PL195017B1 - Gen kodujący oksydazę hydrochinonową typu cytochromu bd z Brevibacterium lactofermentum - Google Patents

Gen kodujący oksydazę hydrochinonową typu cytochromu bd z Brevibacterium lactofermentum

Info

Publication number
PL195017B1
PL195017B1 PL333692A PL33369299A PL195017B1 PL 195017 B1 PL195017 B1 PL 195017B1 PL 333692 A PL333692 A PL 333692A PL 33369299 A PL33369299 A PL 33369299A PL 195017 B1 PL195017 B1 PL 195017B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
dna
amino acid
ala
leu
cytochrome
Prior art date
Application number
PL333692A
Other languages
English (en)
Other versions
PL333692A1 (en
Inventor
Nobuhito Sone
Original Assignee
Ajinomoto Kk
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ajinomoto Kk filed Critical Ajinomoto Kk
Publication of PL333692A1 publication Critical patent/PL333692A1/xx
Publication of PL195017B1 publication Critical patent/PL195017B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C12N9/0038—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6) with a heme protein as acceptor (1.6.2)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

1. Fragment DNA kodujacy polipeptyd okreslony punktami (A) lub (B) (A) polipeptyd posiadajacy sekwencje aminokwasowa przedstawiona Sek Id Nr 2 w Zestawieniu Sekwencji; (B) polipeptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej Sek Id Nr 2 w Zestawieniu Sekwen- cji obejmujacy podstawienie, delecje, insercje, addycje lub inwersje jednej lub wielu reszt aminokwa- sowych w sekwencji aminokwasowej, i mogacy tworzyc bialko wykazujace aktywnosc oksydazy hy- drochinonowej cytochromu typu bd wraz z podjednostka II oksydazy hydrochinonowej cytochromu typu bd, posiadajacy sekwencje aminokwasowa przedstawiona Sek Id Nr 4. 4. DNA wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze DNA okreslone jest punktem (a) lub (b): (a) DNA o sekwencji nukleotydowej odpowiadajacej nukleotydom od 933 do 2483 w sekwencji nukleotydowej przedstawionej Sek Id Nr 1 w Zestawieniu Sekwencji; (b) DNA zdolny do hybrydyzacji z sekwencja nukleotydowa wedlug (a) w warunkach scislych, który koduje polipeptyd tworzacy bialko wykazujace aktywnosc oksydazy hydrochinonowej cytochro- mu typu bd wraz z podjednostka II oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd posiadajacy sekwencje aminokwasowa przedstawiona Sek Id Nr 4. PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku
Zakres wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest oksydaza hydrochinonowa cytochromu bd z Brevibacterium lactofermentum i DNA kodującego wymieniony enzym.
Podstawa wynalazku
Większość organizmów uzyskuje energię niezbędną do aktywności życiowej w wyniku oddychania komórkowego. Organizmy wyższe degradują węglowodany, białka i kwasy alifatyczne, do acetylo-CoA poprzez glikolizę i b-oksydację w cytoplazmie, a następnie katabolizują acetylo-CoA w cyklu kwasów trikarboksylowych w mitochondriach. Wytwarzana w tych procesach energia magazynowana jest w postaci siły redukcyjnej NADH i FADH2. Ostatecznie NADH ulega całkowitemu utlenieniu do wody w wyniku transportu elektronów poprzez łańcuch oddechowy zlokalizowany w wewnętrznej błonie mitochondrialnej, z jednoczesnym wytworzeniem gradientu protonowego towarzyszącego utlenianiu, i służącego za źródło energii do syntezy ATP.
Ponieważ bakteryjny łańcuch oddechowy obejmuje zasadniczo różnorodne funkcjonalne kompleksy enzymatyczne, w zależności od gatunku bakterii i warunków ich wzrostu, wydajność uzyskiwanej w wyniku oddychania komórkowego energii może się znacznie wahać. Na przykład Escherichia coli posiada co najmniej dwa rodzaje oksydazy hydrochinonowej, typu bo i bd, oba tworzące ostatnie oksydazy łańcucha oddechowego. Gdy szczep dziki niosący oba typy enzymu, szczep zmutowany niosący tylko typ bo oksydazy i szczep zmutowany niosący tylko typ bd enzymu porównać między sobą pod względem wydajności wzrostu w warunkach hodowli tlenowej, wydajność wzrostu jest najmniejsza w przypadku szczepu zmutowanego niosącego jedynie typ bd oksydazy, i zależy od rodzaju oksydazy tworzącej ostatnie ogniwo łańcucha oddechowego (Lecture Abstract for The Conference of The Society for Bioscience and Bioengineering, Japan 1995, Subject No 357).
Bakterie maczugowate (korynebakterie), takie jak Brevibacterium lactofermentum i Brevibacterium flavum to bakterie tlenowe, Gram-dodatnie wykorzystywane przemysłowo do produkcji aminokwasów. Jakkolwiek oksydazy tworzące ostatnie ogniwo łańcucha oddechowego były intensywnie badane u proteobacterii, filogenetycznie odległych od bakterii maczugowatych, jak również u Bacillus subtilis i u termofilnych bacilli, które choć Gram-dodatnie jak bakterie maczugowate, są od nich filogenetycznie odmienne, nie badano dotychczas dokładnie oddechowego systemu transportu elektronów w bakterii maczugowatych. Zbadanie systemu transportu elektronów tworzącego łańcuch oddechowy bakterii maczugowatych jest istotne, ze względu na możliwość usprawnienia wydajności przemysłowego otrzymywania pożądanych substancji. Ponadto, jeżeli zostaną zidentyfikowane enzymy zaangażowane w oksydacyjny transport elektronów u bakterii maczugowatych, jak również odpowiadające im geny, możliwe będzie na przykład wytworzenie szczepów w zwiększonej wydajności uzyskiwania energii.
Dotychczas donoszono, iż oddychanie komórkowe Brevibacterium lactofermentum sprzężone jest z transportem protonów i że uczestniczą w nim cytochromy a, b i c (Kawahara Y i wsp (1988) Agric Biol Chem, 52 (8), 1979-1983). Z komórek Brevibacterium flavum wyizolowano, oczyszczono i scharakteryzowano również oksydazę hydrochinonową typu bd (Kusumoto, Sone, Sakamoto, „Respiratory chain of amino acid fermenting bacterium, Brevibacterium flavum, and characteristics of its cytochrome bd type menaquinol oxidase, Abstracts of the 23th Symposium of Bioenergy Study Group, 1997). Nie opublikowano jednak żadnych doniesień dotyczących genów kodujących oksydazę hydrochinonową typu bd z bakterii maczugowatych.
Opis wynalazku
Wynalazek opiera się na wyartykułowanym powyżej założeniu i jego celem jest uzyskanie genu kodującego oksydazę hydrochinonową cytochromu bd z bakterii maczugowatej oraz wyjaśnienie jej struktury.
Wynalazcy zaprojektowali oligonukleotydy opierając się na sekwencji aminokwasowej końca N podjednostki I i końca N podjednostki II oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd z Brevibacterium flavum i przeprowadzili reakcję PGR z uzyskanymi oligonukleotydami jako starterami, stosując jako matrycę chromosomalny DNA z Brevibacterium flavum w celu uzyskania DNA amplimeru. Ponadto przeszukali bibliotekę chromosomalnego DNA otrzymaną ze szczepu dzikiego Brevibacterium lactofermentum stosując jako sondę uzyskany fragment PCR, otrzymując w rezultacie gen kodujący oksydazę hydrochinonową cytochromu cd z Brevibacterium lactofermentum.
Wynalazek obejmuje:
1. fragment DNA kodujący polipeptyd określony w podpunktach (A) i (B)
A. polipeptyd o sekwencji aminokwasowej określonej Sek Id Nr 2 w Zestawieniu Sekwencji
PL 195 017 B1
B. polipeptyd o sekwencji aminokwasowejprzedstawionejSek I dNr2w ZestawieniuSekwencji obejmujący onSotswisoid, Sslscję, iooszcję, sSSycję lub iowszoję jdSosj lub wislu zsoet smiookwsoowych w oskwsocji smiookwsoowsj, i mogący twozeyć białko wykseującs sktywoość okoySsey hySzochioooowsj cytochzomu typu bS wzse e eoSjsSoootką II okoySsey hySzochioooowdj cytochzomu bS OooisSsjący oskwsocję smiookwsoową ozesSotswiooą Ssk IS Nz 4.
2. fzsgmsot DNA koSujący eoliesotyS okzsślooy ouoktsm (C) lub (D) ;
C. pelipedtyypekiaSsjąccsekwencjęaminckweseo/aprzedstawioneSek i dNr4 w Zektawieniu Sskwsocji;
D. pelipeprydo sekwencji aminckwesewejprzedstawionejSek I dNr4 w ZektawieniuSekwencji obsjmujący ooSotswisois, Sslscję, iooszcję, sSSycję lub iowszoję jsSosj lub wislu zsoet smiookwsoowych w oskwsocji smiookwsoowsj, i mogący tworzyć bisłko wykseującs sktywoość okoySsey hySzochioooowsj cytochzomu tyou bS wzse e ooSjsSoootką I okoySsey hySzochioooowsj cytochzomu bS OooisSsjący oskwsocję smiookwsoową ozesSotswiooą Ssk IS Nz 2,
3. frz^c^rm^r^t DNA kkolującc poIlpepOyy okreklonc punktem (A) lut) (B), i poIlpepOyy określono Ouoktsm (C) lub (D);
A. polipopryd pekiaSsjąccsekwencjęaminckweseo/aprzedstawione SeS I dNr2 w Zektawieniu Sskwsocji
B. polipopryd o sekwencji aminckweseo/ejprzedstawionejSek I dNr2 w ZektawieniuSekwencji obsjmujący ooSotswisois, Sslscję, iooszcję, sSSycję lub iowszoję jsSosj lub wislu zsoet smiookwsoowych w oskwsocji smiookwsoowsj, i mogący twozeyć bisłko wykseującs sktywoość okoySsey hySzochioooowsj cytochzomu tyou bS wzse e ooSjsSoootką II okoySsey hySzochioooowsj cytochzomu bS OooisSsjący oskwsocję smiookwsoową ozesSotswiooą Ssk IS Nz 4,
C. polipopryd wekiaSsjąccsekwencjęaminckweseo/aprzedstawioneSek I dNr4 w Zektawieniu Sskwsocji
D. polipoprydo sekwencji aminckwesewejprzedstawionejSek I dNr4 w ZektawieniuSekwencji obsjmujący ooSotswisois, Sslscję, iooszcję, sSSycję lub iowszoję jsSosj lub wislu zsoet smiookwsoowych w oskwsocji smiookwsoowsj, i mogący twozeyć bisłko wykseującs sktywoość okoySsey hySzochioooowsj cytochzomu tyou bS wzse e ooSjsSoootką I okoySsey hySzochioooowsj cytochzomu bS OooisSsjący oskwsocję smiookwsoową ozesSotswiooą Ssk IS Nz 2,
4. DNA wsSług 1., któzy jsot DNA okzsślooym osotęoującymi ouoktsmi (s) lub (b):
s. DNA o oskwsocji ouklsotySowsj oSoowisSsjącsj ouklsotySom oS 933 So 2483 w oskwsocji ouklsotySowsj ozesSotswioosj Ssk IS Nz 1 w esotswisoiu Sskwsocji;
b. DNA eSoloy So hybzySyescji e oskwsocją ouklsotySową wsSług (s) w wszuoksch ściołych, i któzy koSujs ooliosotyS twozeący bisłko wykseującs sktywoość okoySsey hySzochioooowsj cytochzomu tyou bS wzse e ooSjsSoootką II okoySsey hySzochioooowsj cytochzomu bS OooisSsjący oskwsocję smiookwsoową ozesSotswiooą Ssk IS Nz 4.
5. DNA wsSług (2), któzy jsot DNA okzsślooym ouoktsmi (c) lub (S):
c. DNA o oskwsocji ouklsotySowsj oSoowisSsjącsj ouklsotySom oS 2476 So 3498 w oskwsocji ouklsotySowsj ozesSotswioosj Ssk IS Nz 3 w esotswisoiu Sskwsocji;
5. DNA eSoloy So hybzySyescji e oskwsocją ouklsotySową wsSług (c) w wszuoksch ściołych, i któzy koSujs ooliosotyS twoizący bisłko wykseującs sktywoość okoySsey hySzochioooowsj cytochzomu tyou bS wzse e ooSjsSoootką I okoySsey hySzochioooowsj cytochzomu bS OooisSsjący oskwsocję smiookwsoową ozesSotswiooą Ssk IS Nz 2.
6. DNA wsSług (3), obsjmujący DNA okzsślooy ouoktsmi (s) lub (b), i DNA okzsślooy ouoktsmi (c) lub (dS:
s. DNA o wekwencji nobIernyyswej oOsewiaSsjąccj nobIernyysm oo 993 do W248 w wekwencji ouklsotySowsj ozesSotswioosj Ssk IS Nz 1 w esotswisoiu Sskwsocji; lub
b. DNA zeSlno do hyb(zysyesji z sekwencją nobIernty:lswą wedłub (a) w werznCtsh ścieo/ch, i któzy koSujs ooliosotyS twozzący bisłko wykseującs sktywoość okoySsey hySzochioooowsj cytochzomu tyou bS wzse e ooSjsSoootką II okoySsey hySzochioooowsj cytochzomu bS OooisSsjący oskwsocję smiookwsoową ezzdSotswiooą Ssk IS Nz 4; i
c. DNA w sekwencji dobIedtyyso/ejdOsewiaSs)ącej dobIedtyysm wo 2247 dS d349 w sekwencji ouklsotySowsj ozesSotswioosj Ssk IS Nz 3 w esotswisoiu Sskwsocji; lub
S. DNA zeSli-o do hyb(zysyesjj z sekwencją nobIncnyyswą wedłub (c) w we)znCtsh ścistycjΊ, i któzy koSujs ooliosotyS twozzący bisłko wykseującs sktywoość okoySsey hySzochioooowsj cdeochzo4
PL 195 017 B1 mu typu bd wraz z podjednostką I oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną Sek Id Nr 2.
7. fragment DNA punktem (1) o sekwencji nukleotydowej obejmującej nukleotydy od
933 do 2483 w sekwencji nukleotydowej przedstawionej Sek Id Nr ),
8. fragme^ DNA określony (2) o sekwencj nukleotydowej obejm^ącej nukleotydy od
2476 do 3498 w sekwencji nukleotydowej przedstawionej Sek Id Nr ),
9. fragmen DNA określony punkkem (3) o sekwencj nukleooydowej ob^jj^m^u^(^^j nukleotydy od 933 do 3498 w sekwencji nukleotydowej przedstawionej Sek Id Nr ),
W opisie termin aktywność oksydazy hydrochinonowej cytochromu typu bd oznacza aktywność wykazującą spektrum różnicowej absorbancji oksydoredukcyjnej cytochromu b i cytochromu d, niezbędną do utlenienia zredukowanych związków typu hydrochinonu (chinony) z wykorzystaniem tlenu. Fragment DNA kodujący oksydazę hydrochinonową cytochromu typu bd lub jej podjednostkę oznaczany będzie dalej jako „DNA według wynalazku”.
Krótki opis figur
Figura ) przedstawia wynik badania hydropatii podjednostki I cytochromu typu bd:oksydazy hydrochinonowej. Symbolem „*” oznaczono reszty aminokwasowe wspólne dla wymienionych oksydaz.
Figura 2 przedstawia zestawienie sekwencji aminokwasowych podjednostek I cytochromu typu bd:oksydaz hydrochinonowych z Brevibacterium lactofermentum, Bacillus stearothermophilus i Escherichia coli.
Figura 3 przedstawia sekwencji aminokwasowych podjednostek II cytochromu typu bd:oksydaz hydrochinonowych z Brevibacterium lactofermentum, Bacillus stearothermophilus i Escherichia coli.
Szczegółowy opis wynalazku
Wynalazek zostanie szczegółowo wyjaśniony poniżej.
DNA według wynalazku można uzyskać z chromosomalnego DNA B.lactofermentum w oparciu o znajomość części sekwencji aminokwasowej oksydazy hydrochinonowej:cytochromu typu bd z B.flavum. Konkretnie, prowadzi się reakcję PCR z oligonukleotydowymi starterami zsyntezowanymi w oparciu o znaną sekwencją aminokwasową enzymu i chromosomalnym DNA B.flavum jako matrycą w celu uzyskania częściowej sekwncji genu oksydazy hydrochinonowej:cytochromu bd z B.flavum. Następnie można uzyskać gen oksydazy hydrochinonowej:cytochromu bd z B.lactofermentum przeglądając bibliotekę chromosomalnego DNA wykorzystując otrzymaną częściową sekwencję genu jako sondę molekularną.
Chromosomalny DNA z B.flavum i B.lactofermentum można uzyskać na przykład metodą Saito i Miury (Bioch Bioph Acta 72, 6)9, )963) i metodą Kirbiego (Biochem J 64, 405, )956). Bibliotekę chromosomalnego DNA można uzyskać poprzez częściowe strawienie chromosomalnego DNA użytecznym enzymem restrykcyjnym, ligację otrzymanych fragmentów DNA z DNA wektora replikującego się autonomicznie w komórkach E.coli w celu przygotowania zrekombinowanego DNA, i wprowadzenie uzyskanego zrekombinowanego DNA do komórek E.coli. Rodzaj wektora nie jest ograniczony w szczególny sposób, o ile jest to wektor używany zwyczajowo do klonowania DNA, i stosować można plazmidy takie, jak wektory plazmidowe: pUC) 9, pUC)8, pUC)) 8 i pUC))9, wektory fagowe, takie jak DNA faga lambda i podobne.
Starter wykorzystywany do reakcji PGR może być na przykład oligonukleotydem o sekwencji przedstawionej Sek Id Nr 7 lub Sek Id Nr 8. W celu potwierdzenia, że uzyskany produkt PGR ma pożądaną sekwencję, można potwierdzić poprzez sekwencjonowanie, stwierdzając iż posiada sekwencję odpowiadającą sekwencji startera lub stwierdzając iż wyprowadzona sekwencja aminokwasowa obejmuje częściową sekwencję aminokwasowa oksydazy hydrochiononowej cytochromu bd z B.flavum.
Przeszukiwanie biblioteki chromosomalnego DNA z B.lectofermentum z wykorzystaniem jako sondy molekularnej fragmentu DNA uzyskanego w reakcji PCR można prowadzić techniką hybrydyzacji kolonijnej, gdy jako wektor do przygotowania biblioteki stosowano wektor plazmidowy, lub techniką hybrydyzacji łysinkowej, gdy jako wektor do przygotowania biblioteki stosowano wektor fagowy. Specyficzność klonów hybrydyzujących z sondą można potwierdzić poprzez sekwencjonowanie DNA wyizolowanego z klony, w celu potwierdzenia, że klony te zawierają sekwencję genu oksydazy hydrochinonoiwej cytochromu bd. Możliwe jest również przeprowadzenie wstępnej hybrydyzacji typu Southerna z klonami pozytywnymi.
Sekwencja nukleotydowa oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd z B.lactofermentum szczep ATC )3869 uzyskana w sposób podany w przykładzie przedstawiona jest Sek Id Nr ). Przewidywane regiony kodujące i wyprowadzona sekwencja aminokwasowa białka przedstawiona jest Sek
PL 195 017 B1
Id Nr 1-4. Oszacowanie regionów kodujących oraz struktura operonu i analiza homologii oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd z B.stearothermophilus szczep K1041 i E.coli przeprowadzono wykorzystując program GENETYK, Homology ver. 2.2.2 (Software Devel Ltd).
Gen kodujący oksydazę hydrochinonową cytochromu bd obejmuje dwie otwarte ramki odczytu (cydA i cydB, zapisując od końca 5'), i kodujące odpowiednio podjednostkę I oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd (dalej określaną jako „podjednostka I”) oraz podjednostkę II oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd (dalej określaną jako „podjednostka II”). Określono iż cydA i cydB obejmują odpowiednio 1551 pz i 1023 pz, podjednostka I składa się z 517 reszt aminokwasowych, podjednostka II obejmuje 341 rest aminokwasowych. Sekwencja podobna do promotorowej obecna jest w kierunku 5' od cydA, a w kierunku 5' od cydA i cydB obecna jest sekwencja typu SD, w kierunku 3' od cydB zlokalizowano sekwencję podobną do terminatorowej. Uznano zatem, iż cydA i cydB tworzą łącznie operon cyd.
Choć kodon N-końcowego aminokwasu podjednostki określono jako GTG, a zatem odpowiadającym mu aminokwasem jest Va1 w Zestawieniu Sekwencji, w rzeczywistości jest nim Met. Uznano, że jest to spowodowane rozpoznawaniem kodonu GTG jako kodującego początkową metioninę. Przypadki takie są dobrze znane.
Figury 1 i 2 przedstawiają wyniki badania hydropatii przeprowadzone dla porównania struktury oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd według wynalazku i podjednostki I B.stearothermophilus i E.coli oraz zestawienie sekwencji aminokwasowych. Oznaczenia I-VII przedstawiają regiony helisy transmembranowej i potwierdzono, że w strukturze enzymu istnieje co najmniej siedem helis transmembranowych. Ze struktury rysunku wynika, że są one do siebie podobne. Ponadto region obejmujący miejsce wiązania hydrochinonu (pętla Q) obecny jest pomiędzy helisą V i VI podjednostki I z E.coli, podczas gdy nie istnieje region wykazujący homologię z dalszą częścią pętli Q w cydA B.stearothermophilus podobnym do B.lactofermentum, stąd pętla Q jest skrócona. Uwzględniając tę obserwację można oczekiwać że oksydaza hydrochinonowa cytochromu bd z B.lactofermentum posiada strukturę bardziej przypominającą oksydazę hydrochinonową cytochrom bd z B.stearothermophilus niż oksydazę E.coli. Porównanie sekwencji aminokwasowej podjednostki I wykazało iż enzym B.lactofermentum posiada 24,7% homologii do enzymu B.stearothermophilus i około 38,6% homologii do enzymu E.coli, co pozwala przypuszczać, że podjednostka I jako całość, oksydaza hydrochinonowa cytochromu bd B.lactofermentum posiada strukturę bardziej przypominającą oksydazę hydrochinonową cytochromu bd E.coli niż oksydazę B.stearothermophilus.
Reszty H19, H186 i M393 cydA E.coli i H21, H184 i M326 cydA B.stearothermophilus uznane zostały za reszty istotne funkcjonalnie ze względu na wiązanie hemu b558. Wspomniane reszty aminokwasowe są konserwowane ewolucyjnie również w przypadku cydA B.lactofermentum (pozycje: H18, H185 i M350).
Figura 3 przedstawia zestawienie sekwencji aminokwasowych trzech rodzajów bakteryjnej podjednostki II. Jak w przypadku podjednostki II B.lactofermentum wykazuje około 25,9% homologii do B.stearothermophilus i około 34,8% homologii do E.coli.
DNA według wynalazku jest DNA kodującym podjednostkę I, kodowaną przez nukleotydy przedstawione Sek Id Nr 2, podjednostkę II, kodowaną przez nukleotydy przedstawione Sek Id Nr 4 lub białko oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd obejmujące wspomniane podjednostki I i II. Podjednostka I, podjednostka II lub białko oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd można wytwarzać wprowadzając taki DNA do użytecznego gospodarza, i hodując uzyskanego transformanta, tak by DNA uległo ekspresji. DNA o sekwencji nukleotydowej obejmującej nukleotydy o numerach od 933 do 2483 w sekwencji nukleotydowej przedstawionej Sek Id Nr 1 można określić jako DNA kodujący podjednostkę I; DNA o sekwencji nukleotydowej obejmującej nukleotydy o numerach od 2476 do 3498 można określić jako DNA kodujący podjednostkę II; DNA o sekwencji nukleotydowej obejmującej nukleotydy o numerach od 933 do 3498 można określić jako DNA kodujący obie podjednostki.
Wytworzone białko oksydazy hydrochinonowe : cytochromu bd lub jej podjednostkę można zebrać i oczyścić z pożywki hodowlanej sposobami stosowanymi zwykle w celu oczyszczania białek, takimi jak wysalanie, wytrącanie rozpuszczalnikiem, filtracja żelowa czy chromatografia jonowymienna.
DNA według wynalazku kodujący podjednostkę I może być albo DNA kodującym polipeptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej Sek Id Nr 2, obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję lub inwersję jednego lub wielu aminokwasów w sekwencji aminokwasowej lub polipeptydem tworzącym białko wykazujące aktywność oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd w połączeniu z podjednostką II.
PL 195 017 B1
DNA według wynalazku kodujący podjednostkę II może być albo DNA kodującym polipeptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej Sek Id Nr 2, obejmującej podstawienie, delecję, insercję, addycję lub inwersję jednego lub wielu aminokwasów w sekwencji aminokwasowej lub polipeptydem tworzącym białko wykazujące aktywność oksydazy hydrochinonowej:cytochromu bd w połączeniu z podjednostką I.
Ponadto DNA kodujący oksydazę hydrochinonową cytochromu bd zawierający mutacje w podjednostce I, podjednostce II lub obu podjednostkach jest również DNA według wynalazku.
Określenie „w wielu resztach aminokwasowych” oznacza korzystnie 1-40, korzystniej 1-10 reszt aminokwasowych.
DNA kodujący zasadniczo to samo białko, co podjednostka I i/lub podjednostka II, jak przedstawiono to powyżej, można uzyskać na przykład techniką mutagenezy kierunkowej, tak by jedna lub więcej reszt aminokwasowych w konkretnych miejscach uległo podstawieniu, delecji, insercji, addycji lub inwersji. Tak zmodyfikowany DNA można uzyskać standardowymi metodami wprowadzania mutacji. Standardowe metody wprowadzania mutacji obejmują technikę traktowania DNA kodującego podjednostkę I i/lub II na przykład hydroksylaminą, i sposób traktowania bakterii należącej do rodzaju Escherichia niosącej DNA kodujący podjednostkę I i/lub podjednostkę II promieniowaniem ultrafioletowym lub czynnikiem mutagennym, takim jak N-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyna (NTG) i kwasem azotowym, zwykle używanym do mutagenezy.
Podstawienie, delecja, insercja, addycja lub inwersja nukleotydu jak przedstawiono to powyżej obejmuje mutację (mutację lub wariant polimorficzny) występującą naturalnie, na przykład, z powodu indywidualnych różnic lub różnic gatunkowych lub dotyczących rodzaju bakterii maczugowatej posiadającej oksydazę hydrochinonową cytochromu bd.
DNA kodujący białko zasadniczo identyczne z podjednostką I i/lub podjednostką II można uzyskać poprzez ekspresję DNA niosącego wymienione wyżej mutacje, w użytecznej komórce i dalsze określanie aktywności uzyskanego produktu. DNA kodujący białko zasadniczo identyczne z podjednostką I i/lub podjednostką II można uzyskać poprzez izolowanie DNA hybrydyzującego z DNA o sekwencji nukleotydowej na przykład odpowiadającej nukleotydom od 933 do 2483 sekwencji nukleotydowej przedstawionej Sek Id Nr 1 i/lub DNA o sekwencji nukleotydowej na przykład odpowiadającej nukleotydom od 2476 do 3498 sekwencji nukleotydowej przedstawionej Sek Id Nr 3 w Zestawieniu Sekwencji w warunkach ścisłych, i który koduje białko posiadające aktywność podjednostki I i/lub podjednostki II, z DNA kodującego podjednostkę I i/lub podjednostkę II niosącą mutację lub z komórki niosącej wymienione DNA.
„Warunki ścisłe” oznaczają warunki w których tworzona jest tzw. specyficzna hybryda, i nie są tworzone hybrydy niespecyficzne. Trudno wyrazić warunki podając konkretne wartości liczbowe. Jednak, na przykład warunki ścisłe obejmują warunki, w których dwie cząsteczki DNA o stopniu homologii nie mniejszym niż 50% hybrydyzują ze sobą, a cząsteczki DNA o homologii mniejszej niż 50% nie hybrydyzują ze sobą. Inaczej, warunki ścisłe przedstawia przykład warunków, w których cząsteczki DNA hybrydyzują ze sobą w roztworze o stężeniu soli odpowiadającym zwykłym warunkom płukania w technice Southerna, to jest 60°C, 1 x SSC, 0,1% SDS, korzystnie 0,1 x SSC, 0,1% SDS.
Gen hybrydyzujący z sondą w warunkach ścisłych, jak to przedstawiono powyżej, obejmuje geny posiadające kodon stop utworzony w obrębie sekwencji kodującej genu, i geny nie wykazujące aktywności ze względu na mutację centrum aktywnego kodowanego enzymu. Można jednak takie niedogodności łatwo obejść poprzez zligowanie genu z handlowo dostępnym wektorem ekspresyjnym i badanie aktywności eksprymowanej oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd.
Komórka gospodarza dla ekspresji DNA według wynalazku obejmuje na przykład różne rodzaje bakterii włączając w to E.coli, korynebakterie, takie jak B.lactofermentum i B.flavum, komórki eukariotyczne takie jak Saccharomyces cerevisiae i podobne. W celu wprowadzenia DNA według wynalazku do komórki gospodarza, takiej jak wymienione powyżej, można stosować technikę transformacji komórki gospodarza zrekombinowanym wektorem uzyskanym przez wprowadzenie DNA według wynalazku do wektora wybranego w zależności od rodzaju używanej komórki gospodarza, w której dokonuje się ekspresja DNA według wynalazku. Dokonać tego można sposobami inżynierii genetycznej, dobrze znanymi specjalistom.
DNA według wynalazku i oksydaza hydrochinonowa cytochromu bd lub jej podjednostki kodowane przez DNA według wynalazku są ważne w wyjaśnianiu szczegółów oddechowego systemu transportu elektronów w komórkach korynebakterii. Oczekuje się, że DNA według wynalazku będzie
PL 195 017 B1 używane z polepszania jakości bakterii maczugowatych wytwarzających użyteczne substancje z wysoką sprawnością energetyczną.
Najwłaściwszy sposób wykonania wynalazku
Wynalazek wyjaśniony będzie na konkretnych przykładach.
<1> Oczyszczenie oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd z Brevibacterium flavum
Komórki bakteryjne (około 120 g mokrej masy) B.flavum szczepu ATCC 1406 namnożonych do końca fazy stacjonarnej, zawieszono w 200 ml buforu (0,5% NaCl, 10 mM fosforan sodowy, pH 7,4) i natychmiast homogenizowano poprzez mieszanie w homogenizatorze kulkowym (Biospec) na wysokich obrotach w obecności 0,5 mM kuleczek szklanych. Następnie zawiesinę zhomogenizowanych komórek żwirowano przy 5000 rpm przez 10 minut w celu usunięcia nie rozbitych komórek bakteryjnych, a supernatant wirowano przy 15000 rpm przez 10 minut, następnie supernatant wirowano ponowanie przy 15000 przez 30 minut. Precypitaty uzyskane z obu wirowań połączono i zawieszono w buforze o składzie podanym powyżej, w celu uzyskania preparatu błon komórkowych.
Otrzymany tak preparat błon komórkowych (5 mg/ml, 0,5% NaCl, 10 mM fosforan sodowy pH 7,4) homogenizowano w homogenizatorze Teflona i wirowano przy 40000 rpm przez 20 minut w zebrano precypitat. Precypitat uzupełniono 0,5% deoksycholanem sodu, 0,1% NaCl i 10 mM fosforanem sodu (pH 7,4), następnie homogenizowano i wirowano przy 40000 rpm przez 20 minut i zebrano precypitat. Precypitaty uzupełniono 10 mM fosforanem sodowym (pH 7,4), homogenizowano i wirowano przy 40000 rpm przez 20 minut w celu uzyskania precypitratu.
Preparat błon komórkowych przemyto następnie kwasem cholowym jak podano poprzednio i zawieszono w buforze zawierającym czynnik aktywny powierzchniowo, n-nonanoilo-N-metyloglukamid (MEGA-9) i decanoilo-N-metyloglukamid (MEGA-10), każdy w stężeniu 1%. Zawiesinę homogenizowano na lodzie, sonikowano i wirowano przy 40000 przez 20 minut w celu uzyskania spernatantu.
Tak otrzymany supernatant absorbowano na kolumnie z hydroksyapatytu, zrównoważonej 1% MEGA-9, 1% MEGA-10, 10% glicerolem i 10 mM fosforanem sodowym (pH 7.4) i frakcjonowano poprzez elucję schodkowym gradientem stężeń fosforanu sodowego (0, 50, 150, 250 i 400 mM). Cytochromy w kolejnych frakcjach wykrywano badając różnicę spektrum zredukowanego i utlenionego. Ostatecznie cytochromy c i b wymywano z kolumny przy 50 mM fosforanie sodowym, cytochromy c, b i a wykrywano we frakcji eluowanej 150 mM fosforanem sodowym, a cytochromy b i d we frakcji eluowanej 250 mM fosforanem sodowym.
Frakcja eluowana przy stężeniu fosforanu sodowego wynoszącym 250 mM była dializowana wobec 10% glicerolu i 10 mM fosforanu sodowego (pH 7,4), następnie absorbowana na kolumnie DEAE-Toyopearl (Tosho) zrównoważonej tym samym buforem, a następnie frakcjonowana schodkowym gradientem NaCl (0, 80, 100, 120, 140 i 300 mM). Cytochromy w kolejnych frakcjach wykrywano badając różnicę spektrum zredukowanego i utlenionego. Ostatecznie cytochromy bid wymywano z kolumny przy 120 mM NaCl. Tę frakcję stosowano jako preparat oksydazy hydrochiononowej cytochromu bd.
Wspomniany powyżej preparat enzymatyczny poddano elektroforezie PAGE-SDS w 13,5% żelu i następnie przeniesiono na membranę PVDF. Fragmenty membrany w miejscach odpowiadających położeniu prążków podjednostki I i podjednostki II poddano analizie sekwencyjnej w celu określenia sekwencji N końca polipeptydu. Sekwencje aminokwasową przedstawia odpowiednio Sek Id Nr 5 (podjednostka I) i Sek Id Nr 6 (podjednostka II).
<2> Izolacja genu kodującego oksydazę hydrochinonową cytochromu bd z Brevibacterium lactofermentum.
Przeszukanie biblioteki chromosomalnego DNA B.lactofermentum w celu identyfikacji klonów zawierających gen kodujący oksydazę hydrochinonową cytochromu bd przeprowadzono techniką hybrydyzacji kolonijnej.
Zsyntezowano dwa rodzaje oligonukleotydów w oparciu o częściową sekwencje aminokwasową oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd B.flavum. Pierwszy rodzaj przygotowany został w oparciu o sekwencję N końca podjednostki I oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd (bbd1: Sek Id Nr 7), drugi przygotowany został w oparciu o sekwencję N końca podjednostki II oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd (bbd1: Sek Id Nr 8).
PCR prowadzono wykorzystując wspomniane wyżej startery (bbd1 i bbd2) i chromosomalny DNA ze szczepu ATCC 14067 jako matrycą. Profil 35 cyklicznych zmian temperatury po wstępnej denaturacji w 94°C przez 1 minutę, przedstawiał się następująco: denaturacja w 94°C przez 45 sekund, przyłączanie starterów w 50°C przez 1 minutę i wydłużanie w 62°C przez 90 sekund. W rezultacie
PL 195 017 B1 uzyskano fragmenty wielkości około 1500 pz, 800 pz i 100 pz. Opierając się na oszacowanej masie cząsteczkowej podjednostki I (56,4 kDa), otrzymanej dla oczyszczonego białka i znanej z literatury masie cząsteczkowej podjednostki I oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd z innych rodzajów bakterii, przyjęto iż fragment o wielkości 1500 pz jest właściwym. Następnie produkt PCR rozdzielono w 2% żelu agarozowym, fragment o wielkości 1500 pz wycięto z żelu w celu wyizolowania DNA.
Fragment ten uzupełniono do tępych końców wykorzystując DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) i wprowadzono do wektora plazmidowego pUC118 strawionego uprzednio enzymem Smal i traktowanego alkaliczną fosfatazą, stosując DNA Ligation Kit ver 2 (Takara Shuzo). Uzyskanym zrekombinowanym plazmidem transformowano szczep XL-1 E.coli.
Z otrzymanego transformata uzyskano plazmid i określono następnie sekwewncje nukleotydową insertu. Sekwencjonowanie przeprowadzono wykorzystując Fluorescein Labeled Primer M4 (Takara Shuzo, Sek Id Nr 9) jako primer od końca 5' oraz Fluorescein Labeled Primer RV-MF (Takara Shuzo Sek Id Nr 10) jako starter od strony 3' wstawki, zgodnie z zaleceniami producenta zestawu do fluorescencyjnego sekwencjonowania cyklicznego Termo Sequenase Kit (Amersham Life Science). W wyniku sekwencjonowania potwierdzono, iż wstawka obejmuje gen kodujący oksydazę hydrochinonową cytochromu bd. Klon określono jako BD1.
BD1 powielono w reakcji PGR z wykorzystaniem wspomnianych starterów M4 i RV-MF i przygotowano następnie sondę wykorzystując zestaw do znakowania DIG Lebelling Kit (Boehringer Mannheim).
Bibliotekę chromosomalnego DNA B.lactofermentum przeszukiwano następnie tak uzyskaną sondą. Bibliotekę otrzymano poprzez częściowe trawienie chromosomalnego DNA B.lactofermentum szczep ATCC 13869 enzymem Sau3A1, wprowadzenie uzyskanego fragmentu do miejsca BamH1 plazmidu pUC18 i transformowanie komórki E.coli uzyskanym zrekombinowanym plazmidem. Przeprowadzono następnie hybrydyzację kolonijną wobec kolonii transformantów stosując sondę wyznakowaną digoksygeniną (zestaw DIG Lebelling Kit), jak podano to wyżej. Wykrywanie związanej sondy prowadzono wykorzystując zestaw DIG Detection Kit (Boehringer Mannheim), w którym wykorzystywane są przeciwciała przeciwdigoksyeninowe sprzężone z alkaliczną fosfatazą.
Plazmid otrzymano następnie z kolonii hybrydyzujących z sondą, strawiono enzymami EcoRI i PstI i poddano hybrydyzacji typu Sutherna, stosując BD1 jako sondę. W rezultacie uzyskano dwie kolonie hybrydyzujące z sondą. Wstawki uzyskane z hybrydyzujących z sondą kolonii oznaczono jako BD21 i BD31. BD21 obejmuje około 3,8 kpz, a BD31 9,0 kpz. Uzyskane klony poddano subklonowaniu i oznaczono ich sekwencję nukleotydową. Wyniki przedstawia Sek Id Nr 1. Oczekiwane regiony kodujące białko oraz sekwencję aminokwasową przedstawiają Sek Id Nr 1-4.
Zestawienie Sekwencji <110> Ajinomoto Co, Lnc <120> Gen kodujący oksydazę hydrochinoinową cytochromu bd Brevibacterium lactofermentum <130> OP852 <140>
<141>
<150> JP 10-164019 <151> 1998-06-11 <160> 10 <170> Patentln ver 2.0 <210) 1 <211> 3936 <212> DNA <213> Brevibacterium lactofermentum <220>
<221> sekwencja kodująca <222> (9933) ··· (2483) <400> 1 ggatcctctc tcjttc^^^^^ci agcacctact cttttactcc gaagttcga a cgtgccctcg 60 acgaaagcct agaagtgacg gaccgagatg aggctgctca gaattttaag tttcacgtcc 120 aagacatcat cgaaactggg ttgtttatcg ccagaaaaaa tgaattctgg caaggaaacc 180 tcatcgttgg cgaaagatat tcccgacgag atgccigccg aattctcaat tgggaacgaa 240
PL 195 017 B1
acaatgagag cacgatttat ggttacaaag tgggcactta cacatttacg tgtttaatct 300
ttgtgaccta tcacaaggct gatgatgtac ccc^^aat cgttcttatg 360
cgatccgaat acccttcatt ggtatttccc cc^a^ccg acLgatc<t;gt ctaatgagtt 420
caagcccatc gctgcgaatg tgtggatctt c^g^^ig tgaagaagga cgatgccgaa 480
ggccttgatt tcttctacct tggttaaacc c^icag^a acagcaittca ggcatcgatg 540
cccggaaaca aaggagttgt gcaaccggtg CtcacaaCgg atctacagu osacccc^c 600
gtcgaacaaa gcctgtttga gtacctggct ccccc^^ ccgtaatgta gtaaccaccg 660
caaccaagcg tcgaaaagca aaatcttttt tatUU^g acaagggggg 720
agcaaaatca gtcattgaca gggaaaggU gaccaccatc gggtttatcc tttttttagt 780
taagctgtga gcggg^tctt aggaaΐacac ttcaacgaca agttctt.att 840
ggttcttcgt ttttgtatcgc tacccacaat cggUtcctg gcttcatact 900
tcaatctgta aagaagagga atttftacctc gc gtg gat gtc gtt gcc atc gcg 953
Val Asp 1 Val Val Asp Ile Ala 5
cgg tgg caa ttc gga atc acc acc gtc tat ccc ttc att ttt gtc cca 1001
Arg Trp Gln Phe Gly Ile Thr Thr Val Tyr His Phe Ile Phe Val Pro
10 15 20
ctg acc att ggc tta gca ccg ctg gtc gcg atc atg ccc acg ttt tgg 1049
Leu Thr Ile Gly Leu Ala Pro Leu Val Alt Ile Met Gln Thr Phe Trp
25 30 35
caa gtt acc ggc aaa gag cac tgg tat cgg gct ccg agc ttt ttt ggc 1097
Gln Val Thr Gly Lys Glu His Trp Tyr Arg Ala Thr Arg Phe Phe Gly
PL 195 017 Β1
45 50 55
act gtg ctg ctc atc aac ttc gcg gtt ggt gta gca acg ggc att gtg 1145
Thr Val Leu Leu Ile 60 Asn Phe Ala Val Gly 65 Val Ala Thr Gly Ile 70 Val
cag gag ttc cag ttc ggt atg aac tgg tcg gaa tat tcg cgt ttc gtc 1193
Gin Glu Phe Gin Phe Gly Met Asn Trp Ser Glu Tyr Ser Arg Phe Val
75 80 85
ggt gat gtt ttc ggc gga ccg ctg gct ttg gag ggg ctc atc gcg ttc 1241
Gly Asp Val Phe Gly Gly Pro Leu Ala Leu Glu Gly Leu Ile Ala Phe
90 95 100
ttc ctt gag tct gtg ttc tta ggt ctg tgg att ttc gga tgg ggg aag 1289
Phe Leu Glu Ser Val Phe Leu Gly Leu Trp Ile Phe Gly Trp Gly Lys
105 110 115
att cct gga tgg ctg cat act gcg tcc att( tgg atc gtt gct att gcg 1337
Ile Pro Gly Trp Leu His Thr Ala Ser Ile Trp Ile Val Ala Ile Ala
120 125 130 135
acg aat att tct gcc tat ttc atc atc gtg gcc aac tcg ttt atg cag 1385
Thr Asn Ile Ser Ala Tyr Phe Ile Ile Val Ala Asn Ser Phe Met Gin
140 145 150
cat ccg gtg ggt gct gag tat aac cct gag act ggt cgg gcg gag ctt 1433
His Pro Val Gly Ala Glu Tyr Asn Pro Glu Thr Gly Arg Ala Glu Leu
155 160 165
act gat ttc tgg gct ctt ctc aca aac tcc acc gcg ctg gct gcg ttc 1481
Thr Asp Phe Trp Ala Leu Leu Thr Asn Ser Thr Ala Leu Ala Ala Phe
170 175 180
ccg cat gct gtt gcc ggt ggt ttt tta aca gct gga act ttc gtc ctc 1529
Pro His Ala Val Ala Gly GLy Phe Leu Thr Ala Gly Thr Phe Val Leu
185 190 195
PL 195 017 Β1
gga Gly 200 att tcg ggt tgg tgg att att cgt gcg cac cgc cag gcg aag aag 1577
Ile Ser Gly Trp Trp 205 Ile Ile Arg Ala His Arg Gln Ala Lys Lys
210 215
gct gag gcg gaa atc gag tcg aag cat tca atg cac agg ccg gcg ttg 1625
Ala Glu Ala Glu Ile Glu Ser Lys His Ser Met His Arg Pro Ala Leu
220 225 230
tgg gtt ggt tgg tgg acc aca gtt gtc tct tcc gtg gca ctg ttc atc 1573
Trp Val Gly Trp Trp Thr Thr Val Val Ser Ser Val Ala Leu Phe Ile
235 240 245
act ggc gat aca cag gcg aag etc atg ttc gtg cag cag ccg atg aag 1721
Thr Gly Asp Thr Gln Ala Lys Leu Met Phe Val Gln Gln Pro Met Lys
250 255 260
atg gcg tcg gcg gaa tcc ttg tgt gaa acc gcc aca gat cca aac ttc 1769
Met Ala Ser Ala Glu Ser Leu Cys Glu Thr, Ala Thr Asp Pro Asn Phe
265 270 275
tcc att ctg aca att ggt acg cac aac aac tgc gat acg gta acc cac 1817
Ser Ile Leu Thr Ile Gly Thr His Asn Asn Cys Asp Thr Val Thr His
280 285 290 295
ctg atc gat gtt ccg ttt gtg ctt cca ttc ttg gct gaa gga aaa ttc 1865
Leu Ile Asp Val Pro Phe Val Leu Pro Phe Leu Ala Glu Gly Lys Phe
300 305 310
acc ggt gcg act ttg cag ggt gta aac cag ctc caa gct gca gcg gag 19L3
Thr Gly Val Thr Leu Gln Gly Val Asn Gln Leu Gln Ala Ala Ala Glu
315 320 325
caa gca tac ggt cct ggc aac tac tcc cct aac ttg ttt gtc acc tac 1961
Gln Ala Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Ser Pro Asn Leu Phe Val Thr Tyr
330 335 340
PL 195 017 Β1
tgg tca Trp Ser ttc cgc gca Ala atg atc ggc eta atg ctt ggt tct ttg gct atc 2009
Phe Arg Met Ile Gly 350 Leu Met Leu Gly Ser 355 Leu Ala Ile
345
gct gcg att gcg tgg ctg ttg ctg cgt aag aag cgc aca cca act gga 2057
Ala Ala Ile Ala Trp Leu Leu Leu Arg Lys Lys Arg Thr Pro Thr Gly
360 365 370 375
aag att gct cgt ctc ttc caa atc ggc age ctc att gee att cca ttc 2L05
Lys Ile Ala Arg Leu Phe Gin Ile Gly Ser Leu Ile Ala Ile Pro Phe
380 385 390
cca ttc ttg gct aac tct gct ggt tgg atc ttc acc gag atg ggc cgc 2153
Pro Phe Leu Ala Asn Ser Ala Gly Trp Ile Phe Thr Glu Met Gly -Arg
395 400 405
cag cct tgg gtg gta cac ccg aat cct gaa tct gee ggc gat gee ega 2201
Gin Pro Trp Val Val His Pro Asn Pro Glu Ser Ala Gly Asp Ala Arg
410 415 420
aca gag atg atc cgg atg act gtt gat atg ggt gtg tct gat cat gcg 2249
Thr Glu Met Ile Arg Met Thr Val Asp Met Gly Val Ser Asp His Ala
425 430 435
ccg tgg caa gtc tgg ctg act eta att ggc ttc acg att ctc tat ctc 2297
Pro Trp Gin Val Trp Leu Thr Leu Ile Gly Phe Thr Ile Leu Tyr Leu
440 445 450 455
atc ttg ttc gtg gtg tgg gtg tgg ctg att cgc cgc gca gtt ctg atc 2345
Ile Leu Phe Val Val Trp Val- Trp Leu Ile Arg Arg Ala Val Leu Ile
460 465 470
gga cca cca gag gaa ggc gct cca tcc gtg gag gca aag act gga ccg 2393
Gly Pro Pro Glu Glu Gly Ala Pro Ser Val Glu Ala Lys Thr Gly Pro
475 480 485
gca acc ccg att ggt tca gat atg ccc atg aca ccg ctg caa ttt acc 2441
PL 195 017 Β1
Ala Thr Pro ILe Gly Ser Asp Met Pro Met Thr Pro Leu Gin Phe Thr
490 495 500
gtg ccg ccc caa cca cac gtg aaa agg aat aac cat gga tct 2483
Val Pro Pro Gin Pro His Val Lys Arg Asn Asn His Gly Ser
505 510 515
taataccttt tggtttattc tcatcgcatt attcgacttc ggtgtcggaa ttttagcgcc cacgatcatc cgcaccatcg gccctgtctg aggtggcgct ttgtttgctg cattccctga tctgccgctg ttcctcgtgc ttgtgtcgtt caagaaagtc gatgatcctc gttggcaaaa ttggactcca ccgctgatgt ggggattcat atcaaggcgg atcacaccat cgatgctgca cgccatcctg ggtgcacttg cattcactgc ccgcctgaaa actgctggtc gggtgcgcac acttcttgct gcggtgactg gtggaccttt ttcctggtcc tggatcctcg cagtgctgat actgatcaaa gaccgcgatg gattaagctt agttgcactg ctgtttagtt ccctactccc tttgtttgcg ggatactttc tcctcgaagg 2543 gatcatcggt aaagattccg ccgctaaaaa 2503 ggacggaaat gaagtgtggc tgatcgtggc 2663 gtggtacgca acgatgttct ccggaatgta 2723 gatcatgcgc gtggtgggcc ttgaacggcg 2783 gtggtctgac cgggccatct ttattggttc 2843 cttcgccaat attttcaagc ttgcatgccc 2903 gtggctctgc tgtgcaatgt tcaacgtctt 2963 gctgttcgct cttcatggcc ttgcattcat 3023 cgatgcggcg aaggcagctc cagtagtcgc 3083 cgtgttgtgg gctgccatcg catacggccg 3143 catcgcagcg gttctcggtg gagctttcgc 3203 cctgtccact tccgtcgctg tcatcggtgt 3263 caacgtcatg ccaacaacgc ttgccgatgg 3323 cgtgactgga tatttggaac gcctccgcaa gccactacgc attgaccatc ctgacttgga 3383
PL 195 017 Β1
ccgccactgt gatcgcaccg ctggttgtcc tctaccaagg ctggacctac tgggtgttcc 3443
gcaaacgact tcacgccgag ccagtgtctg cctaaaagtt ggaaaaattg agtactaaat 3503
ctgacgctcc ggctagtcgc cgcacaggcc ccgtcgatcc gcggcttttg cgcctatccc 3563
ctgctacccg ccgttgggtg ataatcgcag gtgttctcac cgcgttgaaa actctcgcga 3623
cagtcgcaat gggcttgctc atcggccaga tggcagcggg catcattgag gtttcgggaa 3683
gttctttgcc ccgaatggaa ctcatcgcgc tcgccatcac ggtggttgtg cgcggacttc 3743
ttgcgtgggc acaggatcgg ttcggagcgc gcatcgtccc aggtgactgt ggatcttcgg 3803
gagaaaaccc tgcggcacct ggcacaaagc gatccccgca ccatcgatca agccttgtgg 3863
cgcacccgtt tgacctctgg ccttgatggt ttggggcctt acctcaccgg atttttgccg 3923
cactggccgc cac 3936
<210> 2 <211> 517 <212> białko <213> Brevibacterium lactofermentuia <400> 2
Val Asp Val Val Asp Ile Ala Arg Trp Gln Phe Gly Ile Thr Thr Val 15 10 15
Tyr His Phe Ile Phe Vał Pro Leu Thr Ile Gly Leu Ala Pro Leu Val 20 25 30
Ala Ile Met Gln Thr Phe Trp Gln Val Thr Gly Lys Glu His Trp Tyr 35 40 45
Arg Ala Thr Arg Phe Phe Gly Thr Val Leu Leu Ile Asn Phe Ala VaL
PL 195 017 Β1
55
Gly Val Ala Thr Gly Ile Val 65 70
Ser Glu Tyr Ser Arg Phe Val 85
Leu Glu Gly Leu Ile Ala Phe 100
Trp He Phe Gly Trp Gly Lys 115
Ile Trp Ile Val Ma Ile Ala 130 135
Val Ala Asn Ser Phe Met Gln 145 150
Glu Thr Gly Arg Ala Glu Leu 165
Ser Thr Ala Leu Ala Ala Phe 180
Thr Ala Gly Thr Phe Val Leu 195
Ala His .Arg Gln Ala Lys Lys 210 215
Ser Met His Arg Pro Ala Leu 225 230
Glu Phe Gln Phe Gly Met Asn Trp
75 80
Asp Val Phe Gly Gly Pro Leu Ala
90 95
Leu Glu Ser Val Phe Leu Gly Leu
105 110
Pro Gly Trp Leu His Thr Ala Ser
125
Asn Ile Ser Ala Tyr Phe Ile Ile
140
Pro Val Gly Ala Glu Tyr Asn Pro
155 160
Asp Phe Trp Ala Leu Leu Thr Asn
170 175
His Ala Val Ala Gly Gly Phe Leu
185 190
Ile Ser Gly Trp Trp Ile Ile Arg
205
Glu Ala Glu Ile Glu Ser Lys His
220
Val Gly Trp Trp Thr Thr Val Val 235 240
Ser Ser Val Ala Leu Phe [le Thr Gly Asp Thr Gln Ala Lys Leu Met 245 250 255
PL 195 017 Β1
Phe Val Gin Gin Pro Met Lys Met
260
Thr Ala Thr Asp Pro Asn Phe Ser
275 280
Asn Cys Asp Thr Val Thr His Leu
290 295
Phe Leu Ala Glu Gly Lys Phe Thr
305 310
Gin Leu Gin Ala Ala Ala Glu Gin
325
Pro Asn Leu Phe Val Thr Tyr Trp
340
Met Leu Gly Ser Leu Ala Ile Ala
355 360
Lys Lys Arg Thr Pro Thr Gly Lys
370 375
Ser Leu Ile Ala Ile Pro Phe Pro
385 390
Ile Phe Thr Glu Met Gly Arg Gin
405
Glu Ser Ala Gly Asp Ala Arg Thr
420
Met Gly Val Ser Asp His Ala Pro
435 440
Ala Ser Ala Glu Ser Leu Cys Glu
265 270
Ile Leu Thr Ile Gly Thr His Asn
285
Ile Asp Val Pro Phe Val Leu Pro
300
Gly Val Thr Leu Gin Gly Val Asn
315 320
Ala Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Ser
330 335
Ser Phe Arg Ala Met Ile Gly Leu
345 350
Ala Ile Ala Trp Leu Leu Leu Arg
365
Ile Ala Arg Leu Phe Gin Ile Gly
380
Phe Leu Ala Asn Ser Ala Gly Trp
395 400
Pro Trp Val Val His Pro Asn Pro
410 415
Glu Met Ile Arg Met Thr Val Asp
425 430
Trp Gin Val Trp Leu Thr Leu Ile
445
PL 195 017 B1
Gly Phe Thr Ile Leu Tyr Leu Ile Leu Phe Val Val Trp Val Trp Leu
450 455 460
Ile Arg Arg: Ala Val leu Il^e Gly Pro Pro GCu Glu GG/ Ala Pro Ser
465 470 477 480
Val Glu Ala Lys Thr GCy Pro Ala Thr Pro Ile Gly Ser Asp Met Pro
485 490 495
Met Thr Pro Leu Gln Phe Thr Val Pro Pro Gn Pro His Val Lys Arg 500 505 510
Asn Asn His Gly Ser 515 <210> 3 <211> 3936 <212> DNA <213> Brevibacteriim lactoferrnenim <220>
<221> sekwencja kodująca <222> (2476) . .. (3498) <400> 3 ggatcctctc tgttcaaaac agcacctact cttttactcc cgagttccga cgtgccctcg 60 acgaaagcct agaagtgacg gaccgagatg aggctgctca gaatdttaag tttcacgtcc 120 aagacatcat cgaaactggg ttgtttatcg ccagaaataa tggattctgg caaggaaacc 180 tcgtcgttgg cgaaagatat tcccgacgag atgtctgccg aattctcaat tgggaacgaa 240 acaatgagag cacgatttat ggttacaaag tggacagcta cacatcgacg tgcccaatct 300 ttgtgaccta tcacaaggct gatgatgtat ccgaagtact cgttaccagg atgaactcgt 360
PL 195 017 Β1
cgatccgaat acccttcatt ggtattcccg cggcaaccga aagatcacgt ctaatgagat 420
caagcccatc gctgcgaatg tgtggatctt catgtttttg tgaagaagga cgatgccgaa 480
ggccttgatt tcttctacct tggtcaagcg cattcagaaa acagcaaaca gtcatcgatg 540
cccggaaaca aaggagttgt gcaaccggtg gtcacaatgg atctacagtt cgacacaccc 600
gtcgaacaaa gcctgtttga gtacctgagc acaaatctcg ccgtaacgga gtaaccaccg 660
caaccaagcg tcgaaaagca aaatcttttc gagtttttgg tgacttgtca acaagggggg 720
agcaaaatca gtcattgaca gggaaaggtt gaccacaatc ggggttagcc tttctaaagt 780
taagctgtga gcgggaactt aggaataaac ttcaacgaca acctttaaga agctcttatt 840
ggttcttcgt tttgtatcga taaatacaat cggtttcctg gctcaataag gctgttcctg 900
tcaatctgta aagaagagga aggggaccta gcgtggatgt cgttgacatc gcgcggtggc 960
aattcggaat taccaccgtc tatcacttca tttttgtccc actgaccatt ggcttagcac 1020
cgctggtcgc gatcatgcaa acgttttggc aagttaccgg caaagagcac tggtatcggg 1080
ctacgagatt ttttggcact gtgctgctca tcaacttcgc ggttggtgta gcaacgggca 1140
ttgtgcagga gttccagttc ggtatgaact ggtcggaata ttcgcgtttc gtcggtgatg 1200
ttttcggcgg accgctggct ttggaggggc tcatcgcgtt cttccttgag tctgtgttct 1260
taggtctgtg gattttcgga tgggggaaga ttcctggatg gctgcatact gcgtccattt 1320
ggatcgttgc tattgcgacg aatatttctg cctatttcat catcgtggcc aactcgttta 1380
tgcagcatcc ggtgggtgct gagtataacc ctgagactgg tcgggcggag cttactgatt 1440
PL 195 017 Β1
tctgggctct tctcacaaac tccaccgcgc tggctgcgtt cccgcatgct gttgccggtg 1500
gttttttaac agctggaact ttcgtcctcg gaatttcggg ttggtggatt attcgtgcgc 1560
accgccaggc gaagaaggct gaggcggaaa tcgagtcgaa gcattcaatg cacaggccgg 1620
cgttgtgggt tggttggtgg accacagttg tctcttccgt ggcactgttc atcactggcg 1680
atacacaggc gaagctcatg ttcgtgcagc agccgatgaa gatggcgtcg gcggaatcct 1740
tgtgtgaaac cgccacagat ccaaacttct ccattctgac aattggtacg cacaacaact 1800
gcgatacggt aacccacctg atcgatgttc cgtttgtgct tccattcttg gctgaaggaa 1860
aattcaccgg tgtgactttg cagggtgtaa accagctcca agctgcagcg gagcaagcat 1920
acggtcctgg caactactcc cctaacttgt ttgtcaccta ctggtcattc cgcgcaatga 1980
tcggcctaat gcttggttct ttggctatcg ctgcgąttgc gtggctgttg ctgcgtaaga 2040
agcgcacacc aactggaaag attgctcgtc tcttccaaat cggcagcctc attgccattc 2100
cattcccatt cttggctaac tctgctggtt ggatcttcac cgagatgggc cgccagcctt 2160
gggtggtaca cccgaatcct gaatctgccg gcgatgcccg aacagagatg atccggatga 2220
ctgttgatat gggtgtgtct gatcatgcgc cgtggcaagt ctggctgact ctaattggct 2280
tcacgattct ctatctcatc ttgttcgtgg tgtgggtgtg gctgattcgc cgcgcagttc 2340
tgatcggacc accagaggaa ggcgctccat ccgtggaggc aaagactgga ccggcaaccc 2400
cgattggttc agatatgccc atgacaccgc tgcaatttac cgtgccgccc caaccacacg 2450
tgaaaaggaa taacc atg i gat ctt aat acc ttt tgg ttt att ctc atc gca 2511
Met Asp Leu Asn Thr Phe Trp Phe Ile Leu Ile Ala
PL 195 017 Β1
ttc ttg ttt gcg Ala gga tac ttt ctc ctc gaa gga ttc gac ttc ggt gtc 2559
Phe Leu Phe 15 Gly Tyr Phe Leu 20 Leu Glu Gly Phe Asp 25 Phe Gly Yal
gga att tta gcg ccg atc atc ggt aaa gat tcc gcc gct aaa aac acg 2607
Gly Ile Leu Ala Pro Ile Ile Gly Lys Asp Ser Ala Ala Lys Asn Thr
30 35 40
atc atc cgc acc atc ggc cct gtc tgg gac gga aat gaa gtg tgg ctg 2655
Ile Ile Arg Thr Ile Gly Pro Yal Trp Asp Gly Asn Glu Val Trp Leu
45 50 55 60
atc gtg gca ggt ggc gct ttg ttt gct gca ttc cct gag tgg tac gca 2703
Ile Val Ala Gly Gly Ala Leu Phe Ala Ala Phe Pro Glu Trp Tyr Ala
65 70 75
acg atg ttc tcc gga atg tat ctg ccg ctg ttc ctc gtg ctt gtg tcg 2751
Thr Met Phe Ser Gly Met Tyr Leu Pro Leu, Phe Leu Val Leu Yal Ser
80 85 90
ttg atc atg cgc gtg gtg ggc ctt gaa tgg cgc aag aaa gtc gat gat 2799
Leu Ile Met Arg Val Val Gly Leu Glu Trp Arg Lys Lys Val Asp Asp
95 100 105
cct cgt tgg caa aag tgg tct gac cgg gcc atc ttt att ggt tct tgg 2847
Pro Arg Trp Gln Lys Trp Ser Asp Arg Ala Ile Phe Ile Gly Ser Trp
110 115 120
act cca ccg ctg atg tgg gga ttc atc ttc gcc aat att ttc aag ctt 2895
Thr Pro Pro Leu Met Trp Gly Phe Ile Phe Ala Asn Ile Phe Lys Leu
125 130 135 140
gca tgc cca tca agg cgg atc aca cca tcg atg ctg cag tgg ctc tgc 2943
Ala Cys Pro Ser Arg Arg Ile Thr Pro Ser Met Leu Gln Trp Leu Cys
145 150 155
PL 195 017 Β1
tgt gca atg ttc aac gtc ttc gee atc ctg ggt gca ctt gca ttc act 2991
Cys Ala Met Phe Asn Val Phe Ala Ile Leu Gly Ala Leu Ala 170 Phe Thr
160 165
gcg ctg ttc gct ctt cat ggc ctt gca ttc atc cgc ctg aaa act gct 3039
Ala Leu Phe Ala Leu His Gly Leu Ala Phe Ile Arg Leu Lys Thr Ala
175 180 185
ggt cgg gtg cgc acc gat gcg gcg aag gca gct cca gta gtc gca ctt 3087
Gly Arg Val Arg Thr Asp Ala Ala Lys Ala Ala Pro Val Val Ala Leu
190 195 200
ctt gct gcg gtg act ggt gga cct ttc gtg ttg tgg gct gee atc gca 3135
Leu Ala Ala Val Thr Gly Gly Pro Phe Val Leu Trp Ala Ala Ile Ala
205 210 215 220
tac ggc cgt tcc tgg tcc tgg atc ctc gca gtg ctg atc atc gca gcg 3183
Tyr Gly Arg Ser Trp Ser Trp Ile Leu Ala Val Leu Ile Ile Ala Ala
225 230 235
gtt etc ggt gga gct ttc gca ctg atc aaa gac cgc gat gga tta age 3231
Val Leu Gly Gly Ala Phe Ala Leu Ile Lys Asp .Arg Asp Gly Leu Ser
240 245 250
ttc ctg tcc act tcc gtc gct gtc atc ggt gta gtt gca ctg ctg ttt 3279
Phe Leu Ser Thr Ser Val Ala Val Ile Gly Val Val Ala Leu Leu Phe
255 260 265
agt tcc eta ttc ccc aac gtc atg cca aca acg ctt gee gat ggc g^g 3327
Ser Ser Leu Phe Pro Asn Val Met Pro Thr Thr Leu Ala Asp Gly Val
270 275 280
act gga tat ttg gaa cgc ctc cgc aag cca eta cgc att gac cat cct 3375
Thr Gly Tyr Leu Glu Arg Leu Arg Lys Pro Leu Arg Ile Asp His Pro
285 290 295 300
gac ttg gac cgc cac tgt gat cgc acc gct ggt tgt cct eta cca agg 3423
PL 195 017 Β1
Asp Leu Asp Arg His Cys Asp Arg Thr Ala Gly Cys Pro Leu Pro Arg
305 310 315
ctg gac eta ctg ggt gtt ccg caa acg act tea ege ega gee agt gtc
Leu Asp Leu Leu Gly Val Pro Gln Thr Thr Ser Arg Arg Ala Ser Val
320 325 330
tgc eta aaa gtt gga aaa att gag tac taaatcti gac gctccggci ta
Cys Leu Lys Val Gly Lys Ile Glu Tyr
335 340
gtcgccgcac aggccccgtc gatccgcggc ttttgcgcct atcccctgct acccgccgtt 3578
gggtgataac cgcaggtgtt ctcaccgcgt tgaaaactct cgcgacagtc gcaatgggct 3638
tgctcatcgg ccagatggca gcgggcatca ttgaggtttc gggaagttct ttgccccgaa 3698
tggaactcat cgcgctcgcc atcacggtgg ttgtgcgcgg acttcttgcg tgggcacagg 3758
atcggttcgg agcgcgcatc gtcccaggtg t ' actgtggatc ttcgggagaa aaccctgcgg 3818
cacctggcac aaagcgatcc ccgcaccatc gatcaagcct tgtggcgcac ccgtttgacc 3878
tctggccttg atggtttggg gccttacctc accggatttt tgccgcactg gccgccac 3936
<210> 4 <21> 341 <212> białko <213> Brevibacterium lactofermentum <400> 4
Met Asp Leu Asn Thr Phe Trp Phe Ile Leu Ile Ala Phe Leu Phe Ala 15 10 15
Gly Tyr Phe Leu Leu Glu Gly Phe Asp Phe Gly Val Gly Ile Leu Ala 20 25 30
PL 195 017 Β1
Pro Ile Ile Gly Lys Asp Ser Ala Ala Lys Asn Thr Ile Ile Arg Thr 35 40 45
Ile Gly Pro Val Trp Asp Gly Asn Glu Val Trp Leu Ile Val Ala Gly 50 55 60
Gly Ala Leu Phe Ala Ala Phe Pro Glu Trp Ty.r Ala Thr Met Phe Ser 65 70 75 80
Gly Met Tyr Leu Pro Leu Phe Leu Val Leu Val Ser Leu Ile Met Arg 85 90 95
Val Val Gly Leu Glu Trp Arg Lys Lys Val Asp Asp Pro Arg Trp Gln 100 105 110
Lys Trp Ser Asp Arg Ala Ile Phe Ile Gly Ser Trp Thr Pro Pro Leu 115 120 125
Met Trp Gly Phe Ile Phe Ala Asn Ile Phe Lys Leu Ala Cys Pro Ser 130 135 140
Arg Arg Ile Thr Pro Ser Met Leu Gln Trp Leu Cys Cys Ala Met Phe
145 150 155 160
Asn Val Phe Ala Ile Leu Gly Ala Leu Ala Phe Thr Ala Leu Phe Ala
165 170 175
Leu His Gly Leu Ala Phe Ile Arg Leu Lys Thr Ala Gly Arg Val .Arg 180 L85 190
Thr Asp Ala Ala Lys Ala Ala Pro Val Val Ala Leu Leu Ala Ala Val 195 200 205
Thr Gly Gly Pro Phe Val Leu Trp Ala Ala Ile Ala Tyr Gly Arg Ser 210 215 220
PL 195 017 B1 <210> 5 <211> 19 <213> Brevibacterium lactofermentum <220>
<221> niepewne <222> (18) <400> 5
Met Asp Val Val Asp Ile Ala Arg Trp Gin Phe Gly Ile Thr Ala Val Tyr Xaa Phe <210> 6 <211> 20 <212> białko <213> Brevibacterium lactofermentum <220>
<221> niepewne <222> (16, 17) <400> 6
Met Asp Leu Asn Thr Phe Trp Phe Ile Leu Ile Ala Phe Leu Phe Xaa Xaa Tyr Phe Leu <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> opis sztucznej sekwencji: starter PCR <220>
<221> cechy mieszane <222> (9, 12) <223> n=a lub c lub g lub t <400> 7 atggaygtng togayatygc <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> opis sztucznej sekwencji: starter PCR <400> 8 caraargtrt tvarrtccat <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> opis sztucznej sekwencji: starter PCR <400> 9 cgccagggtt ttcccagtca cgac <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> opis sztucznej sekwencji: starter PCR <400> 10 gagcggataa caatttcaca cagg
PL 195 017 B1

Claims (7)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Fragment DNA kodujący polipeptyd określony punktami (A) lub (B) (A) pollppptyd pooiadająąc sekwencję aminokwaaową przeddtawionąSek I d Nr 2 w Zeetawieniu Sekwencji;
    (B) pollpeptyd o sekwencji aminokwaaowej pr^^c^^t^v^ic^ri^j Sek I d Nr 2 w Zeetawieniu Sekwencji obejmujący podstawienie, delecję, insercję, addycję lub inwersję jednej lub wielu reszt aminokwasowych w sekwencji aminokwasowej, i mogący tworzyć białko wykazujące aktywność oksydazy hydrochinonowej cytochromu typu bd wraz z podjednostką II oksydazy hydrochinonowej cytochromu typu bd, posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną Sek Id Nr 4.
  2. 2. Fragment DNA kodujący polipeptyd określony punktami (C) lub (D) (C) pplippptyy ppsiaddjącc ιβΙ^νβικ^ sminokwasową przzestywioną Seeid Nr S w Ze^twieniu Sekwencji (D) pollpeptyd o sekwencji sminodwasowaj przeestywic>kcj Sek I d Nr S w Zedtywinrιiu Sekwencji obejmujący podstawienie, delecję, insercję, addycję lub inwersję jednej lub wielu reszt aminokwasowych w sekwencji aminokwasowej, i mogący tworzyć białko wykazujące aktywność oksydazy hydrochinonowej cytochromu typu bd wraz z podjednostką I oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną Sek Id Nr 2
  3. 3. Fragmenn DNA kodujący pollpeptyd określony punktem (A) lub (B) i pollpeppyd określony punktem (C) lub (D);
    (A) poilppptyd pokiadającc sekwencję aminokwasową przeestawic>r^ąSek I d Nr S w Ze^wiemu Sekwencji (B) poNpepPyd o sekwen^j aminokwasowej przedstawionej Sek I d Nr 2 w Ze^wieniu Sekwencji obejmujący podstawienie, delecję, insercję, addycję lub inwersję jednej lub wielu reszt aminokwasowych w sekwencji aminokwasowej, i mogący tworzyć białko wykazujące aktywność oksydazy hydrochinonowej cytochromu typu bd wraz z podjednostką II oksydazy hydrochinonowej cytochromu typu bd, posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną Sek Id Nr 4 (C) pc^lil^^e^Pty pokiaddjącc sodwarιgę sminodwasową przzestywic>ką SsIId Nr I w Zedtywioniu Sekwencji (D) pollpeptyd o sekwencji sminodwasowaj przeestawic>kej Sek I d Nr I w Zedtywioniu Sekwencji obejmujący podstawienie, delecję, insercję, addycję lub inwersję jednej lub wielu reszt aminokwasowych w sekwencji aminokwasowej, i mogący tworzyć białko wykazujące aktywność oksydazy hydrochinonowej cytochromu typu bd wraz z podjednostką I oksydazy hydrochinonowej cytochromu typu bd, posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną Sek Id Nr 2
  4. 4. DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że DNA określone jest punktem (a) lub (b):
    (a) DNA o sekwen^j nukleotydowee odpowiadającej nukleotydom od 933 do 2483 w sekwen^j nukleotydowej przedstawionej Sek Id Nr 1 w Zestawieniu Sekwencji;
    (b) DNA zddny do hybrydyza^j z sekwengą nukleotydową według (aa w warunkach ścisSych, który koduje polipeptyd tworzący białko wykazujące aktywność oksydazy hydrochinonowej cytochromu typu bd wraz z podjednostką II oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną Sek Id Nr 4.
  5. 5. DNA według zastrz. 2, znamienny tym, że DNA określony jest punktem (c) lub (d):
    (c) DNA o sekwencji nukleetydowaj oOpowindającej nukleetyyom od 2476 do 3398 w s^Ιιι^^γ^ο^ϊ nukleotydowej przedstawionej Sek Id Nr 3 w Zestawieniu Sekwencji;
    (d) DNA zddny do hydr/dyzaccj z sekweποϊ nukleotydową według (cc w warunkach śccsSych, i który koduje polipeptyd tworzący białko wykazujące aktywność oksydazy hydrochinonowej cytochromu typu bd wraz z podjednostką l oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną Sek Id Nr 2.
  6. 6. DNA według zasSrz. 3, znamienny t^r^, że οΡθΙι^ι^ DNA okreśiony punkkem (aa lub (b), i znamienny tym, że obejmuje DNA określony punktem (c) lub (d):
    (a) DNA o sekwencji nukleotydowej odpowiadającej nukleotydom od 933 do 2483 w sekwencji nukleotydowej przedstawionej Sek Id Nr 1 w Zestawieniu Sekwencji; lub (b) DNA zddny do ήγόιγόγζ3(ϊ z sekwengą nukleotydową według (aa w warunkach ścistych, i który koduje polipeptyd tworzący białko wykazujące aktywność oksydazy hydrochinonowej cytochromu typu bd wraz z podjednostką II oksydazy hydrochinonowej cytochromu bd posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną Sek Id Nr 4; i
    PL 195 017 B1 (c) DNA o sekwencji nukleotydowejodpowiadającejnukleotydom od 2476d o3498w sekwencji nukleotydowej orzoPetdwimuoj Sok IP Ar 4 w Zoetdwiouik Sokwoucji; lub (P) DNA zdolnu do hydbrdpyadji z sekwekcjo nuUleotyddwe wwołuu (c) w wwo^iaC ścistydC, i który koOujo oolioootdd tworaccd białko wdkddujcco dktdwuoćć okedOdad yddrocyiuouowoj cdtocyromu tdpu bO wrda a oodjoduoetkc I okedOdad ydOrocyiuouowoj cdtocyromu bO ooeidOdjccd eokwoucję dmiuokwdeowc oraoOetdwiouc Sok IO Ar 4.
    6. FragmeouDNA weOłuuzastrz. 1 ,znamienny tym, zepooiados ekwekcjek ukleotydddw o Objmujccc ukklootddd oO 844 Oo 4784 w eokwoucji ukklootddowoj ordodetdwiouoj Sok IO Ar 1.
  7. 8. FragmmknDNA weOłukmastrz. 1 ,znamienny tymi, Zepodić^gds ekwekcjek uUleotydddw o Objmujccc uuklootddd oO 4766 Oo 4788 w eokwoucji uuklootddowoj ordodetdwiouoj Sok IO Ar 1.
    8. FragmmknDNAweOłukmastrz. . ,znamienny tymi, Zepodić^gds ekwekcjek uUleotydddw o Objmujccc uuklootddd oO 844 Oo 4788 w eokwoucji uuklootddowoj ordodetdwiouoj Sok IO Ar 1.
PL333692A 1998-06-11 1999-06-11 Gen kodujący oksydazę hydrochinonową typu cytochromu bd z Brevibacterium lactofermentum PL195017B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP10164019A JPH11346776A (ja) 1998-06-11 1998-06-11 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼ遺伝子

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL333692A1 PL333692A1 (en) 1999-12-20
PL195017B1 true PL195017B1 (pl) 2007-08-31

Family

ID=15785252

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL333692A PL195017B1 (pl) 1998-06-11 1999-06-11 Gen kodujący oksydazę hydrochinonową typu cytochromu bd z Brevibacterium lactofermentum

Country Status (13)

Country Link
US (1) US6156886A (pl)
EP (1) EP0967282B1 (pl)
JP (1) JPH11346776A (pl)
KR (1) KR100629091B1 (pl)
CN (1) CN1160459C (pl)
AU (1) AU749069B2 (pl)
BR (1) BR9902248A (pl)
DE (1) DE69926691T2 (pl)
ID (1) ID22875A (pl)
MY (1) MY114645A (pl)
PE (1) PE20000759A1 (pl)
PL (1) PL195017B1 (pl)
SK (1) SK284945B6 (pl)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11346776A (ja) * 1998-06-11 1999-12-21 Ajinomoto Co Inc ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼ遺伝子
JP4380029B2 (ja) * 2000-07-05 2009-12-09 味の素株式会社 微生物を利用した物質の製造法
JP2002078490A (ja) * 2000-09-06 2002-03-19 Ajinomoto Co Inc コリネ型細菌の呼吸鎖酵素遺伝子
US20040014180A1 (en) * 2000-09-14 2004-01-22 Michael Bott Method for the microbial production of metabolic products, polynucleotides from coryneform bacteria and use thereof
EP1476563B1 (en) * 2002-02-26 2008-09-17 E.I. Du Pont De Nemours And Company Method for the recombination of genetic elements
US6977162B2 (en) 2002-03-01 2005-12-20 Ravgen, Inc. Rapid analysis of variations in a genome
US7727720B2 (en) 2002-05-08 2010-06-01 Ravgen, Inc. Methods for detection of genetic disorders
US7442506B2 (en) 2002-05-08 2008-10-28 Ravgen, Inc. Methods for detection of genetic disorders
US7026233B2 (en) * 2003-08-06 2006-04-11 Taiwan Semiconductor Manufacturing Company, Ltd. Method for reducing defects in post passivation interconnect process

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW256842B (pl) * 1991-12-17 1995-09-11 Takeda Pharm Industry Co Ltd
TW293827B (pl) * 1992-04-20 1996-12-21 Takeda Pharm Industry Co Ltd
TW293022B (pl) * 1992-07-27 1996-12-11 Takeda Pharm Industry Co Ltd
DE4411864A1 (de) * 1994-04-08 1995-10-12 Basf Schwarzheide Gmbh Verfahren zur Herstellung von harten bis zähharten Polyurethanschaumstoffen mit erhöhtem Anteil an offenen Zellen und vermindertem Schrumpf
DE4418507A1 (de) * 1994-05-27 1995-11-30 Bayer Ag Verfahren zur Herstellung offenzelliger Polyurethan-Hartschaumstoffe und ihre Verwendung als Isoliermaterial in Paneelen und als Isolierschaumstoffe
DE19545165A1 (de) * 1995-12-04 1997-06-05 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von offenzelligen Polyurethan-Schaumstoffen
US5721284A (en) * 1996-12-20 1998-02-24 The Dow Chemical Company Open-celled rigid polyurethane foam
DE19742013A1 (de) * 1997-09-24 1999-03-25 Basf Ag Offenzellige Hartschaumstoffe auf Isocyanatbasis
JPH11346776A (ja) * 1998-06-11 1999-12-21 Ajinomoto Co Inc ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼ遺伝子

Also Published As

Publication number Publication date
EP0967282B1 (en) 2005-08-17
KR20000006104A (ko) 2000-01-25
CN1160459C (zh) 2004-08-04
KR100629091B1 (ko) 2006-09-28
SK284945B6 (sk) 2006-03-02
CN1239142A (zh) 1999-12-22
JPH11346776A (ja) 1999-12-21
EP0967282A2 (en) 1999-12-29
DE69926691D1 (de) 2005-09-22
ID22875A (id) 1999-12-16
MY114645A (en) 2002-11-30
EP0967282A3 (en) 2001-12-05
US6156886A (en) 2000-12-05
AU3392699A (en) 1999-12-23
AU749069B2 (en) 2002-06-20
DE69926691T2 (de) 2006-06-14
BR9902248A (pt) 2000-05-02
PE20000759A1 (es) 2000-08-29
PL333692A1 (en) 1999-12-20
SK77199A3 (en) 2000-05-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101904675B1 (ko) 5&#39;-이노신산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 5&#39;-이노신산의 생산 방법
Arias et al. Characterization and modelling of VanT: a novel, membrane‐bound, serine racemase from vancomycin‐resistant Enterococcus gallinarum BM4174
Petruschka et al. The cyo operon of Pseudomonas putida is involved in carbon catabolite repression of phenol degradation
Kusumoto et al. Menaquinol oxidase activity and primary structure of cytochrome bd from the amino-acid fermenting bacterium Corynebacterium glutamicum
PL195017B1 (pl) Gen kodujący oksydazę hydrochinonową typu cytochromu bd z Brevibacterium lactofermentum
JP6455430B2 (ja) キサンチンオキシダーゼ遺伝子とそれをコードするアミノ酸配列
EP3147351B1 (en) Microorganism having improved intracellular energy level and method for producing l-amino acid using same
Satoh et al. Characterization of RecA424 and RecA670 proteins from Deinococcus radiodurans
CN1085249C (zh) 变体乳链菌肽的生产
US20050089972A1 (en) Production of porphyrins
JP4157314B2 (ja) 酢酸耐性遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法
US7501262B2 (en) Promoters and gene expression method by using the promoters
JPWO2002044387A1 (ja) 新規なフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
Stoyan et al. Cloning, sequencing and overexpression of the leucine dehydrogenase gene from Bacillus cereus
US6280972B1 (en) Activator for methanol dehydrogenase and gene thereof
JP2002017351A (ja) ホスホヘキシュロイソメラーゼ及びその遺伝子
JP5317081B2 (ja) 酸化ストレス耐性を付与した乳酸菌及び新規発現ベクターを用いたタンパク質生産システム
US20040014180A1 (en) Method for the microbial production of metabolic products, polynucleotides from coryneform bacteria and use thereof
US6331428B1 (en) Hexulose phosphate isomerase gene
CN111635879A (zh) L-赖氨酸高产菌株及其构建方法和应用
ZA200501158B (en) Nucleotide sequences that encode deregulated phosphoglycerate dehydrogenases of coryneform bacteria and method for producing L-serine
MXPA99005412A (en) Gene of quinol oxidase of the cytochrome type bd of brevibacterium lactofermen
JP2003189863A (ja) アスパラギン酸アミド並びにその誘導体の製造方法
JP3330670B2 (ja) アルケンモノオキシゲナーゼ、これをコードする遺伝子及び形質転換微生物並びにアルケンのエポキシ化方法
JP2978001B2 (ja) ポルｉ型ｄｎａポリメラーゼ遺伝子のクローニング方法