CN101457234A - 一种提高植物产量的方法及其表达盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高植物产量的方法及其专用表达盒。所述提高植物产量的方法，是将可在植物叶肉细胞中特异性表达焦磷酸水解酶的表达盒导入植物中，筛选得到可表达焦磷酸水解酶的植物，即为产量提高的植物。所述可在植物叶肉细胞特异性表达焦磷酸水解酶的表达盒，包括依次串联的cyFBPase启动子、焦磷酸水解酶基因和OCS终止子。本发明方法可大大提高转基因植物，特别是转基因农作物的产量水平。
Description
技术领域
本发明涉及一种提高植物产量的方法及其专用表达盒。
背景技术
绿色植物通过光合作用制造有机物，植物光合作用固定CO2产生的原初光合同化产物(primary photoassimilates)一部分在叶绿体转化为淀粉，另一部分则以三碳糖的形式输送到细胞质用于蔗糖的合成及其它代谢反应。
光合作用的效率及其两大原初同化产物——淀粉和蔗糖的分配方式对农作物的产量有着很大的影响。目前，增加作物的产量主要从三个方面来操作：(1)增加源叶片中蔗糖的合成；(2)增加蔗糖的运输能力，即提高H+/蔗糖转运载体的表达量或酶活性；(3)改善库的利用。
植物的光合速率一方面取决于光强，二氧化碳浓度等因素，另一方面也受参与CO2的固定卡尔文循环(Calvin cycle)的各种酶(如1，5二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)、叶绿体型1，6-二磷酸果糖酶)的活性、原初同化产物的分配、碳水同化产物的运输及在库器官的利用等自身代谢的影响。
叶绿体与细胞质间的物质交流对于调节光合速率以满足植物组织对光合产物的需求起着重要作用，这一过程是通过叶绿体膜系统来完成的。在叶绿体的内膜上，有一特异的磷酸丙糖转运载体(triose phosphate translocator，TPT)负责磷酸丙糖的运输。在正常生理条件下，TPT的运输严格遵循1∶1反向交换，即一个分子物质运入叶绿体，则另一个分子物质以相反的方向运出叶绿体。磷酸丙糖从叶绿体中运出之后，在细胞质中参与蔗糖、氨基酸等的合成反应。蔗糖在细胞质中合成的主要限速酶是细胞质型1，6-二磷酸果糖酶(cytosolic fructose-1，6-bisphosphatase，cyFBPase)和磷酸蔗糖合成酶(SPS)，前者与6-磷酸果糖激酶(PFK)和焦磷酸：6-磷酸果糖磷酸转移酶(pyrophosphate：fructose-6-phosphate-1-phosphotransferase，PFP)共同调控1，6-二磷酸果糖(FBP)向6-磷酸果糖(F6P)的转化；后者催化蔗糖合成的最后一步。通过改变这些酶的活性或者打破这些反应的平衡，就可以使反应向增加蔗糖合成的方向移动。在无机磷酸存在时，PFP催化FBP脱磷形成F6P和无机焦磷酸(PPi)，蔗糖合成反应中由葡萄-1-磷酸(G1P)到UDP-葡萄糖的转化反应也释放出PPi。焦磷酸水解酶(Pyrophosphatase，PPase)可将1个分子的无机焦磷酸(PPi)水解成2个分子的无机磷(Pi)。因此根据化学平衡原理，通过表达外源焦磷酸水解酶不断的去除细胞质中的焦磷酸将会刺激细胞质中反应向蔗糖合成的方向进行，同时也为磷酸丙糖向细胞质转移提供了充足的交换体-无机磷酸。为了提高碳水同化产物向蔗糖的分配比，大肠杆菌的焦磷酸水解酶基因被克隆到35S启动子下转入马铃薯和烟草，Northern杂交证明在转基因植物中存在此焦磷酸水解酶的转录产物。与野生型相比，两种转基因植株源叶片中可溶性糖与淀粉的比例都增加了3-4倍。与非转基因相比烟草中葡萄糖含量提高68倍，果糖提高24倍，蔗糖提高12倍，淀粉提高8倍；在马铃薯中碳水同化产物分配的改变是因为蔗糖提高了2倍，淀粉含量降低造成的(Sonnewald U(1992)Expression of E.coli inorganic pyrophosphatase in transgenicplants alters photoassimilate partitioning.Plant J 2：571-581)。
但是，上述转基因植物的植株矮化，节间变短，无机焦磷酸的含量下降，老叶片中可溶性糖的含量是野生型的100倍。转基因植株矮化推测可能是由于35S启动子组成型表达所引起，在转基因植物的维管束中表达焦磷酸水解酶造成焦磷酸含量的下降，而焦磷酸又是蔗糖长距离运输所必需的，焦磷酸的降低造成蔗糖在韧皮部的装载受阻，因而大量蔗糖积累在叶片中(Sonnewald U(1992)Expression of E.coliinorganic pyrophosphatase in transgenic plants alters photoassimilate partitioning.Plant J2：571-581；Lerchl，J.，Geigenberger，P.，Stitt，M.& Sonnewald，U.(1995)Impairedphotoassimilate partitioning caused by phloem-specific removal of pyrophosphate can becomplemented by a phloem-specific cytosolic yeast-derived invertase in transgenic plants.Plant Cell 7，259-270)。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高作物产量的方法及其专用表达盒。
本发明所提供的提高作物产量的表达盒，可在植物叶肉细胞特异性表达能够水解焦磷酸的焦磷酸水解酶基因，包括依次串联的植物叶肉细胞特异性表达的启动子、焦磷酸水解酶基因和终止子；所述焦磷酸水解酶基因具有自GENBANK号为ABE10235的5′端第1—531位核苷酸。
所述植物叶肉细胞特异性表达的启动子为cyFBPase启动子，所述cyFBPase启动子具有自GENBANK号为NC_008394.1的5′端第37511734—37512949位核苷酸；所述终止子为OCS终止子，所述OCS终止子具有自GENBANK号为V00088的5′端第1403—1629位核苷酸。
含有上述的表达盒的重组表达载体，工程菌或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。
所述含有上述的表达盒的重组表达载体的出发载体为双元表达载体，优选为pCAMBIA 1300。
本发明所提供的提高作物产量的方法，是将上述的可在植物叶肉细胞特异性表达焦磷酸水解酶的表达盒导入作物中，筛选得到可表达焦磷酸水解酶的作物，即为产量提高的作物。
所述可在植物叶肉细胞特异性表达焦磷酸水解酶的表达盒是通过上述的重组表达载体导入植物中。
所述植物为水稻、小麦、大麦、玉米等单子叶禾本科植物。
本发明的方法利用叶肉细胞特异性表达启动子控制焦磷酸水解酶基因在植物的叶肉细胞中表达焦磷酸水解酶，通过表达的焦磷酸水解酶不断的去除细胞质中的焦磷酸将会刺激细胞质中反应向蔗糖合成的方向进行，改善水稻中碳水化合物的分配，同时也为磷酸丙糖向细胞质转移提供了充足的交换体-无机磷酸，而且又通过叶肉细胞特异性表达，避免了因韧皮部特别是伴胞中焦磷酸的降低造成蔗糖在韧皮部的装载受阻，从而达到提高作物产量的目的。
本发明方法可大大提高转基因植物，特别是转基因农作物的产量水平。实验证明，将本发明的在叶肉细胞中特异性表达焦磷酸水解酶的表达盒通过重组表达载体转入籼稻6547和粳稻8706中，筛选得到的可特异性表达焦磷酸水解酶的转基因水稻，水稻中碳水化合物的分配得到改善，产量最高提高了50％。
附图说明
图1为FBP:PPase的质粒结构模式图
图2为部分抗性筛选阳性的转FBP:PPase水稻株系的PCR结果
图3为转FBP:PPase水稻的Western(图3中a)、PPase活性(图3中b)和植物中无机焦磷酸(PPi)(图3中c)的检测结果
图4为可表达焦磷酸水解酶的转FBP:PPase水稻叶片中蔗糖，淀粉含量及同位素示踪结果
图5为可表达焦磷酸水解酶的转FBP:PPase水稻中蔗糖和淀粉的昼夜变化
图6为转FBP:PPase水稻的代谢物分析
图7为可表达焦磷酸水解酶的转FBP:PPase水稻的光合作用的变化
具体实施方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
本发明将叶肉细胞特异性表达的启动子(cyFBPase启动子)和焦磷酸水解酶(PPase)基因同时转入植物中，利用叶肉细胞特异性表达的启动子来控制焦磷酸水解酶在水稻中的表达，通过表达外源焦磷酸水解酶不断地去除细胞质中焦磷酸将会刺激细胞质中反应向蔗糖合成的方向进行，同时也为磷酸丙糖向细胞质转移提供充足的交换体-无机磷酸。以便改变植株中碳水同化产物的分配，从而提高植物的产量。
以水稻为例，构建产量提高的转基因水稻，并对其碳水同化产物的分配，产量进行检测，具体方法如下所述。
实施例1、可表达焦磷酸水解酶的转基因水稻的创制及其产量鉴定
一、可表达焦磷酸水解酶的转焦磷酸水解酶基因水稻的创制
1、可表达焦磷酸水解酶(PPase)基因的重组载体(FBP:PPase载体)的构建
将含有cyFBPase启动子pCambia1391Z载体(购自Cambia，澳大利亚，http://www.cambia.org/daisy/cambia/home.html)用EcoRI酶切，得到1229bp的片段，即cyFBPase启动子(自GENBANK号为NC_008394.1的5′端第37511734—37512949位核苷酸)。将酶切得到的cyFBPase启动子片段插入到pCAMBIA1300的EcoRI酶切位点，得到重组载体，将该重组载体进行酶切和测序验证，将经酶切和测序验证表明正确的含有cyFBPase启动子片段的pCAMBIA1300(Cambia，澳大利亚，http：//www.cambia.org/daisy/cambia/home.html)重组载体命名为pCA-FBP。
以大肠杆菌(Escherichia coli XL1-blue菌株，购自北京莱博菲尔生物技术公司)基因组为模板，以5′引物F1：5′GGATCCATGAGCTTACTCAACGTCCCTGCGGGT3′和3’引物R1：5′GGATCCTTATTTATTCTTGGCGCGCTCGAA 3′为引物，进行PCR扩增，扩增得到约530bp的片段，即PPase基因片段，经测序表明，该PPase基因片段具有自GENBANK号为ABE10235的5′端第1—531位核苷酸序列。将该扩增得到的PPase基因片段用BamHI酶切后，插入到pUC19(购自北京莱博菲尔生物技术公司)的BamHI酶切位点之间，得到重组载体，将重组载体进行酶切和测序鉴定，将经鉴定表明正确的含有PPase基因的重组载体命名为pUC-PPase。
将pUC-PPase用BamHI酶切后，回收531bp的PPase基因片段(具有自GENBANK号为ABE10235的5′端第1—531位核苷酸序列)，正向插入到pCA-FBP的BamHI酶切位点，即正向插入到pCA-FBP的cyFBPase启动子后，获得重组载体，将该重组载体进行酶切和测序验证，将经酶切和测序验证表明正确的含有cyFBPase启动子及与其串联的正向PPase基因片段的pCAMBIA1300重组载体命名为pCA-FBP-PPase。
直接以根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)AGL1(购自ATCC(AmericanType Culture Collection))为模板，以5′引物F2：5′CAGGGCTCTCAATGGAGTTTGAA3′和3’引物R2：5′CAATCAGTAAATTGAAC GGAGA 3′为引物，进行PCR扩增，扩增得到227bp的片段，即终止子OCS，经测序表明，该终止子OCS片段具有自GENBANK号为V00088的5′端第1403—1629位核苷酸序列。
将上述获得的终止子OCS片段用SalI与HindIII双酶切后，插入到pCA-FBP-PPase的SalI与HindIII酶切位点之间获得重组载体，将该重组载体进行酶切和测序验证，将经酶切和测序验证表明正确的含有依次串联的cyFBPase启动子、正向PPase基因片段和终止子OCS的重组载体命名为FBP:PPase(结构示意图如图1所示)。图1中，35S-pro为35S CaMV启动子，FBP-pro为cyFBPase启动子，t35为CaMV35S终止子，Hygromycin为潮霉素筛选抗性基因，tOCS为OCS终止子。
2、可表达焦磷酸水解酶的转PPase基因水稻的获得和鉴定
1)转PPase基因水稻(转FBP:PPase水稻)的获得
将载体FBP:PPase通过农杆菌AGL1(购自ATCC(American Type CultureCollection))导入到水稻8706(中国科学院遗传与发育生物学研究所)愈伤组织中。转化方法参见(易自力，曹守云，王力，何锶洁，储成才，唐祚舜，周朴华，田文忠(2001)提高农杆菌转化水稻频率的研究，遗传学报，28(4)：352-358)，获得抗性筛选阳性转FBP:PPase水稻T0代株系。
2)转PPase基因水稻(转FBP:PPase水稻)的PCR鉴定
分别提取步骤1)获得转FBP:PPase水稻株系的基因组DNA，以焦磷酸水解酶基因编码区特异的引物(上游引物F3：ATGAGCTTACTCAACGTCCCTGCGGGT；下游引物R3：TTATTTATTCTTGGCGCGCTCGAA)进行PCR扩增；并以未转基因水稻(水稻8706)为对照，结果表明，步骤1)获得的转FBP:PPase水稻株系中，共有11株可以扩增出约500bp长的预期带，并经测序表明扩增片段为焦磷酸水解酶基因片段，而未转基因水稻阴性对照中没有任何扩增带，说明获得了11个转FBP:PPase水稻株系。部分抗性筛选阳性的转FBP:PPase水稻株系T0代植株的PCR结果如图2所示。图2中，泳道1为分子量标准；泳道2为未转基因水稻阴性对照；泳道3-13为抗性筛选阳性的转FBP:PPase水稻株系扩增结果。
3)可表达焦磷酸水解酶的转PPase基因水稻(转FBP:PPase水稻)的筛选
通过对后代中潮霉素鉴定和筛选，获得三个转FBP:PPase纯合转基因株系，株系27、34和37。分别将未转基因水稻(水稻8706，阴性对照，WT)和转FBP:PPase水稻株系27、34和37完全张开的成熟叶片总蛋白30ug加热变性，进行SDS-PAGE电泳后转至硝酸纤维膜，用PPase特异性抗体(抗体的制备，是将大肠杆菌表达的大肠杆菌PPase蛋白免疫注射兔子三次(每10天注射一次，共计1个月所获的兔子的血清)进行Western检测。Western检测结果表明，非转基因的阴性对照植株(WT)中没有任何带，而三个转FBP:PPase水稻株系27、34和37中有一条预期大小32kD的特异带(如图3中a所示)，说明筛选得到3个外源基因焦磷酸水解酶已经在转基因水稻中表达的转FBP:PPase水稻株系。转FBP:PPase水稻T0代植株的种子及该种子发育而成的植株为转FBP:PPase水稻T1代，依次类推T1代植株的种子及该种子发育而成的植株为T2代。
二、可表达焦磷酸水解酶的转FBP:PPase水稻叶片中焦磷酸水解酶表达活性分析
检测未转基因水稻(水稻8706，阴性对照，WT)和上述得到的三个转FBP:PPase水稻株系27、34和37叶片中焦磷酸水解酶活性，方法和步骤按照(Sonnewald，U.(1992)Expression of E.coli inorganic pyrophosphatase in transgenic plants altersphotoassimilate partitioning.Plant J.2，571-581)进行。结果如图3中b所示，表明，在步骤一筛选得到的可表达焦磷酸水解酶的转PPase基因水稻株系，焦磷酸水解酶活性比未转基因水稻对照提高3至5倍；这一结果证明步骤一筛选得到的可表达焦磷酸水解酶的转PPase基因水稻株系表达的焦磷酸水解酶在植物体内有很高的酶活性。
同时对三个转FBP:PPase水稻株系27、34和37以及未转基因水稻(水稻8706，阴性对照，WT)的无机焦磷酸(PPi)含量进行了检测。按照(Sonnewald，U.(1992)Expression of E.coli inorganic pyrophosphatase in transgenic plants altersphotoassimilate partitioning.Plant J.2，571-581)进行无机焦磷酸(PPi)的提取，提取后立即上样检测。具体检测方法是：PPi的检测采用日本岛津HPLC 10Avp系统(Shimadzu，Japan)和Corona电喷雾检测器(Charged Aerosol Detector)(ESA Inc.，USA)组合系统，分离柱采用5μm Hamilton PRP-X100(100×4.1mm)阴离子交换柱和25×2.3mm保护柱(Hamilton Inc.，USA)，流动相为60mM铵/100mM甲酸，流速为每分钟1.0ml。采用焦磷酸钠为标准样品。检测结果表明，三个不同转基因植物株系中无机焦磷酸(PPi)含量比未转基因对照(WT)都显著降低(结果如图3c所示)。
三、可表达焦磷酸水解酶的转FBP:PPase水稻叶片中碳水化合物含量的分析
分别取步骤一筛选得到的其中三个可表达焦磷酸水解酶的转FBP:PPase水稻株系(株系29、34、37)植株或未转基因水稻(水稻8706，阴性对照，WT)完全展开的成熟叶，按照(Geigenberger，P.et al.(1998)Overexpression of pyrophosphataseleads to increased sucrose degradation and starch synthesis，increased activities ofenzymes for sucrose-starch interconversions，and increased levels of nucleotides ingrowing potato tubers.Planta 205，428-437)所述方法提取、检测植物叶片中蔗糖和淀粉含量，结果如图4中a所示，结果表明，可表达焦磷酸水解酶的转FBP:PPase水稻29、34、37株系与未转基因对照(WT)相比蔗糖的含量没有显著差异，但淀粉的含量比未转基因对照降低了4-5倍(图4中a)。
为了证明所固定的CO2向蔗糖合成的方向流动，对步骤一筛选得到的其中三个可表达焦磷酸水解酶的转FBP:PPase水稻株系(株系29、34、37)植株和未转基因水稻(水稻8706，阴性对照，WT)叶片进行了14CO2示踪实验，具体方法如下：利用直径为1厘米打孔器从播种60天生长在大田的步骤一筛选得到的三个可表达焦磷酸水解酶的转FBP:PPase水稻株系(株系29、34、37)和未转基因水稻(水稻8706，阴性对照，WT)完全展开的旗叶上取样，所取叶盘快速放入密闭保湿的有机玻璃培养室中一个吸水的海绵上以保持湿度。在培养室中放入一个小的培养皿，其中含2毫升10mM 2-吗啉乙磺酸[2-(N-morpholino)ethane sulphonic acid，MES)](pH 6.5；用KOH调节)和40μCi的NaH14CO3，待所取叶盘在培养室中完全摆放好后，向小培养皿中加入2—3毫升10％ 1mol/L盐酸，以释放14C同位素标记的CO2，立即关闭有机玻璃培养室并密封，在有机玻璃培养室外60cm上方加光强为250μ Einstein的光照，培养1个小时后，收集叶盘，用80％(v/v)酒精80℃培养1小时，可溶和不可溶成分分别在液闪计数器下检测计数。结果如图4中b所示，同位素示踪也表明，新固定的14C整合到不可溶成分的比率比未转基因的对照相比显著降低，而转基因植物比未转基因对照整合到可溶性成分的比率明显升高。这些结果表明，在可表达焦磷酸水解酶的转FBP:PPase水稻中淀粉的含量显著下降是由于新固定的CO2中本应合成淀粉的那一部分碳水同化产物分配至蔗糖合成途径，而所合成的蔗糖都已通过植物的运输组织运向库器官，因而在源叶片中并没有造成蔗糖的积累。由此可见，焦磷酸水解酶在可表达焦磷酸水解酶的转FBP:PPase水稻的叶肉细胞中特异性表达确实可以改变碳水化合物的分配。
四、可表达焦磷酸水解酶的转FBP:PPase水稻叶片碳水同化产物分配的昼夜变化分析
为了研究焦磷酸水解酶的表达对可表达焦磷酸水解酶的转FBP:PPase水稻昼夜碳水同化产物分配的影响，分别在一天的六个时间点(10:00，14:00，18:00，22:00，2:00，6:00)分别取步骤一筛选得到的可表达焦磷酸水解酶的转FBP:PPase水稻(株系29、34、37的T1代植株，每个株系选5株植株)或未转基因水稻(水稻8706，阴性对照，WT)(5株)叶片，然后分析其可溶性糖与淀粉的变化。方法按照文献(Geigenberger，P.et al.(1998)Overexpression of pyrophosphatase leads to increasedsucrose degradation and starch synthesis，increased activities of enzymes forsucrose-starch interconversions，and increased levels of nucleotides in growing potatotubers.Planta 205，428-437)所述进行。结果如图5所示，蔗糖的昼夜变化具有很明显的规律性，在凌晨2:00至早上6:00可表达焦磷酸水解酶的转FBP:PPase水稻蔗糖含量较低，上午10:00时蔗糖含量即已开始回升，至14:00达到最大值，此后开始下降。可表达焦磷酸水解酶的转FBP:PPase水稻在夜间的淀粉含量尽管比未转基因对照低，但它仍然保持了足够的量以确保植物在夜间的正常生命活动所需。图5中，WT为未转基因对照的5个单株检测的平均值，29、34、37分别为三个可表达焦磷酸水解酶的转FBP:PPase水稻29、34、37株系5个植株单株检测的平均值。
五、可表达焦磷酸水解酶的转FBP:PPase水稻的代谢分析
对步骤一筛选得到的可表达焦磷酸水解酶的转FBP:PPase水稻(株系29、34、37的T1代植株，每个株系选5-7株植株)和未转基因水稻(水稻8706，阴性对照，WT)(5-7株)进行代谢物分析。代谢物分析方法和步骤按照文献(Geigenberger，P.et al(1998).Overexpression of pyrophosphatase leads to increased sucrose degradation andstarch synthesis，increased activities of enzymes for sucrose-starch interconversions，andincreased levels of nucleotides in growing potato tubers.Planta 205，428-437)所述方法进行。分析结果如图6所示，结果表明，在转FBP:PPase水稻(株系29、34、37)与未转基因对照中6-磷酸果糖、3-磷酸甘油酸的含量没有明显差异；6-磷酸葡萄糖含量在转基因株系29中提高了83％，在34与37中分别比对照提高了26％、12％；尿苷二磷酸葡萄糖的含量显著增加，在29、34、37三个株系分别比未转基因对照提高3倍、2倍、1.18倍。尿苷二磷酸葡萄糖是合成6-磷酸蔗糖的物质之一，且仅存在于细胞质中，因此其含量的显著提高说明代谢反应的确向蔗糖合成的方向转移。图6中，WT为未转基因水稻对照(5-7株检测的平均值)；29、34、37为转FBP:PPase水稻29、34、37株系5-7株单株检测的平均值。
六、可表达焦磷酸水解酶的转FBP:PPase水稻的光合作用分析
当植物的光合产物从叶片中输出过快时，就会造成植物的Calvin循环中的中间产物降低，从而导致光合速率降低。为了研究可表达焦磷酸水解酶的转FBP:PPase水稻中的光合速率的变化，我们检测了转FBP:PPase水稻在光强(0-2000μmol·m-2s-1)条件下的光合速率。具体方法如下所述：水稻净CO2吸收率是在水稻灌浆早期通过检测旗叶的光合作用进行的。光反应曲线采用LI-6400便携式光合作用测定仪(Li-cor，Lincoln，NE，USA)。测定参数设定如下：CO2流速为400μmol/秒，气体流速为500μmol/秒，设定温度28℃。光强由0到2000μmol·/m-2/秒通过叶室上的LED光源实现。结果如图7所示，结果表明，与未转基因的对照相比，净CO2同化率在可表达焦磷酸水解酶的转FBP:PPase水稻中有显著提高。在光饱和点时，转基因植物的光合速率比未转基因对照高出20％。这说明叶肉细胞特异性表达焦磷酸水解酶能够提高转基因水稻的光合作用。
七、可表达焦磷酸水解酶的转FBP:PPase水稻的产量检测
对可表达焦磷酸水解酶的转FBP:PPase水稻(株系29、株系34、株系37)小面积的田间种植实验，以未转基因水稻(野生型水稻8706)为对照，每个转FBP:PPase水稻株系和野生型对照均种植60株，待种子完全成熟后，每个转FBP:PPase水稻株系和野生型对照分别取10株检测株高，每株分蘖数、每穗实粒数，每穗总粒数，结实率、千粒重，单株产量等，然后计算转基因株系与未转基因株系对照相比产量增加情况。产量增加(％)＝(转基因株系—未转基因对照)/未转基因对照×100％。结果表明，可表达焦磷酸水解酶的转FBP:PPase水稻的地上部分和地下部分的生长均比野生型旺盛，单株分蘖数、每穗总粒数、每穗实粒数、结实率与野生型相比均有增加(表1)，但千粒重、株高等与对照相比没有显著变化。单株产量与对照相比增加了24—50％。
表1.转FBP:PPase水稻的农艺性状和产量检测
| 农艺性状 | 野生型 | 株系29 | 株系34 | 株系37 |
| 株高(cm) | 143.8±2.6 | 139.8±3.3 | 126.4±1.1* | 138.4±3.5 |
| 每株分蘖数 | 10.6±0.3 | 13.0±0.3* | 13.6±0.6* | 12.2±0.4* |
| 每穗实粒数 | 216.8±4.3 | 292.5±2.4** | 281.0±2.3** | 244.4±3.4** |
| 每穗总粒数 | 275.0±6.3 | 349.2±2.7** | 330.5±4.5** | 294.4±3.2* |
| 结实率(％) | 79±0.5 | 84±0.5* | 85±0.8* | 83±0.8* |
| 千粒重(g) | 28.0±1.0 | 26.1±0.3 | 23.9±0.4* | 27.5±1.2 |
| 单株产量(g/株) | 66.0±2.9 | 99.3±3.5** | 91.5±4.1** | 82.0±2.7** |
| 产量增加(％) | NA | 50％ | 39％ | 24％ |
对可表达焦磷酸水解酶的转FBP:PPase水稻(株系29、株系34、株系37)和未转基因对照(野生型)分别在北京(2004年)和浙江(2005年)进行小区产量实验，在北京和在浙江的大田试验，每次试验设六个重复，每块田约133.3平方米。转FBP:PPase水稻株系和野生型对照(水稻8706)种植行间距均为25cm×15cm，待种子完全成熟后，对转FBP:PPase水稻株系和野生型对照(水稻8706)实测产量，然后计算转基因株系与未转基因株系的理论产量以及对照相比产量增加情况。理论产量(Kg/公顷)＝实测产量x 75。产量增加(％)＝(转基因株系—未转基因对照)/未转基因对照x 100％。结果如表2所示，结果表明，北京产区的可表达焦磷酸水解酶的转FBP:PPase水稻三个株系29、34、37与对照相比产量分别增加42％，32％，24％；在浙江的实验结果与此北京产区的结果相似，产量增加了22—47％(浙江，2005)。
表2.转FBP:PPase水稻(株系29、34、37)的大田产量实验
实施例2、可表达焦磷酸水解酶转基因籼稻6547的创制及其产量鉴定
为了验证在不同的水稻品种中，特异性表达焦磷酸水解酶也可以增加产量，我们在籼稻6547中也通过农杆菌方法表达FBP:PPase，并对转基因植物的产量进行了田间试验。
按照实施例1的方法将FBP：PPase载体被转入籼稻6547(扬州大学)中，并筛选得到2个可表达焦磷酸水解酶的转FBP：PPase水稻株系3003和3010，分别在2004年和2005年进行大田种植实验。每次试验设三个点，每个点两个重复，每块田约133.3平方米。每个株系包括野生型对照种植行间距为25cm×15cm，待种子完全成熟后，按照实施例1中步骤七的方法取样检测转FBP：PPase水稻株系产量，同时以相同方法处理的未转基因籼稻6547为对照，实验表明，3003的产量与对照相比增加了11％(2004年)，18％(2005年)；株系3010与未转基因对照相比增加了8％(2004年)，21％(2005年)(表3)。
表3.转FBP:PPase籼稻6547(株系3003、株系3010)的大田产量实验结果
Claims (10)
1、一种可在植物叶肉细胞中特异性表达焦磷酸水解酶的表达盒，包括依次串联的植物叶肉细胞特异性表达启动子、焦磷酸水解酶基因和终止子；所述焦磷酸水解酶基因具有自GENBANK号为ABE10235的5′端第1—531位核苷酸。
2、根据权利要求1所述的表达盒，其特征在于：所述植物叶肉细胞特异性表达的启动子为cyFBPase启动子，所述cyFBPase启动子具有自GENBANK号为NC_008394.1的5′端第37511734—37512949位核苷酸；所述终止子为OCS终止子，所述OCS终止子具有自GENBANK号为V00088的5′端第1403—1629位核苷酸。
3、含有权利要求1或2所述的表达盒的工程菌或转基因细胞系。
4、含有权利要求1或2所述的表达盒的重组表达载体。
5、根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体的出发载体为双元表达载体。
6、根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体的出发载体为pCAMBIA1300。
7、一种提高植物产量的方法，是将权利要求1或2所述的表达盒导入植物中，筛选得到可表达焦磷酸水解酶的植物，即为产量提高的植物。
8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法中还将植物筛选标记基因同所述表达盒一同转入植物中。
9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述可在植物叶肉细胞特异性表达焦磷酸水解酶基因的表达盒是通过权利要求4-6任意所述的重组表达载体导入植物中。
10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述植物为禾本科植物，优选为水稻、小麦、大麦或玉米。
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