CN110857317A

CN110857317A - 一种甘蓝型油菜nac47转录因子及其制备方法与应用

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Publication number: CN110857317A
Application number: CN201810932031.9A
Authority: CN
Inventors: 江元清; 杨博; 陈芹芹; 牛芳芳; 燕敬利
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2018-08-16
Filing date: 2018-08-16
Publication date: 2020-03-03
Anticipated expiration: 2038-08-16
Also published as: CN110857317B

Abstract

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种甘蓝型油菜NAC47转录因子及其制备方法与应用。具体的公开了甘蓝型油菜NAC47转录因子的基因结构，以及其制备方法与在正调控油菜叶片的衰老的应用；并且公开了甘蓝型油菜NAC47基因的表达能引起细胞的坏死导致的电导率上升、过氧化氢含量的上升、叶绿素含量的降低、花青素含量的升高以及丙二醛含量的上升；使甘蓝型油菜中RbohD、RbohF、YLS9、BFN1、CEP1及两个VPE基因的表达更好的得到控制激活及表达。

Description

一种甘蓝型油菜NAC47转录因子及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，特别是涉及一种甘蓝型油菜NAC47转录因子及其制备方法与应用。

背景技术

在生长过程中，农作物的产量和质量受到一系列因素的影响，包括干旱、盐害、热害、冷害等。据报道，世界上主要农作物大约超过50％的产量受到损失(Ahuja et al.,2010；Lobell et al.,2011；Shao etal.,2009)。油菜作为重要的油料作物，研究其抗逆机制，增强其抗逆能力，提高产量具有重要意义。

国内外的多个报道表明，活性氧(ROS)是植物中调控对多种环境胁迫与病原物的响应与耐受性的重要的信号分子，维持植物细胞内适度的ROS水平，是植物生长发育的必需的；而偏高的ROS积累，则能提高对于多种病原物的耐受性。但是，如果ROS水平太高，也会对植物的生长发育造成不良影响。因此，挖掘维持植物体内ROS稳态平衡的重要基因与蛋白，具有重要的理论与现实价值。ROS还能促进植物的衰老，而适度地延缓植物的衰老是一个有效地提高植物抗旱性进而提高产量的方法，但是“贪青晚熟”也会影响下一轮作物的播种与栽培。拟南芥是重要的模式植物，同属十字花科的甘蓝型油菜则是我国重要的油料作物，环境胁迫包括干旱以及冷害等严重影响菜籽的产量与品质。利用分子生物学与遗传学方法，挖掘油菜中调控抗逆的基因并阐明它们在增强油菜抗逆性上的应用，通过分子辅助的育种技术培育高产、抗逆的油菜新品种，是一条行之有效的途径。

NAC转录因子组成了植物特异的最大转录因子家族之一，普遍存在于多种植物中。研究发现在过表达ANAC019、ANAC055或ANAC072的转基因植物中，一些胁迫相关基因的表达上调而且这些转基因植物的耐旱性提高(Nakashima et al.,2012)。ANAC096转录因子通过调控RD29A的表达提高转基因拟南芥对于干旱和渗透胁迫的抗性。Wu et al.等发现拟南芥ATAF1(ANAC002)基因的表达受到多种胁迫的诱导，如干旱、ABA、灰霉菌感染等，ATAF1过表达株系对高盐、ABA、氧化胁迫敏感，但是对干旱胁迫耐受；此外，ATAF1过表达株系具有生长矮小，主根较短等特点(Wu et al.,2009)。水稻中的NAC转录因子基因SNAC3能通过调控ROS的稳态平衡，提高耐热性与耐旱性(Fang et al.,2015)。

NAC转录因子作为植物特异的转录因子家族，能够形成多种蛋白复合体，组成各种精密的调控网络参与植物的生长发育及胁迫响应过程。然而关于NAC转录因子的功能研究目前主要集中于模式植物拟南芥及水稻，在油菜中的研究还比较少。

发明内容

本发明提供了一种甘蓝型油菜NAC47转录因子及其制备方法与应用。

具体技术方案是，所述甘蓝型油菜NAC47转录因子的碱基序列具体如下：

ATGATAAGCAAGGATCCAAGATCAAGCTTACCACCAGGGTTTCGATTTCATCCAACAGATGAAGAACTCATCCTCCATTACCTAAGGAAGAAGGTTTCCTCCTTACCAGTCCCTCTTTCGATCATCGCAGATGTCGATATCTATAAGTCTGATCCATGGGACTTACCAGCTAAGGCTCCGTTTGGAGAGAAAGAATGGTATTTTTTCAGTCCGAGGGACAGGAAGTATCCCAATGGAGCAAGACCAAACAGAGCGGCCGCGTCTGGATATTGGAAAGCCACAGGAACAGATAAATTAATCGCGGTACCAAACCGTGAAGGGTTTAATGAAAACATTGGTATAAAAAAGGCTCTTGTGTTTTACACAGGAAAGCCTCCAAAAGGTGTTAAAACCAACTGGATCATGCATGAGTATCGACTTGCCGAATCCTTATCGCCCAAAAGAGTGGCCCATGCTAGGAACGGTAGCCAAGTCAATAATTTGGGAGATAGGACTTTAAAATCTACAGAATACTCAATGAGGCTGGATGATTGGGTTCTTTGCCGTATTTACAAGAAATCACACGCTTCATTGTCATCACCAGAGGTTGCTTCAGCTACAAGCGAGGATCAGGAACATGAGGAAAATGACAACGAACCATTCGTAGTCAGCGAAACCCTTTTGCCAAATTTGGCAAACGATCAAACCCTTAAACGCCAGCAGTCTTCTTTCTCCAACTTACTAGACGCTACAGATTTGACGTTCTTGACAAATTTTCTAAACGAAACTCCGGAAAATCGTACTGAATCAGAGTTTTCTTTCTTGTTTGGAGATTTCTCAAACCCTGACATCTACGGAAACCGTTACTTGGATCACAAGTTACCGCAGTTGAGCTCTCCCACTTCAGAGACCAGAGTTATAGGAAACAAAAGAGAAAGAGTGGATTATGCTGAAGAAATGATGAACAATTCAAAGAAGATCAACAACTTTAGTTACAATAATAGTATAGATCATTTGGATCATAGTCTGATTCAACAATCTAGTTTTCTGAATCAAGAACTCTTGATCAGTCCTCACCTTAAGTATCAAGGCTAG。

进一步的，所述甘蓝型油菜NAC47转录因子基因编码的蛋白氨基酸序列如下：

一种制备甘蓝型油菜NAC47转录因子的方法，包括以下步骤，(1)采用PlantRNAkit提取甘蓝型油菜幼苗的总RNA，经过NanoDrop1000定量后，各取2.5μg总RNA，采用RevertAid RNase H-First Strand cDNA Synthesis Kit进行逆转录反应；(2)进行PCR，PCR反应体系为5PrimeStarbuffer 10μL、cDNA模板1μL、dNTPs 1μL、Primer F 1μL、PrimerR 1μL、PrimeStar 0.5μL、ddH₂O加至终体积50μL，PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30sec，50℃复性l min，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸10min；(3)1％琼脂糖凝胶电泳；(4)扩增片段回收，然后通过连接反应克隆到pJET1.2载体、测序获得到甘蓝型油菜NAC47基因的cDNA序列。

所述甘蓝型油菜NAC47转录因子表达载体为pYJMyc，其构成的重组质粒为ppYJMyc-BnaNAC47。

进一步的，所述甘蓝型油菜NAC47转录因子用于激活甘蓝型油菜中RbohD、RbohF、YLS9、BFN1及两个VPE基因的表达。

进一步的，所述甘蓝型油菜NAC47转录因子用于激活甘蓝型油菜中ROS基因的转录。

进一步的，所述甘蓝型油菜NAC47转录因子用于激活甘蓝型油菜中PCD基因的转录。

进一步的，所述甘蓝型油菜NAC47转录因子用于正调控甘蓝型油菜的衰老及活性氧的积累。

有益效果，通过本发明提供的甘蓝型油菜NAC47转录因子能够更好的正调控油菜叶片的衰老；甘蓝型油菜NAC47基因的表达能引起细胞坏死导致的电导率上升、过氧化氢含量的上升、叶绿素含量的降低、花青素含量的升高以及丙二醛含量的上升；使甘蓝型油菜中RbohD、RbohF、YLS9、BFN1、CEP1及两个VPE基因的表达更好的得到控制激活及表达；构建了新型重组质粒pYJMyc-BnaNAC47；提供了甘蓝型油菜NAC47转录因子的制备方法。

附图说明

图1甘蓝型油菜NAC47基因的RT-PCR扩增产物的电泳检测图。

图2是油菜NAC47的cDNA序列及其翻译的氨基酸残基的序列图。

图3是油菜NAC47的亚细胞定位图。

图4是BnaNAC47在各时期的油菜叶片中转录本水平图。

图5是油菜NAC47对于多种逆境与激素处理的实时荧光定量RT-PCR分析图。

图6是BnaNAC47的表达导致活性氧(ROS)的累积与叶片衰老关系图。

图7是双荧光素酶报告系统检测NAC47激活ROS与PCD相关基因的转录图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式来对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不以此限制本发明。

以下实施例中如无特殊说明均为常规方法。

实施例1

1、油菜NAC47基因cDNA序列的克隆与序列测定。

根据已经公布的甘蓝型油菜的测序基因组的序列信息，设计基因特异性的两对引物，以甘蓝型油菜为模板扩增基因的编码区，引物序列为：

BnaNAC47-F:

5’TTAGGTCATGATAAGCAAGGATCCAAGATCAAG3’；BnaNAC47-R:

5’CGCGTCGACGCCTTGATACTTAAGGTGAG3’。

采用Plant RNAkit(Omega)提取油菜幼苗的总RNA，经过NanoDrop1000定量后，取2.5μg总RNA，采用RevertAid RNase H-First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)进行逆转录反应，按说明书进行。

2、PCR反应体系(50μL)

5PrimeStarbuffer 10μL；

cDNA模板：1μL；

dNTPs(10mM each)1μL；

PrimerF(20μΜ)1μL；

Primer R(20μΜ)1μL；

PrimeStar(TaKaRa)0.5μL；

ddH₂O加至终体积50μL。

3、PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30sec，50℃复性l min，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸10min。

4、1％琼脂糖凝胶电泳，PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测后发现在1kb处有一条目的条带如附图1所示。

5、扩增片段的回收与pJET1.2载体的连接。

对扩增条带采用Omega公司的琼脂糖胶回收试剂盒，步骤按说明书进行。

对回收片段，通过平末端克隆的方法，克隆入pJET1.2载体(Fermentas)，按照CloneJET PCR cloning kit(Fermentas)的说明书进行。

本实验所用的pJET1.2载体的多克隆位点的上游有T7启动子、下游有pJET1.2-R引物结合的序列，所以可以用这两个引物序列对重组质粒进行双向测序。结果表明，我们获得了油菜的NAC47基因的cDNA序列如图2所示。

亚细胞定位分析：通过对上述重组质粒pJET1.2-BnaNAC47，进行BspI+SalI双酶切，释放出BnaNAC47片段，构建在pYJGFP载体上，经过验证无误后，转入农杆菌GV3101感受态细胞中，在28℃培养2～3d，使用28d的烟草进行菌液注射，2d后使用共聚焦显微镜观察融合蛋白定位情况并拍照。结果显示，BnaNAC47定位在细胞核内如图3所示，与作为一个转录因子的角色是一致的。

NAC47转录因子基因在油菜叶片发育过程中的表达分析以及逆境响应表达谱。

材料处理：对于不同生长时期油菜叶片的收集，方案是：甘蓝型油菜种子经过次氯酸钠消毒处理后，播种在1/2x MS培养基上，于4℃层积处理两天后，置于温室萌发7天，然后移栽到泥炭土基质，放于温室正常生长，三周时取幼嫩叶片、4周时取成熟的叶片、5周时取早期衰老的叶片、6周时取晚期衰老的叶片，分别用液氮速冻后存于-80℃冰箱。

对于不同逆境处理的材料的收集，方案是：甘蓝型油菜的种子经表面消毒处理后，播种于1/2MS固体培养基上，4℃冰箱中层积2d，将平板移至温室中竖直生长。待幼苗生长7d后，将幼苗移至各种1/2MS+处理平板上继续竖直生长，同时设置1/2MS对照。各种胁迫处理包括：包括冷害(4℃)，热害(37℃)，盐害(200mM NaCl)，脱落酸(50μMABA)，聚乙二醇8000(15％PEG8000)，甲基紫精(10μMMV)，茉莉酸(50μM JA)，水杨酸(2mM SA)。核盘菌接种采用土培14d的植物，对照为琼脂块处理。分别在处理1、6、24h后收获样品，液氮速冻后，于-80℃超低温冰箱中保存。

采用Plant RNAkit提取上述冷冻油菜材料的总RNA，同时采用配套的DNaseI set去除可能的基因组DNA污染，按照说明书进行。

用NanoDrop检测RNA的浓度与纯度，根据1OD＝40ug/ml计算浓度。根据在230nm、260nm和280nm处的吸光值，检测RNA的纯度，纯RNA的OD260/OD280应为1.9左右，OD260/OD230应大于2。

采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)进行逆转录反应，按说明书进行。

以10倍稀释的cDNA为模板，进行定量PCR反应，采用SYBRGreen I mix(康为世纪)，在CFX96仪器上进行。引物如下：

BnaNAC47-qF 5'-TCAAACCCTTAAACGCCAGCAGT-3'

BnaNAC47-qR 5'-GATTTTCCGGAGTTTCGTTTAGA-3'

BnaUP1-qF 5'-AGCCTGAGGAGATATTAGCAGGAA-3'

BnaUP1-qR 5'-ATCTCACTGCAGCTCCACCAT-3'

BnaUBC9-qF 5'-GCATCTGCCTCGACATCTTGA-3'

BnaUBC9-qR 5'-GACAGCAGCACCTTGGAAATG-3'

qPCR体系：

2x SYBR Green I mix 5μL

Primer qF(20μΜ)0.2μL

Primer qR(20μΜ)0.2μL

ddH₂O 4.6μL

cDNA模板2μL

Total Volume 10μL。

PCR程序：95℃x15min；94℃ 30s；60℃ 1min；35cycles。

根据内参基因BnaUP1与BnaUBC9，计算目的基因在各个组织材料中的表达倍数。结果表明油菜的NAC47基因倾向于在正在衰老的叶片内表达如图4，并且在多个时间点，被盐害、干旱、ABA、SA、JA等多种逆境或激素处理显著诱导如图5所示。

植物过表达载体的构建：(I)质粒pYJMyc空载体和含有目的基因BnaNAC47的pJET1.2-BnaNAC47重组质粒的双酶切体系如下：

NcoI(或BspHI)0.5μL

SalI 0.5μL

pYJMyc载体或pJET1.2-BnaNAC47重组质粒10μL

10x Cutsmart Buffer 1.5μL

ddH₂O To 15μL

于37℃恒温水浴锅酶切4小时。

酶切产物的电泳与回收:双酶切完成后，以1xTAE为电泳缓冲液，将酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。在紫外透射仪下用洁净刀片切下pYJMyc泳道中的11kb载体大片段以及pJET1.2-BnaNAC47酶切泳道里的1kb的BnaNAC47基因片段，琼脂糖凝胶回收试剂盒(Omega)回收目的条带。

连接：经酶切的pYJMyc载体片段和目的基因片段以摩尔比1:3的比例混合，加入T4DNA连接酶，进行16℃连接2小时。

采用常规的CaCl₂介导的热激法转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞之后，通过菌落PCR筛选阳性克隆。

本实验所用的pYJMyc载体，其骨架是pCsGFPBT(GenBank中的登录号为DQ370426)，经过本实验室的改造，在插入片段的3’端添加有3xMyc。设计了上下游测序引物，所以可以用这两个引物对插入片段进行扩增，对重组质粒进行鉴定与测序。

PCR程序：94℃预变性3min；94℃变性1min，50℃复性1min，72℃延伸l min，循环35次；72℃延伸5min。

PCR扩增产物用1％琼脂糖电泳检测，然后挑取两个阳性克隆摇菌，用质粒小量提取试剂盒(杭州博日)提取质粒。重组质粒送至生物公司采用ABI3730仪器双向测序。

农杆菌感受态的制备与转化：采用CaCl₂法制备根癌农杆菌GV3101的感受态细胞，采用冻融法将上述pYJMyc-BnaNAC47重组质粒转入农杆菌细胞。涂于含34μg/ml利福平、25μg/ml庆大霉素、50μg/ml Kan的YEB固体培养基平板上，28℃倒置暗培养2天。

菌落PCR鉴定验证重组质粒确已转入农杆菌。

菌体PCR所用引物以及扩增条件等同上述。

功能验证一叶片的侵染与表型分析

对转化了质粒pYJMyc-BnaNAC47或对照pYJHA-GUS的农杆菌GV3101进行摇菌培养过夜，同时，培养抑制基因沉默的P19菌株，将培养好的菌用含有乙酰丁香酮(AS)的悬浮液(0.15μmol/L乙酰丁香酮、10mmol/L MES-KOH，pH 5.6和10mmol/L MgCl₂)稀释至OD600值为0.5，按照目的基因与P19按1:1混匀，黑暗放置4h，注射到苗龄为30d的叶片背面。正常条件下生长，观察表型变化并测定相关生理指标。

二氨基联苯胺(3,3'-diaminobenzidine，DAB)染色

将叶片剪下，放入12cm培养皿，加入50ml DAB染色液(1mg/mL DAB染色液添加Tween 20(0.05％v/v)、10mM Na₂HPO₄(pH7.0))，确保叶片完全浸入到染色液中，用铝箔纸盖住培养皿，80-100rpm振荡4-5小时。移去DAB，加入70ml脱色液(乙醇:乙酸:甘油，3:1:1),放于沸水浴中脱色15min。移去脱色液，换上新的脱色液，保持30min即可，拍照记录结果。

电导率测定：用1cm直径的打孔器取直径为1cm的叶圆片，转入含5ml ddH₂O的离心管中，抽真空处理10min，在25℃摇床中150rpm孵育30min，利用电导仪测定电导率并记录数据，记录为C₁。将上述样品煮沸5min，冷却至室温后，再次测定样品电导率(C₂)。同时检测ddH₂O的电导率作为C₀，计算相对导电率(C₁-C₀)/(C₂-C₀)*100％。。

叶绿素含量测定：

称取约100mg的叶圆片，置于盛有5ml无水乙醇的指形管中，室温黑暗旋转振荡过夜，次日利用分光光度计测定649及665nm波长处吸光值，计算叶绿素含量。公式为：叶绿素(μg/g FW)＝(6.1*OD₆₆₅+20.04*OD₆₄₉)/样品鲜重(g FW)。

花青素含量的测定：取约100mg的叶圆片，记录鲜重，用液氮充分研磨，用甲醇(含1％HCl)溶液4℃黑暗旋转混合过夜，次日检测530nm及657nm波长下的吸光值，计算花青素的含量。公式为：花青素/mg＝(OD₅₃₀-OD₆₅₇)*1000/mg。

丙二醛含量的测定：取新鲜叶圆片，称重记录后用液氮充分研磨，加1ml 10％的三氯乙酸(TCA)重悬混匀，65℃水浴15min，转速10000g离心10min后吸取700μL上清，加入等量0.6％的硫代巴比妥酸(TBA)混匀，90℃水浴15min后，冷却至室温，取上清检测在532nm和600nm波长处的吸光值并计算其含量。计算公式：C_MDA(μmol/L)＝MDA(μmol/g FW)＝[6.45*(OD₅₃₂-OD₆₀₀)-0.56*OD₄₅₀]*提取液总体积(ml)*10^-3/样品鲜重(g FW)。

H₂O₂含量的测定：取新鲜的叶圆片，称重并记录后用液氮充分研磨，加入5％TCA充分混匀，65℃水浴15min，冷却至室温后，加200uL氯仿：异戊醇(24：1，v/v)充分混匀，转速12000g离心10min。转移上清至新的离心管中，用1M氨水调pH至7.5。设置对照组和实验组，其中对照组加过氧化氢酶(CAT)处理。取100μL样品至新的离心管，后各管加400μL Tris-HCl(pH＝8.5)。反应30min后，加入500μL PAR溶液[30mM potassium titanium oxalate：30mM 4-pyridylazo resorcinol＝1：1(v/v)]，室温稳定15min后，利用紫外分光光度计检测508nm处的吸光值，计算得到叶片中H₂O₂的含量。首先计算标准曲线：Y＝4913.5*OD₅₀₈-873.77，H₂O₂(总量)＝(Y实验组-Y对照组)*(800+330)/100，H₂O₂(μM/mg FW)＝H₂O₂(总量)/样品鲜重(mg)。

上述多个生理与生化指标的定量分析表明，油菜NAC47基因的表达能引起细胞坏死导致的电导率上升、过氧化氢含量的上升、叶绿素含量的降低、花青素含量的升高以及丙二醛含量的上升如图6。

双荧光素酶报告检测

从已经测序的油菜基因组数据库(http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)中，根据拟南芥同源基因进行分析、比对，然后取得分最高的序列(tophit)进行同源基因的启动子引物的设计。

油菜基因组DNA的提取：采用2％CTAB法提取。收获约50mg的幼嫩叶片于2ml离心管中，加入液氮研磨充分，加入300μL含0.2％巯基乙醇的2％CTAB缓冲液(1.4M NaCl,2％(w/v)CTAB,20mMEDTA(pH8.0),100mM Tris-HCl(pH8))，混匀，65℃水浴5min，冷却至室温，加入300μL氯仿/异戊醇混合液(体积比为24：1)，混匀后12500rpm离心10min，转移上清液至新的离心管中。加入210μL异丙醇，混匀后12000rpm离心10min，弃清液。加入700μL 70％乙醇，12000rpm离心5min，弃上清液，风干后加入20μL含RNase A酶的1x TE buffer，溶解gDNA。

启动子的扩增：取1μL上述基因组DNA为模板，进行高保真PCR反应。引物由上海生工合成。PCR体系为：10μL 5x PrimerStarbuffer，1μL 10mmol/l dNTPs，20μmol/l正向引物以及反向引物各1μL，0.5μL PrimeStar DNA polymerase，1μL gDNA及36.5μL ddH₂O。程序为94℃x 3min；94℃x 30s，50℃x 30s，72℃x 1.5min，35个循环；最后72℃保温10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测并用胶回收试剂盒(博日)进行目的条带的回收。

启动子的克隆：将上述回收得到的启动子序列，经过KpnI与NcoI(或BspHI)双酶切后(步骤同前所述)，克隆入载体pGreenII0800-LUC中萤火虫荧光素酶(Fireflyluciferase，LUC)报告基因的上游，提取质粒后送至生物公司进行双向测序验证无误，此为报告质粒。3xNACRS元件与CaMV35S最小启动子的连接按照标准的分子克隆方法进行，同样也构建在LUC的上游。

烟草的培养与农杆菌介导的瞬时表达：先用70％乙醇对本氏烟草种子消毒1min，再用漂白剂(含0.03％Tween20的2.6％的次氯酸钠)消毒1min，无菌水水洗5-6次，然后，将其播种在1/2xMS培养基上，4℃黑暗层积处理2d，转移到温室生长7天后移苗至土壤基质。温室条件为：22℃，相对湿度为60％-70％，光周期为14h光照(光强约为150μmolm^-2s^-1)，10h黑暗。

将上述报告质粒以及由CaMV35S启动子驱动的海肾荧光素酶(Renillaluciferase，REN)报告基因作为内参，pYJMyc-BnaNAC47为效应质粒，pYJGFP作为对照质粒。分别通过冻融法转化农杆菌GV3101，28℃培养2天后，挑取单菌落，过夜振荡培养摇菌，5000rpm离心5min收集菌体后，用新鲜配制的含有乙酰丁香酮的缓冲液(10mMMES-KOH，10mMMgCl₂，0.15mM Acetosyringone)重悬，将转化了报告基因质粒与效应子质粒的菌液按照1：9(v/v)的比例混匀后共注射温室生长30d的烟草叶片，继续在温室培养，并在特定的时间点收取样品，转入2ml离心管，液氮速冻后存于-80℃。

双荧光素酶报告分析:将样品用液氮充分研磨成粉末，按照Dual-LuciferaseReporter Assay System(Promega)试剂盒操作说明书来定量测定萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性。使用仪器为GloMax20/20Luminometer(Promega)，每个试验3个生物学重复。结果如图6所示，说明油菜NAC47作为转录因子，能结合三倍串联重复的NACRS元件以正调控LUC的表达，同时通过上调ROS产生酶基因RbohD、RbohF、叶片衰老相关基因YLS9、细胞程序化死亡相关基因BFN1、CEP1以及两个液泡加工酶基因VPE等的表达，引起ROS的累积与细胞程序性死亡，来调控叶片的衰老进程。

图1甘蓝型油菜NAC47基因的RT-PCR扩增产物的电泳检测图。

其中M表示1kb DNA分子量标准(Fermentas)；1表示油菜NAC47基因的扩增。

图2是油菜NAC47的cDNA序列及其翻译的氨基酸残基的序列图。

图3是油菜NAC47的亚细胞定位图。

BnaNAC47-GFP质粒通过农杆菌介导，在烟草叶片里瞬时表达，通过激光共聚焦显微镜观察GFP信号的分布，标尺＝50微米。

图4是BnaNAC47在各时期的油菜叶片中转录本水平图。

通过qRT-PCR检测BnaNAC47在油菜不同衰老时期及早期衰老叶片各部位的表达水平。YL代表幼叶，ML代表成熟叶片，ES代表早期衰老叶片，LS代表晚期衰老叶片。Tip代表早期衰老叶片的顶端部分，Middle代表早期衰老叶片的中间部分，Base代表早期衰老叶片的基部。实验数据是三个生物学重复的平均值±SE，通过SPSS软件单因素方差分析统计实验数据，不同字母代表是否有显著性差异(P＜0.05)。BnaUPC9及BnaUP1作为内参。

处理包括盐害、冷害、热害、干旱、脱落酸、甲基紫精、水杨酸、茉莉酸、核盘菌侵染。对照平行准备。试验数据是三个生物学重复平均值±SE。星号表示有显著性差异(*P≤0.05，**P≤0.01)。

(A)通过农杆菌介导的转化体系，表达BnaNAC47及GUS对照基因，分别是2、3、4天时观察表型并进行DAB染色。左侧为叶片正面，中间为背面，右侧为DAB染色后的背面拍照。(B)BnaNAC47及GUS表达材料的叶绿色含量、花青素含量、相对电导率、过氧化氢含量以及丙二醛含量的测定分析。数据是三个生物学重复的平均值±S.E，不同字母代表显著性差异(ANOVA分析)。

(A)双荧光素酶报告系统中的双报告基因质粒、效应子质粒示意图。双报告基因质粒包括由CaMV35S启动子驱动表达的REN及由相关基因启动子驱动表达的萤火虫荧光素酶报告基因LUC。效应子质粒是由CaMV35S启动驱动表达的GFP或NAC47质粒。(B)NAC47可激活RbohD、RbohF、YLS9、BFN1、CEP1及两个VPE基因的表达。转录因子激活报告基因LUC的能力是由LUC/REN来表示的。实验数据是三个生物学重复的平均值±S.E。不同字母代表差异的显著性(P≤0.05)。

Claims

1.一种甘蓝型油菜NAC47转录因子，其特征在于：所述甘蓝型油菜NAC47转录因子基因的碱基序列具体如下：

2.根据权利要求1所述的甘蓝型油菜NAC47转录因子，其特征在于：所述甘蓝型油菜NAC47转录因子基因编码的蛋白氨基酸序列如下：

3.一种制备权利要求1所述的甘蓝型油菜NAC47转录因子的方法，其特征在于：包括以下步骤，(1)采用Plant RNAkit提取甘蓝型油菜幼苗的总RNA，经过NanoDrop1000定量后，各取2.5μg总RNA，采用RevertAid RNase H-First Strand cDNA Synthesis Kit进行逆转录反应；(2)进行PCR，PCR反应体系为5PrimeStarbuffer 10μL、cDNA模板1μL、dNTPs 1μL、PrimerF 1μL、Primer R 1μL、PrimeStar 0.5μL、ddH₂O加至终体积50μL，PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30sec，50℃复性l min，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸10min；(3)1％琼脂糖凝胶电泳；(4)扩增片段回收，然后通过连接反应克隆到pJET1.2载体、测序获得到甘蓝型油菜NAC47基因的cDNA序列。

4.根据权利要求4所述的甘蓝型油菜NAC47转录因子的方法，其特征在于：所述甘蓝型油菜NAC47转录因子表达载体为pYJMyc，其构成的重组质粒为ppYJMyc-BnaNAC47。

5.权利要求1-4中所述的甘蓝型油菜NAC47转录因子用于激活甘蓝型油菜中RbohD、RbohF、YLS9、BFN1、CEP1及两个VPE基因的表达。

6.权利要求1-4中所述的甘蓝型油菜NAC47转录因子用于激活甘蓝型油菜中ROS基因的转录。

7.权利要求1-4中所述的甘蓝型油菜NAC47转录因子用于激活甘蓝型油菜中PCD基因的转录。

8.权利要求1-4中所述的甘蓝型油菜NAC47转录因子用于正调控甘蓝型油菜的衰老及活性氧的积累。