磷酸丝氨酸氨基转移酶基因在促进植物生长并提高抗盐性方
面的应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域,具体涉及一种控制植物体内丝氨酸合成、促进生长并提高抗盐性基因在农业生产上应用和方法,是一种运用生物基因工程技术培育高产、抗盐植物新种质的方法。
背景技术
L-丝氨酸(L-Serine,L-Ser)是生物体中非常重要的氨基酸。除了是蛋白质重要组成成分和在许多酶活性中心起催化作用外,L-丝氨酸还是许多细胞生命活动所必须的生物大分子,如甘氨酸、色氨酸和半胱氨酸等氨基酸合成的底物,并参与氮代谢、鞘磷脂、脂质代谢和一碳单位的代谢等,还和抗性有关。
盐胁迫下植物的各种生命活动都受到不同程度的影响,主要表现为抑制植物的生长发育、破坏植物细胞结构以及影响维持植物正常生理代谢所需生物分子的合成等方面。当土壤中盐分过多时,通常会对植物造成生理干旱、离子的毒害作用、破坏正常代谢。植物在遭遇低温和盐胁迫等非常环境时,会启动多种调节响应措施来应对不利影响,例如,细胞内增加可溶性糖、氨基酸等物质的含量以增加细胞的吸水能力,调动酶促和非酶促系统以清除积累的活性氧等。
有研究显示植物在盐胁迫环境下存在L-Ser积累,拟南芥PSP1和PGDH1基因的启动子序列分析显示有很多非生物胁迫特异性的序列存在。在拟南芥中过表达一个来自一种藻的PGDH基因可以提高其抗盐和抗冷性,但在研究中未解释丝氨酸或是这个基因如何影响了植物的抗性。
发明内容
目前的研究表明,在大部分有机体中,L-Ser主要通过磷酸化途径合成。但是在植物中,L-Ser合成主要由与光呼吸有关的乙醇酸途径和磷酸化丝氨酸合成途径合成。光呼吸一些最重要的反应发生在线粒体基质中导致乙醇酸合成途径中L-Ser的合成。在这些反应中,一个甘氨酸分子在甘氨酸脱羧复合体的作用下脱羧,脱氨,产生CO2、NH3,并伴随着NAD+还原为NADH。甘氨酸剩余的亚甲基转移给四氢叶酸(THF)形成亚甲基四氢叶酸,亚甲基四氢叶酸和第二个甘氨酸在丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)的作用下形成L-Ser。因此,光呼吸可以为氨基酸、核酸和蛋白质等的代谢提供一碳单位,还能为硝酸还原酶提供能量,还为很多次级代谢物的合成提供前体物质,如抗性物质甜菜碱的前体物质——甘氨酸。光呼吸与抗性密切相关。我们早期的研究显示,在浮萍和拟南芥中,过表达光呼吸途径中与丝氨酸代谢有关的酶的编码基因AtAGT可以提高其抗盐性。
在植物,动物和细菌体中,磷酸化丝氨酸合成途径都被保存了下来。植物磷酸化丝氨酸合成途径发生在质体中。这条途径中涉及了三个催化反应,分别由3-PGA脱氢酶(PGDH,EC 1.1.1.95),3-磷酸丝氨酸氨基转移酶(PSAT,EC 2.6.1.52),3-磷酸丝氨酸磷酸化酶(PSP,EC 3.1.3.3)所催化。前体物质3-PGA被PGDH氧化,NAD+作为辅助因子,形成3-磷酸羟基丙酮酸(3-PHP),3-PHP又被PSAT催化生成3-磷酸丝氨酸,在这个反应中L-谷氨酸作为氨基酸供体,释放出2-酮戊二酸。最后一步是3-磷酸丝氨酸在PSP酶的催化下去鳞酸化形成丝氨酸。研究显示,磷酸化丝氨酸合成途径在植物的环境胁迫中有重要作用,但具体的抗性机制还不清楚。
在本发明中,我们从拟南芥中克隆出磷酸丝氨酸氨基转移酶AtPSAT1基因,通过植物表达载体转入植物中,发现它不仅可以诱导植物体内源丝氨酸和甘氨酸过量合成,促进植物的生长,生物量提高而且抗盐性也有提高。这种转基因技术可能在农业生产上具有良好的应用前景。
因此,本发明提供的技术方案如下。
磷酸丝氨酸氨基转移酶AtPSAT1基因在促进植物生长和/或提高植物抗盐性方面的应用。
其中,所述磷酸丝氨酸氨基转移酶AtPSAT1基因提取自拟南芥,编码序列为Genebank中At4g35630全长序列,如SEQ ID NO:1所示。不同植物体中具有相同的磷酸化丝氨酸合成途径,三个催化反应过程并不具有实质性差异,磷酸丝氨酸氨基转移酶AtPSAT1基因可以不限于拟南芥这一特定植物;另外,物种间差异使得磷酸丝氨酸氨基转移酶AtPSAT1基因存在相似性序列变体,不影响磷酸化丝氨酸合成途径的本质改变,因此本发明AtPSAT1基因包括At4g35630序列的保守性变体,优选的保守性变体具有与At4g35630序列80%、90%、95%、98%以上的同源性。
其中,所述磷酸丝氨酸氨基转移酶AtPSAT1基因由强启动子启动。强启动子对RNA聚合酶有很高亲和力,能指导合成大量的mRNA,本发明强启动子通过高表达AtPSAT1基因促进丝氨酸催化合成从而促进丝氨酸积累,强启动子可以根据不同表达载体以及感受态细胞的表达需要选取,本发明优选为CaMV35S强启动子。
其中,所述磷酸丝氨酸氨基转移酶AtPSAT1基因至少通过下述途径发挥作用:提高用于合成与调节细胞渗透作用相关的次级代谢物及其前体物质的含量。所述与调节细胞渗透作用相关的次级代谢物包括甜菜碱、脯氨酸,所述前体物质包括甘氨酸,2-酮戊二酸、谷氨酰胺。
本发明还提供了一种促进植物生长和/或提高植物抗盐性的方法,将磷酸丝氨酸氨基转移酶AtPSAT1基因转入植物细胞中高表达。
其中,所述方法包括,构建磷酸丝氨酸氨基转移酶AtPSAT1基因的植物表达载体,将植物表达载体转染植物细胞。
所述植物表达载体的构建方法包括:(1)提取AtPSAT1目的基因;(2)将AtPSAT1目的基因构建至TA克隆载体(本发明为simple-T载体);(3)将AtPSAT1目的基因自TA克隆载体转移至植物表达载体(本发明为pCAMBIA1301)中,植物表达载体上具有能够启动AtPSAT1目的基因高表达的强启动子(CaMV35S)。也可以通过基因重组、人工合成等方法,首先将强启动子与AtPSAT1目的基因连接,再转入克隆载体或植物表达载体中,所用手段采用常规方法即可实现。
所述植物表达载体转染植物细胞采用农杆菌介导法完成。
本发明还提供了一种能够促进植物生长和/或提高植物抗盐性的表达载体,所述表达载体含有磷酸丝氨酸氨基转移酶AtPSAT1基因。
其中,所述表达载体上具有能够启动AtPSAT1目的基因高表达的强启动子,优选为CaMV35S。所述磷酸丝氨酸氨基转移酶AtPSAT1基因提取自拟南芥,编码序列为Genebank中At4g35630全长序列,如SEQ ID NO:1所示。所述AtPSAT1基因还包括At4g35630序列的保守性变体,优选的保守性变体具有与At4g35630序列80%、90%、95%、98%以上的同源性。
其中,所述磷酸丝氨酸氨基转移酶AtPSAT1基因至少通过下述途径发挥作用:提高用于合成与调节细胞渗透作用相关的次级代谢物及其前体物质的含量。所述与调节细胞渗透作用相关的次级代谢物包括甜菜碱、脯氨酸,所述前体物质包括甘氨酸,2-酮戊二酸、谷氨酰胺。
本发明的基因方法能够有效促进植物正常及其抗盐性能力,实验证明,磷酸丝氨酸氨基转移酶AtPSAT1基因转染的转基因植株在正常条件下的生长势、单株生物量均优于野生型植株,在NaCL胁迫下,转基因植株比野生型具有较强的抗逆性。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1是双元表达载体质粒pCAMBIA 1301-AtPSAT1的构建。
图2是AtPSAT1基因的扩增结果示意图。其中,1为AtPSAT;M为DL2000PLUS。
图3是pT-AtPSAT载体的PCR和酶切鉴定图。其中,负为负对照;1-4为转化子;M为DL2000PLUS。
图4 AtPSAT1过表达植株表型。
图5是AtPSAT1过表达植株表型鉴定。其中,A部分为DNA表达水平的鉴定图,A11293bp为AtPSAT1基因的长度,A2 486bp为内参S16基因的长度;B部分为RNA表达水平的实时定量PCR结果鉴定图。
图6是AtPSAT1过表达植株表型中丝氨酸含量。
图7是AtPSAT1过表达植株表型中甘氨酸含量。
图8是为AtPSAT1过表达植株对NaCl的抗性。
图9是AtPSAT1过表达植株表型中脯氨酸含量。
具体实施方式
为了更好的理解本发明,下面结合具体附图对本发明进行详细描述。
本发明方法中,AtPSAT1基因的编码序列是Genebank中At4g35630全长序列(SEQID NO:1)。
通过提取拟南芥7d苗龄幼苗的总RNA,用试剂盒反转为cDNA后,利用特异性引物对cDNA进行PCR扩增,获得1293bp的目的产物(SEQ ID NO:1)。目的产物进行回收纯化后,将其连接至simple-T载体,得到pT-AtPSAT1转化子,通过PCR鉴定和测序序列比对,证明目的序列正确,从而完成了pT-At PSAT1克隆载体的构建。
将测序正确的pT-At PSAT1克隆载体上的AtPSAT1基因经NcoⅠ和BstEⅡ双酶切后,插入双元载体pCAMBIA1301,替换原先载体上的gus基因,构成载体pCAMBIA 1301-AtPSAT1,双元载体pCAMBIA1301中于gus基因前方具有CaMV35S强启动子(图1中35S),能够启动AtPSAT1基因的高效表达。
用冻融法将上述构建好的双元表达载体pCAMBIA 1301-AtPSAT1转入农杆菌感受态细胞Gv3101中,筛选出转化子菌落,经过菌落PCR确认的转化子菌落用于转化植物。
采用获得的转化子菌落感染正要开放的拟南芥花朵,筛选出成功转基因植物,考察转基因植物的生长能力和在盐环境下的耐受能力。
下面详细阐述发明的具体实验过程。
实施例1:拟南芥总RNA的制备与检测
拟南芥总RNA的提取使用TRIzoL Reagent(Invitrogen公司购买)中试剂,按如下方法进行:取7-10天苗龄的叶片0.1g,加入1ml的TRIzoLRNA提取液,混匀室温静置5min,加入0.2ml氯仿,振荡混匀,4℃,12000rpm/min离心15min;转移上清液,加入0.5ml异丙醇,混匀室温放置10min后12000rpm/min离心10min;弃上清,75%的乙醇1ml清洗沉淀,4℃,7500rpm/min离心5min,真空干燥沉淀,用20μl焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水溶解RNA,-20℃,取1ul RNA用1.2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测,结果说明提取到的RNA质量符合要求。
实施例2:拟南芥cDNA的合成
用拟南芥总RNA为模板,使用RevertAidTM-MuLV Reverse Transcriptase Kit(Fermentas)进行cDNA的合成,取植物总RNA 0.25μg,oligo(dT)50ng,10mM dNTP mix 1μl,用DEPC处理水补足至10μl,混匀后,短暂离心将其收集于管底,置于65℃恒温干热加热器中加热5min,冰浴10min,加入9μl反应混合物(10×reaction buffer 4μl,25mM MgCl2 4μl,0.1M DTT 2μl,RNA酶抑制剂1μl),混匀,短暂离心将其收集于管底,25℃保温2min,加入1μlRevertAidTM-MuLV Reverse Transcriptase,混匀25℃保温20min,然后42℃保温70min,冰浴10min,-20℃保存备用。
实施例3:AtPSAT1基因的全长序列的获得
根据AtPSAT1基因片段设计PCR引物,由上海生物工程公司合成。
PSAT-fw-Nco I |
CCATGGGGATGGCGGCTACGACGAAC |
PSAT-rev-BstE II |
GGGTTACCCCTAAGCATGCTTAGCCTGG |
PCR反应体系为:
10×PCR buffer |
2.5μl |
dNTP mixture(10mM) |
0.5μl |
上游引物 |
0.5μl |
下游引物 |
0.5μl |
cDNA |
0.5μl |
Taq plus |
0.3μl |
H<sub>2</sub>O |
15.2μl |
Total volume |
20μl |
PCR反应程序为:94℃预变性3min,然后进行以下循环,94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸60s,共计31个循环,最后72℃延伸10min;
将上述经过PCR扩增到的目的产物利用琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒进行回收纯化(图2),并将其连接至simple-T载体,得到pT-AtPSAT1转化子,提取转化子质粒,对其PCR鉴定,得到1293bp产物(图3);同时利用限制性内切酶NcoⅠ和BstEⅡ对质粒酶切,也得到1293bp酶切产物(图3)。经测序并进行序列比对,证明目的序列正确,从而完成了pT-AtPSAT1克隆载体的构建。
将测序正确的pT-AtPSAT1克隆载体上的AtPSAT1基因经NcoⅠ和BstEⅡ双酶切后,插入同样经NcoⅠ和BstEⅡ双酶切的双元载体pCAMBIA1301,二者连接后,转化大肠杆菌,通过酶切鉴定筛选出重组子,获得PSAT双元表达载体质粒pCAMBIA1301-AtPSAT1。
上述构建过程如图1所示。
实施例4:AtPSAT1基因植物表达载体的构建
制备农杆菌感受态细胞,用冻融法将上述构建好的植物表达载体pCAMBIA1301-AtPSAT1转入农杆菌(GV3101)中,在加有潮霉素的LB平板上筛选转化子,取少量质粒加入农杆菌感受态细胞中,轻轻混匀,冰浴30min;将混合物加入在液氮中迅速冷冻1min,37℃水浴5min,迅速冰浴2min,加入800μl YEP液体培养基,轻柔颠倒混匀,28℃缓慢振荡培养4~6h;常温3000g离心5min,弃去800μl上清液;用剩余150μl上清液重悬菌体,将菌液均匀涂布于含有抗生素的固体培养基,于28℃培养箱中培养1~3天。
首先挑取农杆菌单菌落于20μlddH2O中,98℃处理15分钟后取出10μl农杆菌裂解液作为PCR反应的模板。用特异性引物PSAT-FW-NcoⅠ和PSAT-REV-BstEⅡ进行PCR检测,转化成功的菌落能扩增出1293bp的条带,经菌落PCR确认的转化子菌落用于转化植物。
实施例5:用有AtPSAT1基因植物表达载体的农杆菌转化植物
首先挑取携带有pCAMBIA 1301-AtPSAT1质粒的农杆菌单菌落接种于50ml的LB液体培养基(Hyg,10μg/ml),180rpm,28℃培养2h,待菌液OD600至1.0左右,3500rpm,离心10min,沉淀菌体。再用10ml的MS液体培养基悬浮菌体,3000rpm离心10min,沉淀菌体,重复以上操作2~3次;最后用培养液溶解菌体(YEP培养基+1%蔗糖+0.2%Tween 20),使菌体的OD600值为0.5;将即将开花的花在菌液内浸湿3次,每次约1分钟;黑暗倾斜培养一天;之后正常培养,至结种子,再用抗生素筛选转基因植株。
实施例6:AtPSAT1基因在转基因植物中的插入情况和转录水平的检测
种子发芽后,过表达AtPSAT1幼苗和对照(wild-type,wt)幼苗在正常空气短日照或长日照培养条件下生长四周,统计相关数据,代表图片被展示于图4。数据显示的平均值来自至少6个生物重复,实验至少重复2次。误差线代表SE。星号表示与野生型对照有差异。差异检测采用Student’s t-test(*代表P<0.1)。选取相同培养条件下的三株转基因植株L1、L2、L3及其野生型对照进行基因水平检测。
为了确认转基因植株L1、L2、L3确实有AtPSAT1基因,用PCR方法对筛选到的转基因植株作进一步的鉴定。首先采用CTAB法提取植物基因组:称取0.1g植物叶片置于1.5ml离心管中,加液氮用特制研棒研磨至粉状。加入900μl预热到65℃的2×CTAB缓冲液(Tris-HClpH7.5 100mM,EDTA 20mM,NaCl 1.4M,CTAB 2%),65℃水浴20min,中间每隔2min摇匀一次,取出冷却至室温,再加入500μl氯仿:异戊醇(24:1)混合液,旋转摇匀,4℃,7500rpm,离心10min,转移上清至一新的离心管,重复上述步骤。加入1/10体积3M pH5.2 NaOAc和等体积的异丙醇,摇匀后4℃,12000rpm,离心20min,弃上清,用75%乙醇清洗两次后干燥,用有RNase的1×TE缓冲液溶解并降解RNA,取2μl以1%琼脂糖凝胶电泳检测。以植物基因组DNA为模板,用PSAT基因内部部分序列的上下游特异性引物作PCR检测,成功转入AtPSAT1基因的植株均能扩增出1293bp的DNA条带(图5A),经PCR确认的转基因植株用于RT-PCR分析。
为了考察在有AtPSAT1基因的转基因烟株系L1、L2、L3中AtPSAT1基因的转录情况,从转基因植物L1、L2、L3以及野生型植株wt中抽取总RNA,反转录成cDNA后用于实时荧光定量PCR分析,检测AtPSAT1基因在转基因植物中的转录水平,采用iCycler Thermal Cycler:Bio-Rad iQ5型荧光定量PCR仪和TaKaRa SYBR Premix EX TaqTM II[Code:DRR820A]定量PCR试剂(TAKARA生物)。
用于实时定量PCR的引物为:
PSAT-fw-RT |
CAAGGTGGTGCCACTACTCA |
PSAT-rev-RT |
TCACCCCACGAACCAGTAAC |
S16-fw-RT |
GGCGACACAACCAGCTACTGA |
S16-rev-RT |
CGGTAACTCTTCTGGTAACGA |
(1)配制PCR反应混合液(在冰上进行),混合液体系如下:
Real-time RT-PCR扩增程序如下(三步法):
相对表达量计算采用2-ΔΔCT的方法:
目的基因相对表达量=2(ΔCT对照组-ΔCT实验组)
ΔCT对照组=CT对照组-CT对照组内参
ΔCT实验组=CT对照组-CT对照组内参
每个基因做3个组重复,每个试验至少三个生物重复。
结果证明了AtPSAT1基因在WT株系中不表达,而转基因拟南芥植株中的AtPSAT1基因表达量均显著高于WT,进一步证实所转的AtPSAT1基因cDNA已成功插入转基因拟南芥的基因组中(图5B)。经Real-PCR确认的转基因植株用于进一步的生理生化分析。
实施例7:转基因植物在高NaCl环境条件下的生长情况
为了确认转AtPSAT1基因的植株确实具有生长优势,将转基因和野生型(wt)种子直接播种于含150mM NaCl和不含NaCl的培养基中,在培养一段时间后观察植物表型的变化。转AtPSAT1基因植株长势好,而含150mM NaCl的培养基中wt不发芽(图8),说明了在正常NaCl水平和高浓度NaCl胁迫下,过表达AtPSAT1基因的拟南芥植株都较wt的生物量高;说明过表达AtPSAT1提高了对氯化钠的抗性,在一定程度上缓解了NaCl胁迫对拟南芥生长的影响。
实施例8:转基因植物中丝氨酸和甘氨酸的代谢情况
为了检测转基因植物对产物丝氨酸和甘氨酸是否有影响,我们检测了10天苗龄的转基因植物地上部分植株中丝氨酸和甘氨酸的含量,结果显示(图6-7),与对照相比,转基因三个株系中丝氨酸的含量均为对照的1.2倍左右,而甘氨酸含量则是对照的2-3倍,暗示转基因植株影响了丝氨酸和甘氨酸的代谢。在光呼吸反应中积累的丝氨酸能够提供更多的次级代谢物合成前体物质,甘氨酸作为前体物质之一,是抗性物质甜菜碱的合成前体,我们推测甘氨酸含硫量的有效提高有利于抗性物质甜菜碱的合成表达,这可能是转基因植物抗性提高的原因之一。
实施例9:转基因植物中脯氨酸的代谢情况
有研究显示,磷酸化丝氨酸合成途径的另一个主要功能是提高2-酮戊二酸的含量,我们推测这可能是转基因PGDH提高抗盐和抗冷性的另一部分原因,因为2-酮戊二酸是谷氨酰胺的合成前体,而谷氨酰胺是脯氨酸的合成前体,2-酮戊二酸的增高能够促进渗透调节物质脯氨酸的合成,进而提高植物的抗性。为了确认转AtPSAT1基因植株脯氨酸含量是否受到影响,将转基因及wt型植株的叶片收集检测其内源脯氨酸含量(图9)。结果显示,转基本植株叶片内的脯氨酸含量显著高于野生型植株,约是对照的2.2-3倍,暗示其在提高转基因植株中发挥了重要作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 天津泰达绿化集团有限公司
<120> 磷酸丝氨酸氨基转移酶基因在促进植物生长并提高抗盐性方面的应用
<130> TDLH19005-1
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1293
<212> DNA
<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 1
atggcggcta cgacgaactc tttccttgtc ggaagcaaca acactcagat tcctgctttg 60
aaacccaaat catcatctca atcctttctt cacctcagca aaccaaacac cgtcaacttc 120
gtcagcaaaa ccaagcccgt cgctgttaga tgcgtcgctt caacgactca agttcaagat 180
ggagttagat ccggctccgt cggatcccaa gaacgtgtct tcaacttcgc ggcgggtcca 240
gccactttgc ctgagaacgt tctcctaaaa gctcaggcgg atctatacaa ctggcgtgga 300
tctggcatga gtgtgatgga gatgagtcac agaggcaaag agtttctctc gattatacaa 360
aaagctgaat cggatcttcg tcagcttctc gagattcctc aggaatattc cgttttgttc 420
ttacaaggtg gtgccactac tcaattcgct gctttacctc tcaatctctg caaatcggat 480
gatacagtcg atttcgttgt tactggttcg tggggtgata aagctgtcaa ggaagcgaag 540
aagtattgca agactaatgt gatttggtct gggaaatctg agaaatacac aaaggttcca 600
tcttttgagg agttggagca aactccggac gctaagtatt tgcatatatg cgccaatgag 660
actattcatg gagttgagtt taaagattac cctgttccta aaaatgggtt cttggttgct 720
gatatgtctt ctaacttctg ttcgaaacct gttgatgtat ctaagtttgg tgtgatttac 780
ggtggtgcac agaagaacgt tggtccatct ggtgtcacaa ttgtgatcat tcgtaaagat 840
ttgattggga atgctcaaga tattactcct gtgatgcttg attacaagat tcatgatgag 900
aatagttcgt tgtacaacac gcctccttgc tttgggattt acatgtgtgg tcttgtgttt 960
gaagatctgt tggagcaagg tggattgaaa gaagtggaga agaagaacca gaggaaagct 1020
gatttgcttt acaatgctat tgaagaaagc aatggctttt tcagatgtcc tgttgagaaa 1080
tcagtgaggt cgttgatgaa tgtgcctttc acattggaga agtctgaatt ggaagctgag 1140
tttatcaagg aagctgctaa agagaagatg gtgcagctca aaggacatag atcagtggga 1200
ggtatgagag cttctattta caatgcaatg cctttggctg gtgttgaaaa gcttgttgct 1260
ttcatgaaag atttccaggc taagcatgct tag 1293