CN110760489A - 一种川芎咖啡酸-o-甲基转移酶的突变体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种川芎咖啡酸‑O‑甲基转移酶突变体及其用途，属于生物工程技术领域。突变体的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示；突变体的获得是基于发现318位氨基酸是影响活性的一个关键位点并用定点突变将其318位的异亮氨酸残基(I)突变成苏氨酸残基(T)；利用生物工程技术将突变体重组蛋白表达纯化分离出来。转移酶突变体的应用会明显提高作为催化剂时的咖啡酸甲酯转化效率，在酶法合成阿魏酸甲酯的方法中具有较好的应用前景。

Description

一种川芎咖啡酸-O-甲基转移酶的突变体及其用途

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种川芎咖啡酸-O-甲基转移酶的突变体及其用途。

背景技术

阿魏酸甲酯是一种紫外吸收剂，其对280nm～360nm波长的紫外线有良好的吸收能力且吸收率高，具有抗氧化、美白与消炎等功效。比如，在化妆品加入阿魏酸甲酯，不仅能够起到美白作用，长期使用还能够使皮肤具有绢质感。并且，阿魏酸甲酯还可作为强效美白剂阿魏酸异辛酯的合成中间体。最后，阿魏酸甲酯也是一个重要的医药中间体。

本课题组在前1个申请专利即“一种酶法合成阿魏酸甲酯的方法(申请号201910261291.2)”中，首次提出以川芎咖啡酸-O-甲基转移酶(Ligusticumchuanxiongcaffeic acid O-methyltransferase，以下均简写为LcCOMT) 为催化剂，以咖啡酸甲酯和S-腺苷甲硫氨酸为底物，采用体外酶促反应合成阿魏酸甲酯，从而为阿魏酸甲酯的制备提供了一种新的方法。

本发明精准分析LcCOMT的三维结构，预测318位的异亮氨酸残基改变后可能对酶活性产生影响。因此，课题组将318位的异亮氨酸突变为苏氨酸残基，获得LcCOMT-I318T突变体。相比于野生型LCCOMT，LcCOMT-I318T突变体的转化效率明显提高，具有更低的Km值，更高的Vmax及Kcat值。

发明内容

本发明的目的是提供一种川芎咖啡酸-O-甲基转移酶的突变体(以下均简称为LcCOMT-I318T突变体)。与野生型LcCOMT比较，LcCOMT-I318T突变体的酶促活性更高，对咖啡酸甲酯具有更低的Km值、更高的Vmax值及Kcat值。该突变体的主要用途，能够为酶促反应合成阿魏酸甲酯提供活性更高的优质酶源，从而降低使用成本。

实现上述目的的技术措施是：

本发明提供了一种川芎咖啡酸-O-甲基转移酶LcCOMT-I318T突变体，所述突变体命名为LcCOMT-I318T，其氨基酸序列如序列表SEQID No.2所示。

还提供了所述川芎咖啡酸-O-甲基转移酶突变体LcCOMT-I318T的核苷酸序列，所述核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。

所述的咖啡酸-O-甲基转移酶突变体LcCOMT-I318T的氨基酸序列，利用定点突变将LcCOMT中第318位的异亮氨酸残基(I)突变成苏氨酸残基(T)。

本发明将上述突变体的核苷酸编码序列构建成重组载体，并在大肠杆菌BL2 高效表达，获得重组菌株，通过发酵、提取等技术获得重组蛋白。所述表达载体为LcCOMT-I318T-pET28a质粒，宿主细胞为大肠杆菌BL21。

本发明还提供了在一种快速生物合成阿魏酸甲酯工艺领域中的用途。

本发明所涉及的技术措施还包括LcCOMT-I318T突变体重组载体的构建； LcCOMT-I318T突变体重组菌株的获得；LcCOMT-I318T突变体的表达纯化； LcCOMT-I318T突变体的酶活检测等部分。

(1)LcCOMT-I318T突变体重组载体的构建

1.1从大肠杆菌DH5α中提取LcCOMT-pET28a质粒，该质粒构建方法请见本课题组先前申请的专利(一种酶法合成阿魏酸甲酯的方法，申请号 201910261291.2)。

1.2设计突变引物，以LcCOMT-pET28a质粒为模板，利用购于诺唯赞的Mut ExpressII Fast Mutagenesis Kit V2试剂盒构建LcCOMT-I318T-pET28a突变体质粒。

(2)LcCOMT-I318T突变体重组菌株的获得

2.1突变质粒LcCOMT-I318T-pET28a转入感受态大肠杆菌BL21，50mg/L卡那霉素的LB固体培养基平板抗性筛选及测序确认开放阅读框无误，获得含有 LcCOMT-I318T-pET28a的基因工程菌；

(3)LcCOMT-I318T突变体表达

表达条件：37℃，200rpm将重组菌株培养至OD600＝0.6～0.8；加入IPTG，使其终浓度为0.3mM/L，23-25℃培养8～10h；培养基配方为蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L；蒸馏水溶解后，高温高压灭菌。

(4)LcCOMT-I318T突变体纯化

4.1将步骤3中得到的菌液于4℃，5000g，离心10min离心收集菌体；

4.2用10mL Tris-HCl，pH7.9的缓冲液(20mM咪唑、10mMTris-HCl，pH 7.9，500mMNaCl)重悬菌体，超声裂解菌体(超声程序为60W，工作3s、暂停3s，冰浴条件下超声30min。超声完成后，离心(4℃，13000g，10min)去除细胞碎片，收集上清液；

4.3将上清液加入镍离子亲和层析柱，4℃结合2h后，流出穿透液；

4.4用20mL的结合液洗脱非特异结合的杂蛋白，结合液配方为60mM咪唑， 10mMTris-HCl，pH 7.9，500mMNaCl，然后用5mL的洗脱液洗脱LcCOMT-I318T 突变体，洗脱液配方为200mM咪唑，10mM Tris-HCl，pH 7.9，500mM NaCl，得到LcCOMT-I318T突变体溶液；

4.5将LcCOMT-I318T突变体溶液在透析液中进行第1次透析，透析液配方为 2mMTris-HCl，pH 7.4，10％甘油，β-巯基乙醇0.5mM，250mM NaCl，透析袋截留分子量为8000-14000；4-5h后更换透析液，进行第二次透析，第2次透析液成分：2mM Tris-HCl，pH 7.4，10％甘油，β-巯基乙醇0.5mM，150mM NaCl； 4-5h后，更换透析液，进行第2次透析，第3次透析液成分与第2次透析液成分相同，透析12-16h，收集透析袋中的蛋白液，获得LcCOMT-I318T突变体。

(5)LcCOMT-I318T突变体的酶活检测

5.1酶活反应体系包括突变体，S-腺苷甲硫氨酸，咖啡酸甲酯，二硫苏糖醇， 200mMTris-HCl，pH 7.0，总体积为10mL，反应温度为37℃，反应结束后，加如1mL浓盐酸终止反应；

5.2向反应液中加5mL乙酸乙酯萃取，收集萃取液；再重复萃取两次，合并萃取液，将萃取液转移到圆底烧瓶，通过旋蒸使其完全蒸发，溶质析出附着于圆底烧瓶内；

5.3向烧瓶内加入溶液(甲醇：甲酸＝95:5)洗涤烧瓶，使溶质溶解，收集洗涤液。再用溶液(甲醇：甲酸＝95:5)洗涤烧瓶数次，收集合并所有洗涤液，定容至5mL，作为样品待检测；

5.4HPLC检测，将上步待测样品过0.45μm滤头后，作为HPLC样品，流动相为甲醇：0.1％磷酸＝45:55，流速1mL/min，柱温30℃，检测波长330nm。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明提供了一种新的突变体。

2、该突变体具有更高的转化效率，对咖啡酸甲酯具有更低的Km值、更高的Vmax 及Kcat值，能够提高阿魏酸甲酯的合成效率，降低成本。

附图说明

图1获得LcCOMT-I318T突变体的方法流程图；

图2本发明实施例提供的咖啡酸甲酯和阿魏酸甲酯标准品的色谱峰图；

图3本发明实施例提供的LcCOMT-I318T突变体催化反应样品的色谱峰图；

图4本发明实施例LcCOMT-I318T突变体的双倒数曲线图。

术语解释：

LcCOMT：来自川芎的咖啡酸-O-甲基转移酶：Ligusticum chuanxiong Caffeicacid-O-methyltransferase；

LcCOMT-I318T：川芎咖啡酸-O-甲基转移酶的一种突变体，将LcCOMT第318位的异亮氨酸残基(I)点突变成苏氨酸残基(T)。

具体实施方式

结合附图与实施例对本发明做进一步的具体的说明。

图1概括的描述本发明所说的川芎咖啡酸-O-甲基转移酶突变体的获得过程，包括LcCOMT-I318T突变体重组载体的构建；LcCOMT-I318T突变体重组菌株的获得；LcCOMT-I318T突变体表达；LcCOMT-I318T突变体的纯化；

LcCOMT-I318T突变体的酶活检测等。

实施例1：LcCOMT-I318T突变体重组载体的构建

1.1从本课题组构建的保存于实验室的含LcCOMT-pET28a的大肠杆菌DH5中提取LcCOMT-pET28a质粒；

1.2设计突变引物：设计突变引物如下：

正向引物：GATGTTACGATGCTTGCACATAATCCTGGCGG

反向引物：GCAAGCATCGTAACATCTATATGAATGACATTCTTGGTTGTAAG

1.3扩增突变质粒

利用诺唯赞的Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2试剂盒构建突变质粒LcCOMT-I318T-pET28a质粒。PCR反应体系如下：

PCR扩增条件如下：

1.4消除模板质粒

PCR完成后，按照45μL PCR扩增产物加入Dpn I酶1μL，37℃消化1.5h，消除模板质粒。

1.5重组反应

加入Dpn I消化产物120ng，H₂O 20μL，5x CEⅡBuffer4μL，ExnaseⅡ2μL， 37℃反应30min，获得重组突变质粒LcCOMT-I318T-pET28a。

实施例2：LcCOMT-I318T突变体重组菌株的获得

2.1取10μL重组质粒LcCOMT-I318T-pET28a与100μL感受态大肠杆菌BL21细胞混合，冰浴30min。然后42℃金属浴热激90s，再冰浴5min。

2.2加入800μL LB液体培养基，于37℃，200rpm摇床培养45min。

2.3 5000rpm离心3min，吸去800μL上清，将剩余菌体重悬，涂布于含有50mg/L 卡那霉素的平板中筛选阳性克隆；

2.4阳性菌株测序，确认阅读框无误，得到重组菌株。

实施例3：LcCOMT-I318T突变体表达

表达条件：37℃，200rpm将重组菌株培养至OD600＝0.6～0.8；加入IPTG至终浓度为0.3mM，23-25℃培养8～10h；培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L， NaCl 10g/L；蒸馏水溶解后，高温高压灭菌；

实施例4：LcCOMT-I318T突变体的纯化

4.1将实施例3中得到的重组菌于4℃，5000g，离心10min离心收集菌体；

4.2用10mL 20mM的Tris-HCl，pH7.9的缓冲液(20mM咪唑，10mM Tris-HCl， pH7.9，500mMNaCl)重悬菌体，超声裂解菌体，超声程序为60W，工作3s，暂停3s，冰浴条件下超声30min；4℃，13000g离心去除细胞碎片，收集上清液；

4.3将上清液加入镍离子亲和层析柱，4℃结合2h后，流出穿透液；

4.4用20mL的结合液洗脱杂蛋白，结合液配方为60mM咪唑、10mM Tris-HCl， pH7.9，500mMNaCl，然后用5mL的洗脱液洗脱目的蛋白，洗脱液配方为200mM 咪唑，10mM Tris-HCl，pH 7.9，500mMNaCl，得到LcCOMT-I318T突变体溶液；

4.5将LcCOMT-I318T突变体溶液在透析液中进行第一次透析，透析液成分是： 2mMTris-HCl，pH 7.4，10％甘油，β-巯基乙醇0.5mM，250mMNaCl，透析袋截留分子量为8000-14000；4-5h后更换透析液，进行第二次透析，第二次透析液成分：2mM Tris-HCl，pH 7.4，10％甘油，β-巯基乙醇0.5mM，150mM NaCl； 4-5h后，更换透析液，进行第三次透析，第三次透析液成分与第二次透析液成分相同，透析12-16h，收集透析袋中的蛋白液，获得LcCOMT-I318T突变体。

4.6野生型LcCOMT的表达与纯化

LcCOMT野生型酶的表达与纯化方法同LcCOMT-I318T突变体。

实施例5：LcCOMT-I318T突变体的酶活检测

5.1酶活反应体系

酶活反应体系总体积为10mL，分别加入咖啡酸甲酯(200μM)，S-腺苷甲硫氨酸(1mM)，二硫苏糖醇(1mM)，200mM Tris-HCl，pH 7.0，野生型与突变体分别为10μg/mL，37℃条件下反应25min，反应完成后，加入1mL浓盐酸终止反应。反应表达式如下：

5.2阿魏酸甲酯的提取

向5.1中的反应液加入5mL乙酸乙酯萃取，收集萃取液(重复两次)，合并萃取液，共计15mL，将萃取液转移至圆底烧瓶，旋蒸获得溶质。

少量多次加入阿魏酸提取试剂(甲醇：甲酸＝95:5)溶解溶质，即为阿魏酸甲酯提取液，收集合并并定容至5mL，过0.45μm滤膜，作为样品待HPLC检测。 5.3阿魏酸甲酯的HPLC检测与转化率

HPLC为安捷伦1260I型高效液相色谱仪，色谱柱采用依利特公司的Hypersil ODS2反相层析柱(4.6mm×200mm，,5μm)。HPLC流动相为甲醇：0.1％磷酸＝45:55，流速1mL/min，柱温30℃，检测波长330nm。

LcCOMT-I318T突变体催化反应后，供试品的色谱图如图3，咖啡酸甲酯与阿魏酸甲酯的保留时间分别为4.45min和6.40min，与标准品保留时间(图2)一致，说明成功转化合成了阿魏酸甲酯。根据咖啡酸甲酯与阿魏酸甲酯的峰面积计算咖啡酸甲酯的转化率。结果显示反应25min后，野生型LcCOMT的转化率为 68.68％，LcCOMT-I318T突变体的转化率为83.7％。

5.4动力学参数值测定

参考5.3方法，分别加入0.25，0.1665，0.125，0.1，0.0835，0.0715(mM) 等不同浓度的咖啡酸甲酯，测定不同底物浓度下的反应速率，根据双倒数法(图 4)分别测定野生型LcCOMT与LcCOMT-I318T突变体的Km与Vmax，并最终确定Kcat。

结果显示野生型LcCOMT的Km，Vmax与Kcat值分别为0.02643，2.643*10^-8M/S 与0.113S^-1。LcCOMT-I318T突变体的Km，Vmax与Kcat值分别为0.0197，

4.392*10-8M/S与0.188S-1。相较于野生型LcCOMT，LcCOMT-I318T突变体对底物亲和力更高，最大反应速度更高，同时具有更高的Kcat值，表明突变体的催化效率更高，是更优的酶，能够降低应用过程中的成本。

SEQUENCE LISTING

<110> 西南交通大学

<120> 一种川芎咖啡酸-O-甲基转移酶COMT的突变体

<130> SEQID No.2

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 362

<212> PRT

<213> COMT-I318T氨基酸序列

<400> 1

Met Asn Thr Glu Leu Ile Pro Pro Thr Phe Leu Glu Asp Glu Glu Glu

1 5 10 15

Glu Ala Cys Met Phe Ala Met Gln Leu Ser Ser Ala Ser Val Leu Pro

20 25 30

Met Val Leu Lys Ser Ala Ile Glu Leu Asn Leu Leu Glu Ser Ile Ala

35 40 45

Lys Ala Gly Pro Gly Val Tyr Val Ser Pro Ser His Leu Ala Ala Gly

50 55 60

Leu Pro Ser Ser Gln Pro Asp Thr Pro Val Met Leu Asp Arg Ile Leu

65 70 75 80

Arg Leu Leu Ala Ser Tyr Ser Val Leu Asn Cys Gln Leu Arg Asp Leu

85 90 95

Pro Gln Gly Arg Val Glu Arg Leu Tyr Gly Leu Ala Pro Val Cys Lys

100 105 110

Phe Leu Thr Lys Asn Ser Asp Gly Val Ser Met Ala Pro Leu Leu Leu

115 120 125

Met Asn Gln Asp Lys Ile Leu Met Glu Ser Trp Tyr His Leu Lys Asp

130 135 140

Ala Val Leu Asp Gly Gly Ile Pro Phe Asn Lys Ala Tyr Gly Met Thr

145 150 155 160

Ala Phe Glu Tyr His Gly Lys Asp Pro Arg Phe Asn Lys Val Phe Asn

165 170 175

Gln Gly Met Ser Asn His Ser Thr Ile Thr Met Lys Lys Ile Leu Gln

180 185 190

Thr Tyr Asp Gly Phe Gly Gly Leu Lys Thr Val Val Asp Val Gly Gly

195 200 205

Gly Thr Gly Ala Thr Leu Asn Met Ile Ile Ser Lys Tyr Pro Asn Leu

210 215 220

Lys Gly Ile Asn Phe Asp Leu Pro His Val Val Glu Asp Ala Pro Ser

225 230 235 240

Tyr Pro Gly Val Glu His Val Gly Gly Asp Met Phe Val Ser Val Pro

245 250 255

Lys Gly Asp Ala Ile Phe Met Lys Trp Ile Cys His Asp Trp Ser Asp

260 265 270

Ala His Cys Leu Thr Phe Leu Lys Asn Cys Tyr Lys Ala Leu Pro Lys

275 280 285

Asp Gly Lys Val Ile Leu Ala Glu Cys Ile Leu Pro Glu Ala Pro Asp

290 295 300

Ser Lys Leu Thr Thr Lys Asn Val Ile His Ile Asp Val Thr Met Leu

305 310 315 320

Ala His Asn Pro Gly Gly Lys Glu Arg Thr Glu Lys Asp Phe Glu Ala

325 330 335

Leu Gly Lys Glu Ala Gly Phe Lys Ser Phe Asn Lys Ala Cys Cys Ala

340 345 350

Tyr Asn Thr Trp Val Ile Glu Tyr Tyr Lys

355 360

SEQ ID No.1 SEQUENCE LISTING

<110> 西南交通大学

<120> 一种川芎咖啡酸-O-甲基转移酶COMT的突变体

<130> COMT-I318T

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1089

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atgaatacgg agctgatccc accaacattc ctagaagatg aagaagaaga agcttgcatg 60

tttgccatgc aattatcaag tgcttctgta ttgcctatgg ttctcaaatc agccattgag 120

cttaatcttc tcgagtccat agctaaagct ggtcctggtg tttatgtttc gccttctcat 180

cttgcggctg ggcttccttc cagccaacct gacacgcctg ttatgcttga ccgcatcctc 240

cgcctcctgg ccagctactc tgtgctcaac tgtcaacttc gtgacctgcc tcaaggtcgg 300

gtcgagcgcc tttatggact ggctcctgtg tgcaagttct tgactaaaaa ctctgatggt 360

gtgtctatgg cgccactttt gctcatgaac caagacaaaa tccttatgga gagctggtat 420

cacctgaaag atgctgttct agatggtgga atacctttta acaaggcata tggaatgaca 480

gcatttgagt accatggcaa agatcccaga tttaacaaag tctttaacca gggaatgtcc 540

aatcattcta ctataactat gaagaaaatc ctccaaacat atgacggatt tggcggtctc 600

aaaactgtgg tggatgttgg cggaggcacc ggagccaccc ttaatatgat tatttctaaa 660

taccctaatc tcaaagggat taactttgat ctccctcatg ttgttgaaga tgctccatct 720

tatcctggtg tggagcatgt tggaggtgac atgtttgtta gcgtgcccaa aggggatgct 780

attttcatga agtggatatg tcacgattgg agcgatgcac attgtctgac attcttgaag 840

aactgctata aggcacttcc aaaggatgga aaggtgatac tagcagaatg cattcttcca 900

gaggctccag actccaaact tacaaccaag aatgtcattc atatagatgt tacgatgctt 960

gcacataatc ctggcggaaa agaaagaact gagaaagatt ttgaggcctt gggaaaagag 1020

gctggtttca aaagctttaa caaggcctgc tgtgcttata acacttgggt tattgaatat 1080

tataaatag 1089

Claims (6)

1.一种川芎咖啡酸-O-甲基转移酶的突变体，其特征在于，所述突变体命名为LcCOMT-I318T，其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

2.根据权利要求1所述川芎咖啡酸-O-甲基转移酶突变体LcCOMT-I318T的核苷酸序列，所述核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。

3.根据权利要求1所述的咖啡酸-O-甲基转移酶突变体LcCOMT-I318T的氨基酸序列，利用定点突变将LcCOMT中第318位的异亮氨酸残基(I)突变成苏氨酸残基(T)。

4.根据权利要求1所述LcCOMT-I318T突变体的用途，其特征在于，应用于快速生物合成阿魏酸甲酯工艺领域。

5.一种包含权利要求3所述的编码序列的表达载体或宿主细胞。

6.根据要求5所述的表达载体或宿主细胞，其特征在于，所述表达载体为LcCOMT-I318T-pETa28质粒，宿主细胞为大肠杆菌BL21。

Images