CN110590923B - 丹参nac1转录因子及其编码基因在调控丹参中丹酚酸类化合物含量方面的应用 - Google Patents

丹参nac1转录因子及其编码基因在调控丹参中丹酚酸类化合物含量方面的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了丹参NAC1转录因子及其编码基因在调控丹参中丹酚酸类化合物含量方面的应用。本发明发现丹参NAC1转录因子可以与基因PAL和TAT的启动子相结合，提高丹酚酸类物质合成通路上的两个关键酶PAL和TAT的活力，进而提高丹参中丹酚酸类物质的含量。因此，丹参NAC1转录因子、其编码基因以及含有该编码基因的表达载体可以用于调控提高丹参中的丹酚酸类物质。

Description

丹参NAC1转录因子及其编码基因在调控丹参中丹酚酸类化合 物含量方面的应用
技术领域
本发明属于生物化学领域，涉及植物基因调控次生代谢产物，具体涉及丹参NAC1转录因子及其编码基因在调控丹参中丹酚酸类化合物含量方面的应用。
背景技术
丹参是唇形科(Labiatae)鼠尾草属(Salvia)多年生草本植物，其所含的药物活性成分主要存在于根中，故常以根入药。作为一种传统中药，丹参药材具有活血祛瘀、凉血消痈、消炎养血等作用，被广泛用于治疗心脑血管疾病，疗效显著。丹参根中水溶性药物活性成分主要是丹酚酸类物质，包括丹参素钠、原儿茶酸、肉桂酸、咖啡酸、对香豆酸、迷迭香酸、丹酚酸A、B、C、E等。药典中以丹酚酸B含量作为酚酸类物质的指标，用以判断丹参药材的品质。(参考文献：王春丽等，生长调节物质和可溶性糖含量对丹参中丹酚酸类物质积累的影响，植物生理学报，2012年第48卷第2期。)
丹参的药效活性成分主要分为脂溶性的丹参酮类和水溶性的丹酚酸类，现代药理学研究表明，丹酚酸类成分是丹参发挥活血祛瘀功效的主要成分。(参考文献：马强等，60Co-γ射线辐照对丹参中丹酚酸类成分的影响，中国药师2018年第21卷第8期。)
因此，研究丹参中次生物质丹酚酸类化合物积累的调节机制对生产及学术研究都有重要意义，有利于提高丹参中丹酚酸类化合物的含量。但是，现有技术明显研究不足。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供丹参NAC1转录因子及其编码基因在调控丹参中丹酚酸类化合物含量方面的应用，以提高丹参中丹酚酸类化合物含量。
本发明上述目的通过如下技术方案实现：
丹参NAC1转录因子在调控丹参中丹酚酸类化合物含量方面的应用。
进一步地，所述丹酚酸类化合物为丹酚酸B或迷迭香酸。
丹参NAC1转录因子的编码基因在调控丹参中丹酚酸类化合物含量方面的应用。
进一步地，所述丹酚酸类化合物为丹酚酸B或迷迭香酸。
一种含有丹参NAC1转录因子的编码基因的表达载体在调控丹参中丹酚酸类化合物含量方面的应用。
进一步地，所述丹酚酸类化合物为丹酚酸B或迷迭香酸。
有益效果：
本发明发现丹参NAC1转录因子可以与基因PAL和TAT的启动子相结合，提高丹酚酸类物质合成通路上的两个关键酶PAL和TAT的活力，进而提高丹参中丹酚酸类物质的含量。因此，丹参NAC1转录因子、其编码基因以及含有该编码基因的表达载体可以用于调控提高丹参中的丹酚酸类物质。
附图说明
图1为过表达pHB-NAC1-3Flag载体质粒；
图2为干扰pK7GWIWG2DII-NAC1载体质粒；
图3为NAC1过表达毛状根(NAC1-O)中总DNA琼脂糖凝胶电泳图；
图4为NAC1过表达毛状根(NAC1-O)中蛋白水平图；
图5为NAC1过表达毛状根(NAC1-O)与NAC1-RNAi干扰毛状根(NAC1-R)中NAC1基因的转录水平；
图6为NAC1-RNAi干扰毛状根(NAC1-R)荧光检测图；
图7为丹酚酸B和迷迭香酸的含量；
图8为PAL和TAT酶活力；
图9为SmPAL3和SmTAT3基因转录水平；
图10为转录因子NAC1结合位点验证图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
一、实验材料与仪器
anti-Flag抗体(Abbkine，加利福尼亚，美国)，植物总RNA提取试剂盒(DP432，上海，中国)，标准品丹酚酸B(上海源叶生物科技有限公司)，标准品迷迭香酸(上海源叶生物科技有限公司)。荧光显微镜(LEICADM5000B，Wetzlar，法国)。
二、实验方法
1.NAC1质粒载体的构建
NAC1过表达载体的构建是通过PCR技术，用特异性的引物NAC1-3Flag-SpeI(表1)扩增出NAC1完整的开放阅读框序列，并将其插入pHB-3Flag质粒中，构建出过表达的pHB-NAC1-3Flag载体质粒(图1)。NAC1-RNAi载体的构建是先用PCR技术扩增出NAC1片段的基因序列，然后再将其插入pDONR质粒中，最后利用gateway技术使此质粒与载体pK7GWIWG2DII结合在一起，得到干扰的pK7GWIWG2DII-NAC1载体质粒(图2)。将这两种载体质粒各自转入C58C1农杆菌中，将含有pHB-NAC1-3Flag载体质粒和空载体质粒的农杆菌在50mg/L的卡那霉素和50mg/L的利福平平板培养基上培养，含有pK7GWIWG2DII-NAC1载体质粒的农杆菌在50mg/L的利福平和50mg/L的壮观霉素平板培养基上培养。
表1引物列表
Figure BDA0002239070660000031
2.丹参发根农杆菌C58C1介导的遗传转化
2.1发根农杆菌菌株的保存和活化
在转化平板上挑取单菌落接种于1mL含相应抗生素的LB培养基中(pHB-NAC1-3Flag载体质粒和空的载体质粒的农杆菌培养基含有50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平，pK7GWIWG2DII-NAC1载体质粒的农杆菌培养基含有50mg/L利福平和50mg/L壮观霉素)，200rpm，28℃振荡培养过夜。在10mL含相应抗生素LB培养基中加入200uL上述菌液，200rpm，28℃振荡培养过夜，使菌液浓度OD600值在0.4到0.8之间。室温下4000rpm离心10min，弃上清，菌体用1/2MS(添加乙酰丁香酮AS，终浓度100uM)液体培养基稀释到OD600值在0.4，继续悬浮培养2h，用于接种感染外植体。
2.2外植体预培养
剪切无菌苗叶片(0.5cm×0.5cm)，接种到预培养固体培养基1/2MS(添加AS 100μmol/L)上，25℃暗培养2d。
2.3农杆菌与外植体的共培养
感染前，取出预培养的叶片，放入活化好的农杆菌1/2MS液体悬液中浸染10-20min，轻轻摇动使外植体与菌液充分接触。取出侵染后的外植体，用无菌吸水纸吸干表面余菌，转到共培养培养基(固体)1/2MS(添加AS 100umol/L)中，黑暗下共培养2d。
2.4毛状根的诱导和培养
将共培养2d的外植体转入到脱菌培养基1/2MS+Cef250mg/L(固体)中，25℃16h/8h光照培养。两周左右叶片边缘切口处长出毛状根。剪取毛状根(大约2-3cm)，接种于脱菌培养基1/2MS+Cef 250mg/L中培养两周，选择生长快、分枝好的毛状根转入脱菌培养基1/2MS+Cef250mg/L中继代筛选，每两周继代培养一次，经过4-5次继代后即可完全脱菌。再将生长良好的丹参毛状根转入无抗生素的1/2MS培养基上继续培养20d左右，得到NAC1过表达和RNA干扰的丹参毛状根。
2.5阳性毛状根的鉴定
2.5.1提取NAC1过表达丹参毛状根总DNA
CTAB法提取约100mgNAC1过表达丹参毛状根总DNA(Stewart Jr,C.N.,Via,L.E.(1993)Arapid CTAB DNA isolation technique useful for RAPD fingerprinting andother PCR applications.Biotechniques,14,748-749.)，用特异性的引物P35S-F和NAC1-R PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳后，有相应的条带则表明目的基因整合到染色质中的DNA上。
2.5.2蛋白印迹法(Western blot)
Western blot的方法来验证NAC1过表达毛状根是否为阳性根系，一抗为Anti-Flag抗体。
2.5.3qRT-PCR方法鉴定阳性根系
用植物总RNA提取试剂盒的方法提取毛状根中总的RNA，再逆转录生成cDNA(Yin,X.,Nishimura,M.,Hajika,M.and Komatsu,S.(2016)Quantitative proteomics revealsthe flooding-tolerance mechanism in mutant and abscisic acid-treatedsoybean.J.Proteome Res.,15,2008-2025.)，可用qRT-PCR(表1)的方法分析目的基因的转录水平进行鉴定(Pei,T.,Ma,P.,Ding,K.,Liu,S.,Jia,Y.,Ru,M.,Dong,J.and Liang,Z.(2018)SmJAZ8acts as a core repressor regulating JA-induced biosynthesis ofsalvianolic acids and tanshinones in alvia miltiorrhiza hairyroots.J.Exp.Bot.,69,1663-1678.)，PCR的运行条件如下：95℃，10min；再以95℃，10s，60℃，30s，循环40次，actin(DQ243702.1)基因为内参基因(Pei,T.,Ma,P.,Ding,K.,Liu,S.,Jia,Y.,Ru,M.,Dong,J.and Liang,Z.(2018)SmJAZ8acts as a core repressorregulating JA-induced biosynthesis of salvianolic acids and tanshinones inalvia miltiorrhiza hairy roots.J.Exp.Bot.,69,1663-1678.)。
2.5.4绿色荧光鉴定阳性根系
在荧光显微镜下，NAC1-RNAi干扰毛状根系发出绿色荧光，则表明该组根系为阳性。
3.qRT-PCR分析SmPAL3和SmTAT3基因的表达
PAL和TAT酶是丹参中丹酚类物质合成通路上的两个关键酶，因此测定SmPAL3和SmTAT3的转录水平，来证实NAC1转录因子是否对丹酚酸类物质的合成起到调节作用。方法如2.5.3步骤，引物见表1。
4.PAL和TAT酶活的测定
丹参中PAL和TAT酶活力的测定(
Figure BDA0002239070660000041
A.S.,Pellegrini,E.,Batola,M.D.,Nali,C.,Lorenzini,G.and Petersena,M.(2014)How do background ozoneconcentrations affect the biosynthesis of rosmarinic acid in Melissaofficinalis？J.Plant Physiol.,171,35-41.Riewe,D.,Koohi,M.,Lisec,J.,Pfeiffer,M.,Lippmann,R.,Schmeichel,J.,Willmitzer,L.and Altmann,T.(2012)A tyrosineaminotransferase involved in tocopherol synthesis in Arabidopsis.Plant J.,71,850-859.)，已有很多文献报告，PAL酶活力测定波长为290nm，TAT酶活力测定波长为331nm。
5.通过ChIP-qPCR的方法，探究转录因子NAC1的结合位点
ChIP-qPCR采用试剂盒EpiQuik Plant ChIP Kit(Cat.no.P-2014；Epigentek)的方法来进行实验(Li,Z,.Zhang,L.,Yu,Y.,Quan,R.,Zhang,Z.,Zhang,H.,Huang,R.(2011)The ethylene response factorAtERF11that is transcriptionally modulated by thebZIP transcription factor HY5is a crucial repressor for ethylene biosynthesisinArabidopsis.Plant J.,68,88–99.)，简单描述如下：NAC1过表达毛状根和对照组毛状根各取2g，提取的染色质用anti-Flag抗体免疫沉淀，阴性对照组抗体为IgG，富集的DNA片段用qRT-PCR的分析，依据PAL3和TAT3基因的启动子区域是否含有‘CATGT’各设计两对引物(表2)利用Primer3Plus软件设计引物(http://frodo.wi.mit.edu)。
表2 CHIP-qPCR引物列表
Figure BDA0002239070660000051
6.阳性转基因毛状根中丹酚酸类物质含量的测定
70％的甲醇提取转基因毛状根的丹酚酸类物质，然后用HPLC仪器进行含量测定(Peng,L.,Ru,M.,Wang,K.,Li,B.,Wang,Y.,Xia,P.and Liang,Z.(2014).Spaceflightenvironment-induced variation in root yield and active constituents ofSalviamiltiorrhiza.Planta Med.,80,1029-1035.)，标准品丹酚酸B和标准品迷迭香酸用来定量丹酚酸类物质的含量。
三、实验结果
1.阳性毛状根的鉴定
1.1NAC1过表达毛状根的鉴定
NAC1过表达毛状根(NAC1-O)的鉴定有以下三种方法。方法一为提取过表达毛状根的总DNA，用特异性的引物PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳检测，如图3所示，有相应的条带则表明目的基因NAC1整合到染色质中的DNA上。方法二为测定NAC1的蛋白水平，如图4示。方法三为检测过表达毛状根NAC1的转录水平，如图5所示NAC1的过表达组是对照组的2-3倍。以上结果表明NAC1过表达根系为阳性根系。
1.2NAC1-RNAi干扰毛状根的鉴定
NAC1-RNAi(NAC1-R)干扰毛状根的鉴定有以下两种方法。方法一为测定干扰根系的基因NAC1的转录水平，如图5所示干扰组比对照组低10倍。方法二为在荧光显微镜下观察RNA干扰根系是否发出绿色荧光，从图6可看出干扰根系在倒置荧光显微镜下发出绿色荧光。由此可知NAC1-RNAi干扰毛状根为阳性根系。
2.丹酚酸类物质含量的测定
测定丹酚类物质中代表性物质丹酚酸B和迷迭香酸的含量(图7)，发现在阳性过表达根系中，丹酚酸B的含量约是对照组的2倍，干扰组丹酚酸B的含量比对照组低约25倍；迷迭香酸的含量在过表达组中比对照组高约4倍，干扰组比对照组低约3倍。可得出NAC1转录因子可使丹参中丹酚酸类物质含量增高。
3.NAC1转录因子调节合成丹酚酸类物质的相关酶的表达
为了探究NAC1转录因子是否对丹参中丹酚酸类物质的合成起到调节作用，我们对丹酚酸类物质合成通路上的两个关键酶PAL和TAT进行了研究。首先，我们测了这两个酶的活力，如图8所示，与对照组相比，过表达根系中PAL和TAT酶的明显升高，RNAi干扰组这两种酶活力降低明显。然后，我们检测这两种酶基因(SmPAL3和SmTAT3)的转录水平(图9)，与酶活力结果一致，过表达根系酶活力升高明显，RNAi干扰组酶活力降低也明显。由此推测，NAC1转录因子可能与PAL和TAT基因启动子结合来调节这两种酶的表达。为了证实这一假说，我们采用CHIP-PCR进行验证(图10)，由图可得出NAC1转录因子确实与基因PAL和TAT的启动子相结合，通过调节这两种基因的表达，调节丹酚酸类物质的合成。
实验证明NAC1通过调控酪氨酸氨基转移酶(SmTAT)和苯丙氨酸解氨酶(SmPAL)的基因表达和酶活力来影响丹酚酸类物质的合成与产量。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。

Claims (1)

1.丹参NAC1转录因子在提高丹参中丹酚酸类化合物含量方面的应用，所述丹酚酸类化合物为丹酚酸B或迷迭香酸，所述丹参NAC1转录因子的序列对应于如下引物PCR扩增出的序列：
上游引物序列：5'-CCGGATCCATGACTCAATCCCAGGAG-3'；
下游引物序列：5'-CCACTAGTGTTTGTGAGCTCCATAATGGC-3'。
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