CN110564736A - 佛甲草耐盐基因SlWRKY及其应用 - Google Patents

佛甲草耐盐基因SlWRKY及其应用 Download PDF

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CN110564736A CN201910820427.9A CN201910820427A CN110564736A CN 110564736 A CN110564736 A CN 110564736A CN 201910820427 A CN201910820427 A CN 201910820427A CN 110564736 A CN110564736 A CN 110564736A
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slwrky
salt
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sedum lineare
tolerant gene
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杨少辉
白婧平
岳靖
杨合宇
王洁华
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Tianjin University
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance

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Abstract

本发明公开了佛甲草耐盐基因SlWRKY及其应用，佛甲草耐盐基因SlWRKY的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，实验证明，采用SlWRKY基因转染的拟南芥和杨树增强对盐的耐受力，说明本发明提供的佛甲草对耐盐基因SlWRKY增强在改良作物耐盐能力方面起着重要的作用。

Description

佛甲草耐盐基因SlWRKY及其应用
技术领域
本发明涉及一种佛甲草(Sedum lineare)耐盐基因SlWRKY及其应用，属于分子生物学和生物技术领域。
背景技术
土壤盐渍化已成为制约农业可持续发展的主要因素之一。植物长期处于高盐环境中不仅抑制其生长，还会造成作物减产，甚至死亡。全球约有1亿hm2土地受土壤盐度的影响，占全球耕地总量的6％～7％，且面积还在逐渐扩大，由于全球变暖导致的海平面上升可能会使其问题加剧。我国是世界盐碱地大国之一，目前盐渍化土地面积约0.3亿hm2，占我国耕地面积的20％以上，且分布广泛，利用效率低，严重妨碍农业生产的发展。土壤盐度同时也限制作物的种类和产量，而不同作物或同种作物的不同品种间耐盐性存在差异。因此，亟需一种能转入植物中，增强植物对盐的耐受性，对提高土地利用率具有重要战略意义。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种佛甲草耐盐基因SlWRKY。
本发明的第二个目的是提供含佛甲草耐盐基因SlWRKY的克隆载体pJET1.2_SlWRKY。
本发明的第三个目的是提供含佛甲草耐盐基因SlWRKY的表达载体pBI121_SlWRKY。
本发明的第四个目的是提供含有表达载体pBI121_SlWRKY的宿主细胞。
本发明的第五个目的是提供佛甲草耐盐基因SlWRKY增强植物对盐的耐受性的应用。
本发明的技术方案概述如下：
佛甲草耐盐基因SlWRKY，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
含上述佛甲草耐盐基因SlWRKY的克隆载体pJET1.2_SlWRKY。
含上述佛甲草耐盐基因SlWRKY的表达载体pBI121_SlWRKY。
含有表达载体pBI121_SlWRKY的宿主细胞。
上述佛甲草耐盐基因SlWRKY增强植物对盐的耐受性的应用。
所述植物优选拟南芥或杨树。
本发明的优点：
实验证明，采用SlWRKY基因转染的拟南芥和杨树表现出对盐的耐受力，说明本发明提供的耐盐基因SlWRKY在改良作物耐盐方面起着重要的作用。从而为培育耐盐转基因物种提供了一种有效的方法，
附图说明
图1为佛甲草耐盐基因SlWRKY克隆电泳示意图。
图2为佛甲草耐盐基因SlWRKY插入表达载体后示意图。
图3为pBI121_SlWRKY转化拟南芥后，转化子基因组PCR筛选结果(1-8号分别代表的是pBI121_SlWRKY的单菌落菌液)。
图4为pBI121_SlWRKY转化拟南芥后，T3纯合体半定量PCR测定表达水平结果(4、5代表中表达的拟南芥；1号代表高表达量的拟南芥；2、3、6号代表低表达量的拟南芥)。
图5为佛甲草耐盐基因SlWRKY转基因拟南芥T3纯合体耐盐的实验效果照片。
图6为佛甲草耐盐基因SlWRKY转基因杨树耐盐的实验效果照片。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
载体pJET1.2 pJET1.2:Thermo,Clone JET PCR CloningKit#K1231
载体pBIl21购于中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心，http://biovector.blog.163.com/
实施例1
1.佛甲草(Sedum lineare,简称Sl)SlWRKY基因的克隆
从用150mM NaCl水溶液进行耐盐处理的佛甲草(取自天津市滨海新区)中，使用植物RNeasy Plant Mini Kit(Transgene Code#E101-0150rxns)提取总RNA，并且利用EasyScript Frist-Strand cDNA SynSgesis SuperMix(Transgene Code#AE301-03100rxns)反转录出cDNA。对cDNA进行高通量测序获得78407转录本(诺禾致源公司进行高通量测序)，通过与GO数据库进行对比分析，获得SlWRKY基因的3’端序列，使用RACE技术(Takara-RACE kit)获得SlWRKY基因的全长cDNA序列，将扩增得到的SlWRKY基因进行测序分析，得到完整的SlWRKY基因全长为1014bp(SEQ ID No.1)。由佛甲草SlWRKY基因编码的蛋白质，是SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。构建超表达载体时，则分别在特异性引物的5’端添加pBI121重组位点，上游5'–ACGGGGGACTCTAGAGGATCC-3'(SEQ ID No.3)，下游5'-CGATCGGGGAAATTCGAGCTC-3'(SEQ ID No.4)，以利于后期表达载体的构建。
其具体步骤如下：
1).cDNA第一链的合成
用购买于金唯智的反转录试剂盒EasyScript First-Strand CDNA SynthesisSuperMix(Lot#10227)，以总RNA为模板，Oligo(dT)为引物，在E-Mix逆转录酶的作用下合成cDNA，反转录体系如下：
反应条件：42℃ 30min，85℃ 5min。
2).佛甲草SlWRKY基因反转录质量PCR扩增检测
用佛甲草Actin基因特异引物SEQ ID No.5:5'-GAACTTACTAGCCGACTG-3',SEQ IDNo.6：5'-CCTCAAGCCTTATACGCAA-3'，PCR扩增，以验证反转录反应及RNA质量。
PCR反应体系如下：
反应条件：94℃ 3min；94℃ 30s，40℃ 30s，72℃ 50s，35cycles；72℃ 5min。
3).佛甲草SlWRKY基因片段PCR扩增
根据已知cDNA序列利用primer软件设计SlWRKY基因上下游引物:
SEQ ID No.7:5'-ACAACGCAATTCAAACAGCAG-3'，
SEQ ID No.8:5'-TCATAACCATTTCCCCACCATA-3'，其PCR反应程序如下：
反应条件：94℃ 3min；94℃ 30s，40℃ 30s，72℃ 50s，35cycles；72℃ 5min。
PCR反应结束后，取1μLPCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物的质量(见图1)，其余用作产物的纯化回收。
4).构建含有佛甲草SlWRKY基因的克隆载体
构建含有佛甲草SlWRKY基因的载体pJET1.2_SlWRKY
胶回收纯化后的佛甲草SlWRKY基因目的片段利用Clone JET PCR Cloning Kit
(pJET1.2:Thermo,CloneJET PCR Cloning Kit#K1231)重组到载体pJET1.2上，得到载体pJET1.2_SlWRKY。
其反应程序如下：
反应条件24℃,10min冰上静止30min，42℃热激1min30s冰上静止2min30s，转入感受态细胞DH5α，37℃，180rpm，45min，此程序结束后将菌液涂到LB(添加耐生素Amp100uM)固体培养基(蛋白胨10g，酵母浸出物5g，氯化钠5g，琼脂15g，定容至1L，pH＝7)中，37℃过夜培养。
分别利用目的片段的上下游引物(SEQ ID No.7和SEQ ID No.8)对不同的菌落进行菌落PCR验证，筛选阳性菌落测序，得到含有克隆载体pJET1.2_SlWRKY的宿主细胞。
注：pJET1.2:Thermo,Clone JET PCR Cloning Kit#K1231载体购于invitrogen；所用大肠杆菌为DH5α感受态细胞，TIANGEN，CB101-2。
5).构建含有佛甲草SlWRKY基因的表达载体
构建含有佛甲草SlWRKY基因的表达载体pBI121_SlWRKY，
构建超表达载体时，则分别在特异性引物的5’端和3’添加pBI121重组位点，
SEQ ID No.3:5'–ACGGGGGACTCTAGAGGATCC-3',
SEQ ID No.4:5'-CGATCGGGGAAATTCGAGCTC-3'
得到：
SEQ ID No.9:5'-ACGGGGGACTCTAGAGGATCCACAACGCAATTCAAACAGCAG-3'
SEQ ID No.10:5'-CGATCGGGGAAATTCGAGCTCTCATAACCATTTCCCCACCATA-3'
提取测序正确的pJET1.2-基因的质粒，作为模版，利用含有重组位点SEQ IDNo.9，SEQ ID No.10为引物进行PCR扩增，其反应程序如下：
PCR反应结束后，取1μLPCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物的质量，其余用作产物的纯化回收。
提取pBI121质粒，其载体图谱(见图2)，对其进行双酶切线性化，程序如下：
反应条件：37℃，12h，80℃20min失活。
将基因和线性化的pBI121质粒使用Clone Express Entry One Step CloningKit试剂盒进行重组构建，反应程序如下：
(线性化pBI121质粒需50-200ng均可；胶回收基因片段需20-200ng均可；本实验线性化pBI121质粒浓度100ng/μL；胶回收基因片段浓度在100ng/μL)
反应程序：37℃，30min，冰上5min，42℃热激1min30s冰上静止2min30s，转入感受态细胞DH5α，37℃，180r，45min，此程序结束后将菌液涂到LB(添加耐生素kan50uM)固体培养基中，37℃过夜培养。
分别利用载体和目的片段的上下游引物(见SEQ ID No.9和SEQ ID No.10)对同一个菌落进行菌落PCR双重验证，筛选阳性菌落测序(见SEQ ID No.11)。
注：本步骤使用Clon Express Entry One Step Cloning Kit购于vazyme，
6).含有佛甲草SlWRKY基因的重组载体转化农杆菌感受态细胞
实验所用的农杆菌菌株为C58(购于中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心，http://biovector.blog.163.com/)，C58具有利福平耐性(Rif)，辅助质粒具有庆大霉素耐性(Gen)。
利用电击农杆菌转化法，将含有佛甲草SlWRKY基因的大肠杆菌表达载体pBI121_SlWRKY转化到农杆菌株C58(pMP90)感受态细胞中，28℃，培养36h，菌落PCR挑选阳性克隆菌落。
实施例2
1.转化拟南芥
(1)转化拟南芥。
转化拟南芥的具体操作步骤：
营养土(蛭石：无菌按照1：3的比例混合)，将在4℃冰箱春化72h的拟南芥种子(商业)播种到土壤表面，前7天用保鲜膜覆盖，放到组培架上。培养条件为光照为10000lux；白天16h，22℃；夜晚8h，温度为18℃。剪掉生长1.5个月、抽薹15公分左右拟南芥的果荚和已授粉的花。挑取含基因阳性克隆单菌落到50mL含有30μg/mL庆大霉素、50μg/mL利福平、50μg/mL卡那霉素的YEB液体培养基(蛋白胨5g，酵母浸出物1g，牛肉膏5g，蔗糖5g，定容至1L，pH＝7)中，28℃，180rpm，至OD600值为0.6-0.8。将菌液25℃，4000rpm，离心10min，弃掉上清，加入50mL5％的蔗糖重悬，加入9μL的黏着剂，混匀，倒入培养皿。将上述拟南芥的花苞放入培养皿中1min，套袋，暗处理12h，侵染15颗拟南芥苗。去除袋子，放回组培架子上，此时的拟南芥苗称为T1代。待上述拟南芥的种子完全成熟后，收取拟南芥的种子到1.5mL的EP管中，敞口至37℃的烘箱中，放置两个星期，彻底烘干，每管加入3颗干燥球以便长期保存。
(2)转基因拟南芥阳性转化子纯合体的筛选
将收取的T1代种子经过消毒以后，放置在冰箱4℃三天，然后在超净台上将转基因拟南芥种子均匀播种在含有50μg/mL卡那霉素的1/2MS固体筛选培养基(MS盐2.2g，蔗糖10g，定容至1L，pH＝5.7，琼脂7.2g)上，在1800Lux，光周期16h光照/8h黑暗，生长8-10天，叶子为深绿色即为转基因拟南芥的T1代阳性转化子。当T1代阳性转化子植株长到3-4片真叶时，将其移植到土壤(购于EPAGMA,荷兰，http://www.epagma.eu/)中，在温度25℃，1800Lux，光周期16h光照/8h黑暗，相对湿度为70％的培养条件下继续生长14天，先作阳性转化子的鉴定(见图3；1-8号分别代表的是pBI121_SlWRKY的单菌落菌液)，再通过半定量PCR先对其转基因的表达水平进行鉴定(见图4；其中4、5代表中表达的拟南芥；1号代表高表达量的拟南芥；2、3、6号代表低表达量的拟南芥)，选取表达水平高的独立转化株系1号和表达水平低的独立转化株系2号。在上述条件下继续生长，约一个半月后收集种子即为T2代转化种子。重复上述步骤得到1号和2号的T3代纯合体种子。
(3)对转基因拟南芥进行耐盐处理
将1号T3代纯合体种子、2号T3代纯合体种子、野生拟南芥种子分别种植在土壤中，在温度25℃，1800Lux，光周期16h光照/8h黑暗，相对湿度为70％的培养条件下生长21天，每种植物保留21株长势一致的幼苗，随机分为三组平行实验，每组不同类型的植株各7株，用150mM NaCl水溶液进行耐盐处理(浇灌)。每隔3天处理一次，共处理15天后植物照相(见图5)。
实施例3
1.转化杨树
供阳性克隆菌转化的杨树为欧洲山杨×银白杨(Populustremula×P.albaINRAclone N7171-B4，以下简称717杨树)组培苗。(商品)
(1)将717杨树腋芽或顶芽置于基本培养基(MS盐2.2g，蔗糖30g，定容至1L，pH＝5.7，琼脂7.2g)上继代繁殖，培养6周获得组培苗；切取所述组培苗1cm不带腋芽的茎段，划伤口后于24℃黑暗条件下预培养3天；
(2)将选取的实施例1获得的阳性克隆菌菌液(OD600＝0.8)在室温、4000rpm离心10min，弃去上清液，将沉淀用等体积的M液(M液：MS盐4.4g，蔗糖30g，生长素NAA1.86mg，细胞分裂素2ip1.02mg，乙酰丁香酮As19.86mg，定容至1L，pH＝5.7)重悬，24℃，100rpm活化1h得到侵染液；按40个，25mL的比例将步骤(1)预培养的茎段放入所述侵染液中，24℃条件下100rpm侵染1h。经过共培养(M1固体培养基：MS盐4.4g，蔗糖30g，琼脂7.2g，生长素NAA1.86mg，细胞分裂素2ip1.02mg，乙酰丁香酮As19.86mg，定容至1L，pH＝5.7；培养条件：26℃，暗条件下共培养36小时)、延迟选择(CIM延迟选择培养基：MS盐4.4g，蔗糖30g，生长素NAA1.86mg，细胞分裂素2ip1.02mg，头孢霉素500mg，琼脂7.2g，定容至1L，pH＝5.7；培养条件：800Lux弱光下培养8天，光照/黑暗为16h/8h)、诱导不定芽(SIM筛选培养基中：MS盐4.4g，蔗糖30g，细胞分裂素TDZ0.05mg，头孢霉素500mg，卡那霉素500mg，琼脂7.2g，定容至1L，pH＝5.7；培养条件：26℃，2000Lux，光照/黑暗为16h/8h)、伸长培养(SEM筛选培养基：MS盐4.4g，蔗糖30g，细胞分裂素2ip1.02mg，头孢霉素500mg，卡那霉素500mg，琼脂7.2g，定容至1L，pH＝5.7；培养条件：26℃，2000Lux光照，光照/黑暗为16h/8h，培养4周)、诱导生根(RM培养基的组成为：MS盐2.2g，蔗糖30g，头孢霉素500mg，卡那霉素500mg，琼脂7.2g，定容至1L，pH＝5.7；培养条件：26℃，2000Lux光照，光照/黑暗为16h/8h)多步后，待再生杨树生长正常后，对每一棵独立转化子进行阳性鉴定。
通过半定量PCR选取表达水平高的独立转化株系和表达水平低的独立转化株系进行耐盐实验。
(3)将717杨树进行盐处理
将生长2个月的长势均匀的转基因高表达杨树、低表达转基因杨树、野生型717杨树移栽至土盆中，待土盆苗生长30d后，每种植物保留21株长势一致的幼苗，随机分成三组，每组不同类型的植株各7株，用盐分处理液(150mM NaCl水溶液)进行浇灌处理。3天浇一次，每次浇灌量为土壤质量的0.5倍，以保持盆中处理液浓度的恒定，共处理30天后观察植株并照相(见图6)。
序列表
<110> 天津大学
<120> 佛甲草耐盐基因SlWRKY及其应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1014
<212> DNA
<213> 佛甲草(Sedum lineare)
<400> 1
atgtaaaaag aaggttcaga gaagcgcgga ggatcagaca atgttagtgg cgacatatga 60
tggtgaacat aatcaccctc caccatcaga aatcgataca agctcacaac gcaattcaaa 120
cagcagttca tgtgttacaa actccatttc gtctagtaca attatccaat ccaagcctgt 180
tgtaactcta gatttgatca aaccggtaga cgaaactaag caaaaccgaa caagttcagg 240
tgctgtgaag gtacataacc ttaaccaaaa cgaaagccag aaagggtcaa tgttacagaa 300
gtttattgtg gagcaaatgg catcgtcttt gactaatgat ccaagtttta aagctgccgt 360
ggcggcggcg atttcaggga ggatgatgga tagcagcaat aacaacaatg gtatggtggg 420
gaaatggtta tgaaaaaatg gaggattatg aatgttatga aagtcattac acgtgtgttt 480
acatgtacag ccaaatttga caattttcaa ccaagttgtg aaattgagta ttgaaattga 540
agccaaattt caaccaaatt tagcagacat gaaaatgacg ggaagaaata aaaaccatct 600
tttctataga ttcttgacag aagttcgttc aattgttatt gatattgagc gtgttaaccg 660
taaagagttg atacgtctta attttctgca aatttagaca aaatcaagtc tttatcttgt 720
agtcaattat atatttttaa tgacggtttt aatgtagaat gttagtgtta tgggatccag 780
catagcatca gaccaagttg ggcagctact agctagctgc caagagtagt tgtatatact 840
tgacttgcaa gtaaagctaa aagaaatttc aaataagtca attgattacg gaatgctttg 900
atgtcctatg ttgtccatct aaagtgtttt ccataatctc acagtttcat ctataacttg 960
taaaagatgt cattcagatt tatcataaaa aagttggatt ctaggaagac ataa 1014
<210> 2
<211> 337
<212> PRT
<213> 佛甲草(Sedum lineare)
<400> 2
Met His Lys Glu Gly Ser Glu Lys Arg Gly Gly Ser Asp Asn Val Ser
1 5 10 15
Gly Asp Ile Val Trp Asp Thr Gln Ser Pro Ser Thr Ile Arg Asn Arg
20 25 30
Tyr Lys Leu Thr Thr Gln Phe Lys Gln Gln Phe Met Cys Tyr Lys Leu
35 40 45
His Phe Val Leu Tyr Asn Tyr Pro Ile Gln Ala Cys Cys Asn Ser Arg
50 55 60
Phe Asp Gln Thr Gly Arg Arg Asn Asp Ala Lys Pro Asn Lys Phe Arg
65 70 75 80
Cys Cys Glu Gly Thr Ser Pro Lys Pro Lys Arg Lys Pro Glu Arg Val
85 90 95
Asn Val Thr Glu Val Tyr Cys Gly Ala Asn Gly Ile Val Phe Asp Arg
100 105 110
Val Ser Lys Phe Ala Ser Cys Arg Gly Gly Gly Asp Phe Arg Glu Asp
115 120 125
Asp Gly His Gln Gln Val Gln Gln Trp Tyr Gly Gly Glu Met Val Met
130 135 140
Lys Lys Trp Arg Ile Met Asn Val Met Lys Val Ile Thr Arg Val Phe
145 150 155 160
Thr Cys Thr Ala Lys Phe Asp Asn Phe Gln Pro Ser Cys Glu Ile Glu
165 170 175
Tyr Arg Asn Val Ser Gln Ile Ser Thr Lys Phe Ser Arg His Glu Asn
180 185 190
Asp Gly Lys Lys Met Lys Pro Ser Phe Leu Asn Ile Leu Asp Arg Ser
195 200 205
Ser Ser Ile Val Ile Asp Ile Glu Arg Val Asn Arg Lys Glu Leu Ile
210 215 220
Arg Leu Asn Phe Leu Gln Ile Val Thr Lys Ser Ser Leu Tyr Leu Val
225 230 235 240
Val Asn Tyr Ile Phe Leu Met Thr Val Leu Met Glu Asn Val Ser Val
245 250 255
Met Gly Pro Ala Gln His Gln Thr Lys Leu Gly Ser Tyr Cys Leu Ala
260 265 270
Ala Lys Ser Ser Cys Ile Tyr Leu Thr Cys Lys Asp Ser Ala Lys Lys
275 280 285
Phe Gln Ile Ser Gln Leu Ile Thr Glu Cys Phe Asp Val Leu Cys Cys
290 295 300
Pro Ser Lys Val Phe Ser Ile Ile Ser Gln Phe His Leu Asp Leu Val
305 310 315 320
Lys Asp Val Ile Gln Ile Tyr His Lys Lys Val Gly Phe Ser Glu Asp
325 330 335
Ile
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acgggggact ctagaggatc c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgatcgggga aattcgagct c 21
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaacttacta gccgactg 18
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cctcaagcct tatacgcaa 19
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acaacgcaat tcaaacagca g 21
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcataaccat ttccccacca ta 22
<210> 9
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acgggggact ctagaggatc cacaacgcaa ttcaaacagc ag 42
<210> 10
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgatcgggga aattcgagct ctcataacca tttccccacc ata 43
<210> 11
<211> 1014
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atgtaaaaag aaggttcaga gaagcgcgga ggatcagaca atgttagtgg cgacatatga 60
tggtgaacat aatcaccctc caccatcaga aatcgataca agctcacaac gcaattcaaa 120
cagcagttca tgtgttacaa actccatttc gtctagtaca attatccaat ccaagcctgt 180
tgtaactcta gatttgatca aaccggtaga cgaaactaag caaaaccgaa caagttcagg 240
tgctgtgaag gtacataacc ttaaccaaaa cgaaagccag aaagggtcaa tgttacagaa 300
gtttattgtg gagcaaatgg catcgtcttt gactaatgat ccaagtttta aagctgccgt 360
ggcggcggcg atttcaggga ggatgatgga tagcagcaat aacaacaatg gtatggtggg 420
gaaatggtta tgaaaaaatg gaggattatg aatgttatga aagtcattac acgtgtgttt 480
acatgtacag ccaaatttga caattttcaa ccaagttgtg aaattgagta ttgaaattga 540
agccaaattt caaccaaatt tagcagacat gaaaatgacg ggaagaaata aaaaccatct 600
tttctataga ttcttgacag aagttcgttc aattgttatt gatattgagc gtgttaaccg 660
taaagagttg atacgtctta attttctgca aatttagaca aaatcaagtc tttatcttgt 720
agtcaattat atatttttaa tgacggtttt aatgtagaat gttagtgtta tgggatccag 780
catagcatca gaccaagttg ggcagctact agctagctgc caagagtagt tgtatatact 840
tgacttgcaa gtaaagctaa aagaaatttc aaataagtca attgattacg gaatgctttg 900
atgtcctatg ttgtccatct aaagtgtttt ccataatctc acagtttcat ctataacttg 960
taaaagatgt cattcagatt tatcataaaa aagttggatt ctaggaagac ataa 1014

Claims (6)

1.佛甲草耐盐基因SlWRKY，其特征是所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.含权利要求1的佛甲草耐盐基因SlWRKY的克隆载体pJET1.2_SlWRKY。
3.含权利要求1的佛甲草耐盐基因SlWRKY的表达载体pBI121_SlWRKY。
4.含有权利要求3的表达载体pBI121_SlWRKY的宿主细胞。
5.权利要求1佛甲草耐盐基因SlWRKY增强植物对盐的耐受性的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征是所述植物为拟南芥或杨树。
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