CN108517323A - 一种丹参AP2转录因子SmERF128编码序列及克隆方法与应用 - Google Patents

一种丹参AP2转录因子SmERF128编码序列及克隆方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及丹参AP2转录因子SmERF128编码序列的克隆及其应用，属于基因工程技术领域。具体包括基因SmERF128的克隆、构建基因SmERF128的过表达及RNAi载体并遗传转化丹参叶片获得转基因毛状根、qRT‑PCR检测SmERF128及丹参酮生物合成途径关键酶基因的表达情况、丹参酮生物合成途径关键酶基因启动子序列分析、超高效液相色谱法(UPLC)测定阳性转基因毛状根中丹参酮的含量。本发明公开了SmERF128能够结合GCC box、RAA和CBF2顺式作用元件。本发明证明SmERF128通过上调丹参酮合成途径关键酶基因的表达，从而显著提高丹参酮的含量，为丹参遗传育种提供基因资源。

Description

一种丹参AP2转录因子SmERF128编码序列及克隆方法与应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种丹参AP2类转录因子编码序列SmERF128及其应用。
背景技术
药用植物作为中药和世界传统药物的主要来源，面临着资源稀缺和活性成分含量低等问题，研究人员一直在探索有效提高次生代谢产物积累的方法。研究发现次生代谢产物的产生和积累具有一定规律，比如次生代谢产物通常会在特定时间和空间产生并积累，其次，当植物受到刺激(微生物侵染、动物攻击或诱导子激发)时会产生大量的次生代谢产物。以上过程以及代谢产物合成途径关键酶基因的转录都在不同水平上受到严格的调控，其中通过转录因子调控活性成分合成途径酶基因表达已被广泛研究并成为实现定向、高效调节活性成分合成的有效手段之一。
转录因子AP2家族是植物最大转录因子家族之一，具有调控药用植物活性成分生物合成、发育、胁迫响应等功能。已报道转录因子AP2调控青蒿素、萜类生物碱的生物合成，但AP2转录因子是否对丹参酮的合成具有调控作用尚未见公开报道。因此，克隆能调控丹参酮生物合成途径关键酶基因表达的AP2转录因子，对于改良并提高丹参中丹参酮的含量具有重要的意义。
发明内容
本发明提供了一种丹参AP2类转录因子编码序列，该编码序列记为SmERF128，SmERF128的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供了一种丹参AP2类转录因子编码序列，SmERF128编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明提供了一种丹参酮生物合成途径关键酶基因SmCPS1的启动子序列，SmCPS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明提供了一种丹参酮生物合成途径关键酶基因SmKSL1的启动子序列，SmKSL1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明提供了一种丹参酮生物合成途径关键酶基因SmCYP76AH1的启动子序列，SmCYP76AH1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明公开了上述丹参AP2类转录因子SmERF128能够结合GCC box、RAA和CBF2顺式作用元件。
本发明提供了上述丹参AP2类转录因子编码序列SmERF128的克隆方法，包括以下步骤：
步骤1.总RNA的提取与纯化，采用各种通用的植物总RNA提取试剂盒提取并纯化获得丹参根的总RNA；
步骤2.用反转录酶将所述丹参根的总RNA反转成cDNA；
步骤3.以所述cDNA为模板，通过设计基因特异引物，采用PCR的方法扩增，获得PCR产物，所述基因特异引物为：
正向引物P1：5’-ATGGCGTTTTGTGACGAAG-3’
反向引物P2：5’-CTAGGAGGTGTGTGTGGGGA-3’
步骤4.PCR产物回收纯化测序，获得如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
本发明提供一种构建过表达和RNAi载体的方法，包括以下步骤：
步骤1.根据SEQ ID NO.1序列设计180-200bp的RNAi片段引物及过表达引物，引物序列如下：
步骤2.选择Takara PyrobestTM DNA Polymerase(Cat.R005A)从测序的T-载体上扩增，PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收目的条带；
步骤3.采用Gateway法分别构建RNAi载体pK7GWIWG2D(II)-SmERF128和过表达载体pK7WG2D-SmERF128。
本发明的另一目的在于提供丹参AP2类转录因子SmERF128在提高丹参毛状根中丹参酮含量的应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：本发明从丹参中分离克隆出633bp的SmERF128基因，构建植物表达载体，以发根农杆菌ACCC10060为介导，侵染丹参叶片获得毛状根；抗生素筛选及GFP荧光检测目的基因SmERF128的整合情况；qRT-PCR分析插入目的基因SmERF128及丹参酮生物合成相关基因在毛状根中的表达情况；超高效液相测定转基因毛状根中丹参酮的含量。
本发明还提供了一种鉴定SmERF128与GCC box、RAA和CBF2顺式作用元件结合的方法，该方法包括以下步骤：
步骤1.分别合成3×GCC box、3×RAA和3×CBF2序列，并在3’端进行荧光标记；
步骤2.纯化SmERF128蛋白；
步骤3.微量热涌动(MST)技术分析上述SmERF128蛋白与步骤1中GCC box、RAA和CBF2序列的结合常数。
以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。
附图说明
图1为定量PCR检测SmERF128转基因丹参毛状根中SmERF128和丹参酮生物合成相关基因表达量的结果；＊，P＜0.05(T检验)。
图2为UPLC分析SmERF128转基因丹参毛状根株系中的丹参酮含量；＊，P＜0.05(T检验)。
图3为微量热涌动(MST)技术分析SmERF128蛋白与GCC box、RAA和CBF2序列的结合常数。
具体实施方式
下面结合具体实施实例，进一步阐述本发明。下列实施实例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆(Sambrook等)中所述的条件，或按照制造厂商所提供的试剂或试剂盒所附带的说明书建议的条件。
实施例1：丹参SmERF128基因的克隆
1.1.丹参总RNA的提取
取少量丹参(采用产于药用植物研究所丹参品种99-3)根，用液氮速冻后，迅速用研钵研碎，然后按照TIANGEN公司提供的RNAprep Pure Plant Kit使用说明书提取总RNA。用普通琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，然后用分光光度计检测其纯度和浓度。
1.2.丹参SmERF128基因的克隆
以提取的总RNA为模板(1μg)，按照反转录试剂盒PrimeScriptTM II 1st StrandcDNA Synthesis Kit(Cat.6210A)说明书的方法，反转录生产第一链cDNA；通过设计的特异引物，以cDNA为模板进行PCR扩增，特异引物序列如下：
正向引物P1：5’-ATGGCGTTTTGTGACGAAG-3’
反向引物P2：5’-CTAGGAGGTGTGTGTGGGGA-3’
PCR反应总体积为50μL，0.5μL Takara Ex Taq DNA polymerase，5μL 10×Ex TaqBuffer，2μL primer(F/R)(10μM)，4μL dNTP Mixture，2μL cDNA samples，RNase-freeddH2O补齐50μL。PCR反应体系为：反应条件为：95℃ 30S；30clycles：95℃ 5sec；60℃34sec；72℃ 2min；72℃ 10min；10℃保存。将PCR产物经回收纯化后，连接Takara pMD18-T载体并测序，获得pMD18-T-SmERF128质粒载体。测序结果得到了完整的SmERF128转录因子基因的编码框序列(如SEQ ID NO.1所示)。
实施例2：含丹参SmERF128基因的过表达及RNAi载体的构建
2.1.中间载体的构建
根据SEQ ID NO.1提供的序列设计180-200bp的RNAi片段引物及过表达引物，选择Takara PyrobestTM DNA Polymerase(Cat.R005A)从测序的T-载体上扩增，attBPCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收目的条带。RNAi片段PCR产物和过表达片段PCR产物回收纯化后通过Gateway克隆技术的方法连接到PDONR221载体，具体方法按照Invitrogen公司BP Clonase II Enzyme Mix克隆试剂盒说明书进行。
2.2.RNAi载体及过表达载体的构建
按照Invitrogen公司LR Clonase II Enzyme Mix试剂盒将中间载体pDONR-RNAis与pK7GWIWG2D(II)受体载体进行LR反应；将中间载体pDONR-SmERF128与pK7WG2D受体载体进行LR反应；分别放置于25℃金属浴反应3小时后转化大肠杆菌DH5α感受态，进行阳性克隆PCR验证，最终获得包含有目的基因的RNAi载体pK7GWIWG2D(II)-SmERF128和过表达载体pK7WG2D-SmERF128。
实施例3：发根农杆菌介导的丹参SmERF128基因遗传转化丹参叶片获得转基因丹 参毛状根
3.1.含植物表达载体的发根农杆菌的获得
分别将实施例2中含SmERF128基因的植物过表达载体pK7WG2D-SmERF128和RNAi载体pK7GWIWG2D(II)-SmERF128转入发根农杆菌ACCC10060中，挑取单克隆菌落进行PCR验证。
3.2.发根农杆菌侵染丹参叶片
3.2.1.外植体的预培养
选取生长旺盛、幼嫩丹参无菌苗，将叶片剪成0.5×0.5cm2的小块置于MS固体培养基上，于25℃左右黑暗的条件下预培养2-3天。
3.2.2.农杆菌与外植体的共培养
含有植物表达载体的发根农杆菌接种YEB培养基(50mg/L Spec+50mg/L Rif)中，28℃摇床至OD600＝0.5。将菌液倒入无菌离心管中，6000rpm离心10min，弃上清夜，用15-20mL的MS液体培养基重悬沉淀菌体。将预培养材料放入MS重悬液中，浸染10min，取出外植体，用无菌滤纸吸去菌液，放入新的MS固体培养基上，于25℃黑暗中共培养48-72h。
3.2.3.毛状根的诱导和继代培养
将上述共培养的叶盘于含400mg/L cb的无菌水冲洗10min，转接到MS固体培养基(50mg/L Kan+400mg/L cb)中，25℃暗培养2-3周左右。选择生长迅速长至2.0cm～3.0cm的抗性毛状根，将其切下，转入MS固体培养基(50mg/L Kan+400mg/L cb+0.1mg/L IAA)，IAA可以刺激毛状根长愈伤组织，培养一周左右后，将阳性根转入MS培养基(15mg/L Kan+200mg/Lcb)恢复培养，此时毛根会长出许多侧根，有益于加快生长。待生长出大量侧根后转移至液体6，7-V培养基于25℃黑暗中120rpm摇床培养。
3.3.转基因丹参毛状根的鉴定
培养阳性毛状根在ZEISS倒置荧光显微镜下呈绿色荧光，然后扩大培养。
实施例4：QRT-PCR检测转基因丹参毛状根中相关基因的表达
4.1.毛状根液体培养
实例3转基因毛状根培养60天后，取适量新鲜毛状根液氮冷冻后保存于-80℃用于RNA提取。
4.2.转基因丹参毛状根的QRT-PCR检测
根据SEQ ID NO.1提供的序列设计QRT-PCR引物用于检测丹参毛状根中SmERF128基因的表达情况，同时检测丹参酮生物合成途径中的相关基因SmDXS2，SmDXR，SmMCT，SmCMK，SmMDS，SmHDS，SmHDR1，SmCPS1，SmKSL1，SmCYP76AH1，看家基因Actin用来作为内参。QRT-PCR结果显示：SmERF128基因在过表达株系中的表达量明显提高，而SmERF128基因在RNAi株系中的表达量明显降低(见图1)；丹参酮生物合成途径中的相关基因中的SmCPS1，SmKSL1，SmCYP76AH1与SmERF128基因的表达成正相关性(见图1)，所以预测SmCPS1，SmKSL1，SmCYP76AH1基因可能是SmERF128基因的调控靶点。
QRT-PCR引物如下：
实施例5：利用UPLC测定转基因丹参毛状根中丹参酮含量
5.1.毛状根中丹参酮的提取
将培养4个月的毛状根烘干至恒重，研磨成粉末，称取1g毛状根粉末于20mL离心管中，加入5mL甲醇，超声30min，室温，避光，过夜静置，12000rpm，离心10min，吸取上清萃取液用0.22μm的滤膜过滤后待测。
5.2.毛状根中丹参酮含量的UPLC测定
将二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA标准品分别用分析纯甲醇配置成1mg/mL的浓度。上述0.22μm滤膜过滤后的丹参酮粗提物各取100μL，注入高效液相色谱仪。色谱条件为：ACQUITYBEH C18色谱柱(2.1×100mm，1.7μm)；流动相75％甲醇：25％水；柱温为30℃；流速为0.25mL/min；检测波长为255nm。记录各丹参酮组分的峰面积，代入线性回归方程后，计算即得样品丹参酮含量。
在本发明中，SmERF128过表达丹参毛状根株系中所检测的4种丹参酮(二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA)含量比对照组的含量明显提高(见图2A)；SmERF128-RNAi丹参毛状根株系中所检测的4种丹参酮(二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA)含量比对照组的含量明显降低(见图2B)。
实施例6：微量热涌动(MST)技术检测SmERF128结合GCC box、RAA和CBF2顺式作用 元件
6.1.标记GCC、RAA和CBF2核酸样品的制备
金唯智公司合成3×GCC，3×RAA，3×CBF2核酸序列，并在3’端标记FAM，引物序列如下：
6.2.SmERF128蛋白样品梯度稀释
拿出16个PCR管，先把10μL Tris-HCl加入第2-16管中，再分别加入SmERF128蛋白，取10μL SmERF128蛋白加入第一和第二个PCR管中。第2个PCR管中的混合液用枪混匀，从第2管中吸取10μL加入第3管中，用枪混匀，换枪头，以此类推，直至完成，最后一管混匀后弃掉10μL。
6.3.荧光扫描
将标记好的核酸进行荧光扫描，通过稀释浓度使荧光强度处于400-1500之间。向1-16号管的SmERF128蛋白中分别加入10μL稀释好的GCC box核酸，混匀后在室温孵育30min。将1-16号FAM-GCC-SmERF128样品利用虹吸现象吸入标准毛细管中并放置于Monolith NT.115微量热泳动仪进行测定。LED颜色选择BLUE，强度选择40％；MST强度选择20％；测量温度设置为25℃，时间设置为30sec。三次独立测量后用NT Analysis软件处理数据。FAM-RAA-SmERF128和FAM-CBF2-SmERF128样品的制备及荧光扫描同上。
在本发明中，SmERF128与GCC box的解离常数为13.89±3.30μM，SmERF128与CBF2的解离常数为57.68±0.22μM，SmERF128与RAA的解离常数为199±102.83μM，说明SmERF128与GCC box的结合能力高于SmERF128与CBF2或RAA的结合能力。上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种丹参AP2类转录因子编码序列，其特征在于所述编码序列记为SmERF128，所述SmERF128的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种丹参AP2类转录因子编码序列，其特征在于所述SmERF128编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的丹参AP2类转录因子编码序列SmERF128的克隆方法，其特征在于，所述克隆方法包括以下步骤：
步骤1.总RNA的提取与纯化，采用各种通用的植物总RNA提取试剂盒提取并纯化获得丹参根的总RNA；
步骤2.用反转录酶将上述丹参根的总RNA反转成cDNA；
步骤3.以上述cDNA为模板，通过设计基因特异引物，采用PCR的方法扩增，获得PCR产物，所述基因特异引物为：
正向引物P1：5’-ATGGCGTTTTGTGACGAAG-3’
反向引物P2：5’-CTAGGAGGTGTGTGTGGGGA-3’
步骤4.PCR产物回收纯化测序，获得如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
4.一种转SmERF128基因调控丹参毛状根中丹参酮含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1.将权利要求3所获得的SmERF128基因分别构建过表达和RNAi载体；
步骤2.将SmERF128过表达及RNAi载体转化发根农杆菌ACCC10060，获得用于转化丹参的发根农杆菌菌株；
步骤3.将发根农杆菌菌株转化丹参叶片，获得经抗生素筛选、GFP荧光检测为阳性的转基因丹参毛状根；
步骤4.RT-PCR测定转基因毛状根中SmERF128基因及丹参酮生物合成相关基因的相对表达量；
步骤5.超高效液相色谱(UPLC)测定转基因毛状根中丹参酮含量。
5.根据权利要求4所述的一种转SmERF128基因调控丹参中丹参酮含量的方法，其特征在于，步骤5所述的超高效液相色谱法(UPLC)如下：
ACQUITYC18色谱柱，流动相甲醇和水；检测波长255nm，柱温30℃，流速0.25mL/min，进样量5μL。
6.丹参酮生物合成途径关键酶基因启动子序列分析，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1.根据丹参酮生物合成途径关键酶基因SmCPS1、SmKSL1和SmCYP76AH1的启动子序列设计引物，采用基因克隆的方法分别获得启动子序列，所述的启动子序列如SEQ NO.3，SEQ NO.4，SEQ NO.5所示；
步骤2.利用PlantCARE软件分析上述启动子序列中的AP2转录因子结合位点。
7.一种证明SmERF128能够结合GCC box、RAA和CBF2顺式作用元件的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1.分别合成GCC box、RAA和CBF2序列，并在3’端进行荧光标记；
步骤2.纯化SmERF128蛋白；
步骤3.微量热涌动(MST)技术分析SmERF128蛋白与GCC box、RAA和CBF2序列的结合能力。
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