CN115976095A - OsLAC4基因在提高水稻产量中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了OsLAC4基因在提高水稻产量中的应用。本发明研究显示，敲除水稻的OsLAC4基因，能明显增大水稻的籽粒和穗型，千粒重也明显增加。表明OsLAC4基因是水稻产量的负调控基因，且其对于水稻产量的提升效果显著优于OsLAC20基因，可通过敲除OsLAC4基因来培育高产水稻，为培育高产水稻提供了一种高效的方法。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，更具体地，涉及OsLAC4基因及其编码蛋白在提高水稻产量中的应用。
背景技术
随着全球人口的迅速增长和地球可耕地面积的减少，粮食安全问题变得越来越重要。因此培育高产高抗的品种已成为作物遗传学家们关注的重要问题和研究方向。
水稻属于单子叶禾本科植物，是主要粮食作物之一。水稻的产量主要由分蘖数，每穗粒数和千粒重以及环境等因素的影响。因此，寻找结实率正常，产量增加的基因对生产有重要的指导意义。目前已经有很多与产量相关的基因被鉴定出来。例如：IPA1是miR156下游的转录因子，正调控水稻分蘖，有效粒数，以及粒型方面，是一个水稻理想株型。DEP1是控制穗型和穗粒数的一个关键基因，植株直立，穗粒数增加，进而显著提高水稻产量。GS3是一个控制水稻粒长和粒重的主效QTL，而对水稻粒宽和粒厚影响较小。
公告号为CN111534537B的中国专利公开了OsLAC20基因在增加水稻结实率、提高水稻产量中的应用，公告号为CNCN106480084B的中国专利公开了OsLAC13和miR397a/b在培育高结实率或高产水稻中的应用，但增产效果仍然有待提高。而目前，关于OsLAC4基因在提高水稻产量中的应用还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供SEQ ID NO：1所示OsLAC4基因或SEQ ID NO：2所示OsLAC4蛋白在显著提高水稻产量中的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
OsLAC4基因的序列如下：水稻基因组数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)，OsLAC4的基因编号是：LOC_Os01g62480，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明通过构建水稻OsLAC4基因的敲除载体并转化水稻植株，获得敲除OsLAC4基因的水稻突变株，结果显示，水稻突变株的穗型和籽粒均显著性增大，千粒重也明显增加，表明OsLAC4基因是水稻产量的负调控基因，且其对于水稻水稻产量的提升效果显著优于OsLAC20基因，可通过敲除OsLAC4基因用于培育高产水稻。
因此，本发明提供OsLAC4基因及其编码蛋白的以下用途：
SEQ ID NO：1所示OsLAC4基因或SEQ ID NO：2所示OsLAC4蛋白在调控水稻产量中的应用。
具体地，为调控水稻中OsLAC4基因或OsLAC4蛋白的表达水平，进而调控水稻产量。
SEQ ID NO：1所示OsLAC4基因或SEQ ID NO：2所示OsLAC4蛋白在提高水稻产量中的应用。
SEQ ID NO：1所示OsLAC4基因或SEQ ID NO：2所示OsLAC4蛋白在创制高产量水稻品种中的应用。
具体地，为抑制OsLAC4基因或OsLAC4蛋白的表达，从而提高水稻产量。
优选地，为构建稳定遗传的OsLAC4基因敲除突变体水稻。
具体地，所述构建稳定遗传的OsLAC4基因敲除突变体水稻，包括如下步骤：
S1.构建OsLAC4基因敲除质粒；
S2.将步骤S1所述质粒转化水稻愈伤组织；
S3.转基因水稻阳性愈伤组织的筛选与分化，获得稳定遗传的OsLAC4基因敲除突变体植株。
优选地，所述OsLAC4基因的敲除载体为pYLCRISPRCas9-OsLAC4。
进一步优选地，所述OsLAC4基因的敲除载体靶点的sgRNA表达盒构建序列为：
P1：5'-gccgCCTAGTGATGCCCTGAGCT-3'；
5'-aaacAGCTCAGGGCATCACTAGG-3'；
P2：5'-gttgGCACAACATCTCGTTGCAC-3'；
5'-aaacGTGCAACGAGATGTTGTGC-3'。
本发明还提供OsLAC4基因的敲除载体或质粒在提高水稻产量或在创制高产量水稻品种中的应用。
具体地，所述高产是指穗型更大，每穗粒数或有效粒数更多，籽粒更大、千粒重更重。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明公开了OsLAC4基因在提高水稻产量中的应用。本发明研究显示，敲除OsLAC4基因的水稻植株一级分支增多，穗型增大，敲除籽粒的长宽厚明显增大，千粒重也明显增加，表明OsLAC4基因是水稻产量的负调控基因，且其对于水稻水稻产量的提升效果显著优于OsLAC20基因。因此，对OsLAC4的负调控可用于培育高产水稻，为培育高产水稻提供了一种简单高效的方法。
附图说明
图1为CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC4突变株的基因型检测。
图2为野生型与突变株全株的比较，其中，左边为野生型，右边为CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC4的突变株。
图3中A为野生型与突变株的穗型比较，其中，左边为野生型，右边为CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC4的突变株。B为野生型与突变株的穗型的一级分支统计图。
图4中A为野生型与CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC4突变株的种子粒长粒宽粒厚比较。其中，上排为野生型，下排为CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC4的突变株。A为野生型与CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC4突变株的粒型统计图。
图5为野生型与CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC4突变株的千粒重的统计比较。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 pYLCRISPR/Cas9-OsLAC4敲除质粒的构建
1、OsLAC4敲除质粒的靶点设计
用在线软件CRISPR-P(http://skl.scau.edu.cn/targetdesign/)在OsLAC4上设计两个靶位点。
通过引物构建两个靶位点的sgRNA表达盒。引物序列如下所示：
P1：5'-gccgCCTAGTGATGCCCTGAGCT-3'；
5'-aaacAGCTCAGGGCATCACTAGG-3'；
P2：5'-gttgGCACAACATCTCGTTGCAC-3'；
5'-aaacGTGCAACGAGATGTTGTGC-3'。
2、将表达盒连入以双元载体pCAMBIA-1300为骨架的pYLCRISPR/Cas9载体并转化大肠杆菌，完成OsLAC4敲除质粒的构建。
实施例2 OsLAC4敲除质粒转化水稻愈伤组织获得敲除水稻突变株
1、敲除质粒转化根癌农杆菌
将上述构建的表达质粒转化根癌农杆菌(市售)，所述转化方法为本领域常规操作，然后将该转化有OsLAC4敲除质粒的根癌农杆菌菌种，在含有利福平，卡那霉素和潮霉素的YEP培养基(10g酵母膏，10g蛋白胨，5g NaCl，15g琼脂)上进行划线培养，28℃黑暗培养2～3天后挑取单菌落涂布于含有相同抗生素的YEP培养基上，28℃黑暗培养2天，刮取适量菌体悬浮于含有100μM乙酰丁香酮的液体共培养基中，使之稀释至OD550为0.3左右，28℃摇床(140rpm)培养40分钟，即制备得到根癌农杆菌浸染液，可用于侵染。
取水稻的成熟种子剥去颖壳，用75％酒精浸泡1分钟后用无菌水清洗多次，然后用1％次氯酸钠处理两次，每次20分钟，期间摇动多次，无菌水清洗多次后用无菌滤纸吸干水分，接到诱导培养基(N6大量，B5微量，B5有机，铁盐，2mg/L2,4-D，30g/L蔗糖，500mg/L谷氨酰胺，500mg/L脯氨酸，300mg/L水解酪蛋白，3.0g/L植物凝胶)上，将诱导出的胚性愈伤组织接到新鲜的诱导培养基上继续培养，每隔2～3个星期再挑取生长状态好的愈伤组织接到新鲜的诱导培养基上进行继代培养。
挑取淡黄色、颗粒状、结构致密、生长状态好的愈伤组织到无菌三角瓶中适当干燥处理后，加入上述制备好的根癌农杆菌侵染液侵染20分钟，期间适当摇动几次。侵染后将愈伤组织放在加有无菌滤纸的培养皿中，风干1～2小时。然后把愈伤组织接到加有一层滤纸的共培养基上，再风干半小时左右后，置于26℃黑暗培养2～3天。
2、转基因水稻阳性愈伤组织的筛选与分化
取出共培养后的愈伤组织放在加有三层滤纸的无菌培养皿中，干燥1天左右，再接到筛选培养基上，置于26℃黑暗培养14～21天。共筛选两次。挑取生长状态好的抗性愈伤组织接到预分化培养基上，26℃光照培养。21天后，把生长状态好及出现绿点的抗性愈伤组织接到分化培养基上，使愈伤组织进行再生。待抗性愈伤组织分化出的小苗长到4～6cm时，将其转到生根培养基上，继续在26℃光照培养。待小苗长至10～12cm，叶片宽大、颜色深绿且根系生长健全后，洗掉培养基及其基部附着的愈伤组织，在室外进行盆栽种植，即得到转基因水稻。
上述筛选培养基的配方为：N6培养基大量+MS培养基微量+B5培养基少量+1g/L水解酪蛋白+1g/L脯氨酸+2mg/L(2，4-D)+30g/L蔗糖+潮霉素50mg/L+头孢500mg/L+4g/L植物凝胶，筛选培养基的终PH＝5.8。
上述预分化培养基的配方为：MS培养基+1g/L水解酪蛋白+20g/L蔗糖+1mg/L(2，4-D)+头孢500mg/L+潮霉素50mg/L+4g/L植物凝胶，预分化培养基的终pH＝5.8。
上述分化培养基的配方为：MS培养基+2mg/L(6-BA)+0.5mg/L萘乙酸+1mg/L激动素+30g/L蔗糖+3％山梨醇+4g/L植物凝胶，分化培养基的终pH＝5.8。
上述生根培养基的配方为1/2MS培养基。
本实施例中所采用的MS培养基、1/2MS培养基和N6培养基等的配方均采用本领域的常规配方。上述各培养基配方中所涉及的试剂均为市售。
3、CRISPR/Cas9突变株的鉴定
根据MSU库中基因组DNA的序列在敲除靶点的上下游约100～200bp的位置设计检验引物。提取突变株叶片或其他组织中的DNA为模板，用outer引物经过高保真酶PCR扩增获得DNA片段，然后产物凝胶电泳后切胶回收，用设计好的inner引物送公司测序。测序结果通过网站分析敲除效果：http://dsdecode.scgene.com/home/。CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC4突变株的基因型检测结果如图1所示，表明OsLAC4基因移码突变。
实施例3 OsLAC4突变株水稻种植及表型分析
CRISPER-Cas9敲除突变株使用两条染色体上OsLAC4均失活的突变株。水稻种子用水萌发，在平盘上种植一周后，转种于大田中长至谷粒成熟。其中，种子大小，千粒重比较使用完全成熟并烘干后的种子。所有统计数据均为多于30棵的水稻苗的平均值。
图2为野生型与突变株全株的比较，其中，左边为野生型，右边为CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC4的突变株，表明CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC4的突变株比WT植株高大。
图3为野生型与突变株的穗大小比较，其中A图左边为野生型，右边为CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC4的突变株，表明敲除OsLAC4的突变株穗型比WT大很多。B图为野生型与突变株的一级分支统计图。灰色柱子表示野生型，橘色柱子表示CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC4突变株。表明敲除OsLAC4的突变株一级分支比WT多，穗型大。
图4中A图为野生型与CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC4突变株的种子粒长粒宽粒厚比较。其中，上排为野生型，下排为CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC4的突变株，表明敲除OsLAC4突变株的种子粒长粒宽粒厚比WT大很多。B图为野生型与CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC4突变株的粒长粒宽粒厚统计图。灰色柱子表示野生型，橘色柱子表示CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC4突变株。表明敲除OsLAC4粒型确实增大。
图5为野生型与CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC4突变株的千粒重的统计比较。灰色柱子表示野生型，橘色柱子表示CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC4突变株。表明CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC4突变株千粒重与WT相比有显著的增大。OsLAC4突变株千粒重明显比WT高15％以上，而OsLAC20突变株比WT只高了2.3％左右。表明CRISPR-Cas9技术敲除OsLAC4突变株千粒重与WT和OsLAC20突变株相比有显著的增大。
以上图2～5结果说明，敲除水稻OsLAC4基因，可以增加水稻的生长速度，显著提高水稻的产量，增大谷粒的大小与千粒重，且提升效果显著优于现有技术中报道的OsLAC20基因。
Claims (10)
1.SEQ ID NO：1所示OsLAC4基因在调控水稻产量中的应用。
2.SEQ ID NO：2所示OsLAC4蛋白在调控水稻产量中的应用。
3.SEQ ID NO：1所示OsLAC4基因或SEQ ID NO：2所示OsLAC4蛋白在提高水稻产量中的应用。
4.SEQ ID NO：1所示OsLAC4基因或SEQ ID NO：2所示OsLAC4蛋白在创制高产量水稻品种中的应用。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，为调控水稻中OsLAC4基因或OsLAC4蛋白的表达水平，进而调控水稻产量。
6.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，为抑制OsLAC4基因或OsLAC4蛋白的表达，从而提高水稻产量。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，构建稳定遗传的OsLAC4基因敲除突变体水稻。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述构建稳定遗传的OsLAC4基因敲除突变体水稻，包括如下步骤：
S1.构建OsLAC4基因敲除质粒；
S2.将步骤S1所述质粒转化水稻愈伤组织；
S3.转基因水稻阳性愈伤组织的筛选与分化，获得稳定遗传的OsLAC4基因敲除突变体植株。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述OsLAC4基因的敲除载体为pYLCRISPRCas9-OsLAC4。
10.含有OsLAC4基因敲除靶点sgRNA表达盒的敲除载体或质粒在提高水稻产量或在创制高产量水稻品种中的应用。
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