CN114045248A - 一种解淀粉芽孢杆菌、组合物及其应用与解淀粉芽孢杆菌的发酵培养方法 - Google Patents

一种解淀粉芽孢杆菌、组合物及其应用与解淀粉芽孢杆菌的发酵培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌、组合物及其应用与解淀粉芽孢杆菌的发酵培养方法，所述解淀粉芽孢杆菌的名称为JD，分类名称为：Bacillus amyloliquefaciens，保藏编号为：CCTCC NO:M 20211443，保藏日期为：2021年11月18日，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，解淀粉芽孢杆菌具有优异的益生特性。所述组合物包括解淀粉芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌或所述组合物可用于饲料、食品或肥料。所述解淀粉芽孢杆菌的发酵工艺是将解淀粉芽孢杆菌的种子液接种至一种新型的发酵培养基中进行发酵培养，培养温度为35℃至40℃，溶氧不低于20％，发酵转孢率可达90％以上。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌、组合物及其应用与解淀粉芽孢杆菌的 发酵培养方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种解淀粉芽孢杆菌、组合物及其应用与解淀粉芽孢杆菌的发酵培养方法。
背景技术
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)属于好氧产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌，解淀粉芽孢杆菌在自然界分布广泛，常见于土壤、植物根际体表、植物体内、深海水中等，解淀粉芽孢杆菌对人畜无毒无害且对环境无污染，具有代谢产物丰富、广谱抗菌活性、较强的抗逆能力、生长增殖快速、稳定性佳的特点。解淀粉芽孢杆菌具有益生特性，能够有效抑制多种动植物病原菌，例如灰葡萄孢、链格孢、尖孢镰刀菌、山茶灰斑病菌、黑曲霉和粉红单端孢等。解淀粉芽孢杆菌的益生特性使其广泛应用于食品抑菌保鲜、生物医药和农业生物防治领域。
由于不同株的解淀粉芽孢杆菌性能差异较大，所以筛选获得一株综合性能优异的解淀粉芽孢杆菌具有重要意义。在解淀粉芽孢杆菌的传统发酵生产中，通常采用一些廉价的农副产品或工业副产品(例如玉米粉、麸皮、糖蜜)作为发酵培养基的原料以降低生产成本，具有产孢率低、菌株发酵密度低的缺点，不利于工业化生产以及降低包含解淀粉芽孢杆菌的产品的品质，此外，发酵过程的工艺控制也是影响菌株发酵密度和产孢率的关键因素之一。因此，研发一种适用于解淀粉芽孢杆菌的发酵培养方法以提升菌株发酵密度和产孢率，具有重要价值。
发明内容
针对现有技术的不足之处，本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌、组合物及其应用与解淀粉芽孢杆菌的发酵培养方法。
本发明的技术方案如下所述：
第一方面，本申请提供了一种解淀粉芽孢杆菌，所述解淀粉芽孢杆菌的名称为JD，分类名称为：Bacillus amyloliquefaciens，保藏编号为：CCTCC NO:M 20211443，保藏日期为：2021年11月18日，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心。
第二方面，本申请提供了一种组合物，所述组合物包括如第一方面中所述的解淀粉芽孢杆菌。
进一步地，所述组合物还包括可接受的辅料。
进一步地，所述组合物的剂型为片剂、颗粒剂、粉剂、喷雾剂、混悬液剂、乳剂、胶囊剂或膏剂。
第三方面，本申请提供了如第一方面中所述的解淀粉芽孢杆菌或如第二方面中任意一种所述的组合物在制备饲料、食品或肥料中的应用。
第四方面，本申请提供了一种用于解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基，按照质量份数计算，所述发酵培养基包括：3份至5份的速效碳源、20份至40份的迟效碳源、30份至50份的豆粕粉、5份至12份的酵母粉、3份至8份的蛋白胨、1份至5份的碳酸钙、1份至5份的氯化钠、0.5份至1份的硫酸镁、1份至5份的磷酸氢二钾以及0.1份至0.3份硫酸锰。
进一步地，所述速效碳源为葡萄糖，所述迟效碳源为玉米淀粉。
第五方面，本申请提供了一种解淀粉芽孢杆菌的发酵培养方法，包括步骤：提供解淀粉芽孢杆菌的种子液，将所述解淀粉芽孢杆菌的种子液接种至如第四方面中任意一种所述的发酵培养基中进行发酵培养，培养温度为35℃至40℃，溶氧不低于20％，培养至芽孢形成率在90％以上。
进一步地，在发酵培养过程中，芽孢形成率未达到70％时，培养温度为35至37℃；当芽孢形成率达到70％后，培养温度为38℃至40℃。
进一步地，所述解淀粉芽孢杆菌的种子液的制备方法包括步骤：提供解淀粉芽孢杆菌菌液，将所述解淀粉芽孢杆菌菌液接种于种子培养基中进行培养，培养温度为35℃至40℃，溶氧不低于20％，培养至芽孢形成率在90％以上；
其中，按照质量份数计算，所述种子培养基包括：10份至20份的酵母浸膏、10份至20份的蛋白胨和1份至5份的氯化钠。
本申请提供了一种解淀粉芽孢杆菌、组合物及其应用与解淀粉芽孢杆菌的发酵培养方法，产生如下的技术效果：
相较于解淀粉芽孢杆菌CGMCC1.857，本发明的解淀粉芽孢杆菌JD具有更佳的益生特性，具体表现为：解淀粉芽孢杆菌JD对产气荚膜梭菌CP-1、金黄色葡萄球菌S、表皮葡萄球菌Sp、猪链球菌SS-2、猪链球菌SS-9以及无乳链球菌KYB420均具有理想的抑制效果，而解淀粉芽孢杆菌CGMCC1.857对金黄色葡萄球菌S、表皮葡萄球菌Sp、猪链球菌SS-2、猪链球菌SS-9以及无乳链球菌KYB420均无抑制效果，虽然解淀粉芽孢杆菌CGMCC1.857对产气荚膜梭菌CP-1具有一定的抑制效果，但是抑制效果不如解淀粉芽孢杆菌JD。由动物实验可知，相较于解淀粉芽孢杆菌CGMCC1.857，解淀粉芽孢杆菌JD更有助于提高哺乳仔猪的多项生理指标，例如体重、体增重/采食量等，并且显著降低哺乳仔猪的腹泻率。
本发明中解淀粉芽孢杆菌的发酵培养方法是将解淀粉芽孢杆菌的种子液接种于一种用于新型的发酵培养基中，并结合特定的发酵过程工艺控制进行发酵生产，改善传统解淀粉芽孢杆菌发酵生产所具有的产孢率低、菌株发酵密度低的缺点，当发酵规模为2吨发酵罐时，下罐的发酵液中解淀粉芽孢杆菌的菌体数量可达250亿CFU/mL，芽孢浓度可达228亿CFU/mL，极大地提高了解淀粉芽孢杆菌的发酵水平，有利于提高解淀粉芽孢杆菌制品的品质。
附图说明
下面结合附图，通过对本发明的具体实施方式详细描述，将使本发明的技术方案及其它有益效果显而易见。
图1为本申请中JD和CGMCC1.857两株解淀粉芽孢杆菌的抑菌效果图一，其中，A1至A3分别代表JD对CP-1、KYB420以及S的抑制效果图，B1至B3分别代表CGMCC1.857对CP-1、KYB420以及S的抑制效果图。
图2为本申请中JD和CGMCC1.857两株解淀粉芽孢杆菌的抑菌效果图二，其中，A4至A6分别代表JD对SS-2、SS-9以及Sp的抑制效果图，B4至B6分别代表CGMCC1.857对SS-2、SS-9以及Sp的抑制效果图。
图3为本申请中JD和CGMCC1.857两株解淀粉芽孢杆菌的产蛋白酶能力效果图，其中，A7代表JD的产蛋白酶能力效果图，B7代表CGMCC1.857的产蛋白酶能力效果图。
图4为本申请中JD和CGMCC1.857两株解淀粉芽孢杆菌的产淀粉酶能力效果图，A8代表JD的产淀粉酶能力效果图，B8代表CGMCC1.857的产淀粉酶能力效果图。
图5为本申请中JD和CGMCC1.857两株解淀粉芽孢杆菌的产纤维素酶能力效果图，A9代表JD的产纤维素酶能力效果图，B9代表CGMCC1.857的产纤维素酶能力效果图。
图6为本申请实施例1中发酵液的革兰氏染色镜检图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用，但不能限制本申请的内容。
需说明的是，以下实施例的描述顺序不作为对实施例优选顺序的限定。另外，在本申请的描述中，术语“包括”是指“包括但不限于”。本申请的各个实施例可以以一个范围的型式存在；应当理解，以一范围型式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本发明范围的硬性限制；因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单一数值。例如，“3份至8份的速效碳源”应当认为从3份到8份的范围描述已经具体公开子范围，如从3份到5份、从3份到6份、从3份到7份、从4份到6份、从4份到7份、从4份到8份、从5份到7份、从5份到8份、从6份到8份等，以及所数范围内的单一数字，例如3份、4份、5份、6份、7份以及8份，此不管范围为何皆适用。另外，每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过本领域已知方法制备。
一、本发明实施例中涉及的抑菌实验说明。
1.1、抑菌实验中涉及的指示菌
表1指示菌的种类、来源、特性及培养条件
Figure BDA0003440683370000041
备注：表1中涉及的培养基均购自青岛海博生物技术有限公司，按照厂商条件使用。
1.2、抑菌实验器材
牛津杯：内径为6.0±0.1mm，外径为7.8±0.1mm，高为10.0±0.1mm；
生化培养箱；
CR 22G冷冻高速离心机(Hitachi)。
1.3、抑菌实验方法
Sa、制备解淀粉芽孢杆菌上清液：将置于甘油管保存的解淀粉芽孢杆菌活化接种于NA培养基斜面，在37℃下培养24h，然后挑取一环NA培养基斜面上生长的菌落接种于NB液体培养基，置于37℃下静置培养直至菌液的OD600为1.3，将培养获得的菌液在12000r/min的转速下离心5min，收集上清液以备用；
Sb、将处于对数生长期的指示菌，其OD600达到表2要求，稀释至其使用倍数后涂布于对应的培养基平板上，每种指示菌设置三个平行样；
表2指示菌的对数期OD600及使用稀释倍数
名称 编号 对数期OD<sub>600</sub> 稀释倍数 取用量
产气荚膜梭菌 CP-1 0.86 10<sup>-1</sup> 100μL
金黄色葡萄球菌 S 1.72 10<sup>-3</sup> 100μL
无乳链球菌 KYB420 1.06 10<sup>-3</sup> 100μL
表皮葡萄球菌 Sp 1.42 10<sup>-4</sup> 100μL
猪链球菌 SS-2 0.39 10<sup>-3</sup> 100μL
猪链球菌 SS-9 0.52 10<sup>-3</sup> 100μL
Sc、在涂布有指示菌的培养基平板上等距离放置四个无菌牛津杯；
Sd、向各个牛津杯中分别加入0.15mL的解淀粉芽孢杆菌上清液，然后置于4℃下扩散24h，再置于37℃下培养24h，采用游标卡尺测量抑菌圈的直径(未扣除牛津杯的直径)，计算每个平板上所有抑菌圈的平均直径值，并拍照记录。
二、本发明实施例中涉及的产淀粉酶能力实验说明
2.1、蛋白酶实验
2.1.1、牛奶培养基配方与牛奶平板的配制方法
牛奶培养基配方：5g的脱脂奶粉，1.5g的琼脂以及100mL的蒸馏水。
牛奶平板的配制方法：向5g的脱脂奶粉中加入50mL的蒸馏水，制得A组分；向1.5g的琼脂中加入50mL的蒸馏水，制得B组分；将A组分和B组分分别灭菌，将A组分和B组分分别灭菌，A组分灭菌条件为115℃下灭菌20min，B组分灭菌条件为121℃下灭菌18min；待A组分和B组分均冷却至50℃时，将A组分和B组分混匀，然后倒入至培养皿内，形成牛奶平板。
2.1.2、实验方法
将置于甘油管保存的解淀粉芽孢杆菌活化接种于NA培养基斜面，在37℃下培养24h，然后挑取一环NA培养基斜面上生长的菌落接种于NB液体培养基，置于37℃下静置培养直至菌液的OD600为1.3，取100μL的菌液于12000r/min下离心5min，收集上清液，然后取2μL的上清液点涂于牛奶平板上，每种解淀粉芽孢杆菌菌液设置两个平行样，置于37℃倒置培养48h，测量每个透明圈的内径和外径，平行样取平均值，并拍照记录。
2.2、淀粉酶实验
2.2.1、淀粉酶培养基配方与淀粉酶平板的配制方法
淀粉酶培养基配方：5g的牛肉膏，10g的蛋白胨、2g的可溶性淀粉、20g的琼脂以及1000mL的蒸馏水
淀粉酶平板的配制方法：将配方中的各个组分混合，然后115℃下灭菌20min，调pH为7.2至7.6，然后倒入至培养皿内，形成淀粉酶平板。
2.2.2、实验方法
将置于甘油管保存的解淀粉芽孢杆菌活化接种于NA培养基斜面，在37℃下培养24h，然后挑取一环NA培养基斜面上生长的菌落接种于NB液体培养基，置于37℃下静置培养直至菌液的OD600为1.3，取100μL的菌液于12000r/min下离心5min，收集上清液，然后取2μL的上清液点涂于淀粉酶平板上，每种解淀粉芽孢杆菌菌液设置两个平行样，置于37℃倒置培养48h，测量每个透明圈的内径和外径，平行样取平均值，并拍照记录。
2.3、纤维素酶实验
2.3.1、纤维素酶培养基配方与纤维素酶平板的配制方法
纤维素酶培养基配方：每1L培养基中，15g的羧甲基纤维素钠、2g的(NH4)2SO4、1g的酵母浸膏、0.5g的MgSO4·7H2O、1g的KH2P04、20g的琼脂以及余量为蒸馏水。
纤维素酶平板的配制方法：将配方中的各个组分混合，然后115℃下灭菌20min；向空白培养皿中倒入灭菌后的琼脂，在琼脂凝固之后，将5个牛津杯置于琼脂上，两个牛津杯中心间距28mm，牛津杯与平板外延距离18mm，平板直径为90mm，后倒入灭菌后的纤维素酶培养基，待纤维素酶培养基凝固之后用镊子夹取出牛津杯，制得纤维素酶平板，其中，打底琼脂的厚度为1mm，纤维素酶培养基的厚度为7mm。
2.3.2、实验方法
将置于甘油管保存的解淀粉芽孢杆菌活化接种于NA培养基斜面，在37℃下培养24h，然后挑取一环NA培养基斜面上生长的菌落接种于NB液体培养基，置于37℃下静置培养直至菌液的OD600为1.3，取1mL的菌液于12000r/min下离心5min，收集上清液，在每个牛津杯中加入150μL的上清液，每种解淀粉芽孢杆菌菌液设置两个平行样，置于37℃正置培养48h，测量每个透明圈的内径和外径，平行样取平均值，并拍照记录。
四、发明实施例中涉及的动物实验说明
4.1、实验动物
选用若干头21日龄健康状况良好、体重接近的“杜长大”哺乳仔猪，随机分成四个组，每组设置两个重复，每个重复15头仔猪，任意两头仔猪之间的出生日期差异在±1天，且任意两头仔猪之间的体重差异在±0.05kg。免疫程序由工作人员按照常规进行，各个组的饲养管理方式和环境条件均相同，实验周期为21天。
4.2、实验试剂
生理盐水；
混合抗生素溶液，由土霉素钙、金霉素、恩拉霉素以及去离子水组成，其中，土霉素钙的浓度为100ppm，金霉素的浓度为75ppm，恩拉霉素的浓度为10ppm；
益生菌剂，由供试解淀粉芽孢杆菌和葡萄糖组成，其中，供试解淀粉芽孢杆菌的有效浓度为1.0×109CFU/g；
4.3、实验方法
在实验周期内，每天对对照一组中的各头仔猪灌服生理盐水、对对照二组中的各头仔猪灌服混合抗生素溶液，以及对实验组中的各头仔猪灌服益生菌剂，每次每头仔猪灌服对应试剂的剂量为2mL，每天灌服1次，各个组每次灌服的时间保持一致，记录每头仔猪的初始体重，并每天记录每头仔猪的体重和健康状况，以及计算各个组的21日龄平均体重(Kg/头)、实验周期内的日平均增重(g/d)、实验周期内的日平均采食量(g/d)、体增重/采食量(g/g)以及腹泻率(％)。“21日龄平均体重”是指各组中所有存活仔猪在第21日龄的平均体重，各组取两个重复的平均值，各组中每个重复的所有存活仔猪在第21日龄的平均体重为：所有存活仔猪在第21日龄的总体重/存活头数；“实验周期内的日平均增重”是指各组中在实验周期内存活的所有仔猪在实验周期内的平均日增重，各组取两个重复的平均值，各组的每个重复中在实验周期内存活的所有仔猪在实验周期内的平均日增重的计算公式为：所有存活仔猪在第21日龄的总体重-所有存活仔猪的初始总体重)/(实验天数*存活仔猪头数)；“日平均采食量”是指各组中在实验周期内存活的所有仔猪在实验周期内的平均日采食量；“体增重/采食量”是指各组中在实验周期内存活的所有仔猪在实验周期内的日平均增重/日平均采食量的比值；“腹泻率”是指在实验周期(21天)内，各组中腹泻仔猪的头数占各组中仔猪总头数的百分比。
本发明实施例提供了一种解淀粉芽孢杆菌，所述解淀粉芽孢杆菌的名称为JD，分类名称为：Bacillus amyloliquefaciens，保藏编号为：CCTCC NO:M 20211443，保藏日期为：2021年11月18日，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心。
解淀粉芽孢杆菌JD的筛选过程如下：
S1、分别采集丝羽乌骨鸡肠道和湖南本地鸡肠道样品，将各个鸡肠道样品与玻璃珠和无菌水混合制得样品悬浮液，将样品悬浮液稀释涂布于NA培养基平板，每种样品悬浮液的各个稀释度分别设置三个平行样，将涂布完成的NA培养基平板置于37℃培养24h；
S2、在NA培养基平板上挑取形状较大、边缘不规则的白色单菌落进行分离纯化，然后采用100倍的油镜对纯化后获得的单菌落镜检，挑选出镜检结果为纯菌且具有芽孢且为杆状的菌株，并且符合《伯杰细菌鉴定手册》第八版及《常见细菌系统鉴定手册》中关于解淀粉芽孢杆菌的形态特征及生理生化指标描述的菌株初步认定为解淀粉芽孢杆菌；
S3、将步骤S2中初步认定为解淀粉芽孢杆菌的菌种进行16S rDNA序列鉴定，测序由北京擎科生物科技有限公司完成；
S4、将16S rDNA序列鉴定结果为解淀粉芽孢杆菌的8株菌进行抑菌实验、产酶能力实验以及动物实验，筛选获得综合性能优异的一株解淀粉芽孢杆菌，命名为JD；
选取中国普通微生物菌种保藏管理中心编号为CGMCC1.857的解淀粉芽孢杆菌作为实验菌株，将JD和CGMCC1.857分别进行抑菌实验、产酶能力实验以及动物实验，以比较JD与CGMCC1.857的抑菌能力、产酶能力以及对动物的益生能力，结果详见下表3至表7。
对于抑菌实验，图1和图2示出了JD和CGMCC1.857的抑菌效果图，抑菌结果详见下表3：
表3JD和CGMCC1.857两株解淀粉芽孢杆菌的抑菌结果
Figure BDA0003440683370000091
由图1、图2和表3可知，JD对产气荚膜梭菌CP-1、金黄色葡萄球菌S、表皮葡萄球菌Sp、猪链球菌SS-2、猪链球菌SS-9以及无乳链球菌KYB420均具有理想的抑制效果，而CGMCC1.857对产气荚膜梭菌CP-1具有一定的抑制效果，并且CGMCC1.857对产气荚膜梭菌CP-1的抑制效果不如JD，此外，CGMCC1.857对金黄色葡萄球菌S、表皮葡萄球菌Sp、猪链球菌SS-2、猪链球菌SS-9以及无乳链球菌KYB420均无抑制效果。
在产酶能力实验中，图3示出了JD和CGMCC1.857两株解淀粉芽孢杆菌的产蛋白酶能力的效果图，产蛋白酶能力实验的结果详见下表4：
表4JD和CGMCC1.857两株解淀粉芽孢杆菌的产蛋白酶能力实验结果
Figure BDA0003440683370000092
由表4和图3可知，JD的产蛋白酶能力明显优于CGMCC1.857。
图4示出了JD和CGMCC1.857两株解淀粉芽孢杆菌的产淀粉酶能力的效果图，产淀粉酶能力实验的结果详见下表5：
表5JD和CGMCC1.857两株解淀粉芽孢杆菌的产淀粉酶能力实验结果
Figure BDA0003440683370000093
由表5和图4可知，JD的产淀粉酶能力明显优于CGMCC1.857。
图5示出了JD和CGMCC1.857两株解淀粉芽孢杆菌的产纤维素酶能力的效果图，产纤维素酶能力实验的结果详见下表6：
表6JD和CGMCC1.857两株解淀粉芽孢杆菌的产纤维酶能力实验结果
Figure BDA0003440683370000101
由表6和图5可知，JD的产纤维酶能力明显优于CGMCC1.857。
JD和CGMCC1.857两株解淀粉芽孢杆菌的动物实验结果详见下表7：
表7JD和CGMCC1.857两株解淀粉芽孢杆菌的动物实验结果一览表
Figure BDA0003440683370000102
由表7可知，实验一组中哺乳仔猪的21日龄平均体重、实验周期内的日平均增重、实验周期内的日平均采食量以及体增重/采食量均高于对照一组、对照二组和实验二组，并且实验一组中哺乳仔猪的腹泻率均低于对照一组、对照二组和实验二组，实验一组中哺乳仔猪的各项指标均优于实验二组，充分说明JD的益生效果优于CGMCC1.857。
本申请实施例还提供了一种组合物，所述组合物包括解淀粉芽孢杆菌JD。可以理解的是，解淀粉芽孢杆菌JD在组合物中的存在形式可以是：纯种解淀粉芽孢杆菌JD、解淀粉芽孢杆菌JD的发酵培养物、解淀粉芽孢杆菌JD的发酵培养物离心所得的培养液或其干燥物、解淀粉芽孢杆菌JD的发酵培养物离心所得的菌体或其干燥物。组合物可以是液体，也可以是固体。
在本申请的一些实施例中，组合物为片剂、颗粒剂、粉剂、喷雾剂、混悬液剂、乳剂、胶囊剂或膏剂。
在本申请的一些实施例中，组合物还包括可接受的辅料。辅料是指生产组合物和调配处方时所用的附加成分，具有赋形、保护活性成分、提高稳定性、增溶、助溶、缓控释放等重要功能，以使组合物达到一定的保质期和生物利用度，从而提高组合物的安全性和有效性，辅料包括但不限于是赋形剂、稀释剂、填充剂、溶剂、支持剂、预混剂、崩解剂、表面活性剂和吸附载体等。当组合物应用于制备饲料时，辅料可以是动物饲料科学领域中任何常规的辅料，辅料的选择将取决于组合物的使用方式。当组合物应用于制备食品时，辅料可以是食品科学可接受的辅料，例如香味剂、甜味剂等。当组合物应用于制备肥料时，辅料可以是肥料可接受的辅料，例如吸附载体。
可以理解的是，组合物还可以包括其他微生物，例如其他具有益生功能的微生物。
本申请实施例还提供了一种用于解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基，按照质量份数计算，所述发酵培养基包括：3份至5份的速效碳源、20份至40份的迟效碳源、30份至50份的豆粕粉、5份至12份的酵母粉、3份至8份的蛋白胨、1份至5份的碳酸钙、1份至5份的氯化钠、0.5份至1份的硫酸镁、1份至5份的磷酸氢二钾以及0.1份至0.3份硫酸锰。可以理解的是，所述发酵培养基能够用于发酵生产解淀粉芽孢杆菌JD，也可以用于发酵生产其他株解淀粉芽孢杆菌，即所述发酵培养基具有普适性。
如本申请所用，“速效碳源”是指能够被解淀粉芽孢杆菌直接利用的含碳化合物，速效碳源能较快地参与菌体合成、产生能量、合成代谢产物等活动，例如速效碳源可以是葡萄糖。
如本申请所用，“迟效碳源”是指不能够被解淀粉芽孢杆菌直接吸收利用的含碳化合物，通常是在无速效碳源的前提下为解淀粉芽孢杆菌利用，需要依赖解淀粉芽孢杆菌分泌胞外酶以将其分解成小分子物质而利用，因此，解淀粉芽孢杆菌利用速率缓慢。
在本申请的一些实施例中，速效碳源为葡萄糖，第一迟效碳源为玉米淀粉，有利于降低发酵生产成本。
本申请实施例还提供了一种解淀粉芽孢杆菌的发酵方法，包括步骤：提供解淀粉芽孢杆菌的种子液，将所述解淀粉芽孢杆菌的种子液接种至本申请实施例中所述的发酵培养基中进行发酵培养，培养温度为35℃至40℃，溶氧不低于20％，培养至芽孢形成率在90％以上。
在本申请的一些实施例中，在发酵培养过程中，芽孢形成率未达到70％时，培养温度为35至37℃；当芽孢形成率达到70％后，培养温度为38℃至40℃。
在本申请的一些实施例中，解淀粉芽孢杆菌的种子液的制备方法包括步骤：制备芽孢数为10亿/mL的解淀粉芽孢杆菌菌液，按体积比为0.5％至1％的接种量接种于种子罐，控制罐压为0.05MPa、通气比2.0vvm以及搅拌转速250rpm，35℃至40℃培养12h，获得种子液。其中，按照质量份数计算，种子罐培养基包括：10份至20份的酵母浸膏、10份至20份的蛋白胨和1份至5份的氯化钠，种子罐培养基的pH为7.2。
需要说明的是，申请实施例的解淀粉芽孢杆菌的发酵方法适用于摇瓶发酵阶段、小试阶段、中试阶段、大罐试产阶段以及工业化生产阶段，发酵规模包括但不限于是100L发酵罐、500L发酵罐、2吨发酵罐、10吨发酵罐等，本领域技术人员根据发酵规模，能够依赖自身所掌握的专业知识逐级制备种子液。
下面通过具体实施例和对比例对本申请的解淀粉芽孢杆菌发酵方法及技术效果进行详细说明，以下实施例仅仅是本申请的部分实施例，并非对本申请作出具体限定。
实施例1
本实施例提供了一种解淀粉芽孢杆菌JD的发酵培养方法，其中，发酵规模为2吨发酵罐。
一、制备种子液
(1)种子活化
取-80℃甘油管保存的解淀粉芽孢杆菌JD，待解淀粉芽孢杆菌JD甘油管完全融化后，吸取0.5mL的菌液接种于50mL的NB液体培养基中，置于37℃、200r/min的条件下摇瓶培养直至菌液OD660为2.5至3.0，然后挑取菌液划线于NA培养基平板，置于37℃培养18h，获得解淀粉芽孢杆菌JD的单菌落。
(2)制备一级种子液
从NA培养基平板上挑取解淀粉芽孢杆菌JD的单菌落，接种于50mL的NB培养基，置于37℃、200r/min的条件下摇瓶培养20h，镜检转孢率在80％以上时，80℃水浴15min，然后转接NA试管斜面，置于37℃培养48h，转孢率达到95％以上。采用无菌水洗脱NA试管斜面上的解淀粉芽孢杆菌JD，获得芽孢数为10亿/mL的一级种子液。
(3)制备二级种子液
选择100L的发酵罐作为种子罐，向其中加入60L的种子罐培养基，并且加入2‰(体积比,V/V)的聚醚消泡剂，氢氧化钠调节pH为7.2，然后121℃灭菌20min，灭菌结束后向夹套内通冷水以快速冷却降温，并向罐内通入无菌空气保压0.05Mpa。其中，按照质量份数计算，种子罐培养基由10g/L的酵母浸膏、10g/L的蛋白胨和5g/L的氯化钠组成。
按体积比为1％的接种量将一级种子液接种于种子罐，在通气比2.0vvm、罐压0.05Mpa、搅拌转速250r/min以及37℃的条件下培养12h，获得二级种子液。
二、2吨发酵罐发酵生产
(1)发酵培养基
发酵培养基由以下成分组成：
5g/L的葡萄糖、35g/L的玉米淀粉、40g/L的豆粕粉、10.5g/L酵母粉、8g/L的蛋白胨、3g/L的碳酸钙、2g/L的氯化钠、0.5g/L的硫酸镁、2g/L的磷酸氢二钾以及0.3g/L的硫酸锰。
(2)2吨发酵罐实消
根据发酵罐装液量(罐体积的60％)，称取发酵培养基的各个组分，将称取好的各个组分相混合，并加水分散均匀后倒至发酵罐中，加入2‰(体积比,V/V)的聚醚消泡剂，氢氧化钠调节pH为7.2，然后121℃灭菌20min，灭菌结束后向夹套内通冷水以快速冷却降温，并向罐内通入无菌空气保压0.05Mpa。
(3)发酵控制
当罐温冷却至40℃，取60L的二级种子液按5％(体积比,V/V)的接种量接种上罐，初始转速为100r/min，初始通气比为0.5vvm，初始温度为35℃，在发酵培养过程中，当溶氧低于20％时，逐渐提高转速至500r/min和通气比至2.5vvm；当芽孢形成率达到70％后，将温度升高至38℃。发酵培养至24h时，每隔4h取样镜检，观察转孢状况，当转孢率在90％以上(如图6所示)时，即可下罐。
在本实施例中，将下罐的发酵液稀释涂布于NA培养基平板，每个稀释度设置三个平行样，37℃静置培养20h后计数，通过计数可知下罐的发酵液中菌体数量为220亿CFU/mL，芽孢浓度为200亿CFU/mL。
实施例2
本实施例提供了一种解淀粉芽孢杆菌JD的发酵培养方法，其中，发酵规模为2吨发酵罐。相较于实施例1的发酵工艺，本实施例的发酵工艺的区别之处在于：发酵培养基不相同。
本实施例的发酵培养基为：5g/L的葡萄糖、40g/L的玉米淀粉、50g/L的豆粕粉、12g/L酵母粉、8g/L的蛋白胨、5g/L的碳酸钙、5g/L的氯化钠、1g/L的硫酸镁、5g/L的磷酸氢二钾以及0.3g/L的硫酸锰。
在本实施例中，将下罐的发酵液稀释涂布于NA培养基平板，每个稀释度设置三个平行样，37℃静置培养20h后计数，通过计数可知下罐的发酵液中菌体数量为250亿CFU/mL，芽孢浓度为228亿CFU/mL。
实施例3
本实施例提供了一种解淀粉芽孢杆菌JD的发酵培养方法，其中，发酵规模为2吨发酵罐。相较于实施例1的发酵工艺，本实施例的发酵工艺的区别之处在于：发酵培养基不相同。
本实施例的发酵培养基为：3g/L的葡萄糖、20g/L的玉米淀粉、30g/L的豆粕粉、5g/L酵母粉、3g/L的蛋白胨、1g/L的碳酸钙、1g/L的氯化钠、0.5g/L的硫酸镁、1g/L的磷酸氢二钾以及0.1g/L的硫酸锰。
在本实施例中，将下罐的发酵液稀释涂布于NA培养基平板，每个稀释度设置三个平行样，37℃静置培养20h后计数，通过计数可知下罐的发酵液中菌体数量为180亿CFU/mL，芽孢浓度为150亿CFU/mL。
实施例4
本实施例提供了一种解淀粉芽孢杆菌JD的发酵培养方法，其中，发酵规模为2吨发酵罐。相较于实施例1的发酵工艺，本实施例的发酵工艺的区别之处在于：在采用2吨发酵罐进行发酵生产的过程中，培养温度始终控制在35℃。
在本实施例中，将下罐的发酵液稀释涂布于NA培养基平板，每个稀释度设置三个平行样，37℃静置培养20h后计数，通过计数可知下罐的发酵液中菌体数量为185亿CFU/mL，芽孢浓度为160亿CFU/mL。
实施例5
本实施例提供了一种解淀粉芽孢杆菌JD的发酵培养方法，其中，发酵规模为2吨发酵罐。相较于实施例1的发酵工艺，本实施例的发酵工艺的区别之处在于：在采用2吨发酵罐进行发酵生产的过程中，培养温度始终控制在37℃。
在本实施例中，将下罐的发酵液稀释涂布于NA培养基平板，每个稀释度设置三个平行样，37℃静置培养20h后计数，通过计数可知下罐的发酵液中菌体数量为230亿CFU/mL，芽孢浓度为185亿CFU/mL。
实施例6
本实施例提供了一种解淀粉芽孢杆菌JD的发酵培养方法，其中，发酵规模为2吨发酵罐。相较于实施例1的发酵工艺，本实施例的发酵工艺的区别之处在于：发酵培养基不相同。
本实施例的发酵培养基为：5g/L的葡萄糖、35g/L的玉米粉、40g/L的豆粕粉、10.5g/L酵母粉、8g/L的蛋白胨、3g/L的碳酸钙、2g/L的氯化钠、0.5g/L的硫酸镁、2g/L的磷酸氢二钾以及0.3g/L的硫酸锰。
在本实施例中，将下罐的发酵液稀释涂布于NA培养基平板，每个稀释度设置三个平行样，37℃静置培养20h后计数，通过计数可知下罐的发酵液中菌体数量为160亿CFU/mL，芽孢浓度为135亿CFU/mL。
实施例7
本实施例提供了一种解淀粉芽孢杆菌JD的发酵培养方法，其中，发酵规模为30L发酵罐。种子活化和制备一级种子液的方法参照实施例1。
向30L的发酵罐中加入15L的发酵培养基(与实施例1的发酵培养基相同)，并且加入2‰(体积比,V/V)的聚醚消泡剂，氢氧化钠调节pH为7.2，然后121℃灭菌20min，灭菌结束后向夹套内通冷水以快速冷却降温，并向罐内通入无菌空气保压0.05Mpa。当罐温冷却至40℃，取750mL的一级种子液按5％(体积比,V/V)的接种量接种上罐，初始转速为150r/min，初始通气量为0.5m3/h，初始温度为35℃，在发酵培养过程中，当溶氧低于20％时，逐渐提高转速至700r/min，并将通气量逐渐升高至3m3/h；当芽孢形成率达到70％后，将温度升高至38℃。发酵培养至24h时，每隔4h取样镜检，观察转孢状况，当转孢率在80％以上时，即可下罐。
其中，发酵培养过程中的菌体量、芽孢数以及转孢率详见下表8：
表8实施例7中解淀粉芽孢杆菌JD发酵培养过程中菌体量、芽孢数以及转孢率的变化情况表
Figure BDA0003440683370000151
对比例1
本对比例提供了一种解淀粉芽孢杆菌的发酵工艺，其中，发酵规模为2吨发酵罐。相较于实施例1的发酵工艺，本对比例的发酵工艺的区别之处在于：发酵培养基不相同。
本对比例的发酵培养基为：25g/L的葡萄糖、15g/L的玉米粉、40g/L的豆粕粉、10.5g/L酵母粉、8g/L的蛋白胨、3g/L的碳酸钙、2g/L的氯化钠、0.5g/L的硫酸镁、2g/L的磷酸氢二钾以及0.3g/L的硫酸锰。
在本实施例中，将下罐的发酵液稀释涂布于NA培养基平板，每个稀释度设置三个平行样，37℃静置培养20h后计数，通过计数可知下罐的发酵液中菌体数量为135亿CFU/mL，芽孢浓度为118亿CFU/mL。
对比例2
本对比例提供了一种解淀粉芽孢杆菌的发酵工艺，其中，发酵规模为2吨发酵罐。相较于实施例1的发酵工艺，本对比例的发酵工艺的区别之处在于：发酵培养基不相同。
本对比例的发酵培养基为：20g/L的葡萄糖、20g/L的玉米粉、40g/L的豆粕粉、10.5g/L酵母粉、8g/L的蛋白胨、3g/L的碳酸钙、2g/L的氯化钠、0.5g/L的硫酸镁、2g/L的磷酸氢二钾以及0.3g/L的硫酸锰。
在本对比例中，将下罐的发酵液稀释涂布于NA培养基平板，每个稀释度设置三个平行样，37℃静置培养20h后计数，通过计数可知下罐的发酵液中菌体数量为120亿CFU/mL，芽孢浓度为101亿CFU/mL。
在上述实施例中，对各个实施例和对比例的描述都各有侧重，某个实施例/对比例/实验例中没有详述的部分，可以参见其他实施例/对比例/实验例的相关描述。
以上对本发明实施例所提供的一种解淀粉芽孢杆菌、组合物及其应用与解淀粉芽孢杆菌的发酵培养方法，进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的技术方案及其核心思想；本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例的技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌的名称为JD，分类名称为：Bacillus amyloliquefaciens，保藏编号为：CCTCC NO:M 20211443，保藏日期为：2021年11月18日，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心。
2.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括如权利要求1中所述的解淀粉芽孢杆菌。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括可接受的辅料。
4.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物的剂型为片剂、颗粒剂、粉剂、喷雾剂、混悬液剂、乳剂、胶囊剂或膏剂。
5.如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌、或如权利要求2至4任一项中所述的组合物在制备饲料、食品或肥料中的应用。
6.一种用于解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基，其特征在于，按照质量份数计算，所述发酵培养基包括：3份至5份的速效碳源、20份至40份的迟效碳源、30份至50份的豆粕粉、5份至12份的酵母粉、3份至8份的蛋白胨、1份至5份的碳酸钙、1份至5份的氯化钠、0.5份至1份的硫酸镁、1份至5份的磷酸氢二钾以及0.1份至0.3份硫酸锰。
7.根据权利要求6所述的发酵培养基，其特征在于，所述速效碳源为葡萄糖，所述迟效碳源为玉米淀粉。
8.一种解淀粉芽孢杆菌的发酵培养方法，其特征在于，包括步骤：提供解淀粉芽孢杆菌的种子液，将所述解淀粉芽孢杆菌的种子液接种至如权利要求6或7所述的发酵培养基中进行发酵培养，培养温度为35℃至40℃，溶氧不低于20％，培养至芽孢形成率在90％以上。
9.根据权利要求8所述的发酵培养方法，其特征在于，在发酵培养过程中，芽孢形成率未达到70％时，培养温度为35至37℃；当芽孢形成率达到70％后，培养温度为38℃至40℃。
10.根据权利要求8所述的发酵培养方法，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌的种子液的制备方法包括步骤：提供解淀粉芽孢杆菌菌液，将所述解淀粉芽孢杆菌菌液接种于种子培养基中进行培养，培养温度为35℃至40℃，溶氧不低于20％，培养至芽孢形成率在90％以上；
其中，按照质量份数计算，所述种子培养基包括：10份至20份的酵母浸膏、10份至20份的蛋白胨和1份至5份的氯化钠。
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