CN110438131A - 黄瓜金属硫蛋白基因CsMT4的原核表达载体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种金属硫蛋白基因CsMT4在提高植物非生物因子胁迫抗逆性方面的应用，所述金属硫蛋白基因CsMT4为如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或为编码如SEQ ID NO：2所示黄瓜金属硫蛋白的核苷酸序列。插入有该基因的原核表达载体，是由pET‑32a表达载体和作为筛选标记的金属硫蛋白基因CsMT4构成的重组表达载体；该原核表达载体转入大肠杆菌中，在大肠杆菌中过表达，可提高大肠杆菌对不同非生物胁迫因子的耐受性，可应用于培育提高非生物因子胁迫的黄瓜中。本发明转入CsMT4的大肠杆菌在不同胁迫下表现出较好的耐受性，为进一步研究黄瓜MT基因家族及其在植物中耐胁迫的机制提供了重要的信息。

Description

黄瓜金属硫蛋白基因CsMT4的原核表达载体及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种黄瓜硫蛋白基因CsMT4的原核表达载体及其应用。
背景技术
金属硫蛋白(metallothionein，MT)是一类富含半胱氨酸(cysteine，Cys)、分子量较低(<10kDa)的蛋白，最早发现于马的肾脏外皮细胞中，后来的研究表明，它们广泛地存在于动物、植物和微生物中。研究表表明，金属硫蛋白可以结合Zn2+、Cd2+、Cr6+等多种金属离子，在细胞内具有降解重金属的功能，从而可以调控微量元素的储存、运输和代谢。同时由于金属硫蛋白含有多个半胱氨酸残基，具有较强的抗氧化能力，能清除细胞内富余的活性氧，降低由各种逆境胁迫造成的氧化胁迫伤害。可见，金属硫蛋白强大的生化功能决定了该类蛋白具有较大的应用潜力，而通过开发不同生物体内的金属硫蛋白基因，以及该类基因的应用价值具有重大意义。
黄瓜又叫青瓜、刺瓜，属葫芦科，是一种一年生攀援草本植物，种植很广泛，是世界性的蔬菜。黄瓜在养生和药食中占有不可替代的作用。黄瓜中含有大量的葫芦素C，具有提高人体免疫的功能，有抗肿瘤的作用，对治疗慢性肝炎、原发性肝癌有重要作用。黄瓜中含有丰富的维生素E，可延年益寿、抗衰老。用黄瓜捣汁涂擦皮肤，有润肤、舒张皱纹作用。黄瓜中的丙氨基酸、精氨基酸、谷氨酰胺对肝病患者，特别是酒精性肝硬化患者有一定的辅助治疗作用，并可预防酒精中毒。
基于黄瓜上述的各种应用价值，一直被广泛关注，但是黄瓜在自然条件下经常受到各种胁迫，导致生产的活性氧(ROS)，如超氧离子(O2-)、过氧化氢(H2O2)，羟自由基(·OH)，每个氧自由基和臭氧过量产生活性氧会导致氧化应激并诱导细胞成分的氧化损伤，使植物的生长和生产力受到胁迫。应对氧化应激，植物进化出了许多对抗机制。金属硫蛋白能有效的降低过氧化物浓度，维持细胞内的平衡，是一种主要的抗氧化物。许多研究表明，金属硫蛋白与植物抗逆性有关。目前，关于黄瓜抗逆性方面的研究主要是集中在外源物质和嫁接提高黄瓜的抗逆性，黄瓜金属硫蛋白抗逆性的研究极少被报道。
本发明主要公开了黄瓜体内的金属硫蛋白基因CsMT4，该基因在黄瓜体内的表达对不同胁迫因子胁迫做出响应，金属硫蛋白的表达可以影响到不同胁迫因子在生物体内的积累，因此，本申请克隆金属硫蛋白基因CsMT4，并构建该基因的原核表达载体，利用重组菌研究了该蛋白的抗逆功能。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种金属硫蛋白基因CsMT4，以及编码基因CsMT4在植物非生物胁迫因子抗逆性方面的应用。
本发明还有一个目的是提供一种原核表达载体以及对应的大肠杆菌及其应用，该重组表达载体插入了金属硫蛋白基因CsMT4，将重组表达载体转入大肠杆菌中通过不同胁迫因子的诱导该基因在大肠杆菌中过表达，能够在在不同胁迫因子胁迫下，提高对相应胁迫因子的耐受性，并改变了大肠杆菌细胞活性。
为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了一种金属硫蛋白基因CsMT4在提高植物非生物因子胁迫抗逆性方面的应用，其特征在于，所述金属硫蛋白基因CsMT4为如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或为编码如SEQ ID NO：2所示黄瓜金属硫蛋白的核苷酸序列。
本发明还提供了氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示黄瓜金属硫蛋白基因CsMT4在提高植物非生物因子胁迫抗逆性方面的应用。
优选的是，所述植物为黄瓜。
本发明还提供了插入有所述的金属硫蛋白基因CsMT4的核苷酸序列的原核表达载体，所述原核表达载体由pET-32a表达载体和作为筛选标记的金属硫蛋白基因CsMT4构成的重组表达载体；
其中，所述作为筛选标记的金属硫蛋白基因CsMT4为如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或为编码如SEQ ID NO：2所示黄瓜金属硫蛋白的核苷酸序列。
本发明还提供了所述的原核表达载体在培育提高非生物因子胁迫抗逆性的黄瓜中的应用。
本发明还提供了一种大肠杆菌，所述大肠杆菌转化所述的原核表达载体。
本发明还提供了所述的原核表达载体在提高权利要求6所述的大肠杆菌对非生物因子胁迫抗逆性中的应用。
优选的是，所述重组表达载体由以下方法步骤构建：
S1：自黄瓜叶中提取RNA，并以RNA为模板反转录成cDNA，再以cDNA为模板，进行PCR扩增，经回收纯化得到CsMT4基因片段，再将其连接到克隆载体pMD18-T上，通过PCR和酶切鉴定，获得质粒pMD18-CsMT4；
S2：用限制性内切酶BamH I和Hind III对所得质粒pMD18-CsMT4和表达载体pET-32A同时进行双酶切后，用连接酶连接，再转入大肠杆菌经培养抽提质粒并进行酶切鉴定及测序，得到重组表达载体pET32a-CsMT4。
优选的是，S1中PCR扩增时的引物为：
CsMT4-2F：aaaaGGATCCATGGCAGAACCAGGTGGTC；
CsMT4-2R：aaaaAAGCTTCGATTCACACCGGCAAACTTCA。
优选的是，S1中PCR扩增的反应体系为：cDNA 5μL、2×pfu PCR Master Mix 25μl、CsMT4-2F 1μl、CsMT4-2R1μl、ddH2O 18μl；
反应条件为：94℃预变性5min、94℃变性30s、52℃退火45s、72℃延伸20s、72℃延伸5min，40个循环。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明通过基因组数据库中下载基因组、转录组和蛋白组数据筛选出黄瓜金属硫蛋白基因CsMT4基因，并对其进行应用性探索，主要是通过金属硫蛋白在黄瓜体内的表达具备不同胁迫因子胁迫诱导表达的特性，说明该基因具有响应不同胁迫因子胁迫的功能，可应用于该基因提高对不同胁迫因子耐受性的基因工程改造上；另外，该基因在大肠杆菌中的过量表达能够提高大肠杆菌细胞对不同胁迫因子的耐受性，进而保证大肠杆菌的细胞活性，提高了大肠杆菌的生存能力，可将该基因应用于针对不同非生物胁迫因子胁迫的微生物修复工程菌的遗传改造中，可见，CsMT4对非生物胁迫具有重要意义，原核表达金属硫蛋白基因CsMT4可提高大肠杆菌的抗逆性；这也为更深入了解黄瓜金属硫蛋白基因CsMT4的功能奠定了基础。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明黄瓜金属硫蛋白基因CsMT4在各组织中的表达情况；
图2为本发明黄瓜金属硫蛋白基因在逆境胁迫下表达模式，其中，a为CsMT4对NaCl胁迫的表达模式；b为CsMT4对PEG胁迫的表达模式；c为CsMT4对ABA胁迫的表达模式；
图3为本发明黄瓜金属硫蛋白基因CsMT4的PCR扩增结果；
图4为本发明重组质粒的菌液PCR鉴定结果；
图5为本发明重组质粒的酶切鉴定结果；
图6为本发明重组质粒菌液PCR鉴定结果；
图7为本发明重组质粒pET-CsMT4的酶切鉴定；
图8为本发明重组质粒pET18-CsMT4转化大肠杆菌BL21的情况；
图9为本发明重组质粒菌液PCR鉴定(转BL21)结果；
图10为本发明融合蛋白CsMT4在最优条件下诱导表达的SDS-PAGE分析；
图11为本发明CsMT4原核表达对大肠杆菌耐热能力的影响；
图12为本发明CsMT4原核表达对大肠杆菌耐冷能力的影响；
图13为本发明CsMT4原核表达对大肠杆菌耐盐能力的影响；
图14为本发明CsMT4原核表达对大肠杆菌耐旱能力的影响；
图15为本发明原核表达载体的质谱图。
具体实施方式
下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
实施例1金属硫蛋白基因CsMT4在黄瓜体内受不同胁迫因子诱导表达的检测
本发明描述了金属硫蛋白基因CsMT4在植物非胁迫因子抗逆性方面的应用，本发明首先阐述了该基因受各种胁迫诱导表达的特征。
本发明用到的黄瓜实验材料取自江西农业大学种植基地。选取黄瓜两周龄的幼苗，对幼苗进行各种胁迫处理。具体如下：盐胁迫采用200mM NaCl浇灌黄瓜根部；脱落酸(ABA)处理采用100μM ABA浇灌黄瓜根部；干旱处理采用300mM PEG-6000浇灌黄瓜根部。经过0、1、3、6和12h处理后，将胁迫不同时间的黄瓜叶片速冻至-80℃保存；采用Trizol法提取总RNA，具体按照购自Invitrogen公司提取试剂Trizol的说明书进行。取各组织的总RNA 1μl分别进行cDNA第1链的合成：使用GIBICOL公司的SuperScriptTM Pre-amplificationSystem for First Strand cDNA Synthesis试剂盒。其中，semi RT-PCR(半定量逆转录PCR)引物如下所示：
CsMT4-F GGAAACGCTTGTAGGTGCTC；
CsMT4-R CCACACCTGCAGTTACCCTT。
黄瓜金属硫蛋白基因CsMT4的荧光定量分析：实时定量PCR(qRT-PCR)在LightCycler 480系统上进行。PCR反应体系20μl：模板cDNA 4μL，上/下游引物2μl，PremixEx TaqTM 10μL，Rox Plus 2μl。反应程序：95℃5min；95℃30s，55℃20s，72℃90s，共40个PCR循环。按公式2-(Ct，Target-Ct，Actin)来计算基因的相对表达量，采用2-ΔΔCt法进行数据分析。其中，qRT-PCR(实时定量PCR)的引物如下所示：
qCsMT4-F GAGACTGCGTATAATTGGAGA；
qCsMT4-R GCAAACTTCACATCGACA。
如图1所示，本发明公开的金属硫蛋白基因CsMT4在黄瓜的茎和花中检测不到转录信号，在根的表达量比较低，在叶和果中的表达量较高，表明金属硫蛋白基因CsMT4具有调控植物代谢过程的基本特性。
如图2所示，本发明公开的金属硫蛋白基因CsMT4，黄瓜叶经过不同时间的胁迫处理后，CsMT4在各个胁迫下的表达量都非常明显，在不同程度上对CsMT4的表达都具有促进作用。
实施例2黄瓜金属硫蛋白基因CsMT4的克隆和原核表达载体的构建
1、黄瓜金属硫蛋白基因CsMT4的克隆
(1)总RNA提取
取自江西农业大学园艺种植基地的华北型黄瓜(Cucumis sativus var.sativusline9930)，在黄瓜2叶期时，取叶片，马上放入液氮速冻。使用Promega公司的RNA提取试剂盒提取叶片的RNA，具体操作见试剂盒说明书。
(2)cDNA合成和扩增
用TaKaRa的逆转录试剂盒将抽提的黄瓜幼苗叶片RNA逆转录成cDNA(具体操作见试剂盒说明书)，并以cDNA为模板，设计引物：
CsMT4-2F aaaaGGATCCATGGCAGAACCAGGTGGTC，
CsMT4-2R aaaaAAGCTTCGATTCACACCGGCAAACTTCA，用于扩增cDNA，获得DNA片段，PCR扩增的反应体系为：cDNA 5μL、2×pfu PCR Master Mix 25μl、CsMT4-2F1μl、CsMT4-2R1μl、ddH2O 18μl；反应条件为：94℃预变性5min、94℃变性30s、52℃退火45s、72℃延伸20s、72℃延伸5min，40个循环。PCR经1.5％琼脂凝胶电泳检测发现，DNA片段其长度和与预期的273bp一致(如图3所示)。
(3)回收CsMT4片段
将上述扩增得到的DNA片段用北京TIANGEN生化公司凝胶回收试剂盒完成CsMT4片段的回收，具体操作见说明书。
(4)CsMT4片段克隆
回收得到的片段连接到pMD18-T表达载体上，具体使用10μl连接体系反应：CsMT4基因片段回收产物7.0μl、10×T4Ligase buffer1.0μl、pMD18-T Vector 1.5μl、T4DNALigase 0.5μl，连接过夜；在1.5mL离心管中，加入50μl感受态细胞DH5a细胞和连接产物5μL，混匀，在冰上反应30分钟。接着，离心管放置42℃水浴60-90s，之后迅速置冰上冷却2-3分钟。最后吸取350μl已转化的感受态细胞加入到含有Amp+的LB固体培养基上，用三角玻璃棒将细胞均匀涂开，倒板，放入光照培养箱中，调节温度37℃，培养过夜(12-16h)，收集菌体，使用TaKaRa公司质粒小量抽提试剂盒，具体操作见试剂盒说明书。
(5)PCR鉴定和酶切鉴定
通过PCR鉴定和酶切鉴定获得的重组质粒pMD18-CsMT4，具体的PCR菌液鉴定方法为：挑取单菌落于10ml含有Amp+的LB液体培养基中，摇床37℃，150rpm培养12～16h，以此菌液为DNA模板，作PCR鉴定，采用20μL的PCR反应体系10×PCR buffer2μl、CsMT4-2F 0.2μl(10μM)、CsMT4-2R 0.2μl(10μM)、dNTP Mix 0.2μl(2.5mM)、菌液DNA 2μl、Taq酶0.2μl(5U/μl)、ddH2O 15.2μl；反应条件：94℃预变性5min、94℃变性30s、52℃退火45s、72℃延伸20s、72℃延伸5min、40个循环；PCR反应结束后，经1.5％琼脂糖凝胶电泳，重组质粒pMD18-CsMT4可酶切出预期大小的片段，结果如图4所示，1、2和4号菌的PCR反应有条带，可以确定这3个菌为含重组质粒的阳性菌。
对1号菌进行提取质粒，用Bam HI和Hind III两种酶进行双酶切，具体的为50μL酶切体系：pMD18-CsMT4/pET-32a 40.5μL、10×buffer K 5μL、Bam HI(15U/μL)2μL、Hind III(15U/μL)2μL和BSA 0.5μL，37℃水浴酶切3h，反应结束后，经1.5％琼脂糖凝胶电泳，大约270bp处有目的基因条带，确定该提取质粒为重组质粒，1号菌为阳性菌(如图5所示)，经测序得到插入目的基因正确的重组质粒pMD18-CsMT4。
2、原核表达载体的构建
pMD18-CsMT4及表达载体pET-32a同时经限制性内切酶BamH I和Hind III双酶切，酶切体系为：pMD18-CsMT4/pET-32a 40.5μL、10×buffer K 5μL、Bam HI(15U/μL)2μL、HindIII(15U/μL)2μL、BSA 0.5μL；酶切后使用TaKaRa公司的DNA连接试剂盒进行连接，具体操作见试剂盒说明书。
连接后的产物进行转化，具体操作为：在1.5mL离心管中，加入50μL感受态细胞DH5α和连接产物5μL，混匀，在冰上反应30min；接着，离心管放置42℃水浴60-90s，之后迅速置冰上冷却2-3min；最后用移液枪吸取100μl转化感受态细胞，加入到含有Amp+的LB固体培养基上，用灭菌玻璃棒将细胞均匀涂开，倒置平板，放入光照培养箱中，设置温度37℃，培养12～16h。
PCR菌液检测获得重组质粒pET-32a-CsMT4。具体的，用枪头挑选几个CsMT4的单菌落，放入含有100mg/mL Amp+的LB液体培养基中，每个培养基的总体积为50mL，然后固定在摇床上，设置温度为37℃，转速为150rpm，培养16h，隔天吸取2μL模板用来PCR扩增，进行CsMT4重组质粒的鉴定。跑1.5％琼脂糖凝胶，扩增目的带约270bp，与目的基因条带长度基本一致(如图6所示)。
酶切检测获得重组质粒pET-32a-CsMT4。具体采用50μL酶切体系：10×buffer K 5μL、重组质粒40.5μL、Bam HI(15U/μL)2μL、Hind III(15U/μL)2μL、BSA 0.5μL，按酶切体系加入离心管中，再将离心管中试剂用移液枪反复吹打几次，混合均匀，然后放入到37℃水浴锅中进行酶切反应，反应3h；反应结束后，跑1.5％琼脂糖凝胶电泳，发现双酶切后构建的pET-32a-CsMT4原核表达载体准确无误(如图7所示)。
实施例3CsMT4蛋白的诱导表达
(1)制备重组质粒pET32a-CsMT4
将测序正确的菌液，按1％在含有抗生素(100mg/mL Amp+)的LB液体培养基中扩大培养，摇床设置温度37℃，转速摇床150rpm，时间16h，过夜。第二天提取质粒，过程和前面提取质粒的方法相同。
(2)重组质粒pET32a-CsMT4转化大肠杆菌BL21感受态细胞
在1.5mL离心管中，加入50μL感受态细胞BL21和提取的质粒5μL，混匀，在冰上反应30min；接着，离心管放置42℃水浴60-90s，之后迅速置冰上冷却2-3min；最后用移液枪吸取100μl转化感受态细胞，加入到含有Amp+的LB固体培养基上，用灭菌玻璃棒将细胞均匀涂开，倒置平板，放入光照培养箱中，设置温度37℃，培养12～16h；结果如图8所示，转化是成功的。
(3)重组质粒pET32a-CsMT4的鉴定
用枪头挑选几个CsMT4的单菌落，放入含有100mg/mL Amp+的LB液体培养基中，每个培养基的总体积为50mL，然后固定在摇床上，设置温度为37℃，转速150rpm，培养16h。隔天吸取2μL模板用来PCR扩增，进行CsMT4重组质粒的鉴定。用1.5％琼脂糖凝胶，电压和电流分别为150V和150mA，电泳时间为30min，跑完电泳在紫外灯下看胶进行鉴定，结果如图9所示，4个菌有2个可能为阳性重组子。
将经过菌液PCR鉴定的pET32a-CsMT4重组质粒送去公司进行测序，其余的放入-80℃冰箱进行保存。
(4)SDS-PAGE电泳检测CsMT4蛋白表达情况
挑取含有重组质粒pET32a-CsMT4和pET-32a空载体的单菌落接种于10ml液体LB培养基(含100μg/ml Amp+)中，37℃，200rpm振荡培养过夜，次日按1％(v/v)的比例接种到150ml新鲜LB培养基(含100μg/ml Amp+)中，37℃，200rpm振荡培养至OD600为0.6时分装至50ml无菌三角瓶中，菌液加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃，200rpm诱导4h后取1.8ml菌液，12000rpm，20℃，离心2min，弃上清，用50μl PBS缓冲液重悬，加入50μl 2×SDS上样缓冲液后放入沸水浴5min，12000rpm，20℃，离心2min，取上清用SDS-PAGE电泳检测，同时以各自对应相同条件诱导的pET-32a空载体作为对照。
如图10所示，经SDS-PAGE电泳发现，重组质粒pET32a-CsMT4诱导后，在30kDa左右有很明显的目的条带，并且表达量很大，符合预测的蛋白大小；在空载体pET-32a诱导后所对应的泳道约20kDa位置检测到一条比较明显的条带。
实施例4重组大肠杆菌的抗逆性分析
用枪头挑取pET-32a空载体的单菌落和含有重组质粒pET32a-CsMT4的单菌落进行50mL扩大培养。将单菌落放入50mL含抗生素的液体LB培养基中，摇床温度37℃，转速150rpm，进行培养。用酶标仪测OD值达到OD600＝1.0时停止培养，准备待用。
(1)耐高温分析
制备含抗生素(100μg/mL Amp+)和IPTG诱导剂浓度为1mM的LB固体培养基，取OD600＝1.0的菌液分装于7个2mL离心管中，每个离心管加入1mL，将菌液放到50℃烘箱中，分别在0、10、20、30、40、50min时取出。取出菌液吸取100μL，稀释25倍后，涂板，放入光照培养箱，设置温度37℃进行培养，对长出的白色斑点进行记录。
如图11所示，高温(50℃)处理大肠杆菌，以空载体BL/pET32a为对照，计算存活率。在未处理时，BL/CsMT4和BL/pET32a两者的存活率保持一致，随时间的变化，两者的存活率都开始下降，不过可以发现，在热胁迫10min、20min时BL/CsMT4的存活率比BL/pET32a稍微要高一些；40～50min时，两种大肠杆菌全部死亡。因此，可得出CsMT4蛋白提高了大肠杆菌的耐高温能力。
(2)耐低温分析
制备含抗生素(100μg/mL Amp+)和IPTG诱导剂浓度为1mM的LB固体培养基，取OD600＝1.0的菌液分装于7个2mL离心管中，每个离心管加入1mL菌液，然后将离心管放入液氮速冻，接着在37℃烘箱中进行融解，分别在冻融0、3、6、9、12cycles时拿出各个离心管。取出菌液吸取100μL，稀释25倍后，涂板，放入光照培养箱，设置温度37℃进行培养，对长出的白色斑点进行记录。
如图12所示，采用液氮反复冻融的方法处理大肠杆菌，同时以空载体BL/pET32a为对照。在不做处理的情况下，BL/CsMT4和BL/pET32a的存活率都是100％，随着冻融次数的不断增加，存活率逐渐开始下降，并且两者的存活率相当。当冻融周期达到12个循坏时，BL/pET32a已经全部死亡，但BL/CsMT4依旧有存活。在15个循坏时，两组细胞全部死亡。因此，可得出CsMT4蛋白提高了大肠杆菌的耐冷能力。
(3)耐盐分析
制备含抗生素(100μg/mL Amp+)和IPTG诱导剂浓度为1mM的LB固体培养基，取OD600＝1.0的菌液100μL，稀释25倍后，涂布于0、100、200、300、400、500mM NaCl固体LB平板，放入光照培养箱，设置温度37℃进行培养，对长出的白色斑点进行记录。
如图13所示，采用不同浓度NaCl的方法处理大肠杆菌，同时以空载体BL/pET32a为对照。在未经处理的条件下，BL/CsMT4和BL/pET32a细胞在LB培养基上生长保持一致，都是100％。在使用NaCl胁迫后BL/CsMT4和BL/pET32a细胞存活率下降幅度很大，与BL/pET32a相比，BL/CsMT4细胞的活性更大。在400mM NaCl处理下，所有的BL/pET32a细胞死亡，BL/CsMT4也全部死亡，当NaCl达到500mM，BL/CsMT4也全部死亡。但是当NaCl处于100～300mM时，可以明显发现，BL/CsMT4的存活率远远高于BL/pET32a，因此，可得到CsMT4蛋白提高了大肠杆菌的抗盐能力。
(4)耐旱分析
制备含抗生素(100μg/mL Amp+)和IPTG诱导剂浓度为1mM的LB固体培养基，取OD600＝1.0的菌液100μL，稀释25倍后，涂布于0、300、600、900mM山梨醇固体LB平板，放入光照培养箱，设置温度37℃进行培养，对长出的白色斑点进行记录。
如图14所示，采用不同浓度山梨醇的方法处理大肠杆菌，同时以空载体pET32a为对照，在未经处理的条件下，BL/CsMT4和BL/pET32a细胞在LB培养基上生长一致，随着山梨醇浓度的变化，两者的存活率都开始下降，在300mM和600mM山梨醇时，BL/CsMT4和BL/pET32a存活率相当。当在山梨醇浓度达到900mM时，BL/CsMT4细胞依旧有存活，BL/pET32a细胞全部死亡。浓度再往上增加至1200mM，两组细胞全部死亡。因此，可得到CsMT4蛋白提高了大肠杆菌的抗旱能力。
有上述可看出，金属硫蛋白基因CsMT4在大肠杆菌中过表达，可以提高大肠杆菌细胞对不同胁迫因子的耐受性，具体的经高温、低温、盐或山梨醇处理过的大肠杆菌，在LB培养基上培养，转入金属硫蛋白基因CsMT4的大肠杆菌的存活率明显高于未经转入金属硫蛋白基因CsMT4的大肠杆菌，说明金属硫蛋白基因CsMT4能够提高大肠杆菌对胁迫因子的抗逆性。可见，CsMT4对非生物胁迫具有重要意义，原核表达金属硫蛋白基因CsMT4可提高大肠杆菌的抗逆性，这为深入了解黄瓜金属硫蛋白基因CsMT4的功能奠定了基础。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与附图。
序列表
<110> 江西农业大学
<120> 黄瓜金属硫蛋白基因CsMT4的原核表达载体及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 273
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggcagaac caggtggtcg tagcggtaga ggcggagtcg gggcttgcaa ccagagctgc 60
ggttgtgccg ttccctgccc cggtggaaac gcttgtaggt gctcaactgc agcggcagcg 120
ggaggggaga ctgcgtataa ttggagatgc ccgtgcgggg agcattgtga ctgtaacccg 180
tgcacgtgtc ccagaacgga ggtcggagtc gggaagggta actgcaggtg tggagcggat 240
tgtcgatgtg aagtttgccg gtgtgaatcg tga 273
<210> 2
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ala Glu Pro Gly Gly Arg Ser Gly Arg Gly Gly Val Gly Ala Cys
1 5 10 15
Asn Gln Ser Cys Gly Cys Ala Val Pro Cys Pro Gly Gly Asn Ala Cys
20 25 30
Arg Cys Ser Thr Ala Ala Ala Ala Gly Gly Glu Thr Ala Tyr Asn Trp
35 40 45
Arg Cys Pro Cys Gly Glu His Cys Asp Cys Asn Pro Cys Thr Cys Pro
50 55 60
Arg Thr Glu Val Gly Val Gly Lys Gly Asn Cys Arg Cys Gly Ala Asp
65 70 75 80
Cys Arg Cys Glu Val Cys Arg Cys Glu Ser
85 90

Claims (10)

1.一种金属硫蛋白基因CsMT4在提高植物非生物因子胁迫抗逆性方面的应用，其特征在于，所述金属硫蛋白基因CsMT4为如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或为编码如SEQ IDNO：2所示黄瓜金属硫蛋白的核苷酸序列。
2.氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示黄瓜金属硫蛋白基因CsMT4在提高植物非生物因子胁迫抗逆性方面的应用。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述植物为黄瓜。
4.插入有如权利要求1所述的金属硫蛋白基因CsMT4的核苷酸序列的原核表达载体，其特征在于，所述原核表达载体由pET-32a表达载体和作为筛选标记的金属硫蛋白基因CsMT4构成的重组表达载体；
其中，所述作为筛选标记的金属硫蛋白基因CsMT4为如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或为编码如SEQ ID NO：2所示黄瓜金属硫蛋白的核苷酸序列。
5.如权利要求4所述的原核表达载体在培育提高非生物因子胁迫抗逆性的黄瓜中的应用。
6.一种大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌转化权利要求4所述的原核表达载体。
7.如权利要求4所述的原核表达载体在提高权利要求6所述的大肠杆菌对非生物因子胁迫抗逆性中的应用。
8.如权利要求4所述的原核表达载体，其特征在于，所述重组表达载体由以下方法步骤构建：
S1：自黄瓜叶中提取RNA，并以RNA为模板反转录成cDNA，再以cDNA为模板，进行PCR扩增，经回收纯化得到CsMT4基因片段，再将其连接到克隆载体pMD18-T上，通过PCR和酶切鉴定，获得质粒pMD18-CsMT4；
S2：用限制性内切酶BamH I和Hind III对所得质粒pMD18-CsMT4和表达载体pET-32A同时进行双酶切后，用连接酶连接，再转入大肠杆菌经培养抽提质粒并进行酶切鉴定及测序，得到重组表达载体pET32a-CsMT4。
9.如权利要求8所述的原核表达载体，其特征在于，S1中PCR扩增时的引物为：
CsMT4-2F：aaaaGGATCCATGGCAGAACCAGGTGGTC；
CsMT4-2R：aaaaAAGCTTCGATTCACACCGGCAAACTTCA。
10.如权利要求8所述的原核表达载体，其特征在于，S1中PCR扩增的反应体系为：cDNA5μL、2×pfu PCR Master Mix 25μl、CsMT4-2F 1μl、CsMT4-2R 1μl、ddH2O 18μl；
反应条件为：94℃预变性5min、94℃变性30s、52℃退火45s、72℃延伸20s、72℃延伸5min，40个循环。
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