Gly

Ser

Leu

Ile

Ala

Ile

Pro

Phe

380

385

390

cca

ttc

ttg

gct

aac

tct

gct

ggt

tgg

atc

ttc

acc

gag

atg

ggc

cgc

2153

Pro

Phe

Leu

Ala

Asn

Ser

Ala

Gly

Trp

Ile

Phe

Thr

Glu

Met

Gly

-Arg

395

400

405

cag

cct

tgg

gtg

gta

cac

ccg

aat

cct

gaa

tct

gee

ggc

gat

gee

ega

2201

Gin

Pro

Trp

Val

Val

His

Pro

Asn

Pro

Glu

Ser

Ala

Gly Asp

Ala

Arg

410

415

420

aca

gag

atg

atc

cgg

atg

act

gtt

gat

atg

ggt

gtg

tct

gat

cat

gcg

2249

Thr

Glu

Met

Ile

Arg

Met

Thr

Val

Asp

Met

Gly

Val

Ser

Asp

His

Ala

425

430

435

ccg

tgg

caa

gtc

tgg

ctg

act

eta

att

ggc

ttc

acg

att

ctc

tat

ctc

2297

Pro

Trp

Gin

Val

Trp

Leu Thr

Leu

Ile

Gly

Phe

Thr

Ile

Leu

Tyr

Leu

440

445

450

455

atc

ttg

ttc

gtg

gtg

tgg

gtg

tgg

ctg

att

cgc

cgc

gca

gtt

ctg

atc

2345

Ile

Leu

Phe

Val

Val

Trp

Val- Trp

Leu

Ile

Arg Arg

Ala

Val

Leu

Ile

460

465

470

gga

cca

cca

gag

gaa

ggc

gct

cca

tcc

gtg

gag

gca

aag

act

gga

ccg

2393

Gly

Pro

Pro

Glu

Glu

Gly

Ala

Pro

Ser

Val

Glu

Ala Lys Thr Gly

Pro

475

480

485

gca acc ccg att ggt tca gat atg ccc atg aca ccg ctg caa ttt acc 2441

PL 195 017 Β1

Ala

Thr

Pro

ILe

Gly

Ser

Asp

Met

Pro

Met

Thr

Pro

Leu

Gin Phe Thr

490

495

500

gtg

ccg

ccc

caa

cca

cac

gtg

aaa

agg

aat

aac

cat

gga

tct 2483

Val

Pro

Pro

Gin

Pro

His

Val

Lys

Arg

Asn

Asn

His

Gly

Ser

505

510

515

taataccttt tggtttattc tcatcgcatt attcgacttc ggtgtcggaa ttttagcgcc cacgatcatc cgcaccatcg gccctgtctg aggtggcgct ttgtttgctg cattccctga tctgccgctg ttcctcgtgc ttgtgtcgtt caagaaagtc gatgatcctc gttggcaaaa ttggactcca ccgctgatgt ggggattcat atcaaggcgg atcacaccat cgatgctgca cgccatcctg ggtgcacttg cattcactgc ccgcctgaaa actgctggtc gggtgcgcac acttcttgct gcggtgactg gtggaccttt ttcctggtcc tggatcctcg cagtgctgat actgatcaaa gaccgcgatg gattaagctt agttgcactg ctgtttagtt ccctactccc tttgtttgcg ggatactttc tcctcgaagg 2543 gatcatcggt aaagattccg ccgctaaaaa 2503 ggacggaaat gaagtgtggc tgatcgtggc 2663 gtggtacgca acgatgttct ccggaatgta 2723 gatcatgcgc gtggtgggcc ttgaacggcg 2783 gtggtctgac cgggccatct ttattggttc 2843 cttcgccaat attttcaagc ttgcatgccc 2903 gtggctctgc tgtgcaatgt tcaacgtctt 2963 gctgttcgct cttcatggcc ttgcattcat 3023 cgatgcggcg aaggcagctc cagtagtcgc 3083 cgtgttgtgg gctgccatcg catacggccg 3143 catcgcagcg gttctcggtg gagctttcgc 3203 cctgtccact tccgtcgctg tcatcggtgt 3263 caacgtcatg ccaacaacgc ttgccgatgg 3323 cgtgactgga tatttggaac gcctccgcaa gccactacgc attgaccatc ctgacttgga 3383

PL 195 017 Β1

ccgccactgt	gatcgcaccg	ctggttgtcc	tctaccaagg	ctggacctac	tgggtgttcc	3443
gcaaacgact	tcacgccgag	ccagtgtctg	cctaaaagtt	ggaaaaattg	agtactaaat	3503
ctgacgctcc	ggctagtcgc	cgcacaggcc	ccgtcgatcc	gcggcttttg	cgcctatccc	3563
ctgctacccg	ccgttgggtg	ataatcgcag	gtgttctcac	cgcgttgaaa	actctcgcga	3623
cagtcgcaat	gggcttgctc	atcggccaga	tggcagcggg	catcattgag	gtttcgggaa	3683
gttctttgcc	ccgaatggaa	ctcatcgcgc	tcgccatcac	ggtggttgtg	cgcggacttc	3743
ttgcgtgggc	acaggatcgg	ttcggagcgc	gcatcgtccc	aggtgactgt	ggatcttcgg	3803
gagaaaaccc	tgcggcacct	ggcacaaagc	gatccccgca	ccatcgatca	agccttgtgg	3863
cgcacccgtt	tgacctctgg	ccttgatggt	ttggggcctt	acctcaccgg	atttttgccg	3923
cactggccgc	cac					3936

<210> 2 <211> 517 <212> białko <213> Brevibacterium lactofermentuia <400> 2

Val Asp Val Val Asp Ile Ala Arg Trp Gln Phe Gly Ile Thr Thr Val 15 10 15

Tyr His Phe Ile Phe Vał Pro Leu Thr Ile Gly Leu Ala Pro Leu Val 20 25 30

Ala Ile Met Gln Thr Phe Trp Gln Val Thr Gly Lys Glu His Trp Tyr 35 40 45

Arg Ala Thr Arg Phe Phe Gly Thr Val Leu Leu Ile Asn Phe Ala VaL

PL 195 017 Β1

55

Gly Val Ala Thr Gly Ile Val 65 70

Ser Glu Tyr Ser Arg Phe Val 85

Leu Glu Gly Leu Ile Ala Phe 100

Trp He Phe Gly Trp Gly Lys 115

Ile Trp Ile Val Ma Ile Ala 130 135

Val Ala Asn Ser Phe Met Gln 145 150

Glu Thr Gly Arg Ala Glu Leu 165

Ser Thr Ala Leu Ala Ala Phe 180

Thr Ala Gly Thr Phe Val Leu 195

Ala His .Arg Gln Ala Lys Lys 210 215

Ser Met His Arg Pro Ala Leu 225 230

Glu	Phe	Gln	Phe	Gly	Met	Asn	Trp
		75					80
Asp	Val	Phe	Gly	Gly	Pro	Leu	Ala
	90					95
Leu	Glu	Ser	Val	Phe	Leu	Gly	Leu
105					110
Pro	Gly	Trp	Leu	His	Thr	Ala	Ser
				125
Asn	Ile	Ser	Ala	Tyr	Phe	Ile	Ile
			140
Pro	Val	Gly	Ala	Glu	Tyr	Asn	Pro
		155					160
Asp	Phe	Trp	Ala	Leu	Leu	Thr	Asn
	170					175
His	Ala	Val	Ala	Gly	Gly	Phe	Leu
185					190
Ile	Ser	Gly	Trp	Trp	Ile	Ile	Arg
				205
Glu	Ala	Glu	Ile	Glu	Ser	Lys	His

220

Val Gly Trp Trp Thr Thr Val Val 235 240

Ser Ser Val Ala Leu Phe [le Thr Gly Asp Thr Gln Ala Lys Leu Met 245 250 255

PL 195 017 Β1

Phe	Val	Gin	Gin	Pro	Met	Lys	Met
			260
Thr	Ala	Thr	Asp	Pro	Asn	Phe	Ser
		275					280
Asn	Cys	Asp	Thr	Val	Thr	His	Leu
	290					295
Phe	Leu	Ala	Glu	Gly	Lys	Phe	Thr
305					310
Gin	Leu	Gin	Ala	Ala	Ala	Glu	Gin
				325
Pro	Asn	Leu	Phe	Val	Thr	Tyr	Trp
			340
Met	Leu	Gly	Ser	Leu	Ala	Ile	Ala
		355					360
Lys	Lys	Arg	Thr	Pro	Thr	Gly	Lys
	370					375
Ser	Leu	Ile	Ala	Ile	Pro	Phe	Pro
385					390
Ile	Phe	Thr	Glu	Met	Gly	Arg	Gin
				405
Glu	Ser	Ala	Gly	Asp	Ala	Arg	Thr
			420
Met	Gly	Val	Ser	Asp	His	Ala	Pro

435 440

Ala	Ser	Ala	Glu	Ser	Leu	Cys	Glu
265					270
Ile	Leu	Thr	Ile	Gly	Thr	His	Asn
				285
Ile	Asp	Val	Pro	Phe	Val	Leu	Pro
			300
Gly	Val	Thr	Leu	Gin	Gly	Val	Asn
		315					320
Ala	Tyr	Gly	Pro	Gly	Asn	Tyr	Ser
	330					335
Ser	Phe	Arg	Ala	Met	Ile	Gly	Leu
345					350
Ala	Ile	Ala	Trp	Leu	Leu	Leu	Arg
				365
Ile	Ala	Arg	Leu	Phe	Gin	Ile	Gly
			380
Phe	Leu	Ala	Asn	Ser	Ala	Gly	Trp
		395					400
Pro	Trp	Val	Val	His	Pro	Asn	Pro
	410					415
Glu	Met	Ile	Arg	Met	Thr	Val	Asp
425					430
Trp	Gin	Val	Trp	Leu	Thr	Leu	Ile
				445

PL 195 017 B1

Gly

Phe

Thr

Ile

Leu

Tyr

Leu

Ile

Leu

Phe

Val

Val

Trp

Val

Trp

Leu

450

455

460

Ile

Arg

Arg:

Ala

Val

leu

Il^e

Gly

Pro

Pro

GCu

Glu

GG/

Ala

Pro

Ser

465

470

477

480

Val

Glu

Ala

Lys

Thr

GCy

Pro

Ala

Thr

Pro

Ile

Gly

Ser

Asp

Met

Pro

485

490

495

Met Thr Pro Leu Gln Phe Thr Val Pro Pro Gn Pro His Val Lys Arg 500 505 510

Asn Asn His Gly Ser 515 <210> 3 <211> 3936 <212> DNA <213> Brevibacteriim lactoferrnenim <220>

<221> sekwencja kodująca <222> (2476) . .. (3498) <400> 3 ggatcctctc tgttcaaaac agcacctact cttttactcc cgagttccga cgtgccctcg 60 acgaaagcct agaagtgacg gaccgagatg aggctgctca gaatdttaag tttcacgtcc 120 aagacatcat cgaaactggg ttgtttatcg ccagaaataa tggattctgg caaggaaacc 180 tcgtcgttgg cgaaagatat tcccgacgag atgtctgccg aattctcaat tgggaacgaa 240 acaatgagag cacgatttat ggttacaaag tggacagcta cacatcgacg tgcccaatct 300 ttgtgaccta tcacaaggct gatgatgtat ccgaagtact cgttaccagg atgaactcgt 360

PL 195 017 Β1

cgatccgaat	acccttcatt	ggtattcccg	cggcaaccga	aagatcacgt	ctaatgagat	420
caagcccatc	gctgcgaatg	tgtggatctt	catgtttttg	tgaagaagga	cgatgccgaa	480
ggccttgatt	tcttctacct	tggtcaagcg	cattcagaaa	acagcaaaca	gtcatcgatg	540
cccggaaaca	aaggagttgt	gcaaccggtg	gtcacaatgg	atctacagtt	cgacacaccc	600
gtcgaacaaa	gcctgtttga	gtacctgagc	acaaatctcg	ccgtaacgga	gtaaccaccg	660
caaccaagcg	tcgaaaagca	aaatcttttc	gagtttttgg	tgacttgtca	acaagggggg	720
agcaaaatca	gtcattgaca	gggaaaggtt	gaccacaatc	ggggttagcc	tttctaaagt	780
taagctgtga	gcgggaactt	aggaataaac	ttcaacgaca	acctttaaga	agctcttatt	840
ggttcttcgt	tttgtatcga	taaatacaat	cggtttcctg	gctcaataag	gctgttcctg	900
tcaatctgta	aagaagagga	aggggaccta	gcgtggatgt	cgttgacatc	gcgcggtggc	960
aattcggaat	taccaccgtc	tatcacttca	tttttgtccc	actgaccatt	ggcttagcac	1020
cgctggtcgc	gatcatgcaa	acgttttggc	aagttaccgg	caaagagcac	tggtatcggg	1080
ctacgagatt	ttttggcact	gtgctgctca	tcaacttcgc	ggttggtgta	gcaacgggca	1140
ttgtgcagga	gttccagttc	ggtatgaact	ggtcggaata	ttcgcgtttc	gtcggtgatg	1200
ttttcggcgg	accgctggct	ttggaggggc	tcatcgcgtt	cttccttgag	tctgtgttct	1260
taggtctgtg	gattttcgga	tgggggaaga	ttcctggatg	gctgcatact	gcgtccattt	1320
ggatcgttgc	tattgcgacg	aatatttctg	cctatttcat	catcgtggcc	aactcgttta	1380

tgcagcatcc ggtgggtgct gagtataacc ctgagactgg tcgggcggag cttactgatt 1440

PL 195 017 Β1

tctgggctct	tctcacaaac	tccaccgcgc	tggctgcgtt	cccgcatgct	gttgccggtg	1500
gttttttaac	agctggaact	ttcgtcctcg	gaatttcggg	ttggtggatt	attcgtgcgc	1560
accgccaggc	gaagaaggct	gaggcggaaa	tcgagtcgaa	gcattcaatg	cacaggccgg	1620
cgttgtgggt	tggttggtgg	accacagttg	tctcttccgt	ggcactgttc	atcactggcg	1680
atacacaggc	gaagctcatg	ttcgtgcagc	agccgatgaa	gatggcgtcg	gcggaatcct	1740
tgtgtgaaac	cgccacagat	ccaaacttct	ccattctgac	aattggtacg	cacaacaact	1800
gcgatacggt	aacccacctg	atcgatgttc	cgtttgtgct	tccattcttg	gctgaaggaa	1860
aattcaccgg	tgtgactttg	cagggtgtaa	accagctcca	agctgcagcg	gagcaagcat	1920
acggtcctgg	caactactcc	cctaacttgt	ttgtcaccta	ctggtcattc	cgcgcaatga	1980
tcggcctaat	gcttggttct	ttggctatcg	ctgcgąttgc	gtggctgttg	ctgcgtaaga	2040
agcgcacacc	aactggaaag	attgctcgtc	tcttccaaat	cggcagcctc	attgccattc	2100
cattcccatt	cttggctaac	tctgctggtt	ggatcttcac	cgagatgggc	cgccagcctt	2160
gggtggtaca	cccgaatcct	gaatctgccg	gcgatgcccg	aacagagatg	atccggatga	2220
ctgttgatat	gggtgtgtct	gatcatgcgc	cgtggcaagt	ctggctgact	ctaattggct	2280
tcacgattct	ctatctcatc	ttgttcgtgg	tgtgggtgtg	gctgattcgc	cgcgcagttc	2340
tgatcggacc	accagaggaa	ggcgctccat	ccgtggaggc	aaagactgga	ccggcaaccc	2400
cgattggttc	agatatgccc	atgacaccgc	tgcaatttac	cgtgccgccc	caaccacacg	2450
tgaaaaggaa	taacc atg i	gat ctt aat	acc ttt tgg ttt att ctc atc gca	2511

Met Asp Leu Asn Thr Phe Trp Phe Ile Leu Ile Ala

PL 195 017 Β1

ttc ttg ttt

gcg Ala

gga tac ttt

ctc ctc gaa gga ttc gac ttc ggt gtc

2559

Phe

Leu

Phe 15

Gly

Tyr

Phe

Leu 20

Leu Glu

Gly Phe

Asp 25

Phe

Gly

Yal

gga

att

tta

gcg

ccg

atc

atc

ggt

aaa

gat

tcc

gcc

gct

aaa

aac

acg

2607

Gly

Ile

Leu

Ala

Pro

Ile

Ile

Gly Lys

Asp

Ser

Ala

Ala

Lys

Asn

Thr

30

35

40

atc

atc

cgc

acc

atc

ggc

cct

gtc

tgg

gac

gga

aat

gaa

gtg

tgg

ctg

2655

Ile

Ile

Arg

Thr

Ile

Gly

Pro

Yal

Trp

Asp Gly Asn

Glu

Val

Trp

Leu

45

50

55

60

atc

gtg

gca

ggt

ggc

gct

ttg

ttt

gct

gca

ttc

cct

gag

tgg

tac

gca

2703

Ile

Val

Ala

Gly Gly

Ala

Leu

Phe

Ala

Ala Phe

Pro

Glu

Trp Tyr

Ala

65

70

75

acg

atg

ttc

tcc

gga

atg

tat

ctg

ccg

ctg

ttc

ctc

gtg

ctt

gtg

tcg

2751

Thr

Met

Phe

Ser

Gly

Met

Tyr Leu

Pro

Leu, Phe

Leu

Val

Leu

Yal

Ser

80

85

90

ttg

atc

atg

cgc

gtg

gtg

ggc

ctt

gaa

tgg cgc

aag

aaa

gtc

gat

gat

2799

Leu

Ile

Met

Arg

Val

Val

Gly

Leu

Glu

Trp Arg Lys

Lys

Val

Asp

Asp

95

100

105

cct

cgt

tgg

caa

aag

tgg

tct

gac

cgg

gcc

atc

ttt

att

ggt

tct

tgg

2847

Pro

Arg Trp

Gln

Lys Trp

Ser

Asp Arg

Ala

Ile

Phe

Ile

Gly

Ser

Trp

110

115

120

act

cca

ccg

ctg

atg

tgg

gga

ttc

atc

ttc

gcc

aat

att

ttc

aag

ctt

2895

Thr

Pro

Pro

Leu

Met

Trp

Gly

Phe

Ile

Phe

Ala

Asn

Ile

Phe

Lys

Leu

125

130

135

140

gca

tgc

cca

tca

agg

cgg

atc

aca

cca

tcg

atg

ctg

cag

tgg

ctc

tgc

2943

Ala

Cys

Pro

Ser

Arg

Arg

Ile

Thr

Pro

Ser

Met

Leu

Gln

Trp

Leu

Cys

145

150

155

PL 195 017 Β1

tgt gca atg ttc aac gtc ttc gee atc ctg ggt gca ctt gca ttc act

2991

Cys

Ala Met

Phe Asn Val Phe Ala Ile

Leu Gly

Ala Leu

Ala 170

Phe

Thr

160

165

gcg

ctg

ttc

gct

ctt

cat

ggc

ctt

gca

ttc

atc

cgc

ctg

aaa

act

gct

3039

Ala

Leu

Phe

Ala

Leu

His

Gly

Leu

Ala

Phe

Ile

Arg

Leu

Lys

Thr

Ala

175

180

185

ggt

cgg

gtg

cgc

acc

gat

gcg

gcg

aag

gca

gct

cca

gta

gtc

gca

ctt

3087

Gly Arg

Val

Arg

Thr

Asp

Ala Ala

Lys

Ala

Ala

Pro

Val

Val

Ala

Leu

190

195

200

ctt

gct

gcg

gtg

act

ggt

gga

cct

ttc

gtg

ttg

tgg

gct

gee

atc

gca

3135

Leu

Ala

Ala

Val

Thr

Gly Gly

Pro

Phe

Val

Leu

Trp

Ala

Ala

Ile

Ala

205

210

215

220

tac

ggc

cgt

tcc

tgg

tcc

tgg

atc

ctc

gca

gtg

ctg

atc

atc

gca

gcg

3183

Tyr Gly

Arg

Ser

Trp

Ser

Trp

Ile

Leu

Ala Val

Leu

Ile

Ile

Ala

Ala

225

230

235

gtt

etc

ggt

gga

gct

ttc

gca

ctg

atc

aaa

gac

cgc

gat

gga

tta

age

3231

Val

Leu

Gly Gly

Ala

Phe

Ala Leu

Ile

Lys Asp .Arg Asp

Gly

Leu

Ser

240

245

250

ttc

ctg

tcc

act

tcc

gtc

gct

gtc

atc

ggt

gta

gtt

gca

ctg

ctg

ttt

3279

Phe

Leu

Ser

Thr

Ser

Val

Ala

Val

Ile

Gly

Val

Val

Ala

Leu

Leu

Phe

255

260

265

agt

tcc

eta

ttc

ccc

aac

gtc

atg

cca

aca

acg

ctt

gee

gat

ggc

g^g

3327

Ser

Ser

Leu

Phe

Pro

Asn

Val

Met

Pro

Thr

Thr

Leu

Ala

Asp

Gly

Val

270

275

280

act

gga

tat

ttg

gaa

cgc

ctc

cgc

aag

cca

eta

cgc

att

gac

cat

cct

3375

Thr

Gly Tyr

Leu

Glu

Arg

Leu

Arg

Lys

Pro

Leu

Arg

Ile

Asp

His

Pro

285

290

295

300

gac ttg gac cgc cac tgt gat cgc acc gct ggt tgt cct eta cca agg 3423

PL 195 017 Β1

Asp

Leu

Asp

Arg

His

Cys

Asp

Arg

Thr

Ala

Gly

Cys

Pro

Leu

Pro

Arg

305

310

315

ctg

gac

eta

ctg

ggt

gtt

ccg

caa

acg

act

tea

ege

ega

gee

agt

gtc

Leu

Asp

Leu

Leu

Gly

Val

Pro

Gln

Thr

Thr

Ser

Arg

Arg

Ala

Ser

Val

320

325

330

tgc

eta

aaa

gtt

gga

aaa

att

gag

tac

taaatcti

gac

gctccggci

ta

Cys

Leu

Lys

Val

Gly

Lys

Ile

Glu

Tyr

335 340

gtcgccgcac	aggccccgtc	gatccgcggc	ttttgcgcct	atcccctgct	acccgccgtt	3578
gggtgataac	cgcaggtgtt	ctcaccgcgt	tgaaaactct	cgcgacagtc	gcaatgggct	3638
tgctcatcgg	ccagatggca	gcgggcatca	ttgaggtttc	gggaagttct	ttgccccgaa	3698
tggaactcat	cgcgctcgcc	atcacggtgg	ttgtgcgcgg	acttcttgcg	tgggcacagg	3758
atcggttcgg	agcgcgcatc	gtcccaggtg	t ' actgtggatc	ttcgggagaa	aaccctgcgg	3818
cacctggcac	aaagcgatcc	ccgcaccatc	gatcaagcct	tgtggcgcac	ccgtttgacc	3878
tctggccttg	atggtttggg	gccttacctc	accggatttt	tgccgcactg	gccgccac	3936

<210> 4 <21> 341 <212> białko <213> Brevibacterium lactofermentum <400> 4

Met Asp Leu Asn Thr Phe Trp Phe Ile Leu Ile Ala Phe Leu Phe Ala 15 10 15

Gly Tyr Phe Leu Leu Glu Gly Phe Asp Phe Gly Val Gly Ile Leu Ala 20 25 30

PL 195 017 Β1

Pro Ile Ile Gly Lys Asp Ser Ala Ala Lys Asn Thr Ile Ile Arg Thr 35 40 45

Ile Gly Pro Val Trp Asp Gly Asn Glu Val Trp Leu Ile Val Ala Gly 50 55 60

Gly Ala Leu Phe Ala Ala Phe Pro Glu Trp Ty.r Ala Thr Met Phe Ser 65 70 75 80

Gly Met Tyr Leu Pro Leu Phe Leu Val Leu Val Ser Leu Ile Met Arg 85 90 95

Val Val Gly Leu Glu Trp Arg Lys Lys Val Asp Asp Pro Arg Trp Gln 100 105 110

Lys Trp Ser Asp Arg Ala Ile Phe Ile Gly Ser Trp Thr Pro Pro Leu 115 120 125

Met Trp Gly Phe Ile Phe Ala Asn Ile Phe Lys Leu Ala Cys Pro Ser 130 135 140

Arg Arg Ile Thr Pro Ser Met Leu Gln Trp Leu Cys Cys Ala Met Phe

145 150 155 160

Asn Val Phe Ala Ile Leu Gly Ala Leu Ala Phe Thr Ala Leu Phe Ala

165 170 175

Leu His Gly Leu Ala Phe Ile Arg Leu Lys Thr Ala Gly Arg Val .Arg 180 L85 190

Thr Asp Ala Ala Lys Ala Ala Pro Val Val Ala Leu Leu Ala Ala Val 195 200 205

Thr Gly Gly Pro Phe Val Leu Trp Ala Ala Ile Ala Tyr Gly Arg Ser 210 215 220

PL 195 017 B1 <210> 5 <211> 19 <213> Brevibacterium lactofermentum <220>

<221> niepewne <222> (18) <400> 5

Met Asp Val Val Asp Ile Ala Arg Trp Gin Phe Gly Ile Thr Ala Val Tyr Xaa Phe <210> 6 <211> 20 <212> białko <213> Brevibacterium lactofermentum <220>

<221> niepewne <222> (16, 17) <400> 6

Met Asp Leu Asn Thr Phe Trp Phe Ile Leu Ile Ala Phe Leu Phe Xaa Xaa Tyr Phe Leu <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> opis sztucznej sekwencji: starter PCR <220>

<221> cechy mieszane <222> (9, 12) <223> n=a lub c lub g lub t <400> 7 a^tggayg^tng togayatygc <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> opis sztucznej sekwencji: starter PCR <400> 8 caraargtrt tvarrtccat <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> opis sztucznej sekwencji: starter PCR <400> 9 cgccagggtt ttcccagtca cgac <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> opis sztucznej sekwencji: starter PCR <400> 10 gagcggataa caatttcaca cagg

PL 195 017 B1

Claims (7)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Fragment DNA kodujący polipeptyd określony punktami (A) lub (B) (A) pollppptyd pooiadająąc sekwencję aminokwaaową przeddtawionąSek I d Nr 2 w Zeetawieniu Sekwencji;

   (B) pollpeptyd o sekwencji aminokwaaowej pr^^c^^t^v^ic^ri^j Sek I d Nr 2 w Zeetawieniu Sekwencji obejmujący podstawienie, delecję, insercję, addycję lub inwersję jednej lub wielu reszt aminokwasowych w sekwencji aminokwasowej, i mogący tworzyć białko wykazujące aktywność oksydazy hydrochinonowej cytochromu typu bd wraz z podjednostką II oksydazy hydrochinonowej cytochromu typu bd, posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną Sek Id Nr 4.
2. 2. Fragment DNA kodujący polipeptyd określony punktami (C) lub (D) (C) pplippptyy ppsiaddjącc ιβΙ^νβικ^ sminokwasową przzestywioną Seeid Nr S w Ze^twieniu Sekwencji (D) pollpeptyd o sekwencji sminodwasowaj przeestywic>kcj Sek I d Nr S w Zedtywinrιiu Sekwencji obejmujący podstawienie, delecję, insercję, addycję lub inwersję jednej lub wielu reszt aminokwasowych w sekwencji aminokwasowej, i mogący tworzyć białko wykazujące aktywność oksydazy hydrochinonowej cytochromu typu bd wraz z podjednostką I oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną Sek Id Nr 2
3. 3. Fragmenn DNA kodujący pollpeptyd określony punktem (A) lub (B) i pollpeppyd określony punktem (C) lub (D);

   (A) poilppptyd pokiadającc sekwencję aminokwasową przeestawic>r^ąSek I d Nr S w Ze^wiemu Sekwencji (B) poNpepPyd o sekwen^j aminokwasowej przedstawionej Sek I d Nr 2 w Ze^wieniu Sekwencji obejmujący podstawienie, delecję, insercję, addycję lub inwersję jednej lub wielu reszt aminokwasowych w sekwencji aminokwasowej, i mogący tworzyć białko wykazujące aktywność oksydazy hydrochinonowej cytochromu typu bd wraz z podjednostką II oksydazy hydrochinonowej cytochromu typu bd, posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną Sek Id Nr 4 (C) pc^lil^^e^Pty pokiaddjącc sodwarιgę sminodwasową przzestywic>ką SsIId Nr I w Zedtywioniu Sekwencji (D) pollpeptyd o sekwencji sminodwasowaj przeestawic>kej Sek I d Nr I w Zedtywioniu Sekwencji obejmujący podstawienie, delecję, insercję, addycję lub inwersję jednej lub wielu reszt aminokwasowych w sekwencji aminokwasowej, i mogący tworzyć białko wykazujące aktywność oksydazy hydrochinonowej cytochromu typu bd wraz z podjednostką I oksydazy hydrochinonowej cytochromu typu bd, posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną Sek Id Nr 2
4. 4. DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że DNA określone jest punktem (a) lub (b):

   (a) DNA o sekwen^j nukleotydowee odpowiadającej nukleotydom od 933 do 2483 w sekwen^j nukleotydowej przedstawionej Sek Id Nr 1 w Zestawieniu Sekwencji;

   (b) DNA zddny do hybrydyza^j z sekwengą nukleotydową według (aa w warunkach ścisSych, który koduje polipeptyd tworzący białko wykazujące aktywność oksydazy hydrochinonowej cytochromu typu bd wraz z podjednostką II oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną Sek Id Nr 4.
5. 5. DNA według zastrz. 2, znamienny tym, że DNA określony jest punktem (c) lub (d):

   (c) DNA o sekwencji nukleetydowaj oOpowindającej nukleetyyom od 2476 do 3398 w s^Ιιι^^γ^ο^ϊ nukleotydowej przedstawionej Sek Id Nr 3 w Zestawieniu Sekwencji;

   (d) DNA zddny do hydr/dyzaccj z sekweποϊ nukleotydową według (cc w warunkach śccsSych, i który koduje polipeptyd tworzący białko wykazujące aktywność oksydazy hydrochinonowej cytochromu typu bd wraz z podjednostką l oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną Sek Id Nr 2.
6. 6. DNA według zasSrz. 3, znamienny t^r^, że οΡθΙι^ι^ DNA okreśiony punkkem (aa lub (b), i znamienny tym, że obejmuje DNA określony punktem (c) lub (d):

   (a) DNA o sekwencji nukleotydowej odpowiadającej nukleotydom od 933 do 2483 w sekwencji nukleotydowej przedstawionej Sek Id Nr 1 w Zestawieniu Sekwencji; lub (b) DNA zddny do ήγόιγόγζ3(ϊ z sekwengą nukleotydową według (aa w warunkach ścistych, i który koduje polipeptyd tworzący białko wykazujące aktywność oksydazy hydrochinonowej cytochromu typu bd wraz z podjednostką II oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną Sek Id Nr 4; i

   PL 195 017 B1 (c) DNA o sekwencji nukleotydowejodpowiadającejnukleotydom od 2476d o3498w sekwencji nukleotydowej orzoPetdwimuoj Sok IP Ar 4 w Zoetdwiouik Sokwoucji; lub (P) DNA zdolnu do hydbrdpyadji z sekwekcjo nuUleotyddwe wwołuu (c) w wwo^iaC ścistydC, i który koOujo oolioootdd tworaccd białko wdkddujcco dktdwuoćć okedOdad yddrocyiuouowoj cdtocyromu tdpu bO wrda a oodjoduoetkc I okedOdad ydOrocyiuouowoj cdtocyromu bO ooeidOdjccd eokwoucję dmiuokwdeowc oraoOetdwiouc Sok IO Ar 4.

   6. FragmeouDNA weOłuuzastrz. 1 ,znamienny tym, zepooiados ekwekcjek ukleotydddw o Objmujccc ukklootddd oO 844 Oo 4784 w eokwoucji ukklootddowoj ordodetdwiouoj Sok IO Ar 1.
7. 8. FragmmknDNA weOłukmastrz. 1 ,znamienny tymi, Zepodić^gds ekwekcjek uUleotydddw o Objmujccc uuklootddd oO 4766 Oo 4788 w eokwoucji uuklootddowoj ordodetdwiouoj Sok IO Ar 1.

   8. FragmmknDNAweOłukmastrz. . ,znamienny tymi, Zepodić^gds ekwekcjek uUleotydddw o Objmujccc uuklootddd oO 844 Oo 4788 w eokwoucji uuklootddowoj ordodetdwiouoj Sok IO Ar 1.