CN105063045A

CN105063045A - 玉米zmERF18基因启动子及其应用

Info

Publication number: CN105063045A
Application number: CN201510467506.8A
Authority: CN
Inventors: 杜何为; 黄敏
Original assignee: Yangtze University
Current assignee: Yangtze University
Priority date: 2015-08-03
Filing date: 2015-08-03
Publication date: 2015-11-18

Abstract

本发明提供了玉米zmERF18基因启动子，其特征在于：所述玉米zmERF18基因启动子具有：(1)SEQ？ID？No.1所示的核苷酸序列；或(2)SEQ？ID？No.1所示核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且同等功能的由(1)衍生的核苷酸序列。该启动子直接驱动外源基因的转基因植物，启动能力较强，淹水条件下快速高效启动外源基因在植株根部大量表达，提高植株的耐渍性，或抗虫、抗病等能力；该启动子是只在根部特异表达的组织特异性启动子，对于食用非根部的转基因植物，不存在转基因食品安全问题；为玉米及其他旱生作物的耐渍性遗传改良提供了新的根部特异表达、淹水诱导型的启动子资源，可进一步阐明玉米耐渍性形成的分子机制，具有十分重要的理论价值和实践意义。

Description

玉米zmERF18基因启动子及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，特别是涉及玉米zmERF18基因启动子及其应用。

背景技术

到本世纪中期，全球人口将达到90亿，急需农作物的增产、稳产，来满足人口日益增长的需求。玉米是我国种植面积最大的作物，然而在我国南方及东南亚地区，局部地区的洪涝灾害，给玉米的生产带来了严重的损失。仅南亚，每年超过15％的玉米种植面积遭受不同程度的危害。在印度，洪涝灾害造成玉米每年减产25-30％。我国南方春玉米和北方夏玉米在正常的栽培季节中，经常遭受洪涝和渍害，玉米根系长期处于低氧状态，导致玉米减产10％-40％。涝渍害已成为我国南方玉米高产、稳产的主要制约因子之一。因此，克隆玉米淹水胁迫响应基因及其启动子，对阐明玉米淹水胁迫响应形成的分子机理以及玉米和其他旱生作物耐涝渍的遗传改良，具有十分重要的理论价值和实践意义。

研究表明，ERF基因广泛参与植物的非生物胁迫响应。水稻的Sub1A、SNORNEL1、SNORKEL2，以及拟南芥中的RAP2.2等，这些重要的淹水胁迫响应基因，都是ERF家族基因。课题组前期的研究，发掘了玉米淹水胁迫响应相关的ERF基因。因此，克隆这些参与淹水响应的ERF基因的启动子，有助于阐明玉米耐渍性形成的分子机制，同时为玉米及其他旱生作物的耐渍遗传改良提供理论指导。然而，玉米ERF基因启动子的克隆，目前，尚未见有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供玉米zmERF18基因启动子，并提供zmERF18基因启动子在植物耐渍遗传改良中的应用。

本发明第一方面提供了玉米zmERF18基因启动子，其具有：

(1)SEQIDNo:1所示的核苷酸序列；或

(2)SEQIDNo:1所示核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且同等功能的由(1)衍生的核苷酸序列。

本发明第二方面提供了含有玉米zmERF18基因启动子的载体。

本发明第三方面提供了玉米zmERF18基因启动子在植物的耐渍性改良中的应用。

本发明第四方面提供了玉米zmERF18基因启动子在制备转基因植物中的应用。

本发明的有益效果是：(1)玉米zmERF1基因启动子直接驱动外源基因的转基因植物，淹水条件下4h内快速高效启动外源基因在植株根部的大量表达，可以提高植株的耐渍性，或抗虫、抗病等能力；2)玉米zmERF1基因启动子是只在根部特异表达的组织特异性启动子，所以对于食用非根部的转基因植物，不存在转基因食品安全问题；(3)玉米zmERF1基因启动子的启动能力较强，是强启动子；(4)为玉米及其他旱生作物的耐渍性遗传改良提供了新的根部特异表达、淹水诱导型的启动子资源；(5)对该启动子中所含顺式元件的分析，可进一步阐明玉米耐渍性形成的分子机制，具有十分重要的理论价值和实践意义。

具体实施方式

本发明第一方面提供了玉米zmERF18基因启动子，其核苷酸序列如SEQIDNo:1所示，序列全长1390bp，该启动子含有1个GARE、1个TC-richmotif、3个Skn-1motif、1个CGTCA-motif和1个MBS位点顺式元件，这些顺式元件与植物激素、厌氧胁迫响应相关；是一个组织特异型的启动子，只在根系中表达；是一个诱导型的启动子，受淹水诱导高效表达。

玉米zmERF18基因启动子还包括根据SEQIDNo:1所示的核苷酸序列，对其取代、缺失或添加一个或几个核苷酸，而衍生的具有相同功能的DNA片段。

所述玉米zmERF18基因启动子是从玉米自交系Hz32中克隆获得的。

本发明第二方面提供了含有玉米zmERF18基因启动子的载体。在本发明的实施例中含有玉米zmERF18基因启动子的载体为pCAMBIA1300-zmERF18-GUS载体。

例如，可以将玉米zmERF18基因启动子克隆到转化载体上，其后连接一个Tnos终止子，构建成一个转化载体。将所转化的目的基因以正确的方向，克隆到玉米zmERF18基因启动子与Tnos终止子之间，构建好转化载体。然后通过基因枪轰击法或农杆菌法介导法将目的基因转化到受体细胞中，通过组织培养等技术手段获得转基因植株。

优选的，所述植物为旱生作物，更加优选的，所述植物为玉米、水稻。

下面将结合实施例对本发明提供的玉米zmERF18基因启动子及其应用予以进一步说明。

1、玉米zmERF18基因的获得

使用生物信息学方法，对玉米全基因组进行分析，获得了107个玉米ERF基因。使用qRT-PCR技术，分析了这些基因在玉米自交系Hz32根系中的表达，结果发现zmERF18基因在淹水处理1、2、4d，表达水平显著升高。说明该基因受淹水诱导表达，该基因的启动子是淹水胁迫响应的诱导型启动子。植物的淹水胁迫受GA、乙烯等信号途径调控。因此，使用GA、ACC处理Hz32幼苗，并检测了zmERF18基因的表达，结果显示该基因经GA、ACC处理，表达水平显著提高，所述GA为赤霉素、ACC为促进剂1—氨基环丙烷—1—羧酸。以上结果表明，该基因受淹水、GA、ACC诱导表达，因此，我们把zmERF18基因确定为淹水胁迫响应候选基因。

2、玉米自交系Hz32叶片总DNA的提取

将玉米Hz32的种子于培养箱中在28℃下发芽，取2.0g幼叶于液氮中充分研磨，并转入50ml离心管中。向离心管中加入预热的CTAB缓冲液5ml，混匀，所述CTAB缓冲液包括：1.17MNaCL、0.0016MEDTA-8.0,0.835MTris-7.5,1.6％CTAB，1％β-疏基乙醇。在65℃水浴锅内反应30分钟，不时轻摇离心管。取出离心管，待冷至室温后，加入5ml氯仿、异戊醇混合液，其中氯仿与异戊醇体积比为24：1，小心摇动试管10分钟。8000rpm离心10分钟，将上清液转至另一50ml离心管中。加4ml异丙醇，小心混匀，将棉絮状DNA转入盛10ml70％乙醇的50ml离心管中，浸泡12小时。倒掉70％乙醇，将DNA晾干，加入1mlTE溶解。待DNA完全溶解后，转入2.0ml离心管中，加入10μl10mg/mlRNaseA，混匀；在37℃下，温育2小时。再用1ml苯酚、氯仿、异戊醇混合液抽提一次，其中苯酚、氯仿、异戊醇的体积比为25∶24∶1，8000rpm离心10分钟。将上清液转入2.0ml离心管中，加入1/10上清液体积的3MNaAC，所述NaAC的pH为5.2，再加入2/3上清液体积的异丙醇沉淀DNA。将棉絮状DNA转入2.0ml离心管中，用70％乙醇洗涤一次，短暂离心，使DNA贴壁，倒去70％乙醇，晾干DNA。待DNA晾干后，加入0.5mlTE溶液，完全溶解DNA，于-20℃长期保存。

3、zmERF18基因启动子的克隆

根据玉米自交系B73zmERF18基因的启动子序列，设计一对特异引物，左引物：5′CACCCGTTGACGATGGTGAAAGGAGA3′，即SEQIDNo:2；右引物：5′TTGTTGGCGGTGAGACATTAGG3′，即SEQIDNo:3。以Hz32的DNA作为模板，使用高保真Taq酶phusion进行PCR扩增。

PCR扩增反应体系为：5μl10×PCR缓冲液,2μl10mMdNTPs,1μl10mM特异左引物，1μl10mM特异右引物，1单位phusion酶，40ng模板DNA，加ddH₂O至总体积50μl。

PCR扩增程序为：95℃3分钟；95℃1分钟，58℃1分钟，72℃2分钟，循环35次；72℃7分钟；4℃30分钟。

PCR扩增产物于1％琼脂糖凝胶中120伏直流电压电泳45分钟，使用北京全式金生物技术有限公司的凝胶回收试剂盒，回收特异DNA片段，后续将该DNA片段连接到pENT-D载体上，进行DNA测序。所述pENT-D载体从北京全式金生物有限公司购买。

4、转化载体的构建

从凝胶中回收的PCR产物，克隆到pENT-D载体中，使用北京全式金生物技术有限公司的pENT-D试剂盒进行反应，反应体系：40-50ngPCR产物，dilutedsalt(稀释的盐溶液)1μl，pENT-D0.5μl，加水至6μl；

反应产物混匀后以转速5000rpm离心1分钟，25℃放置1小时。将反应产物通过电击法转化DH10B大肠杆菌感受态细胞，然后进行振荡培养，37℃培养1小时后，取出均匀涂抹于含有100mg/Lkm的LB平板上，再将含有km的LB平板置于恒温箱中37℃培养20小时。挑选单克隆，PCR检测、DNA测序，获得阳性克隆。获得的阳性克隆中提取质粒DNA，并与pCAMBIA1300载体进行重组，然后将zmERF18启动子重组到pCAMBIA1300载体中，以获得pCAMBIA1300-zmERF18-GUS载体，由市场上购得的pCAMBIA1300载体均适用于本发明。

重组反应体系：pENT-D-zmERF182μl，pCAMBIA13002μl，ClonseII1μl，25℃1小时；获得的重组产物电击法转入大肠杆菌DH10B感受态细胞后，均匀涂抹于含有100mg/LAmp(氨苄)的LB平板，然后将含有Amp的LB平板置于恒温箱中，37℃培养20小时。挑选单克隆，采用碱变性提取法提取质粒DNA，用NotI、AscI双酶切检测，并用1％琼脂糖凝胶分析酶切图谱，选阳性克隆用于水稻的转基因；

对所克隆的zmERF18基因启动子进行DNA测序，测得的DNA序列如SEQIDNO:1所示。

该启动子含有1个GARE、1个TC-richmotif、3个Skn-1motif、1个CGTCA-motif和1个MBS位点顺式元件，这些顺式元件与植物激素、厌氧胁迫响应相关；是一个组织特异型的启动子，只在根系中表达；是一个诱导型的启动子，受淹水诱导高效表达。该启动子与抗虫、抗病、抗逆等目的基因连接，在淹水、涝渍条件下，可提高转基因植株根部的抗虫、抗病、抗逆境能力。同时该启动子只在根部表达，不涉及食用转基因植物地上部分的食品安全问题。zmERF18启动子在旱生植物的耐渍遗传改良中，具有很好的应用前景。

5、转zmERF18启动子水稻植株的获得

将pCAMBIA1300-zmERF18-GUS载体，转入到LBA4404农杆菌中。由武汉伯远生物科技有限公司进行水稻的遗传转化，将zmERF18启动子转化到水稻自交系Kittaka中。所述LBA4404农杆菌菌株，由武汉伯远生物科技有限公司提供。

6、zmERF18启动子活性的检测

将转zmERF18水稻于苗期进行淹水处理，将正常生长和淹水处理的转基因水稻幼苗进行GUS组织化学染色。结果发现，在正常生长条件下，转zmERF18启动子水稻植株的根和叶片，未出现GUS染色的蓝色；而淹水条件下，转zmERF18启动子水稻的根呈现较强的GUS蓝色，叶片未见GUS蓝色。研究表明zmERF18启动子既是一个在根中表达的组织特异型启动子，同时也是一个淹水诱导表达的诱导型启动子。

zmERF18启动子是淹水条件下诱导表达的诱导型启动子，其直接驱动外源基因的转基因植物，淹水条件下4h内快速高效启动外源基因在植株根部的大量表达，启动能力较强，是强启动子，可以提高植株的耐渍性，或抗虫、抗病等能力；zmERF18启动子直接驱动外源基因的转基因植物，由于外源基因只在淹水条件下诱导表达，且表达部位仅局限于根部，所以对于食用非根部的转基因植物，不存在转基因食品安全问题。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.玉米zmERF18基因启动子，其特征在于：所述玉米zmERF18基因启动子具有：

(1)SEQIDNo:1所示的核苷酸序列；或

2.如权利要求1所述的玉米zmERF18基因启动子，其特征在于：所述玉米zmERF18基因启动子是从玉米自交系Hz32中克隆获得的。

3.一种载体，其特征在于：所述载体含有权利要求1或2所述的玉米zmERF18基因启动子。

4.权利要求1或2所述的玉米zmERF18基因启动子在植物的耐渍性改良中的应用。

5.权利要求1或2所述的玉米zmERF18基因启动子在制备转基因植物中的应用。

6.如权利要求5所述的玉米zmERF18基因启动子在制备转基因植物中的应用，其特征在于：所述植物为旱生作物。

7.如权利要求6所述的玉米zmERF18基因启动子在制备转基因植物中的应用，其特征在于：所述植物为玉米、水稻。