CN103993020B - 一种植物强耐盐基因SseNHX1及其编码蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物强耐盐基因SseNHX1及其编码蛋白和应用，植物强耐盐基因SseNHX1如SEQ ID NO:1所示；植物强耐盐基因SseNHX1编码的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白如SEQID NO:2所示；植物强耐盐基因SseNHX1在培育抗盐植物方面的应用。本发明将同一家族中的2个不同来源的Na⁺/H⁺逆转运蛋白基因(NHX1)通过基因改组后获得的高度耐盐的基因(SseNHX1)遗传转化模式植物烟草，经过盐胁迫处理后能够进一步提高转基因烟草的耐盐性，为培育出更具耐盐性的新遗传材料提供了依据。

Description

一种植物强耐盐基因SseNHX1及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明涉及到植物基因工程领域，具体是涉及一种植物强耐盐基因SseNHX1及其编码蛋白和应用。

背景技术

土壤盐碱化问题是目前全球最严重的环境问题之一，包括人口膨胀的各方面因素不断使人类开发和利用大面积的土地，逐渐生成新的次生盐渍化，加速了土壤盐碱化的进程。目前全世界大约20％的耕种土地和50％的灌溉土地都不同程度的受到了盐渍化的危害，并且每年平均约12万hm²土地发生次生盐渍化(Zhu J K,Plant salt tolerance.Trends in plant science.2001,6(2):66-71)。因此，土壤资源的开发和高效利用是保护人类粮食安全的重中之重。长期以来，为解决土壤的盐渍化问题，国内外展开了广泛的研究。传统的解决方法有挖沟排碱、淡水压碱、平地深翻等。这些方法不但投资大，而且收效甚微。因此，从生物学的角度解决植物本身的耐盐问题是盐渍化土地改良和利用的根本出路。在当今提倡生态效益为重的前提下，普遍认为生物改良措施是最具有生态效益、经济效益的措施。因而，若能够发现并创制耐高盐的新型基因，进而将这些基因转化到植物中以培育植物耐盐新遗传材料用于盐渍化土地的生物改良，应对未来农业发展人口增多、可用耕地减少的挑战，均具有重大的科学意义和经济价值。

盐分对植物胁迫分为渗透胁迫、离子伤害、离子不平衡或营养缺乏三类，渗透胁迫和离子伤害目前被认为是对植物危害的两个主要过程(Blumwald E,Aharon G S,Apse M P.Sodiumtransport in plant cells.Biochem Biophy Acta.2000,1465:140-151)。在盐胁迫下，一方面植物被迫吸收盐离子，由于盐离子的毒害作用，造成活性氧等自由基产生和修复系统的动态平衡被破坏，启动了膜脂过氧化或膜蛋白过氧化作用，造成膜脂或膜蛋白损伤，从而破坏膜结构，使质膜的透性增加，胞内水溶性物质外渗，植物表现出盐害特征。另一方面，土壤中的盐分使土壤溶液的水势降低，植物吸水困难造成“生理干旱”，从而表现出旱害特征。

为了抵御盐离子的胁迫，植物体形成了一系列的调节适应机制。植物耐盐的机制在细胞水平上主要有渗透调节和离子均衡两个方面。渗透调节主要是植物通过在细胞质中积累脯氨酸、甘露糖、甜菜碱等渗透保护剂和其他无机盐来降低渗透势，避免失水。植物离子均衡的策略涉及消除Na⁺毒害，其核心就是降低细胞内Na⁺浓度，促进细胞对K⁺的吸收(Viswanathan C,Andre J,Zhu J K.Understanding and improving salt tolerance in plants.Crop Sci,2005,45(2):437-448)。而降低细胞内Na⁺含量主要通过Na⁺的外排和Na⁺的液泡区隔化来实现，一般是由位于细胞质膜或液泡膜上的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白来承担。液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白(Vacuolar Na⁺/H⁺Antiporter,NHX)位于植物液泡膜上，可以使Na⁺在液泡内区域化，不仅可以减少盐分对植物细胞的伤害，还可以促进细胞从外界环境中吸水维持渗透平衡，对改善植物耐盐性起着非常重要的作用(Mansour M M F,Salama K H A,Al-Mutawa M M.Transportproteins and salt tolerance in plants.Plant Science,2003,164:891-900.)。

近几年，通过转化NHX基因以提高植物耐盐性的基因工程已经展开，并在高等植物拟南芥等材料中取得了一定进展。到目前已经从拟南芥、水稻、北滨藜、冰叶午时花、碱蓬、盐角草等植物中分离出了NHX基因，并都已证明该基因的表达产物具有Na⁺/H⁺交换的功能。这些结果表明，NHX基因是一种非常有效的耐盐基因，利用基因工程手段将其转入非抗盐性农作物中，可以培育出抗盐的转基因作物新品种，使其正常生长在盐渍土壤上。在实际生产应用上，植物耐盐基因工程大多集中在针对单个耐盐基因的克隆及遗传转化，单个耐盐基因尽管能够在一定程度上提高植物的耐盐性，然而，由于已克隆的单个基因活性不高、耐盐性不强的缺陷，很大程度上限制了该基因的生产应用和推广。因此，利用分子生物学技术提高单个耐盐基因的耐盐能力逐渐成为了扩展耐盐基因应用进而培育更强转基因耐盐植物的新方向。

1994年美国Stemmer(Stemmer W.P.C.Rapid evolution of a protein in vitro by DNAshuffling.Nature,1994,370(4):389-391)首次提出DNA shuffling的策略。DNA改组(DNAshuffling)又称有性PCR(sexual PCR)，其基本操作过程是：将一群密切相关的序列，如多种同源而有差异的基因(或一组突变的基因文库)，在DNaseⅠ的作用下随机切割，得到的随机片段经过不加引物的多次PCR循环。在PCR循环过程中，随机片段之间互为模板和引物进行扩增直到获得全长的基因。这些重排产物的集合又称嵌合文库(突变文库)。由于片段之间可借助互补序列而自由匹配，一个亲本的突变可与另一亲本的突变相结合，从而可以产生新的突变组合。进一步，再对嵌合文库筛选，以期望最终获得性能满意的突变体。当DNA shuffling用于一组同源基因时，这种技术称为“DNA家族改组”(DNA family shuffling)。DNA家族改组是一项高效的体外进化技术，该技术利用自然界中具有同源序列的基因家族如来自不同种属的相同基因以及同一种属的相关基因等进行改组，为蛋白质定向进化和结构—功能关系分析等研究提供了有效获得突变文库的方法。与单个基因的改组相比，DNA家族改组技术不仅可以显著加速有益突变的累积，还易于实现目的蛋白多种特性的共进化。

DNA shuffling技术自诞生以来，已在基础研究、工业、农业、医药、环保等各方面得到广泛应用，尤其是在酶的改良、药物蛋白的优化方面应用成果显著。大肠杆菌葡糖酸普酶基因改组后，筛选到的新基因表达的蛋白催化降解能力提高500倍；Chang等以多种人α-INF基因为底物进行DNA shuffling，经两轮改组筛选后得到的大多数活性克隆的活性较野生型提高了285000倍；因此，相信利用DNA family shuffling技术对盐生植物来源的液泡膜上的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因进行改组定能显示其强大的优势，创制出更强的新型耐盐基因。

发明内容

本发明目的在于获得一种能编码具有离子转运活性的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的植物强耐盐基因SseNHX1。

本发明的另一个目的在于提供上述基因编码的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白SseNHX1，其离子转运活性比野生型的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白更强。

本发明还提供了含有上述基因的重组载体。

本发明的另一方面，还提供了含有上述重组载体的宿主细胞。

本发明的另一方面，还提供了重组载体的构建、转基因植物等方法，以应用上诉基因和编码蛋白培育耐盐性更强的转基因植物新品种。

本发明的技术方案概述如下：

一种植物强耐盐基因SseNHX1，所述基因序列如SEQ ID NO:1所示。

上述植物强耐盐基因SseNHX1编码的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

含有上述基因的重组载体。

含有上述重组载体的宿主细胞。

上述植物强耐盐基因SseNHX1在培育抗盐植物方面的应用，所述植物强耐盐基因SseNHX1转入植物中，培育出耐盐性及生物学性状得到改善的植物新品种。

本发明的优点：

(1)用于改组的模板基因SsNHX1和SeNHX1分别来源于碱蓬和盐角草，耐盐基因的耐盐度起点高。通过2个不同来源的Na⁺/H⁺逆转运蛋白基因进行DNA改组定向进化，大大增加了筛选到高度耐盐基因(即正义突变子)的几率。

(2)采用盐敏感型酵母突变体AXT3(Δena1-4::HIS3Δnha1::LEU2Δnhx1::TRP1)来进行改组后突变基因的高通量筛选，大大提高了筛选效率。

(3)本发明将同一家族中的2个不同来源的Na⁺/H⁺逆转运蛋白基因(NHX1)通过基因改组后获得的高度耐盐的基因(SseNHX1)遗传转化模式植物烟草，经过盐胁迫处理后能够进一步提高转基因烟草的耐盐性，为培育出更具耐盐性的新遗传材料提供了理论依据。

附图说明

图1为SsNHX1和SeNHX1的DNA改组过程。

图2为部分改组文库的耐盐筛选。其中箭头所指的是含有强耐盐改组基因SseNHX1的酵母菌落。

图3为SseNHX1与SsNHX1、SeNHX1的氨基酸序列比对。其中白色框标记为随机突变的氨基酸；灰色阴影框标记为氨基酸替换情况。

图4为改组获得的SseNHX1基因与未改组SsNHX1、SeNHX1基因在酵母突变菌株AXT3中功能互补实验比较，即在含有0、50、75、100和150mM NaCl的APGal平板上生长情况：其中Ⅰ为含有pYES2质粒的野生型W303，Ⅱ为含有pYES2质粒的缺陷型菌株AXT3，Ⅲ为含有pYES2-SsNHX1重组质粒的AXT3菌株，Ⅳ为含有pYES2-SeNHX1重组质粒的AXT3菌株，Ⅴ为含有pYES2-SseNHX1重组质粒的AXT3菌株。

图5为盐胁迫1个月后野生型烟草和转基因烟草(分别转SsNHX1、SeNHX1和SseNHX1基因)植株表型。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1.碱蓬和盐角草Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因的克隆

用Trizol试剂从碱蓬和盐角草植物叶片中抽提总RNA，以总RNA为模板进行反转录，合成cDNA第一链。以合成的cDNA为模板，参照对编码Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的野生型耐盐基因SsNHX1(来源于碱蓬，其GenBank序列号：AY261806)和SeNHX1(来源于盐角草，其GenBank序列号：：AY131235)的cDNA序列设计以下引物(5’端分别包含BamHI和SalI酶切位点)：

ssF(5’-CGCGGATCCATGTGGTCACAGTTAAGCTC-3’)SEQ ID NO:3

ssR(5’-ACGCGTCGACTTATGTTCTCTGTGACAAATTAGTGG-3’)SEQ ID NO:4

seF(5’-CGCGGATCCATGTTGTCACAATTGAGCTC-3’)SEQ ID NO:5

seR(5’-ACGCGTCGACTGTTCTGTCTAGCAAATTGTC-3’)SEQ ID NO:6

通过PCR扩增获得碱蓬Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因SsNHX1和盐角草Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因SeNHX1，分别将其连接到pMD-18T载体中，转入大肠杆菌TOP10，克隆得到SsNHX1和SeNHX1的序列，并通过测序来确定。

实施例2.SsNHX1、SeNHX1基因的DNA改组

1)改组模板的制备分别以pMD-18T-SsNHX1和pMD-18T-SeNHX1质粒为模板，用TaqPlus DNA聚合酶分别对两个基因进行PCR扩增，纯化后作为DNA家族改组的模板。

2)DNaseI随机酶切紫外吸收法测定纯化后的DNA浓度，分别取含量为1.5μg的模板混合。取混合后的模板加入到50μL酶切反应体系中。

首先用0.15M NaCl(Sigma)稀释DNaseI(No.EN0525Fermentas，10U/μl)100倍至浓度为0.1U/μL。

DNaseI消化反应体系：

按上述体系配制酶切反应液，混匀后，15℃，10min，然后再加入3μL稀释后的DNaseI，0.3U，混匀，15℃，2min，90℃，10min，终止反应。消化产物通过2％琼脂糖凝胶电泳，切下100-200bp的片段进行切胶回收。

3)无引物PCR取1μg回收的小片段，加入到50μL反应体系中。

反应体系：

反应条件：94℃，1min；94℃，30s；50℃，30s；72℃，30s；72℃，8min；45个循环。

4)有引物PCR取1ul无引物PCR的产物作为模板，分别用每个模板基因的上下游引物ssF/ssR和seF/seR，以及两个基因的上下游交叉引物ssF/seR和seF/ssR共4对引物对重组的基因全长序列进行PCR扩增。

反应体系：

反应条件：94℃，1min；94℃，30s；57℃，30s；72℃，1min40s；72℃，8min。30个循环。

整个DNA改组过程如图1所示。

实施例3.中间载体pYES2-GFP的构建

根据绿色荧光蛋白GFP基因(GenBank序列号：AY013825)的cDNA序列设计以下引物(5’端分别包含BamHI和SalI酶切位点)

GFP-F:(5’-CGCGGATCCATGAGTAAAGGAGAAGAAC-3’)SEQ ID NO:7

GFP-R:(5’-ACGCGTCGACTTATTTGTATAGTTCAT-3’)SEQ ID NO:8

用高保真Pfu DNA聚合酶扩增GFP基因片段，将其连接到pGM-T载体中，转入大肠杆菌TOP10，克隆得到含有BamHI/SalI酶切位点的GFP的基因序列，并通过测序来确定载体pGM-GFP序列的正确性。

酵母表达载体pYES2上没有SalⅠ酶切位点，但有一个EcoRⅠ酶切位点，载体pGM-GFP的目的基因GFP两侧均有EcoRⅠ酶切位点，且GFP基因片段中间没有EcoRⅠ酶切位点，因此，将载体pYES2、pGM-GFP分别用EcoRⅠ单酶切、去磷酸化、纯化后，分别回收大片段pYES2和小片段GFP，然后经连接、转化，构建pYES2-GFP中间载体。

新构建的中间载体pYES2-GFP在GFP基因两端分别引入BamHⅠ和SalⅠ酶切位点，因此，可利用pYES2-GFP上的BamHⅠ/SalⅠ两个酶切位点作为中间载体来构建pYES2-SsNHX1和pYES2-SeNHX1及pYES2-SseNHX1载体。

实施例4.表达改组文库的构建及耐高盐Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因SseNHX1的筛选

用BamHI/SalI对实施例3得到的中间载体pYES2-GFP进行酶切，然后切胶回收获得表达载体大片段pYES2。

用BamHI/SalI对实施例2得到的重组产物进行酶切，纯化后连接到同样酶切的表达载体大片段pYES2中得到连接产物。载体pYES2既可以在大肠杆菌中在T7启动子的作用下作为克隆载体使用，也可以在酵母菌中在GAL1启动子的作用下作为表达载体使用。将连接产物(约500ng)用电击法转化大肠杆菌DH5a感受态中。将转化产物全部涂布到含100mg/L浓度的氨苄青霉素抗性的LB平板上(100μL/板，共涂布10个平板)培养12h。然后将平板上全部转化子用无菌水洗下，抽提质粒建立突变基因库，-20℃保存。

用乙酸锂方法将构建的突变基因库质粒导入酵母突变株AXT3(Δena1-4::HIS3Δnha1::LEU2Δnhx1::TRP1)中，获得突变基因表达库，转化子全部涂布到含100mM NaCl(不含尿嘧啶)的APGal选择培养基上，30℃，培养2-3d，进行耐高盐Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因的高通量筛选。最终得到了一个正常生长的酵母突变子，含有新的植物强耐盐基因SseNHX1，如图2所示。

实施例5.耐高盐基因SseNHX1的序列分析

用酵母质粒提取试剂盒提取耐高盐的酵母突变子中的质粒，由于酵母质粒的拷贝数比较低，故再通过氯化钙法将提取的质粒转化大肠杆菌TOP10中，提取阳性转化子的质粒进行DNA测序，植物强耐盐基因SseNHX1序列如SEQ ID NO:1所示。用Vector NTI和ClustalX等软件对耐高盐Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因和野生型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因进行核苷酸序列比对、氨基酸序列比对分析。

结果显示，SseNHX1编码蛋白与碱蓬野生型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白SsNHX1之间有2个氨基酸的改变和12个氨基酸的替换，还有4个氨基酸的缺失。具体情况如附图3所示。植物强耐盐基因SseNHX1编码的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白如SEQ ID NO:2所示。

实施例6.酵母功能互补比较试验

野生型酵母W303-1B(MATα,ra3-1，leu2-3,trp1-1,his3-11,ade2-1,can1-100)是一种具有耐盐性的酵母，其突变株AXT3(Δena1-4::HIS3Δnha1::LEU2Δnhx1::TRP1)的耐盐性很低，是盐敏感型突变体。将野生型SsNHX1和SeNHX1基因的重组载体导入该酵母突变株中，就可以和耐高盐筛选出的改组后的基因SseNHX1(已经成功导入酵母菌AXT3中)进行功能互补比较试验。

分别用引物ssF/ssR和seF/seR，以pMD-18T-SsNHX1和pMD-18T-SeNHX1质粒为模板，用高保真Pfu DNA聚合酶对两个基因进行PCR扩增，纯化后连接到同样酶切的表达载体pYES2中，阳性转化子经测序鉴定。用乙酸锂方法将构建成功的重组载体pYES2-SsNHX1和pYES2-SeNHX1导入到酵母突变株AXT3中，同时将空的酵母表达载体pYES2分别导入野生型酵母W303和酵母突变株AXT3中，在不含尿嘧啶的APGal选择性培养基中进行筛选。将筛选到的阳性转化子和筛选到的耐高盐酵母菌株分别接种到APGal液体培养基中培养，将OD600统一调至1.0，分别进行10倍梯度稀释，各取5ul点种到pH5.6不同盐浓度(0、50、75、100、150mMNaCl)的APGal平板上，30℃培养3天，观察生长状况。

结果如图4所示，缺失Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因的酵母突变株AXT3(Ⅱ)比野生型的酵母菌株W303(Ⅰ)对盐敏感的多，表达SsNHX1和SeNHX1的酵母突变株AXT3(Ⅲ和Ⅳ)能够部分互补酵母的耐盐性，而SseNHX1基因能够赋予酵母突变株更强的耐盐性(Ⅴ)，表明此改组获得的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白SseNHX1比未改组的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白具有更强的离子转运活性，可以将更多Na⁺从细胞质中区隔化到液泡中。

实施例7.植物表达载体的构建及农杆菌转化

用BamHI/SalI分别酶切上述实施例中已经获得的pYES2-SsNHX1、pYES2-SeNHX1和pYES2-SseNHX1载体，然后将切胶回收后的目的基因SsNHX1、SeNHX1和SseNHX1分别连接到用同样的两个酶酶切的植物表达载体pCAMBIA2300上。

构建成功的pCAMBIA2300-SsNHX1、pCAMBIA2300-SeNHX1和pCAMBIA2300-SseNHX1载体通过电击法转化农杆菌工程菌C58，通过菌落PCR验证正确的阳性转化子存于-80℃，用于后续的植物转基因。其中农杆菌感受态细胞的制备和电转化过程参照相关的实验手册。

实施例8.农杆菌介导的烟草遗传转化

本实验用到的培养基

无菌苗培养基：MS固体培养基，pH5.8；

侵染培养基：MS液体培养基，pH5.8；

共培培养基：MS+1mg/L6-BA+0.1mg/L NAA

脱菌筛选培养基：MS+1mg/L6-BA+0.1mg/L NAA+100mg/L卡那霉素+400mg/L头孢霉素，pH5.8；

抗性苗生根培养基：MS+100mg/卡那霉素+400mg/l头孢霉素，pH5.8；

农杆菌转化烟草过程如下：

(1)烟草苗的无菌培养：选饱满、健康的烟草种子，用75％乙醇浸泡lmin，25％的安替福明(有效氯2.5％)水溶液灭菌8min，无菌水漂洗三次，将种子放在MS培养基中，25℃光培养，16h/8h光周期。

(2)烟草的农杆菌转化

①侵染菌液的制备

挑取阳性农杆菌单菌落，接种到5ml含100mg/L卡那霉素的YEP液体培养基中，于28℃、200r/min的摇床上过夜培养。

②次日，取3ml菌液，接种到含100mg/L卡那霉素的50mlYEP液体培养基中，当菌液处于旺盛生长期(OD600＝0.6-0.9)时，将菌液倒入50ml离心管，在3500r/min，4℃下离心15min，弃上清液，收集菌体。

③用等量的MS液体培养基重悬，使OD600＝0.9-1。

(3)外植体浸染

①将烟草叶片去除主脉和叶边缘，然后将叶片切成0.5×0.5cm大小，浸入制备好的农杆菌菌液，浸泡15-20min，其间摇动2-3次，使叶片充分接触菌液，取出叶片，用无菌的滤纸吸净多余的菌液，叶面朝下、叶背朝上接种于共培培养基中，25℃左右暗培养2天。

②将叶片转移至筛选培养基中，20天左右更换一次培养基，诱导抗性芽产生，当抗性芽从愈伤组织上长到1cm左右，从愈伤上切取抗性芽，接种于抗性苗生根培养基中。

(4)转基因苗移栽

将根系生长良好、生命力旺盛的烟草组培苗从组培瓶中取出，用自来水冲洗培养基(尽量减少根系损伤)，种植在蛙石和腐殖土的培养土中，覆盖薄膜保温保湿15天，然后揭开薄膜，定期浇水、施肥，使之在温室中正常生长。

(5)转基因烟草基因组DNA的PCR检测

①CTAB法提取烟草总DNA；

②以基因组DNA为模板，以转入的基因SsNHX1、SeNHX1和SseNHX1的5’和3’端为

引物进行PCR检测。

实施例9.转基因植株耐盐性鉴定

经鉴定为阳性的T0代转基因植株种子按照实施例8中的消毒方式对种子进行灭菌处理，然后铺在含100mg/L卡那霉素的MS培养基上，25℃光培养，16h/8h光周期。7天之后移出深绿色的抗性苗至含有不同盐浓度(0,100,200,300mM NaCl)的MS培养基的培养瓶中盐处理1个月，培养条件同上。作为对照，萌发后1周大的野生型烟草幼苗也在含有上述盐梯度的培养瓶中培养1个月。结果表明，转基因植株耐盐性明显强于野生型对照植株。而且，转有SseNHX1基因的转基因植株的耐盐性优于转有SsNHX1和SeNHX1的转基因植株。随着盐浓度的升高，转有SsNHX1和SeNHX1基因的植株表现出发黄、萎焉等症状(300mM NaCl胁迫处理下)，且在300mM NaCl胁迫处理下，野生型植株已经完全枯萎死亡。而转SseNHX1基因植株生长相对健壮(图5)耐盐性试验结果表明：SseNHX1可以用于植物耐盐性状的改良。

Claims (4)

1.一种植物强耐盐基因SseNHX1，其特征是所述基因序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述的植物强耐盐基因SseNHX1编码的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白。

3.含有权利要求1所述基因的重组载体。

4.权利要求1所述的植物强耐盐基因SseNHX1在培育抗盐烟草的应用。