CN105063022A - 盐地碱蓬耐低磷基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种盐地碱蓬耐低磷基因及应用，盐地碱蓬耐低磷基因，是序列表中SEQ？ID？NO.1所示的核苷酸序列。本发明的盐地碱蓬耐低磷基因，从盐地碱蓬中获取并具有序列表中SEQ？ID？NO.1所示的核苷酸序列，并能够获得含有该基因的重组载体和宿主细胞，采用该基因转染的拟南芥表现出对低磷胁迫的耐受力，说明本发明提供的耐低磷基因能在改良作物耐低磷能力中应用。

Description

盐地碱蓬耐低磷基因及应用

技术领域

本发明属于分子生物学和生物技术领域，更加具体地说，涉及一种盐地碱蓬耐低磷基因及其应用。

背景技术

磷是生物生长发育的重要营养元素之一，是蛋白质、核酸、脂类以及各种重要的小分子的重要组成成分，在植物新陈代谢过程中扮演着十分重要的角色。然而，磷是一种不可再生的资源，大部分土壤有效磷含量较低，难以满足植物生长的正常需求。据报道，世界上至少有30％～40％的作物产量受到低磷胁迫的严重抑制(Runge-MetzgerA.)。农业生产上，主要通过施用磷肥来解决土壤磷缺乏问题，但是使用的磷肥很容易被土壤固定为作物不易吸收的难溶性磷，难以完全满足作物对磷的需求。因此，提高植物对磷的吸收和利用率，创制耐低磷作物品种，对于减少农业磷的施用量，维护生态安全，提高作物的产量等方面具有重要意义。随着对植物低磷胁迫应答的分子机理研究不断深入，特别是以拟南芥为研究对象，植物在低磷胁迫条件下的研究取得了突破性的进展。目前，对耐低磷基因的分离是当前利用基因工程方法进行耐低磷作物培育的首要任务。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种盐地碱蓬耐低磷基因。

本发明的第二个目的是提供一种含盐地碱蓬耐低磷基因的重组载体。

本发明的第三个目的是提供一种含上述重组载体的宿主细胞。

本发明的第四个目的是提供一种盐地碱蓬耐低磷基因的应用。

本发明的技术方案概述如下：

一种盐地碱蓬耐低磷基因，是序列表中SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。

含上述一种盐地碱蓬耐低磷基因的重组载体。

含有上述重组载体的宿主细胞。

一种盐地碱蓬耐低磷基因在改良植物耐低磷的应用。

本发明的盐地碱蓬耐低磷基因，从盐地碱蓬中获取并具有序列表中SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，并能够获得含有该基因的重组载体和宿主细胞，采用该基因转染的拟南芥表现出对低磷胁迫的耐受力，说明本发明提供的耐低磷基因能在改良作物耐低磷能力中应用。

附图说明

图1是本发明的盐地碱蓬耐低磷PHT基因克隆电泳示意图。

图2是包含本发明的盐地碱蓬耐低磷的基因S.saPHT的表达载体示意图。

图3是S.saPHT转基因拟南芥genomicDNAPCR筛选结果。

图4是S.saPHT转基因拟南芥T3纯合体半定量PCR结果。

图5是S.saPHT转基因拟南芥T3纯合体耐低磷根系实验效果。

图6是S.saPHT转基因拟南芥耐低磷实验根系生长情况。

具体实施方式

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

实施例1

一种盐地碱蓬耐低磷基因的获得

使用的植物碱蓬(盐地碱蓬)来源为天津市滨海新区北塘口东海路。

首先，以此为原料获取本发明的耐低磷基因(即盐地碱蓬PHT基因的克隆)。

取五周新鲜盐地碱蓬植株，使用植物RNeasyPlantMiniKit(TransgeneCode#EP101-0150rxns)提取totalRNA，并且利用EasyScriptFirst-StrandcDNASynS.saesisSuperMix(TransgeneCode#AE301-03100rxns)去除基因组DNA干扰，反转录出cDNA。

根据NCBI数据库中的ArabidopsisthalianaPHT1:n基因的序列保守区设计简并引物PHT-5(SEQIDNO.2所示，5’-GGGTTCTTTACGGATGCCTACGAT-3’)和PHT-3(SEQIDNO.3所示，5’-TCACCGAGCCATCCGAAGAAG-3’)，然后利用RACE-PCR技术(Introgen,FirstChoiceRLM-RACEKitwithManual)获得盐地碱蓬PHT基因全长cDNA序列即PHT基因，将PHT基因进行测序分析，得到完整S.saPHT基因全长为1578bp，如序列表中SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，即本发明的盐地碱蓬耐低磷基因，见图1。

根据盐地碱蓬耐低磷基因核苷酸序列设计上下游引物PHT-F(SEQIDNO.4所示，5’-TCGACGACTTCCTATCTATGGC-3’)和PHT-R(SEQIDNO.5所示,5’-GCCAAAACAATCCTTTCCAGT-3’)，利用EasyScriptFirst-StrandcDNASynS.saesisSuperMix(TransgeneCode#AE301-03100rxns)去除基因组DNA干扰，反转录出盐地碱蓬cDNA，反应PCR程序：42℃30min，85℃5min；4℃，∞。

利用RACE-PCR技术的具体步骤，如下：

(1)cDNA第一链的合成，用反转录试剂盒TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.3.0，以盐地碱蓬总RNA为模板，Oligo(dT)为引物，在AMV逆转录酶的作用下合成cDNA第一链，反转录体系如下表所示。反应条件：30℃10min，42℃30min，99℃5min和5℃5min。

(2)盐地碱蓬耐低磷基因反转录质量PCR扩增检测，用盐地碱蓬Actin基因特异引物进行PCR扩增，以验证反转录反应及RNA质量。PCR反应体系如下表所示。PCR反应条件：95℃，5min；95℃30s，55℃30s，72℃50s，35cycles；72℃，10min；4℃，∞。引物S.saACT-F如序列表中SEQIDNo.6所示，5'–GTGGTCGTACAACGGTATTGTG-3'，引物S.saACT-R如序列表中SEQIDNo.7所示，5'-GACCTCCAATCCAGACACTG-3'。

(3)盐地碱蓬耐低磷基因片段的PCR扩增，以cDNA为模板，以SEQIDNo.2、SEQIDNo.3所示核苷酸为上下游引物，进行PCR反应。反应体系如下表所示。PCR反应条件：94℃3min；94℃30s,55℃30s，72℃60s，35cycles；72℃5min；4℃，∞。PCR结束后，取5μlPCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。

对通过RACE技术扩增得到的盐地碱蓬耐低磷基因进行测序分析，得到完整的盐地碱蓬PHT基因全长为1578bp(SEQIDNo.1)。

(4)构建超表达载体时，在SEQIDNo.4的5’端添加Gateway系统重组位点SEQIDNo.8:5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3’；在SEQIDNo.5的5’端添加Gateway系统重组位点SEQIDNo.9:5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3’分别得到：

SEQIDNo.10:5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGACGACTTCCTATCTATGGC-3'

SEQIDNo.11:5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGCCAAAACAATCCTTTCCAGT-3'

(5)attB-PCR产物的合成及纯化回收

PCR离心管中加入以下反应体系

PCR反应条件为:95℃，5min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，90s；72℃，10min；4℃，∞。

PCR反应结束后，取1μLPCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物的质量，其余用作产物的纯化回收。

实施例2

一种含盐地碱蓬耐低磷基因的重组载体(pK2GW7I_S.saPHT)及宿主细胞的构建

构建含有本发明的盐地碱蓬耐低磷基因的中间载体pJET1.2_S.saPHT、pDONR201_S.saPHT和植物表达载体pK2GW7I_S.saPHT，见图2。

将胶回收纯化后的目的片段(纯化后的盐地碱蓬耐低磷基因(S.saPHT基因))利用CloneJETPCRCloningKit(CloneJETPCRCloningKit#K123120rxns)连接到pJET1.2上，(质粒pJET1.2：Thermo)分别利用载体和目的片段的上下游引物PHT-F(SEQIDNO.4)和PHT-R(SEQIDNO.5)对同一个大肠杆菌DH5α感受态细胞菌落进行菌落PCR双重验证，筛选pJET1.2_S.saPHT阳性菌落测序。提取测序正确菌液的质粒进行BP反应，筛选出阳性克隆进行测序。同样，提取测序正确的BP菌质粒进行LR反应，筛选出阳性克隆。

采用如上述相同的方法构建中间载体表达载体pDONR201_S.saPHT，pDONR201购自invitrogen公司。对中间载体进行阳性克隆筛选，如附图3所示，用1％的胶电泳，点样为5μL2×loadingbuffer+5μLPCR产物。右侧7个条带为：将pDONR201_S.saPHT转化大肠杆菌DH5α后，挑选单菌落，用克隆引物进行菌落PCR，然后进行琼脂糖凝胶电泳得到的条带。条带大小为1679bp。最左侧条带为MarkerDL2000。

构建含盐地碱蓬耐低磷基因的重组载体(pK2GW7I_S.saPHT),pK2GW7(I)载体购自invitrogen公司，大肠杆菌为DH5α感受态细胞，Tiangen，CB101-2，使用提纯的目的基因进行转染，并进行PCR验证，筛选阳性菌落，得到得到一种盐地碱蓬耐低磷基因的重组载体以及含有上述重组载体的宿主细胞。

实施例3

一种盐地碱蓬耐低磷基因在改良植物耐低磷的应用

利用实施例2筛选的pK2GW7I_S.saPHT阳性表达载体(盐地碱蓬耐低磷基因的重组载体)转化农杆菌，实验所用的农杆菌菌株为C58(购于中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心，http://biovector.blog.163.com/)，C58染色体具有利福平抗性(Rif)，辅助质粒具有庆大霉素抗性(Gen)。菌落PCR挑选阳性克隆侵染拟南芥。

农杆菌的活化与扩大培养：挑保存的阳性农杆菌的单菌落置于3mLYEB液体培养基中(含相应Gen抗生素，浓度为25μg/ml；Rif抗生素，浓度为10μg/ml；Km抗生素，浓度为50μg/ml)过夜培养15小时左右(至OD₆₀₀＝0.8左右)，170rpm，28℃。农杆菌的扩大培养：新鲜的10ml的YEB液体培养基中加入适量的抗生素(Gen抗生素，浓度为25μg/ml；Rif抗生素，浓度为10μg/ml；Km抗生素，浓度为50μg/ml)，然后接种接适量农杆菌菌液到YEB液体培养基中进行培养，170rpm，在28℃培养至OD₆₀₀＝0.6。得到含有重组载体的宿主细胞。

经过上述步骤筛选的阳性农杆菌(含有重组载体的宿主细胞)进行保存，挑保存的阳性农杆菌的单菌落过夜培养(至OD₆₀₀＝0.8左右)，菌液离心后弃上清，用5％的蔗糖液体重悬菌体后浸泡待转化的拟南芥的整个花序约30-45秒，取出拟南芥横躺在托盘中，用塑料薄膜罩住保湿，并暗处理12h，然后在温度25℃，光周期16h光照/8h黑暗，相对湿度：70％的培养条件下下使其正常生长，直到种子成熟。种子采集后放到37℃烘箱烘干两周，已备后续试验使用。

将收取的T1代种子经过消毒以后，放置在冰箱4℃春化三天，然后在超净台上将已经春化好的拟南芥种子均匀播种在含有50μg/ml卡那霉素的1/2MS固体筛选培养基上，在22-25℃，140μmol/(㎡·s)(下生长8-10天，叶子为深绿色即为转基因拟南芥的T1代阳性转化子(由于农杆菌中含有卡那霉素的抗体，故成功转染的拟南芥中表现出卡那霉素的抗性)。当转化植株长到3-4片真叶时，将其移植到土壤中，约一个半月后收集种子即为T2代转化种子。采用相同方法进行筛选，继续生长一代后得到T3代种子，通过在含kan抗生素的1/2MS培养基上筛选，100％成活率的从种子即为T3代纯合体种子。

盐地碱蓬耐低磷基因转化拟南芥后，T3纯合体PCR测定表达水平结果，用克隆引物做半定量，检测基因的表达情况，部分结果如附图4所示。选取表达水平高的2个独立转化株系和野生型拟南芥(WT)的种子同时无菌处理，平铺到MS固体平板上，4℃春化两天，22℃光照培养箱萌发5天，然后分别移到MS正常磷(1mMPi)及低磷(50μMPi)培养基上垂直培养5天，观察其表型差异。如图5和图6所示在正常磷处理条件下，转盐地碱蓬耐低磷基因拟南芥(OES.saPHT)和野生型对照基本一致；而在低磷处理条件下，野生型和转盐地碱蓬耐低磷基因拟南芥在植株鲜重、根长和根密度上有显著差异。

上述实验验证本发明的盐地碱蓬耐低磷基因具有耐低磷性能。

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种盐地碱蓬耐低磷基因，其特征是序列表中SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。

2.含权利要求1一种盐地碱蓬耐低磷基因的重组载体。

3.含有权利要求2所述重组载体的宿主细胞。

4.权利要求1的一种盐地碱蓬耐低磷基因在改良植物耐低磷的应用。