CN107312766B - 一种酶活提高的丙酮酸脱羧酶突变体 - Google Patents

一种酶活提高的丙酮酸脱羧酶突变体 Download PDF

Info

Publication number
CN107312766B
CN107312766B CN201710666524.8A CN201710666524A CN107312766B CN 107312766 B CN107312766 B CN 107312766B CN 201710666524 A CN201710666524 A CN 201710666524A CN 107312766 B CN107312766 B CN 107312766B
Authority
CN
China
Prior art keywords
pyruvate decarboxylase
leu
ala
thr
gly
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710666524.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107312766A (zh
Inventor
陆茜
张德鸿
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Lingkai Pharmaceutical Technology Co Ltd
Original Assignee
Shanghai Lingkai Pharmaceutical Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Lingkai Pharmaceutical Technology Co Ltd filed Critical Shanghai Lingkai Pharmaceutical Technology Co Ltd
Priority to CN201710666524.8A priority Critical patent/CN107312766B/zh
Publication of CN107312766A publication Critical patent/CN107312766A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107312766B publication Critical patent/CN107312766B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01001—Pyruvate decarboxylase (4.1.1.1)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种酶活提高的丙酮酸脱羧酶突变体，属于酶工程、生物工程领域。本发明通过定点突变的方法，将丙酮酸脱羧酶分子内部，稳定性较差区域的亲水性氨基酸缬氨酸突变成疏水性较强的酪氨酸，改变酶分子内部的疏水性，提高了丙酮酸脱羧酶的酶活，并在催化2‑酮基‑L‑古龙酸生成L‑木糖的反应中提高了木糖的产量。用改造后的酶在生成L‑木糖的生产中，更适合工业应用，可降低生产成本，提高生产效率。

Description

一种酶活提高的丙酮酸脱羧酶突变体
技术领域
本发明涉及一种酶活提高的丙酮酸脱羧酶突变体，属于酶工程、生物工程领域。
背景技术
丙酮酸脱羧酶(pyruvatedecarboxylase,PDC)是一种焦磷酸硫胺素(thiamindiphosphate,TPP)依赖性的非氧化酶，在TPP、Mg2+的辅助作用下，它能使α-酮基羧酸脱羧，进而与醛类发生聚合反应，生成手性的α-羟基酮类化合物。α-羟基酮类化合物是一类重要的有机合成中间体，在制药工业上发挥着重要的作用，它进一步还原可生成邻二醇的结构，氧化可生成邻二酮，还原氨化可生成醇胺等许多药物，例如维生素E、抗真菌药Sch42427、麻黄碱，都是通过α-羟基酮类化合物合成的。
丙酮酸脱羧酶在自然界中广泛存在，迄今研究较多的是酵母和运动单胞菌的PDC。不同来源的PDC性质都有所不同，尤其是因此而生成的不同构型的α-枪击酮类化合物更为引人注意。譬如，以乙醛酸，乙醛为底物，由酵母PDC催化合成的乳醛酸以R型为主，而由移动单胞PDC催化则以S型为主，而丙酮酸与芳香醛或杂环醛的缩合反应，用以上两种丙酮酸脱羧酶催化，生成的产物都以R型为主，且R构型能占97％以上。因此，不同来源的酶作为生物催化剂在合成不同构型的手性化合物中有着非常重要的意义。
由于野生型菌株的丙酮酸脱羧酶产量低，利用基因工程技术将丙酮酸脱羧酶克隆到大肠杆菌中，获得了丙酮酸脱羧酶的高效表达，利用基因工程菌产丙酮酸脱羧酶已成为一个重要的来源。
发明内容
本发明通过定点突变技术来改变蛋白质分子的疏水性，从而进一步提高了丙酮酸脱羧酶的酶活，并应用于催化2-酮基-L-古龙酸产L-木糖，从而提高木糖转化率。
本发明所要解决的问题是提供一种酶活力提高的丙酮酸脱羧酶突变体，所述突变是对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的来源于酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶蛋白质内部氨基酸进行定点突变，从而提高丙酮酸脱羧酶的活性。
所述突变是将丙酮酸脱羧酶的第176位的缬氨酸突变为酪氨酸的突变体V176Y。
丙酮酸脱羧酶突变体V176Y的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明解决的另一个技术问题是提供构建所述突变体的方法，是通过定点突变技术将丙酮酸脱羧酶蛋白质分子内部第176位的缬氨酸突变为酪氨酸。
在本发明的一种实施方式中，将含有编码丙酮酸脱羧酶的基因与载体pET22b(+)连接，转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，挑选转化子接种到LB液体培养基中，37℃培养10h，转接到TB培养基，接种量为1％，菌体长到OD600为0.8时，加入IPTG诱导，并将培养温度降到28℃，培养24h，收集菌体，进行破碎，离心，将破壁上清液进行纯化，得到丙酮酸脱羧酶的突变体。
本发明还提供了一株丙酮酸脱羧酶活力增加的大肠杆菌，是将含有编码丙酮酸脱羧酶的基因与表达载体连接后转化大肠杆菌。
本发明还提供了一种提高丙酮酸脱羧酶活力的方法，是将氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的丙酮酸脱羧酶蛋白质分子内部的第176位的缬氨酸突变为酪氨酸。
本发明通过定点突变的方式，将丙酮酸脱羧酶分子内部亲水性氨基酸缬氨酸突变为输水性强的酪氨酸，改变分子内部疏水性，提高了菌株表达丙酮酸脱羧酶的活力，并将丙酮酸脱羧酶酶活提高了67％。改造后的酶用来催化2-酮基-L-古龙酸，L-木糖的转化效率提高31％，更适合工业应用，不仅降低成本，也可提高生产效率。
附图说明
图1突变体酶活
具体实施方式
LB培养基：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L，pH7.0。
TB培养基：蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，甘油8g/L，17mmol/LKH2PO4，72mmol/LK2HPO4。
采用分光光度法测定酿酒酵母中丙酮酸脱羚酶活性：在25℃和pH6.0的条件下测定反应液5min内在波长340nm处每分钟吸光度值的变化。以在25℃和pH6.0的条件下每分钟转化1.0μmol丙酮酸生成乙醛定义为以单位酶活。
实施例1：丙酮酸脱羧酶表达菌株的构建
根据Genebank中酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因序列设计引物，如下：
上游引物：CATGCCATGGATTCAATTACTTTGGGTAAATATTTGTTCG
下游引物：CCGCTCGAGTTGCTTAGCGTTGGTAGCAGCAGTC
将丙酮酸脱羧酶的PCR产物插入到质粒pET-22b后，构建重组表达质粒pET-22b-pdc。
取0.01g重组表达质粒pET-22b-pdc转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后，在600μl的LB培养基中培养1h，取100μl菌液涂布于含有氨苄青霉素的固体LB平板，37℃培养10h，挑取阳性菌落，37℃摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证正确后，转化子由上海生工进行测序，从而获得可以高效表达丙酮酸脱羧酶的基因工程菌。
实施例2：丙酮酸脱羧酶表达菌株的验证
将实施例1中测序正确的菌株接种在LB液体培养基中，37℃培养10h，以1％的接种量接种到TB培养基中，待菌体长到OD600为0.8时，加入IPTG诱导，30℃下继续培养13h，离心收集菌体细胞，用磷酸缓冲液重悬，用超声破碎仪对细胞进行超声破碎，10000×离心20min，上清即为丙酮酸脱羧酶酶液，利用酶活检测方法，测得比酶活为15.3U/mg蛋白。
实施例3：高活性及其热稳定突变株的获得
利用定点突变试剂盒，设计引物如下:
F:AACTAGCCAGCTAACTTG
R:CAAGTCGACCAAGTTAGC
以已构建的质粒pET-22b-pdc为模板，进行PCR，将丙酮酸脱羧酶的第176位的缬氨酸突变为酪氨酸。PCR条件为：95℃5min，30个循(95℃5min、55℃30s、72℃7min)，72℃10min。PCR扩增体系：模板1μl，上下游引物各1μl，2×primSTARBuffer25μl，ddH2O22μl。采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收。转化子由上海生工进行测序，转化子命名为pET-22b-pdc-V176Y。
实施例4：高产丙酮酸脱羧酶生产菌株的验证
将实施例3中测序正确的菌株接种在LB液体培养基中，37℃培养10h，以1％的接种量接种到TB培养基中，待菌体长到OD600为0.8时，加入IPTG诱导，30℃下继续培养13h，离心收集菌体细胞，用磷酸缓冲液重悬，用超声破碎仪对细胞进行超声破碎，10000×离心20min，上清即为丙酮酸脱羧酶酶液，利用酶活检测方法，测得比酶活为25.5U/mg蛋白，较出发菌株提高67％。
实施例5：丙酮酸脱羧酶突变体催化2-酮基-L-古龙酸产L-木糖
反应体系包含2mg丙酮酸脱羧酶，5mM氯化镁，1mM焦磷酸硫胺素和1％的2-酮基-L-古龙酸溶解于50mM的pH5.8的柠檬酸缓冲液中，将反应体系放置于50℃条件下反应15h。反应结束后，离心去除不溶物，并将上清过0.22mm滤膜，所得的反应液采用高效液相色谱法进行检测，木糖含量的分析使用AminexHPX-87H色谱柱，色谱条件:柱温：40℃；流动相：5mM/LH2SO4；进样量：10μl；检测器：RID；流速：0.5ml/min。检测到同样的条件下，突变酶较原始酶，木糖的转化率提高31％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海凌凯医药科技有限公司
<120> 一种酶活提高的丙酮酸脱羧酶突变体
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 563
<212> PRT
<213> 酿酒酵母
<400> 1
Met Ser Glu Ile Thr Leu Gly Lys Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Lys Gln
1 5 10 15
Val Asn Val Asn Thr Val Phe Gly Leu Pro Gly Asp Phe Asn Leu Ser
20 25 30
Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Glu Val Glu Gly Met Arg Trp Ala Gly Asn
35 40 45
Ala Asn Glu Leu Asn Ala Arg Tyr Ala Ala Asp Gly Tyr Ala Arg Ile
50 55 60
Lys Gly Met Ser Cys Ile Ile Thr Thr Phe Gly Val Gly Glu Leu Ser
65 70 75 80
Ala Leu Asn Gly Ile Ala Gly Ser Tyr Ala Glu His Val Gly Val Leu
85 90 95
His Val Val Gly Val Pro Ser Ile Ser Ser Gln Ala Lys Gln Leu Leu
100 105 110
Leu His His Thr Leu Gly Asn Gly Asp Phe Thr Val Phe His Arg Met
115 120 125
Ser Ala Asn Ile Ser Glu Thr Thr Ala Met Ile Thr Asp Ile Cys Thr
130 135 140
Ala Pro Ala Glu Ile Asp Arg Cys Ile Arg Thr Thr Tyr Val Thr Gln
145 150 155 160
Arg Pro Val Tyr Leu Gly Leu Pro Ala Asn Leu Val Asp Leu Asn Val
165 170 175
Pro Ala Lys Leu Leu Gln Thr Pro Ile Asp Met Ser Leu Lys Pro Asn
180 185 190
Asp Ala Glu Ser Glu Lys Glu Val Ile Asp Thr Ile Leu Val Leu Ala
195 200 205
Lys Asp Ala Lys Asn Pro Val Ile Leu Ala Asp Ala Cys Cys Ser Arg
210 215 220
His Asp Val Lys Ala Glu Thr Lys Lys Leu Ile Asp Leu Thr Gln Phe
225 230 235 240
Pro Ala Phe Val Thr Pro Met Gly Lys Gly Ser Ile Ser Glu Gln His
245 250 255
Pro Arg Tyr Gly Gly Val Tyr Val Gly Thr Leu Ser Lys Pro Glu Val
260 265 270
Lys Glu Ala Val Glu Ser Ala Asp Leu Ile Leu Ser Val Gly Ala Leu
275 280 285
Leu Ser Asp Phe Asn Thr Gly Ser Phe Ser Tyr Ser Tyr Lys Thr Lys
290 295 300
Asn Ile Val Glu Phe His Ser Asp His Met Lys Ile Arg Asn Ala Thr
305 310 315 320
Phe Pro Gly Val Gln Met Lys Phe Val Leu Gln Lys Leu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ala Asp Ala Ala Lys Gly Tyr Lys Pro Val Ala Val Pro Ala Arg
340 345 350
Thr Pro Ala Asn Ala Ala Val Pro Ala Ser Thr Pro Leu Lys Gln Glu
355 360 365
Trp Met Trp Asn Gln Leu Gly Asn Phe Leu Gln Glu Gly Asp Val Val
370 375 380
Ile Ala Glu Thr Gly Thr Ser Ala Phe Gly Ile Asn Gln Thr Thr Phe
385 390 395 400
Pro Asn Asn Thr Tyr Gly Ile Ser Gln Val Leu Trp Gly Ser Ile Gly
405 410 415
Phe Thr Thr Gly Ala Thr Leu Gly Ala Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ile
420 425 430
Asp Pro Lys Lys Arg Val Ile Leu Phe Ile Gly Asp Gly Ser Leu Gln
435 440 445
Leu Thr Val Gln Glu Ile Ser Thr Met Ile Arg Trp Gly Leu Lys Pro
450 455 460
Tyr Leu Phe Val Leu Asn Asn Asp Gly Tyr Thr Ile Glu Lys Leu Ile
465 470 475 480
His Gly Pro Lys Ala Gln Tyr Asn Glu Ile Gln Gly Trp Asp His Leu
485 490 495
Ser Leu Leu Pro Thr Phe Gly Ala Lys Asp Tyr Glu Thr His Arg Val
500 505 510
Ala Thr Thr Gly Glu Trp Asp Lys Leu Thr Gln Asp Lys Ser Phe Asn
515 520 525
Asp Asn Ser Lys Ile Arg Met Ile Glu Val Met Leu Pro Val Phe Asp
530 535 540
Ala Pro Gln Asn Leu Val Glu Gln Ala Lys Leu Thr Ala Ala Thr Asn
545 550 555 560
Ala Lys Gln
<210> 2
<211> 563
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Ser Glu Ile Thr Leu Gly Lys Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Lys Gln
1 5 10 15
Val Asn Val Asn Thr Val Phe Gly Leu Pro Gly Asp Phe Asn Leu Ser
20 25 30
Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Glu Val Glu Gly Met Arg Trp Ala Gly Asn
35 40 45
Ala Asn Glu Leu Asn Ala Arg Tyr Ala Ala Asp Gly Tyr Ala Arg Ile
50 55 60
Lys Gly Met Ser Cys Ile Ile Thr Thr Phe Gly Val Gly Glu Leu Ser
65 70 75 80
Ala Leu Asn Gly Ile Ala Gly Ser Tyr Ala Glu His Val Gly Val Leu
85 90 95
His Val Val Gly Val Pro Ser Ile Ser Ser Gln Ala Lys Gln Leu Leu
100 105 110
Leu His His Thr Leu Gly Asn Gly Asp Phe Thr Val Phe His Arg Met
115 120 125
Ser Ala Asn Ile Ser Glu Thr Thr Ala Met Ile Thr Asp Ile Cys Thr
130 135 140
Ala Pro Ala Glu Ile Asp Arg Cys Ile Arg Thr Thr Tyr Val Thr Gln
145 150 155 160
Arg Pro Val Tyr Leu Gly Leu Pro Ala Asn Leu Val Asp Leu Asn Tyr
165 170 175
Pro Ala Lys Leu Leu Gln Thr Pro Ile Asp Met Ser Leu Lys Pro Asn
180 185 190
Asp Ala Glu Ser Glu Lys Glu Val Ile Asp Thr Ile Leu Val Leu Ala
195 200 205
Lys Asp Ala Lys Asn Pro Val Ile Leu Ala Asp Ala Cys Cys Ser Arg
210 215 220
His Asp Val Lys Ala Glu Thr Lys Lys Leu Ile Asp Leu Thr Gln Phe
225 230 235 240
Pro Ala Phe Val Thr Pro Met Gly Lys Gly Ser Ile Ser Glu Gln His
245 250 255
Pro Arg Tyr Gly Gly Val Tyr Val Gly Thr Leu Ser Lys Pro Glu Val
260 265 270
Lys Glu Ala Val Glu Ser Ala Asp Leu Ile Leu Ser Val Gly Ala Leu
275 280 285
Leu Ser Asp Phe Asn Thr Gly Ser Phe Ser Tyr Ser Tyr Lys Thr Lys
290 295 300
Asn Ile Val Glu Phe His Ser Asp His Met Lys Ile Arg Asn Ala Thr
305 310 315 320
Phe Pro Gly Val Gln Met Lys Phe Val Leu Gln Lys Leu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ala Asp Ala Ala Lys Gly Tyr Lys Pro Val Ala Val Pro Ala Arg
340 345 350
Thr Pro Ala Asn Ala Ala Val Pro Ala Ser Thr Pro Leu Lys Gln Glu
355 360 365
Trp Met Trp Asn Gln Leu Gly Asn Phe Leu Gln Glu Gly Asp Val Val
370 375 380
Ile Ala Glu Thr Gly Thr Ser Ala Phe Gly Ile Asn Gln Thr Thr Phe
385 390 395 400
Pro Asn Asn Thr Tyr Gly Ile Ser Gln Val Leu Trp Gly Ser Ile Gly
405 410 415
Phe Thr Thr Gly Ala Thr Leu Gly Ala Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ile
420 425 430
Asp Pro Lys Lys Arg Val Ile Leu Phe Ile Gly Asp Gly Ser Leu Gln
435 440 445
Leu Thr Val Gln Glu Ile Ser Thr Met Ile Arg Trp Gly Leu Lys Pro
450 455 460
Tyr Leu Phe Val Leu Asn Asn Asp Gly Tyr Thr Ile Glu Lys Leu Ile
465 470 475 480
His Gly Pro Lys Ala Gln Tyr Asn Glu Ile Gln Gly Trp Asp His Leu
485 490 495
Ser Leu Leu Pro Thr Phe Gly Ala Lys Asp Tyr Glu Thr His Arg Val
500 505 510
Ala Thr Thr Gly Glu Trp Asp Lys Leu Thr Gln Asp Lys Ser Phe Asn
515 520 525
Asp Asn Ser Lys Ile Arg Met Ile Glu Val Met Leu Pro Val Phe Asp
530 535 540
Ala Pro Gln Asn Leu Val Glu Gln Ala Lys Leu Thr Ala Ala Thr Asn
545 550 555 560
Ala Lys Gln
<210> 3
<211> 1692
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 3
atgtctgaaa ttactttggg taaatatttg ttcgaaagat taaagcaagt caacgttaac 60
accgttttcg gtttgccagg tgacttcaac ttgtccttgt tggacaagat ctacgaagtt 120
gaaggtatga gatgggctgg taacgccaac gaattgaacg ctcgttacgc cgctgatggt 180
tacgctcgta tcaagggtat gtcttgtatc atcaccacct tcggtgtcgg tgaattgtct 240
gctttgaacg gtattgccgg ttcttacgct gaacacgtcg gtgttttgca cgttgttggt 300
gtcccatcca tctcttctca agctaagcaa ttgttgttgc accacacctt gggtaacggt 360
gacttcactg ttttccacag aatgtctgcc aacatttctg aaaccactgc tatgatcact 420
gacatctgta ccgccccagc tgaaattgac agatgtatca gaaccactta cgtcacccaa 480
agaccagtct acttaggttt gccagctaac ttggtcgact tgaacgtccc agctaagttg 540
ttgcaaactc caattgacat gtctttgaag ccaaacgatg ctgaatccga aaaggaagtc 600
attgacacca tcttggtctt ggctaaggat gctaagaacc cagttatctt ggctgatgct 660
tgttgttcca gacacgacgt caaggctgaa actaagaagt tgattgactt gactcaattc 720
ccagctttcg tcaccccaat gggtaagggt tccattagcg aacaacaccc aagatacggt 780
ggtgtttacg tcggtacctt gtccaagcca gaagttaagg aagccgttga atctgctgac 840
ttgattttgt ctgtcggtgc tttgttgtct gatttcaaca ccggttcttt ctcttactct 900
tacaagacca agaacattgt cgaattccac tccgaccaca tgaagatcag aaacgccact 960
ttcccaggtg tccaaatgaa attcgttttg caaaagttgt tgaccaatat tgctgacgcc 1020
gctaagggtt acaagccagt tgctgtccca gctagaactc cagctaacgc tgctgtccca 1080
gcttctaccc cattgaagca agaatggatg tggaaccaat tgggtaactt cttgcaagaa 1140
ggtgatgttg tcattgctga aaccggtacc tccgctttcg gtatcaacca aaccactttc 1200
ccaaacaaca cctacggtat ctctcaagtc ttatggggtt ccattggttt caccactggt 1260
gctaccttgg gtgctgcttt cgctgctgaa gaaattgatc caaagaagag agttatctta 1320
ttcattggtg acggttcttt gcaattgact gttcaagaaa tctccaccat gatcagatgg 1380
ggcttgaagc catacttgtt cgtcttgaac aacgatggtt acaccattga aaagttgatt 1440
cacggtccaa aggctcaata caacgaaatt caaggttggg accacctatc cttgttgcca 1500
actttcggtg ctaaggacta cgaaacccac agagtcgcta ccaccggtga atgggacaag 1560
ttgacccaag acaagtcttt caacgacaac tctaagatca gaatgattga ggttatgttg 1620
ccagtcttcg atgctccaca aaacttggtt gaacaagcta agttgactgc tgctaccaac 1680
gctaagcaat aa 1692
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
catgccatgg attcaattac tttgggtaaa tatttgttcg 40
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ccgctcgagt tgcttagcgt tggtagcagc agtc 34
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aactagccag ctaacttg 18
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
caagtcgacc aagttagc 18

Claims (9)

1.一种丙酮酸脱羧酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.编码权利要求1所述丙酮酸脱羧酶突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的载体或细胞系。
4. 一种获得权利要求1所述突变体的方法，其特征在于，是通过定点突变技术将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的丙酮酸脱羧酶蛋白质内部的第176位的缬氨酸突变为酪氨酸。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将含有编码权利要求1所述丙酮酸脱羧酶突变体的基因与载体pET22b(+)连接，转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)；挑选转化子接种到LB液体培养基中，37℃培养10h，转接到TB培养基，接种量为1%，菌体长到OD600为0.8时，加入IPTG诱导，并将培养温度降到28℃，培养24h，收集菌体，进行破碎，离心，将破壁上清液进行纯化，得到丙酮酸脱羧酶的突变体。
6.一种表达权利要求1所述丙酮酸脱羧酶突变体的大肠杆菌，其特征在于，是将含有编码丙酮酸脱羧酶突变体的基因与表达载体连接后转化大肠杆菌。
7. 根据权利要求6所述的大肠杆菌，其特征在于，将含有编码丙酮酸脱羧酶突变体的基因与载体pET22b(+)连接，转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。
8.权利要求1所述的丙酮酸脱羧酶突变体在催化2-酮基-L-古龙酸生成L-木糖中的应用。
9.权利要求6所述的大肠杆菌在催化2-酮基-L-古龙酸生成L-木糖中的应用。
CN201710666524.8A 2017-08-07 2017-08-07 一种酶活提高的丙酮酸脱羧酶突变体 Active CN107312766B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710666524.8A CN107312766B (zh) 2017-08-07 2017-08-07 一种酶活提高的丙酮酸脱羧酶突变体

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710666524.8A CN107312766B (zh) 2017-08-07 2017-08-07 一种酶活提高的丙酮酸脱羧酶突变体

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107312766A CN107312766A (zh) 2017-11-03
CN107312766B true CN107312766B (zh) 2020-02-18

Family

ID=60170633

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710666524.8A Active CN107312766B (zh) 2017-08-07 2017-08-07 一种酶活提高的丙酮酸脱羧酶突变体

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107312766B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108165591B (zh) * 2017-12-18 2020-07-03 上海凌凯医药科技有限公司 一种l-木糖的酶法制备方法
CN109055292B (zh) * 2018-08-20 2020-08-04 上海凌凯医药科技有限公司 一种生产l-木糖的重组变形假单胞菌及其应用
CN110295204B (zh) * 2019-07-29 2022-08-23 湖北大学 苯丙酮酸脱羧酶突变体f542w在生物发酵生产苯乙醇中的应用
CN116790569B (zh) * 2022-04-07 2024-04-26 杭州酶易生物技术有限公司 丙酮酸脱羧酶突变体及其在制备α-羟基酮类化合物中的应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAA54522.1;Kellermann, E.,et al;《NCBI》;20061114;全文 *
Structure and properties of pyruvate decarboxylase and site-directed mutagenesis of the Zymomonas mobilis enzyme;CANDY JM,ET AL;《Biochimica et biophysica acta》;19981231;第2卷(第2期) *
来源于运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶的结构与功能的研究;高赛学;《吉林大学学位论文》;20011231;全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107312766A (zh) 2017-11-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107312766B (zh) 一种酶活提高的丙酮酸脱羧酶突变体
CN111269900B (zh) 一种l-氨基酸脱氨酶突变体的制备及其应用
CN108467860B (zh) 一种高产γ-氨基丁酸的方法
CN108070581B (zh) 一种酶活提高的L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体及其应用
CN108559735B (zh) 一种亮氨酸脱氢酶突变体的构建及其应用
CN110938616B (zh) 一种温泉热碱芽孢杆菌来源的腈水合酶的突变体
CN108841844B (zh) 一种高效生产苯丙酮酸的方法
CN111690624A (zh) 一种利用微生物合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的方法
CN113337495B (zh) 一种提高唾液酸产量的方法与应用
CN112877307A (zh) 一种氨基酸脱氢酶突变体及其应用
CN113462678B (zh) 一种谷氨酸脱羧酶突变体
CN109321541B (zh) 一种l-氨基酸氧化酶的突变体
CN108004225B (zh) 一种成团泛菌来源的苯丙氨酸氨基变位酶的突变体
CN113355366B (zh) 一种多酶级联制备2-苯乙醇的方法
CN113862290B (zh) 一种来源于甘草的异黄酮4′-o-甲基转移酶及其应用
CN112831532B (zh) 一种酶促合成d-亮氨酸的方法
CN110438055B (zh) 一种含有苯丙酮酸脱羧酶突变体的全细胞催化剂及在生产苯乙醇中的应用
CN107653257A (zh) 一种烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因、重组表达载体及应用
CN110846288B (zh) 一种谷胱甘肽双功能酶突变体及其应用
CN109182286B (zh) 一种改进的氰基还原酶及其在合成3-氯吡嗪-2甲胺中的应用
CN113308446A (zh) 一种海藻糖转化率提高的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体及其应用
CN114934037B (zh) 用于生产3-氨基丙腈的天冬氨酸酶突变体
CN109337891B (zh) 一种热稳定性提高的苯丙氨酸氨基变位酶突变体
CN113481175B (zh) 一种活性和立体选择性提高的烯键还原酶突变体及其编码基因以及应用
CN112442474B (zh) 一种(-)γ-内酰胺的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant