CN116179562A - PavKLUH基因及其转录因子PavRAV2在调控甜樱桃果实大小中的用途 - Google Patents
PavKLUH基因及其转录因子PavRAV2在调控甜樱桃果实大小中的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了PavKLUH基因及其转录因子PavRAV2在调控甜樱桃果实大小中的用途。本发明通过在拟南芥中异位过表达PavKLUH和在甜樱桃果实中瞬时沉默PavKLUH基因表达等试验发现，将PavKLUH基因在甜樱桃中进行超表达或过表达，能够使樱桃果实变大。本发明进一步利用酵母单杂交筛库获得PavKLUH启动子上游的结合蛋白PavRAV2，再利用EMSA和双荧光素实验证实PavRAV2可以直接结合PavKLUH启动子并抑制PavKLUH基因表达，结合瞬时沉默甜樱桃果实PavRAV2基因实验确定PavRAV2负调控PavKLUH基因的表达，抑制或沉默甜樱桃中的PavRAV2基因能够使甜樱桃果实显著变大。
Description
技术领域
本发明涉及PavKLUH基因及其转录因子PavRAV2的新用途，尤其涉及PavKLUH基因及其转录因子PavRAV2在调控甜樱桃果实大小中的用途，属于PavKLUH基因及其转录因子PavRAV2的新用途领域。
背景技术
欧洲甜樱桃(Prunus avium L.)，又名甜樱桃，为蔷薇科、李属植物，原产于欧洲及亚洲西部，是北方春季上市最早的鲜果，深受消费者喜爱。目前中国甜樱桃栽培面积和产量已达世界第一。由于中国甜樱桃适种区的气候与原生境存在极大差异，表现为果个小、产量低，尤其是河南、安徽、山西、陕西等中西部暖温带地区的早熟产区，果个更小。果实大小对樱桃的经济效益影响极大，已成为樱桃育种研究工作中重要的育种目标。目前，国内外关于果实大小的研究，大多数停留在构建群体的连锁图谱，进行果实大小的QTL定位分析，而挖掘果实大小相关基因，调控果实大小的分子机理少有研究。截止目前调控甜樱桃果个大小的关键基因仍未发掘，因此需要通过多种生物学手段去发掘甜樱桃果实大小的关键基因，并鉴定基因功能与解析其遗传与分子机理。
细胞色素P450(CYP)CYP78A亚家族是植物体内高度保守的一类家族基因。截止目前，多个CYP78A家族成员被鉴定与籽粒/果实大小密切相关。比如，拟南芥的AtCYP78A5/KLUH、AtCYP78A7和AtCYP78A10通过影响种子表皮细胞的增殖控制籽粒大小；AtCYP78A6、AtCYP78A8和AtCYP78A9通过调节珠被细胞的大小控制籽粒大小。然而CYP78A亚家族成员在果树的功能鉴定还未报道，其家族成员是否同样影响植物器官的发育，参与调控果实大小等分子机理的研究仍未见报道，而且上游何种转录因子调控CYP78A亚家族成员的表达水平，进而影响甜樱桃的果实性状的分子机制尚不清楚。
因此，挖掘与甜樱桃果个大小相关的CYP78A家族基因并鉴定基因的分子功能与解析其遗传与分子机理，可进一步丰富CYP78A的功能注释，对解析调控樱桃等核果类果树的果实大小的分子机制提供理论参考，为果树基因改良方面提供一些理论基础，对改善目前甜樱桃产业果个小的生产现状具有重要的实践意义。
发明内容
本发明的目的之一是提供PavKLUH基因在调控甜樱桃果实大小中的用途；
本发明的目的之二是提供PavKLUH基因的转录因子PavRAV2在调控甜樱桃果实大小中的用途；
本发明的目的之三是提供一种促进甜樱桃果实变大的方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明发现在拟南芥中异位过表达PavKLUH基因能够是果实变大，进一步在甜樱桃中瞬时沉默PavKLUH基因结果能够使甜樱桃果实变小，由此，本发明确定PavKLUH基因具有调控甜樱桃果实大小的用途，包括：将PavKLUH基因在甜樱桃中进行超表达或过表达，使甜樱桃果实变大。
作为PavKLUH基因调控甜樱桃果实大小的一种参考的实施方案，包括，将PavKLUH基因与含有启动子的表达调控元件进行可操作性的连接后构建得到重组植物表达载体，将该重组植物表达载体转化到甜樱桃中将PavKLUH基因在甜樱桃中进行超表达或过表达，所得到的转基因甜樱桃果实变大。
本发明中所述的重组植物表达载体可以由5′端非编码区、PavKLUH基因的多核苷酸序列和3′非编码区组成，其中，所述的5′端非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子可以是组成性启动子、诱导型启动子、组织或器官特异性启动子；所述的3′非编码区可以包含终止子序列、mRNA切割序列等。合适的终止子序列可取自根癌农杆菌的Ti-质粒，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区。
本发明中所述重组植物表达载体还可含有用于选择转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因用于选择经转化的细胞或组织。标记基因包括：编码抗生素抗性的基因以及赋予除草化合物抗性的基因等。此外，所述的标记基因还包括表型标记，例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白等。
含有PavKLUH基因所示的多核苷酸序列的重组植物表达载体以及含有所述重组植物表达载体的宿主细胞也属于本发明的保护范畴。
本领域技术人员可以采用任何一种的植物转化方法将本发明所构建的重组植物表达载体转化到甜樱桃的细胞、组织中，得到转化体；再由转化体通过植物组织培养方法再生得到完整的甜樱桃植株及其无性系或其后代；作为一种参考的实施方案，所述的转化方法包括：农杆菌介导的转化、原生质体转化、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、显微注射、电穿孔法、微粒轰击等。
本发明中所述的PavKLUH基因的核苷酸序列如下：
此外，本领域人员也可按照本领域人员的常规突变技术在上述核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入得到多个核苷酸变体，且该核苷酸变体仍具有调控甜樱桃果实大小的功能。
本发明中所述的启动子可以是任何一种能够启动外源基因在植物中进行表达的启动子，包括组成型启动子、组织特异性启动子和诱导性启动子；优选的，所述的启动子是核苷酸序列如下：
GCGAACATGAATTTCCATCAACTAGAAGCCTCGTCCTTAAGAACATAGTCCTATTGCTAACCCAAAAGTAGAGAGTGAGATAGATTTGACAAAAAAAGAAAGAGAGAGAGGTAGAGAAACAGTTAGGTGGCGGAAAAGTTGGCCGGATTTATGCGGTTTGGAAGCGTTTTCCGACTTCGTCTTGGTGCCATCGAGCGCAGTTCCTGTTTATATGAAATGCACTTATCCCTCTCATCTCTTGTCCTTCAACTCTAGCATCCCATCATCTTGTACAAGGCATCACAAAGTAAAATGACCATAATAATCCTATTCAATCTCATAAAAACTCAAATAAATTCTAACAAAACTGTCAAATAAATGACTGAACCACCAAACACCAAATAAAGAACACTTAAACATAATTAACTTATAGAATTAAACCCCAAATGAACAAAGCTATAAATATTGGAACGGCTGTTCCGGCCAAAAAAAAAATTTCAACGGCTGAGATTTTCTTATTAAATTGATTTTGACATTATGGACCTCTGAGATGCCATATGGTCTCCATCATACCGTCAGCTAACTTATTCTAACGTACGCACAATTCCATTTCCATACATTATGGACCTCTCAAATGTGGGAAGGTAAAGCAAGAAAATGCAAAAGCATATCAGAATCATAATATTTTTCGAAAGAGACGGCGCAAAACCAGAGTTTGATTCTTCATTTTAACCCAGGGGGTAAATCCGTCCACGAAAATTTGAGGAAGGCATCATAATTTCATAATTCATTCTTCTAGGAGACGGCAGTAAAATTAATGTTTACGGCTGTTAAAATACTTGAAGAGTCACATTTCCCTCTATATAACTCATCACACTCTTCTTTCTCTTCCTCACACCACAACCCCTCCTCAGCTTTAGTTTCCCACTTGGCTTTCTTGTTTCCTAAGCTTTGCCTTTTCATATTCTCGCTCATTTTCTGACTAACCAAACACTAAGAAAAAGAGCAGGGAGTCAAAAAA。
作为PavKLUH基因在调控果实大小的另一种参考的实施方案，包括采用基因敲除或基因编辑技术等手段，将甜樱桃中的PavKLUH基因进行沉默或敲除，使甜樱桃果实变小。
本发明还进一步提供了PavKLUH基因的靶标因序列，其核苷酸序列为如下所示：
GTCCTTCTGGCCTTCCTGTTCTTGGGTTGGTCTTGGCCTTCACTGGCTCTCTGACTCACAGAGTTCTAGCTAAGCTTGCTGAGACCTCAAAGGCCAAACCTTTAATGGCATTCTCTGTTGGGTTTACTCGTTTTGTCATCTCCAGCCACCCTGATACAGCTAAAGAGCTCTTGAATAGCTCTGCCTTCGCTGACCGACCCATTAAAGAGTCGGCTTATGAGCTTTTGTTCCATAAAGCAATGGGTTTTGCCCCTTTTGGCGAGTATTGGAGGAACTTGAGGAGAATCTCGGCCACCCATTTGTTCAGCCCGAAAAGAATCGCTAGTTTCGGGTTGTTTCGGGAAACTATCGGGCACAAAATGGTGGAGGAGATGAAGGCC。
采用该靶标基因序列构建的基因编辑载体或打靶载体转化到植物体内能够有效沉默甜樱桃PavKLUH基因的表达。
本发明进一步利用酵母单杂交筛库获得PavKLUH启动子上游的结合蛋白PavRAV2，然后利用EMSA和双荧光素实验证实PavRAV2可以直接结合PavKLUH启动子并抑制PavKLUH基因表达，进一步甜樱桃果实中瞬时沉默PavRAV2基因暗示PavRAV2负调控PavKLUH基因，也具有调控甜樱桃果实大小的功能。
由此，本发明的第二方面是确定了PavRAV2基因在调控甜樱桃果实大小中的用途，包括：沉默或者敲除甜樱桃中的PavRAV2基因使甜樱桃果实变大，或者将PavRAV2基因在甜樱桃中进行超表达或过表达，使甜樱桃果实变小。
本发明的第三方面是提供了一种促进甜樱桃果实变大的方法，包括：将PavKLUH基因在甜樱桃中进行超表达或过表达；或者沉默或者敲除甜樱桃中PavRAV2基因，采取这些技术手段均能使甜樱桃果实表大。
本领域人员可以采用常规的基因敲除或基因编辑技术等常规的方法，将甜樱桃中的PavRAV2基因进行突变或敲除实现沉默PavRAV2基因的目的，譬如构建PavRAV2基因敲除载体或采用基因编辑技术构建CRISPR/Cas9基因编辑载体等，这些方法均为本领域技术人员所熟练掌握。
本发明中所述PavRAV2基因的核苷酸序列为如下所示：
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。
术语“重组植物表达载体”：一种或多种用于实现植物转化的DNA载体；本领域中这些载体常被称为二元载体。二元载体连同具有辅助质粒的载体是大多常用于土壤杆菌介导转化的。二元载体通常包括：T-DNA转移所需要的顺式作用序列、经工程化处理以便能够在植物细胞中表达选择标记物或待转录的异源性基因等。
术语“重组宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。
术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。
术语“启动子”指存在于目的基因编码序列的上游，提供RNA聚合酶和正确转录起始所必需的其它因子的识别位点，启动或指导目的基因转录为mRNA。
术语“选择标记基因”：该基因在植物细胞中的表达给予该细胞选择优势，用这些选择性标记基因所转化的这些细胞所具有的选择优势可以是由于它们与非转化细胞的生长相比具有在阴性选择剂(如：抗菌素或除草剂)的存在下生长的能力。选择标记基因还指多种基因的组合，它们在植物细胞中的表达给予该细胞阴性以及阳性的选择优势。
术语“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。
术语“转化”：将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。
术语“表达”：内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。术
术语“编码序列”：转录成RNA的核酸序列。
附图说明
图1甜樱桃PavKLUH基因的系统进化树和基因表达模式分析。
图2拟南芥中异位过表达PavKLUH基因对果荚和籽粒大小的影响。
图3瞬时沉默甜樱桃果实PavKLUH基因对果实大小的影响。
图4酵母单杂筛库获得PavKLUH启动子的结合蛋白PavRAV2。
图5酵母单杂、EMSA验证PavRAV2蛋白直接结合PavKLUH启动子。
图6双荧光素酶实验确定PavRAV2抑制PavKLUH基因表达。
图7瞬时沉默甜樱桃果实PavRAV2基因对果实大小的影响。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实验例1 PavKLUH基因、PavRAV2基因影响甜樱桃果实大小以及PavRAV2影响PavKLUH基因表达的试验
1实验方法
1.1实验材料
植物材料：欧洲甜樱桃栽培品种‘布鲁克斯’和‘龙冠’来自中国农业科学院郑州果树研究所樱桃种质资源圃，砧木为‘ZY-1’，树龄9年，树体生长正常。
拟南芥和烟草在人工气候箱培养。
1.2 PavKLUH基因的进化树分析
利用MEGA 6.0软件对甜樱桃PavKLUH基因和其他物种中已经报道的KLUH基因(拟南芥、水稻、小麦、番茄、葡萄、苹果、草莓、桃等)进行氨基酸序列的同源比对分析，并构建其进化树。
1.3 PavKLUH基因的表达模式分析
收集不同发育期的‘布鲁克斯’果实，利用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(天根生物科技有限公司，北京，中国)提取经DNaseI酶消化的总RNA，并反转录成cDNA。设计特异性引物对PavKLUH-q-F/R、(表1)。
表1本实验中所用的扩增引物
进行3次独立的荧光定量PCR，分析甜樱桃PavKLUH基因的表达模式。qPCR反应在ABI7500 PCR热循环仪(Applied Biosystems,Foster City,CA,United States)上进行，使用TransStart Top Green qPCR SuperMix(北京全式金生物技术有限公司，北京，中国)试剂盒进行反应，以甜樱桃的actin(Pav_sc0002247.1_g030.1.mk)为内参进行分析。进行3次生物学重复，取平均值。采用2-ΔΔct方法计算基因的相对表达量。
1.4 PavKLUH基因过表达载体构建及拟南芥的遗传转化
以甜樱桃果实的cDNA为模板，设计PavKLUH基因编码区序列的特异性引物PavKLUH-F\R(表1)进行PCR扩增，分别获得PavKLUH基因的全长片段，利用同源重组的方法分别将PavKLUH基因构建到植物表达载体pBI121上，获得pBI121-PavKLUH的重组载体，电击转化根癌农杆菌，通过农杆菌介导的方法转化拟南芥，获得了多个过表达PavKLUH基因的拟南芥阳性转化株系，并继代培养2代后，得到纯合的转化株系，选取三个表达量最高的株系(PavKLUH-2、PavKLUH-8和PavKLUH-13)进行进一步表型研究(图7)
1.5 VIGS-PavKLUH重组载体、VIGS-PavRAV2重组载体构建与VIGS技术瞬时转化甜樱桃果实
靶基因片段的长度(300bp-500bp)及序列信息是影响TRV病毒诱导基因沉默本生烟效率的关键因素，因此本实验针对PavKLUH基因设计了3条靶标序列，分别为PavKLUH-1、PavKLUH-2、PavKLUH-3。
其中，PavKLUH-1的核苷酸序列如下：
GTCCTTCTGGCCTTCCTGTTCTTGGGTTGGTCTTGGCCTTCACTGGCTCTCTGACTCACAGAGTTCTAGCTAAGCTTGCTGAGACCTCAAAGGCCAAACCTTTAATGGCATTCTCTGTTGGGTTTACTCGTTTTGTCATCTCCAGCCACCCTGATACAGCTAAAGAGCTCTTGAATAGCTCTGCCTTCGCTGACCGACCCATTAAAGAGTCGGCTTATGAGCTTTTGTTCCATAAAGCAATGGGTTTTGCCCCTTTTGGCGAGTATTGGAGGAACTTGAGGAGAATCTCGGCCACCCATTTGTTCAGCCCGAAAAGAATCGCTAGTTTCGGGTTGTTTCGGGAAACTATCGGGCACAAAATGGTGGAGGAGATGAAGGCC。
PavKLUH-2的核苷酸序列如下：
PavKLUH-3的核苷酸序列如下：
而PavRAV2全长序列仅540bp，本实验针对PavRAV2设计了1条靶标序列PavRAV2。
pTRV2-PavKLUH和pTRV2-PavRAV2载体的构建采用In-Fusion Cloning技术。分别设计带有16个重叠区域(与经EcoRI和KpnI线性化的pTRV2片段互为反向互补的接头)的PavKLUH或PavRAV2基因特异性引物对PavKLUH-RNAi-F1-3/R1-3、PavPavRAV2-RNAi-F/R(表1)。以甜樱桃cDNA为模板分别扩增PavKLUH或PavRAV2基因的靶标片段，利用In-FusionTMHD Cloning kit(Clontech,CA,United States)分别将靶标片段构建接到经EcoRI和KpnI双酶切线性化的pTRV2构建上，分别命名为pTRV2-PavKLUH和pTRV2-PavRAV2，并转入大肠杆菌DH5α感受态中，挑取阳性菌株，经PCR鉴定，双酶切鉴定和测序正确后，分别将pTRV2-PavKLUH和pTRV2-PavRAV2载体转入农杆菌菌种GV3101中备用。甜樱桃果实的VIGS方法参照齐希梁等的方法(齐希梁,李明,刘聪利,&宋露露.(2018).TRV介导欧洲甜樱桃果实VIGS体系的建立.果树学报,35(11),1309-1315.)进行，并进行六次生物学重复。
1.6半定量RT-PCR检测分析
提取甜樱桃果实样品的总RNA并反转录成cDNA，以甜樱桃的actin(Pav_sc0002247.1_g030.1.mk)基因为内参，对不同样品的cDNA含量进行调节，然后分别利用PavKLUH或PavRAV2基因特异性引物对(表1)检测沉默后PavKLUH或PavRAV2基因的表达水平。并进行三次生物学重复，取平均值。
1.7酵母单杂交筛库获得PavKLUH基因启动子上游的结合蛋白PavRAV2
酵母单杂交文库筛选参照MatchmakerTMGold Yeast One-Hybrid LibraryScreening System(Clontech,美国)试剂盒进行。
首先构建甜樱桃果实的cDNA文库。利用EASY spin RNA植物RNA快速提取试剂盒(原平皓生物，中国)从甜樱桃果实中提取总RNA，然后使用Oligo(dT)磁珠纯化mRNA，利用反转录试剂盒将mRNA反转了成cDNA，并扩增和纯化得到dscDNA。将纯化的dscDNA插入到pGADT7载体形成重组质粒，然后转入到大肠杆菌DH10B中获得甜樱桃果实的cDNA文库。设计PavKLUH基因特异性引物对PavKLUH-Pro-F/R(表1)，以甜樱桃DNA为模板，扩增PavKLUH基因的启动子片段，然后通过同源重组的方法克隆到pAbAi载体中，构建pAbAi-PavKLUH诱饵载体，将pAbAi-PavKLUH诱饵载体线性化，转入Y1HGold菌株中并制作成感受态Y1HGold(pAbAi-PavKLUH)。取甜樱桃果实的cDNA文库质粒10μg，按照Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System说明书进行酵母单杂筛库实验。文库质粒导入Y1HGold(pAbAi-PavKLUH)酵母诱饵菌株后，取转化后的重悬菌液涂布在400ng/mL AbA的SD/-Leu培养基上进行筛选。获得阳性菌落后，通过测序鉴定片段序列信息，获得候选结合蛋白。
1.8酵母单杂交载体构建与验证PavRAV2直接与PavKLUH基因启动子结合
设计PavKLUH基因特异性引物对PavKLUH-Pro-F/R(表1)，以甜樱桃DNA为模板，扩增PavKLUH基因的启动子片段，然后通过同源重组的方法克隆到pAbAi载体中，产生pAbAi-PavKLUH重组质粒，将pAbAi-PavKLUH重组质粒线性化，转入Y1HGold菌株中，并制作成感受态Y1HGold(pAbAi-PavKLUH)。将PavRAV2基因全长构建到pGADT7载体上，形成pGADT7-PavRAV2重组质粒。将pGADT7-PavRAV2重组质粒分别转化到含有pAbAi-PavKLUH的Y1HGold菌株的感受态中，涂布在含有400ng/mL AbA抑制浓度的SD/-Leu培养基上，观察酵母菌斑的生长情况。每隔培养组合至少进行四次生物学重复。
1.9凝胶阻滞电泳迁移率变动实验(EMSA)
EMSA实验参照LightShift Chemiluminescent EMSA Kit(Thermo FisherScientific,USA)试剂盒说明书进行。将PavRAV2基因全长序列克隆到带有His标签的pET32a载体中，然后导入大肠杆菌BL21中扩增融合蛋白，然后用His蛋白纯化系统回收His-PavRAV2融合蛋白。生物素标记的PavKLUH基因启动子探针由上海生物工程有限公司合成，然后将His-PavRAV2蛋白和生物素标记的PavKLUH启动子探针混合，于EMSA胶上进行电泳分析，并设计竞争性探针、突变体探针和阴性对照。
1.10双荧光素酶报告实验
设计特异性引物PavKLUH-Pro-F/R(表1)扩增PavKLUH启动子序列，通过同源重组方法插入到pGreenII 0800-LUC载体中生成报告质粒。类似地通过同源重组方法将PavRAV2编码序列克隆到pGreenII 62-SK载体中作为效应质粒。将含有效应质粒和报告质粒的根癌农杆菌GV3101共转化烟草叶片。通过在烟草中瞬时转化报告载体和效应载体，2天后，使用双荧光素酶报告试剂盒在荧光素酶仪测量LUC和REN的活性。双荧光素酶报告实验至少进行了四个生物学重复。
1.11数据处理
使用Microsoft Excel 2010软件对所获数据处理并绘图；使用SPSS17.0软件进行相关性分析和差异显著性(P<0.05)分析。
2实验结果
2.1甜樱桃PavKLUH的系统进化树和基因表达模式分析。
为了确定甜樱桃的PavKLUH基因与其他物种的KLUH基因的进化关系，本实验构建了其KLUH系统进化树，结果显示：PavKLUH能与其他物种的KLUH蛋白聚合在一起，与桃、草莓和苹果具有高度相似性，相似度达75％以上，其中与梅花PmKLUH具有96.55％的同源性，与桃PpKLUH具有96.92％的同源性，但是与上述相似性极高的物种KLUH的功能至今未见报道(图1A)。
为了分析甜樱桃果实发育与成熟过程中PavKLUH基因的表达模式，本实验利用实时荧光定量(qRT-PCR)分析了其在叶片、花和不同果实发育阶段的基因表达情况。结果显示：PavKLUH基因在整个花期和果实生长发育过程中均表达，但存在显著的表达差异。在果实生长发育早期(盛花后0-15天，DAFB)，PavKLUH表达较低。随后在21DAFB后，PavKLUH基因的表达急剧增加，然后逐渐下降，在果实生长发育后期(35-50DAFB)仍保持较高的表达水平(图1B)，暗示PavKLUH基因可能在果实生长发育中起关键作用。
2.2拟南芥中异位过表达PavKLUH基因对果荚和籽粒大小的影响。
利用在拟南芥中异位过表达甜樱桃PavKLUH基因产生的阳性转基因T3代株系，PavKLUH-OE-2,PavKLUH-OE-8和PavKLUH-OE-13，对其进行表型观察和统计分析发现：过表达PavKLUH基因的拟南芥的形态特征和生长特性与转化空载的野生型拟南芥相比，没有明显差异。但是过表达PavKLUH基因的拟南芥株系产生更大的果荚和种子，果荚和种子大小都显著高于空载的野生型的果荚和种子(图2)，表明甜樱桃PavKLUH基因是调控果实大小的关键基因。
2.3瞬时沉默甜樱桃果实PavKLUH基因对果实大小的影响。
利用本发明人课题组成功建立的TRV病毒诱导基因沉默甜樱桃果实的转化体系，将含有TRV::00(空白对照)和TRV::PavKLUH的农杆菌菌株GV3101分别侵染甜樱桃栽培种‘龙冠’。侵染15天后提取果实的mRNA进行表达量检测，结果显示含有靶基因片段PavKLUH-1的TRV::PavKLUH侵染的甜樱桃果实中PavKLUH的表达量低于TRV::00侵染的甜樱桃果实(图3A)，基因沉默效率达90％以上，表明PavKLUH基因分别被有效的沉默，而含有靶基因片段PavKLUH-2和PavKLUH-3的TRV::PavKLUH的沉默效率较低。
测量和统计分析TRV::PavKLUH和TRV::00侵染后5天、10天、15天和25天甜樱桃果实的重量、直径、果核重量的结果显示：TRV::PavKLUH侵染的甜樱桃果实的果实重量、果实横茎和纵茎显著低于TRV::00侵染的果实(图3B-D)，而TRV::PavKLUH侵染的甜樱桃果实的果核重量与TRV::00侵染的果实的果核重量没有显著差异(图3E)。表明PavKLUH在甜樱桃果实生长与发育过程中影响果实大小。
2.4酵母单杂筛库获得PavKLUH基因启动子的结合蛋白PavRAV2
为明确何种蛋白调控PavKLUH基因的表达，本实验构建了PavKLUH基因启动子的诱饵融合载体，转入Y1HGold菌株中构建诱饵菌株，检测鉴定正确后，将诱饵菌株Y1HGold(pAbAi-PaKLUH)制作感受态。将本实验已构建的甜樱桃果实的酵母单杂交cDNA文库质粒转入诱饵菌株Y1HGold(pAbAi-PaKLUH)感受态中，涂布在含有400ng/mL AbA抑制浓度的SD/-Ura/-Leu培养基上进行筛选，筛选得到的阳性酵母转化子，提取质粒并测序，分析其包含的序列编码蛋白，初步确定与PavKLUH基因启动子的调节蛋白PavRAV2(与ABI3/VP2有关，属于AP2/ERF类转录因子，图4)。
2.5酵母单杂、EMSA验证PavRAV2蛋白直接结合PavKLUH启动子
为验证酵母单杂交筛库获得的候选转录因子PavRAV2是否为假阳性。本实验将PavRAV2基因全长构建到pGADT7载体，经酵母转化转入Y1HGold(pAbAi-PaKLUH)菌株的感受态中，涂布在含有400ng/mL AbA抑制浓度的SD/-Leu培养基上，观察酵母菌斑的生长情况。结果发现，候选蛋白PavRAV2经酵母转化后，酵母菌斑在含有400ng/mL AbA抑制浓度的SD/-Leu培养基上正常生长，并且稀释一定倍数后，酵母菌斑个数逐渐减少(图5A)，表明PavRAV2与PavKLUH基因启动子结合。
然后，本实验利用纯化的重组蛋白PavRAV2-HIS进行凝胶阻滞电泳迁移率变动实验(EMSA)进一步确定PavRAV2蛋白在体外是否直接与PavKLUH启动子结合。EMSA结果显示重组蛋白PavRAV2-HIS直接与PavKLUH启动子的ABRE顺式元件AAGAA序列结合位点结合。而且随着生物素未标记探针数量增加，PavKLUH与生物素标记的探针结合数量减少(图5B)。当PavKLUH启动子的结合位点AAGAA序列发生突变后，没有观察到生物素标记的突变体探针结合的数量增多(图5B)。上述结果表明PavRAV2蛋白与PavKLUH基因启动子特异性结合。
2.6双荧光素酶实验确定PavRAV2抑制PavKLUH基因表达
为了确定PavRAV2是如何调控PavKLUH基因的表达，本试验构建了双荧光素酶报告系统，该系统包含PavKLUH基因启动子驱动Luc基因表达(萤火虫萤光素酶，为报告基因)和CaMV35S启动子驱动REN基因表达(海肾萤光素酶，为内参基因)的报告载体以及CaMV35S启动子PavRAV2表达的效应载体，通过在烟草中瞬时转化报告载体和效应载体，2天后，使用双荧光素酶报告试剂盒在荧光素酶仪测量LUC和REN的活性。结果显示，与空载对照相比，PavRAV2基因表达的效应载体转化的烟草中LUC/REN相对比值显著降低(图6)，表明PavRAV2直接抑制PavKLUH基因表达。综上表明PavRAV2可直接与PavKLUH启动子结合，并负向调控PavKLUH基因表达。
2.7瞬时沉默甜樱桃果实PavRAV2基因对果实大小的影响
为了确定PavRAV2基因是否关联调控甜樱桃果实大小的分子功能，本实验通过病毒诱导基因沉默技术，将含有TRV::00(空白对照)和TRV::PavRAV2的农杆菌菌液分别侵染甜樱桃栽培种‘布鲁克斯’。14天后提取侵染果实的总mRNA进行半定量PCR检测。结果发现，与TRV::00侵染的甜樱桃果实相比，TRV::PavRAV2侵染甜樱桃果实中PavRAV2基因的表达量显著降低(图7A)，基因沉默效率达85％以上，表明PavRAV2基因被有效的沉默。
侵染21d后，对PavRAV2沉默的甜樱桃果实的表型进行观察，发现PavRAV2沉默的甜樱桃果实比对照果实表现出更大的果实大小(图7B)。然后对其果实纵横经和单果重进行测量，结果显示：PavRAV2沉默的甜樱桃果实的果实纵径、横茎和单果重显著高于TRV::00侵染的甜樱桃果实(对照)，然而PavRAV2沉默的甜樱桃果核大小与对照相比，没有差异(图7C-E)。表明沉默PavRAV2显著增加了甜樱桃果实大小，暗示PavRAV2调控甜樱桃果实大小。
Claims (9)
1.PavKLUH基因在调控甜樱桃果实大小中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，包括：将PavKLUH基因在甜樱桃中进行超表达或过表达，使甜樱桃果实变大。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，包括：将PavKLUH基因与含有启动子的表达调控元件进行可操作性的连接后构建得到重组植物表达载体，将该重组植物表达载体转化到甜樱桃中将PavKLUH基因在甜樱桃中进行超表达或过表达。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，包括：将甜樱桃中的PavKLUH基因进行突变或敲除，使甜樱桃果实变小。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，包括：以PavKLUH基因的靶基因构建PavKLUH基因敲除载体，将甜樱桃中的PavKLUH基因进行敲除，使甜樱桃果实变小。
6.PavKLUH基因的转录因子PavRAV2在调控甜樱桃果实大小中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，包括：沉默甜樱桃中的PavRAV2基因，使甜樱桃果实变大。
8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，包括：将PavKLUH基因在甜樱桃中进行超表达或过表达，使甜樱桃果实变小。
9.一种促进甜樱桃果实变大的方法，包括：将PavKLUH基因在甜樱桃中进行超表达或过表达；或者沉默甜樱桃中调控PavKLUH基因的转录因子PavRAV2。
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