CN111961701A - 一种解淀粉芽孢杆菌sz-60产胞外抑菌蛋白用发酵液及其发酵方法 - Google Patents

一种解淀粉芽孢杆菌sz-60产胞外抑菌蛋白用发酵液及其发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种解淀粉芽孢杆菌SZ‑60产胞外抑菌蛋白胞外蛋白用发酵液及其发酵方法。发酵培养液中每含1000mL去离子水时，其含有可溶性淀粉10‑20g，黄豆粉10‑20g，NaCl 2‑7g，MnSO4 2‑7mg，Ca(HCO3)2 5‑15mg，FeSO4 1‑4mg；发酵培养液的pH为6.5‑7.5。本发明优化了解淀粉芽孢杆菌SZ‑60产蛋白类抑菌物质的发酵培养条件组合，为解淀粉芽孢杆菌SZ‑60菌株工业化生产和获得高产蛋白类抑菌物质提供了技术支撑和理论指导。由解淀粉芽孢杆菌SZ‑60发酵制得的NB60YF微生物制剂对由灰葡萄孢引起的灰霉病具有良好的防治效果。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌SZ-60产胞外抑菌蛋白用发酵液及其发 酵方法
技术领域
本发明属于解淀粉芽孢杆菌SZ-60胞外抑菌蛋白的发酵工艺技术领域，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌SZ-60产胞外蛋白用发酵液及其发酵方法。
背景技术
人参(Panax ginseng Meyer)为五加科人参属多年生宿根药用植物，在中国、韩国、俄罗斯、朝鲜等国家有大面积种植。中国东北地区是中国人参的主产区，在长白山麓地区有大面积种植。由于地理位置特殊，由灰葡萄孢Botrytis cinerea Pers.ex Fr.引起的人参灰霉病频发。目前，防治人参灰霉病仍以化学防治为主，通过施用代森锰锌、腐霉利等控制病情蔓延，但长期大面积使用化学农药会造成病害抗药性、土壤农残、土壤微生态失衡等一些问题。生物防治办法可减少或抑制人参病害的发生，且具有绿色安全、高效等特点，因此，是目前最为理想的防治途径之一，也是植物病害防治的主要研究方向。研究发现，内生细菌NJ13菌株发酵液对人参黑斑病具有防治作用；分离自人参根围土壤的芽孢杆属(Bacllius spp.)菌株可用于防治腐皮镰孢菌Fusarium solani(mart.)App.et Wollenw引起的人参根腐病和恶疫霉Phytophthora cactorum引发的人参疫病。
关于利用生防细菌防治植物真菌性病害，如何有效地提高其产胞外抑菌物质的能力是提高其生防效力的关键。有研究者证实，芽孢杆菌通过核糖体及非核糖体合成途径产生的抑菌蛋白具有直接杀死或抑制病原物生长、与病原菌进行营养和空间的竞争及诱导植物产生抗病性的作用。目前，芽胞杆菌发酵的常用培养基主要成分有黄豆饼粉、小麦粉、玉米糊、鱼粉和酵母膏(粉)以及一些微量元素等。针对不同的菌株，培养基组分的不同可对发酵液菌含量及抑菌物质合成积累产生较大影响。通过优化解淀粉芽胞杆菌Lx-11的发酵培养基，张荣胜等(解淀粉芽胞杆菌Lx-11生物发酵工艺优化，2013，29(2)：254-262)发现菌株发酵液的菌含量、抑菌效果分别提高了180％和30％；研究发现，发酵培养基中豆粕含量的高低对枯草芽孢杆菌NJ-18的菌含量和抑菌活性存在较大的影响；张文芝等(蜡质芽孢杆菌AR156发酵培养基及发酵条件的优化，2010，37(6)：803-810)研究发现，碳、氮源以及无机盐含量的变化对提高蜡质芽孢杆菌Bacillus cereus产胞外抑菌物质的能力有利。
解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens SZ-60是发明人课题组前期分离获得的一株对人参灰霉病等真菌性病害具有良好防治效果的生防细菌。该菌株现保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(保藏编号为CGMCC No.8277)，并拥有名称为“一种解淀粉芽孢杆菌及其应用”、授权公告号为CN103789234B的发明专利。为了进一步提高解淀粉芽孢杆菌SZ-60微生物制剂中抑菌蛋白的含量，亟需对解淀粉芽孢杆菌SZ-60产抑菌蛋白的发酵方法进行优化。
发明内容
本发明提供一种发酵培养液，所述发酵培养液中每含1000mL去离子水时，其含有可溶性淀粉10-20g，黄豆粉10-20g，NaCl 2-7g，MnSO4 2-7mg，Ca(HCO3)2 5-15mg，FeSO4 1-4mg。
例如，所述发酵培养液中每含1000mL去离子水时，其含有可溶性淀粉12-18g，黄豆粉12-18g，NaCl 3-6g，MnSO4 3-6mg，Ca(HCO3)2 7-13mg，FeSO4 1.5-3mg。
示例性地，所述发酵培养液中每含1000mL去离子水时，其含有可溶性淀粉15.0g，黄豆粉15.0g，NaCl 5.0g，MnSO4 5.0mg，Ca(HCO3)2 10.0mg，FeSO4 2.0mg。
根据本发明，所述发酵培养液的pH为6.5-7.5，例如为6.7-7.2，示例性为7.0。
根据本发明的实施方案，所述发酵培养液每1000mL去离子水含有可溶性淀粉15.0g，黄豆粉15.0g，NaCl 5.0g，MnSO4 5.0mg，Ca(HCO3)2 10.0mg，FeSO4 2.0mg，pH 7.0。
本发明还提供上述发酵培养液的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
按上述用量称取可溶性淀粉、黄豆粉、NaCl、MnSO4、Ca(HCO3)2以及FeSO4，放入去离子水中加热溶解混匀，调整混合液的pH至6.5-7.5，湿热灭菌后冷却备用。
根据本发明，所述湿热灭菌的温度为115-125℃，例如118-123℃，示例性为121℃。进一步地，所述湿热灭菌的时间为10-60min，例如20-50min，示例性为30min。
根据本发明，所述发酵培养液的制备方法包括如下步骤：以1000mL去离子水计，将可溶性淀粉12-18g，黄豆粉12-18g，NaCl 3-6g，MnSO4 3-6mg，Ca(HCO3)2 7-13mg，FeSO41.5-3mg，放入去离子水中加热溶解，充分搅拌混合均匀，调整混合液的pH至6.7-7.2，于118-123℃湿热灭菌20-50min，冷却备用。
根据本发明示例性的实施方案，所述发酵培养液的制备方法包括如下步骤：以1000mL去离子水计，将可溶性淀粉15.0g，黄豆粉15.0g，NaCl 5.0g，MnSO4 5.0mg，Ca(HCO3)210.0mg，FeSO4 2.0mg，放入去离子水中加热溶解，充分搅拌混合均匀，调整混合液的pH至7.0，用双层封口膜封好三角瓶口，121℃湿热灭菌30min，冷却后立即接种。
本发明还提供上述发酵培养液在解淀粉芽孢杆菌SZ-60产胞外抑菌蛋白中的应用。其中，所述解淀粉芽孢杆菌SZ-60的保藏号为CGMCC No.8277。
本发明还提供一种解淀粉芽孢杆菌SZ-60产胞外抑菌蛋白的发酵方法，包括如下步骤：
(1)将解淀粉芽孢杆菌SZ-60菌种活化于牛肉膏蛋白胨培养基，培养后挑取单一菌落接种于牛肉膏蛋白胨培养液中，培养后，从得到的细菌培养液中分离出菌体，将所得菌体制成含菌量为108CFU/mL数量级的细菌悬液备用；
(2)吸取步骤(1)所述细菌悬液，接种于NBYM发酵液中，培养至发酵液菌体生长较为饱满即将出现芽孢时，得到发酵种子液；
(3)将步骤(2)所述发酵种子液接种于发酵培养液中，培养得到解淀粉芽孢杆菌SZ-60发酵液；
所述发酵培养液具有如上文所述的含义。
根据本发明，步骤(1)中，所述牛肉膏蛋白胨培养基中每含1000mL去离子水时，其含有牛肉膏2.5-3.5g、蛋白胨7-15g、NaCl 3-8g，琼脂12-20g。例如，所述牛肉膏蛋白胨培养基中每含1000mL去离子水时，其含有牛肉膏2.8-3.2g、蛋白胨8-12g、NaCl 4-7g，琼脂14-18g。示例性地，所述牛肉膏蛋白胨培养基中含有牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g，琼脂16.0g，去离子水1000mL。进一步地，所述牛肉膏蛋白胨培养基的pH为6.5-7.2，例如为6.8-7.0。
根据本发明，步骤(1)中，所述牛肉膏蛋白胨培养基的制备过程包括：按照上述用量，将牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂和去离子水混合均匀，调整混合物pH至6.5-7.2，115-125℃湿热灭菌20-50min，冷却后备用。例如，按照上述用量，将牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂和去离子水混合均匀，调整混合物pH至6.8-7.0，121℃湿热灭菌30min，冷却后备用。
根据本发明，步骤(1)中，所述解淀粉芽孢杆菌SZ-60在所述牛肉膏蛋白胨培养基中的培养条件包括：35-40℃人工气候箱内培养12-30h，传代2-3次；例如，37℃人工气候箱内培养16-24h，传代2-3次。
根据本发明，步骤(1)中，所述牛肉膏蛋白胨培养液为不含琼脂的所述牛肉膏蛋白胨培养基。其中，所述牛肉膏蛋白胨培养液与培养器的体积比为(30-60)mL/250mL，例如(40-55)mL/250mL，示例性为50mL/250mL。
根据本发明，步骤(1)中，所述单一菌落在所述牛肉膏蛋白胨培养液中的培养条件包括：30-32℃、160-200转/min恒温振荡培养12-20h，例如30-32℃、180转/min恒温振荡培养18-24h。
根据本发明，步骤(1)中，菌体分离的操作包括：所述细菌培养液在2-5℃、4000-5500转/min、15-20min条件下，离心2-4次，弃去上清液，得到菌体。例如，所述菌体分离的操作包括：所述细菌培养液在4℃、4500-5000转/min、15-20min条件下，离心2次，弃去上清液，得到菌体。
根据本发明，步骤(1)中，所述细菌悬液采用血球计数板法计数。
根据本发明，步骤(2)中，所述NBYM发酵液中每含1000mL去离子水时，还含有牛肉膏2-7g，蛋白胨5-15g，酵母浸膏2-10g，麦芽浸膏4-12g，葡萄糖2-7g，MgSO4 5-15mg。例如，所述NBYM发酵液中每含1000mL去离子水时，还含有牛肉膏3-6g，蛋白胨7-12g，酵母浸膏4-8g，麦芽浸膏6-10g，葡萄糖2.5-5g，MgSO4 7-12mg。示例性地，所述NBYM发酵液中以1000mL去离子水计，含有牛肉膏4.0g，蛋白胨9.0g，酵母浸膏6.5g，麦芽浸膏8.0g，葡萄糖3.0g，MgSO4 10.0mg。进一步地，所述NBYM发酵液的pH为6.5-7.2，例如为6.8-7.0。根据本发明示例性的方案，所述NBYM发酵液中以1000mL去离子水计，含有牛肉膏4.0g，蛋白胨9.0g，酵母浸膏6.5g，麦芽浸膏8.0g，葡萄糖3.0g，MgSO4 10.0mg，pH 6.8-7.0。
根据本发明，步骤(2)中，所述NBYM发酵液的制备过程包括：按上述用量称取牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、麦芽浸膏、葡萄糖和MgSO4，放入去离子水中加热溶解混匀，将pH调整至6.5-7.2，三角瓶中发酵液装液量为(100-150)mL/500mL，用膜封好三角瓶口，115-125℃湿热灭菌20-40min，冷却后备用。例如，所述NBYM发酵液的制备过程包括：按上述用量称取牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、麦芽浸膏、葡萄糖和MgSO4，放入去离子水中加热溶解混匀后，将pH调整至6.8-7.2，三角瓶中发酵液装液量为125mL/500mL，用双层封口膜封好三角瓶口，121℃湿热灭菌30min，冷却后备用。
根据本发明，步骤(2)中，所述细菌悬液与所述NBYM发酵液的体积比为1:(15-40)，例如1:(20-35)，示例性为1:25。
根据本发明，步骤(2)中，所述NBYM发酵液与培养器的体积比为(100-150)mL/500mL，例如(110-130)mL/500mL，示例性为125mL/500mL。
根据本发明，步骤(2)中，所述培养的条件包括：30-35℃、140-180转/min恒温振荡培养至8-16h(例如33℃、165转/min恒温振荡培养至12h)，之后每隔2h对SZ-60菌株发酵液进行发酵质量检测，直到发酵液菌体生长较为饱满即将出现芽孢时，即获得发酵种子液；例如，所述SZ-60菌株的发酵的总时间为24-28h。
根据本发明，步骤(3)中，所述发酵培养液与培养器的体积比为(150-300)mL/500mL，例如(170-250)mL/500mL，示例性为200mL/500mL。
根据本发明的实施方案，步骤(3)中，所述发酵种子液与所述发酵培养液的体积百分比为3-8％，例如3.5-7％，示例性为4％。
根据本发明的实施方案，步骤(3)中，所述培养的条件包括：28-32℃、150-200转/min恒温振荡培养1.5-5d；例如30℃、180转/min恒温振荡培养3d。
根据本发明示例性的方案，所述解淀粉芽孢杆菌SZ-60产胞外抑菌蛋白的发酵方法，包括如下步骤：
(1)将解淀粉芽孢杆菌SZ-60菌种活化于牛肉膏蛋白胨培养基，37℃培养18-24h，传代2-3次，挑取单一菌落接种于牛肉膏蛋白胨培养液30-32℃、180转/min恒温振荡培养18-24h，所得细菌培养液经4℃、4500-5000转/min、15-20min条件离心2次，弃上清，采用血球计数板法，将所得菌体制成约为108CFU/mL的SZ-60细菌悬液备用；
所述牛肉膏蛋白胨培养基中每1000mL去离子水，含有牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g，琼脂16.0g，pH 6.8-7.0；
所述牛肉膏蛋白胨培养液中含有牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g，pH 6.8-7.0，去离子水1000mL；
(2)吸取SZ-60细菌悬液，接种于含NBYM发酵液，接种量为4％(v/v)，33℃、165转/min恒温振荡培养至12h，之后每隔2h对SZ-60菌株发酵液进行发酵质量检测，直到发酵液菌体生长即将出现芽孢时，即获得发酵种子液，发酵时间为24-28h；
所述NBYM发酵液中每1000mL去离子水，含有牛肉膏4.0g，蛋白胨9.0g，酵母浸膏6.5g，麦芽浸膏8.0g，葡萄糖3.0g，MgSO4 10.0mg，pH 6.8-7.0；
(3)将所述发酵种子液以接种量4％接种于含200mL发酵培养液的500mL三角瓶，摇床振荡培养，发酵温度30℃，转速为180转/min，发酵时间为3d，即获得解淀粉芽孢杆菌SZ-60发酵液；
所述发酵培养液中含有每1000mL去离子水，可溶性淀粉15.0g，黄豆粉15.0g，NaCl5.0g，MnSO4 5.0mg，Ca(HCO3)2 10.0mg，FeSO4 2.0mg，pH 7.0。
根据本发明，所述发酵方法为摇瓶发酵方法，适用于摇瓶中的发酵。
本发明还提供上述发酵方法制备得到的解淀粉芽孢杆菌SZ-60发酵液。其中，所述解淀粉芽孢杆菌SZ-60发酵液中含菌量超过5.00×109CFU/mL，例如超过6.5×109CFU/mL，示例性为(8.88±0.15)×109CFU/mL。其中，所述解淀粉芽孢杆菌SZ-60发酵液中可溶性抑菌蛋白的浓度高于9μg/mL，例如高于9.5μg/mL，示例性为10.20±0.04μg/mL。
本发明还提供上述解淀粉芽孢杆菌SZ-60发酵液在制备防治植物真菌病害的微生物制剂中的应用。优选地，所述真菌病害为灰葡萄孢(B.cinerea Pers.ex Fr.)引起的灰霉病。优选地，所述植物为人参。
本发明还提供一种微生物制剂，所述微生物制剂中含有所述解淀粉芽孢杆菌SZ-60发酵液。例如，可将所述微生物制剂记为NB60YF微生物制剂。其中，所述解淀粉芽孢杆菌SZ-60发酵液中含菌量超过5.00×109CFU/mL，例如超过6.5×109CFU/mL，示例性为(8.88±0.15)×109CFU/mL。其中，所述解淀粉芽孢杆菌SZ-60发酵液中可溶性抑菌蛋白的浓度高于9μg/mL，例如高于9.5μg/mL，示例性为10.20±0.04μg/mL。
本发明还提供所述微生物制剂的制备方法，所述方法可以与上述解淀粉芽孢杆菌SZ-60发酵液产胞外抑菌蛋白的发酵方法相同。
本发明还提供所述微生物制剂在制备防治植物真菌病害的微生物制剂中的应用。优选地，所述真菌病害为灰葡萄孢(B.cinerea Pers.ex Fr.)引起的灰霉病。优选地，所述植物为人参。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种适用于保藏编号为CGMCC No.8277的解淀粉芽孢杆菌SZ-60的发酵培养基，并进一步筛选获得解淀粉芽孢杆菌SZ-60的最佳摇瓶发酵条件组合。本发明解决了现有解淀粉芽孢杆菌SZ-60微生物制剂中抑菌蛋白含量偏低的问题，得到了优化的解淀粉芽孢杆菌SZ-60高产胞外抑菌蛋白的发酵工艺，并验证该条件所得SZ-60菌株发酵液对人参灰霉病的防治效果。与优化前的摇瓶发酵条件组合相比，采用高产胞外抑菌蛋白摇瓶发酵工艺提高了解淀粉芽孢杆菌SZ-60所产抑菌蛋白对灰葡萄孢(B.cinerea Pers.exFr.)的抑菌效率，增长量为8.56％；同时，SZ-60菌株发酵液的含量菌提高了157.39％，发酵液的蛋白含量提高了13.71％。本发明为解淀粉芽孢杆菌的菌株工业化生产及获得高产蛋白类抑菌物质提供了技术支撑和理论指导。
本发明的优点在于，由保藏编号为CGMCC No.8277的解淀粉芽孢杆菌SZ-60发酵制得的NB60YF微生物制剂可对由灰葡萄孢(B.cinerea Pers.ex Fr.)引起的人参灰霉病具有良好的防治效果，无毒无致病性，对人畜安全，不污染环境；生防菌剂稀释后，利用灌根方式直接施加于植物土壤中即可发挥其杀菌作用，可显著改善植物栽培土壤微生态环境，提高植物栽培土壤质量，从而有效地、持久地控制植物真菌性病害的流行。
附图说明
图1为不同发酵培养基对SZ-60胞外蛋白抑菌活性的影响。
图2为不同碳源及其含量对SZ-60胞外蛋白抑菌活性的影响。
图3为不同氮源及其含量对SZ-60胞外蛋白抑菌活性的影响。
图4为不同发酵时间对SZ-60胞外蛋白抑菌活性的影响。
图5为不同发酵温度对SZ-60胞外蛋白抑菌活性的影响。
图6为不同初始pH对SZ-60胞外蛋白抑菌活性的影响。
图7为不同接种量对SZ-60胞外蛋白的抑菌活性的影响。
图8为不同发酵液体积对SZ-60胞外蛋白抑菌活性的影响。
图9为NB60YF微生物制剂对人参灰霉病的防治效果；
其中，A：NB60YF微生物制剂+病原菌，B：农药+病原菌，C：空白对照，D：单接病原真菌。
图10为施加NB60YF微生物制剂与农药的人参根对比；
其中，A：农药+病原菌，B：NB60YF微生物制剂+病原菌。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
实施例1
解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens SZ-60由中国普通微生物菌种保藏管理中心保存，灰葡萄孢Botrytis cinerea Pers.ex Fr.由吉林农业大学省部共建生态恢复与生态系统管理国家重点实验室保存。
解淀粉芽孢杆菌SZ-60的活化采用牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g，琼脂16.0g，去离子水1000mL，pH 6.8-7.0)；细菌悬液的制备采用牛肉膏蛋白胨培养液(不含琼脂的牛肉膏蛋白胨培养基质)；发酵种子液的制备采用NBYM发酵液(牛肉膏4.0g，蛋白胨9.0g，酵母浸膏6.5g，麦芽浸膏8.0g，葡萄糖3.0g，MgSO4 10.0mg，去离子水1000mL，6.8-7.2)；灰葡萄孢的活化采用PDA培养基(马铃薯淀粉5.0g、葡萄糖20.0g、琼脂22.0g，去离子水1000mL，pH 7.0-7.2)。本实施例涉及的8种发酵液详见表1。
表1 发酵液的种类与组成
Figure BDA0002377606840000101
发酵种子液的制备：将解淀粉芽孢杆菌SZ-60试管种活化于牛肉膏蛋白胨培养基，37℃人工气候箱内培养24h，传代3次，挑取单一菌落接种于含50mL牛肉膏蛋白胨培养液的250mL三角瓶，32℃、180转/min恒温振荡培养24h，所得细菌培养液经4℃、4500转/min、20min条件离心2次，弃上清，采用血球计数板法，将所得菌体制成含菌量约为108CFU/mL的细菌悬液，吸取细菌悬液5mL，接种于含125mL NBYM发酵液的500mL三角瓶，33℃、165转/min恒温振荡培养至12h，之后每隔2h对SZ-60菌株发酵液进行发酵质量检测，直到发酵液菌体生长比较饱满即将出现芽孢时，即获得发酵种子液，发酵时间为24-28h。
无菌滤液的制备：无菌条件下，将发酵种子液以5.0％(v/v)接种量接入含100mL发酵液的250mL三角瓶，34℃、180转/min恒温振荡培养5d，所得各发酵液经4℃、4500转/min、20min条件离心2次，弃菌体保留上清液，收集上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，即得去菌体发酵滤液，简称无菌滤液。
抑菌蛋白的提取：取(NH4)2SO4粉末加入无菌滤液至饱和度为70％，4℃人工气候培养箱内静置过夜后，于4℃、12000转/min离心25min，所得沉淀经pH为7.0的PBS缓冲液重悬、0.22μm微孔滤膜过滤、
Figure BDA0002377606840000111
Pro纯化超滤管置换除盐以及浓缩，所得胞外浓缩蛋白用无菌去离子水等体积定容，4℃保藏备用，用于抑菌活性测定。
抑菌活性的测定：采用牛津杯法，以灰葡萄孢作为病原靶标菌，将灰葡萄孢于PDA平板活化、传代培养至第4代后，用打孔器制作8.0mm的菌饼，转接入无菌PDA平板中央，28℃人工气候箱内下培养24h，以菌饼为中心，向距离中心25.0mm处、十字方位的4个角点分别放置无菌牛津杯(规格为内径6mm、外径8mm、高10mm)，每杯内滴加200μL胞外蛋白液，28℃人工气候箱内培养7d后待病原真菌长满平板，测量处理菌落直径并计算其抑菌率。
抑菌率(％)＝[(A－B)/(A－8)]×100％，A为对照组病原菌菌落直径，即90mm；B为处理组病原菌菌落直径，数字为病原菌菌饼直径。
发酵工艺的优化：
基础发酵液的筛选：根据解淀粉芽孢杆菌SZ-60经表1中各优选发酵液发酵培养后所得蛋白液对灰葡萄孢菌丝体生长的抑制情况，比较各处理组抑菌率的大小，筛选基础发酵液。结果如图1所示，可以发现，BPY发酵液的抑菌效果最好，故以BPY发酵液的培养基成分作为基础，进行下一步的单因素发酵试验。
采用单因素法进行解淀粉芽孢杆菌SZ-60的摇瓶发酵试验：
共包括发酵液的碳源及其浓度、氮源及其浓度、发酵时间、发酵温度、初始pH、接种量、装液量9个因素。
最佳发酵碳源及浓度的筛选：将BPY基础发酵液中的碳源，以等量各优选碳源做替代，包括可溶性淀粉、麦芽糖、木糖、玉米淀粉、蔗糖、纤维素以及乳糖共7种备选碳源，其余的发酵条件不变，以菌株SZ-60经BPY基础发酵液发酵作为阳性对照，牛津杯法测定各处理蛋白的抑菌活性，每处理3次重复。如图2中的A可知，可溶性淀粉可作为菌株SZ-60的最佳碳源。以可溶性淀粉浓度梯度为5、7、10、15、20、30mg/mL制备发酵液并发酵菌株SZ-60，提取胞外可溶性抑菌蛋白，以供试灰葡萄孢为病原靶标菌，牛津杯蛋白抑菌活性，每处理3次重复。如图2中的B可知，当发酵液中的可溶性淀粉含量为15mg/mL时，SZ-60抑菌蛋白抑菌活性最高，抑菌率达84.62％。故选取15mg/mL作为最佳碳源(可溶性淀粉)浓度用于单因素试验，选取10、15、20mg/mL这3个水平用于正交试验的设计。
最佳发酵氮源及浓度的筛选：以15mg/mL可溶性淀粉作为BPY发酵液碳源，以等量各优选氮源做替代，包括黄豆粉、尿素、硝酸钾、鱼粉、花生粉、玉米粉以及菜籽粉共7种备选氮源，其余的发酵条件不变，以菌株SZ-60经BPY基础发酵液(碳源为可溶性淀粉)发酵作为阳性对照，牛津杯法测定各处理蛋白的抑菌活性，每处理3次重复。如图3中的A可知，黄豆粉可作为菌株SZ-60的最佳氮源。以黄豆粉浓度梯度为10、15、20、25、30mg/mL制备发酵液并发酵菌株SZ-60，提取胞外可溶性抑菌蛋白，以供试灰葡萄孢为病原靶标菌，牛津杯蛋白抑菌活性，每处理3次重复。如图3中的B可知，当发酵液中的黄豆粉含量为15mg/mL时，SZ-60抑菌蛋白抑菌活性最高，抑菌率达87.03％。故选取15mg/mL作为最佳氮源(黄豆粉)浓度用于单因素试验，选取10、15、20mg/mL这3个水平用于正交试验的设计。
最佳发酵时间的筛选：以15mg/mL可溶性淀粉、15mg/mL黄豆粉作为BPY发酵液碳源、氮源，以时间梯度为0.5d、1d、2d、3d、4d、5d、6d及7d对SZ-60菌株进行发酵，其余的发酵条件不变，提取胞外可溶性抑菌蛋白，以供试灰葡萄孢为病原靶标菌，牛津杯法测定各处理蛋白的抑菌活性，每处理3次重复。如图4所示，菌株发酵3d后，所得蛋白抑菌活性最高，抑菌率为87.36％。故选取菌株SZ-60的最佳发酵时间为3d，并选取发酵时间2d、3d、4d这3个水平进行SZ-60正交试验的设计。
最佳发酵温度的筛选：以15mg/mL可溶性淀粉、15mg/mL黄豆粉作为BPY发酵液碳源、氮源，发酵时间为3d，以温度梯度为25℃、28℃、30℃、32℃、35℃及37℃对SZ-60菌株进行发酵，其余的发酵条件不变，提取胞外可溶性抑菌蛋白，以供试灰葡萄孢为病原靶标菌，牛津杯法测定各处理蛋白的抑菌活性，每处理3次重复。如图5所示，发酵温度为32℃时最高，所得蛋白抑菌活性最高，抑菌率为87.14％。故选取菌株SZ-60的最佳发酵温度为32℃，并选取发酵时间30℃、32℃、35℃这3个水平进行SZ-60正交试验的设计。
最佳初始pH的筛选：以15mg/mL可溶性淀粉、15mg/mL黄豆粉作为BPY发酵液碳源、氮源，发酵时间为3d，发酵温度32℃，以发酵液初始pH梯度为4、5、6、6.5、7、7.5及8对SZ-60菌株进行发酵，余下发酵条件不变，提取胞外可溶性抑菌蛋白，以供试灰葡萄孢为病原靶标菌，牛津杯法测定各处理蛋白的抑菌活性，每处理3次重复。如图6所示，初始pH为7.5时蛋白的抑菌活性开始出现峰值，抑菌率为87.17％。故选取菌株SZ-60的最佳初始pH为7.5，并选取发酵液初始pH 7、7.5、8这3个水平进行SZ-60正交试验的设计。
最佳接种量的筛选：以15mg/mL可溶性淀粉、15mg/mL黄豆粉作为BPY发酵液碳源、氮源，发酵时间3d，发酵温度32℃，发酵液初始pH 7.5，以接种量梯度为3％、4％、5％、6％、8％和10％对SZ-60菌株进行发酵，余下发酵条件不变，提取胞外可溶性抑菌蛋白，以供试灰葡萄孢为病原靶标菌，牛津杯法测定各处理蛋白的抑菌活性，每处理3次重复。如图7所示，接种量为5％时蛋白的抑菌活性开始出现峰值，抑菌率为86.56％；而高于5％时其抑菌活性变化较为平缓，抑菌率基本持平。故选取菌株SZ-60的最佳接种量为5％，并选取接种量为4％、5％、6％这3个水平进行SZ-60正交试验的设计。
最佳发酵液装液量的筛选：以15mg/mL可溶性淀粉、15mg/mL黄豆粉作为BPY发酵液碳源、氮源，发酵时间3d，发酵温度32℃，发酵液初始pH 7.5，接种量5％，以装液量梯度为50mL/500mL、100mL/500mL、150mL/500mL、200mL/500mL、250mL/500mL和300mL/500mL注入发酵液并对SZ-60菌株进行发酵，提取胞外可溶性抑菌蛋白，以供试灰葡萄孢为病原靶标菌，牛津杯法测定各处理蛋白的抑菌活性，每处理3次重复。如图8所示，当发酵液装液量为150mL/500mL时，蛋白的抑菌率达到峰值，为86.05％，而后随着装液量的增加，抑菌活性大幅下降，说明装液量大小对菌株SZ-60抑菌蛋白的积累存在较大影响。故选取装液量为100mL/500mL、150mL/500mL、200mL/500mL这3个水平进行SZ-60正交试验的设计。
解淀粉芽孢杆菌SZ-60的多因素多水平正交试验：
基于单因素方法建立7因素3水平模型，设计以可溶性淀粉浓度(10、15、20mg/mL)、黄豆粉浓度(10、15、20mg/mL)、发酵时间(2d、3d、4d)、发酵温度(30℃、32℃、35℃)、初始pH(7、7.5、8)、接种量(4％、5％、6％)、装液量(100mL/500mL、150mL/500mL、200mL/500mL)这7种因素(详见表2)，采用DPS 9.50设计正交表L1837，进行正交试验以明确SZ-60菌株的最佳发酵因素水平组合。首先，需考虑选择供试主要7因素中的最佳水平条件的问题；其次，需结合提高生产效率、节约劳动成本以及合理缩短发酵周期等问题。通过综合考虑主、次问题，进而获取对生产菌株SZ-60具有现实意义的最佳发酵条件。
表2 菌株SZ-60发酵水平与因素
Figure BDA0002377606840000141
字母代表A：可溶性淀粉，B：黄豆粉，C：发酵时间，D：发酵温度，E：初始pH，F：接种量，G：装液量
发酵培养基关键组分及培养条件正交分析：根据菌株SZ-60胞外可溶性抑菌蛋白发酵条件的正交优化测试指标(表3)，对其发酵优化组合进行选取。发酵各因素包括碳源(可溶性淀粉)浓度(A)、氮源(黄豆粉)浓度(B)、发酵时间(C)、发酵温度(D)、初始pH(E)、接种量(F)以及装液量(G)经F检验法分析可知，用于发酵菌株SZ-60的可溶性淀粉浓度、黄豆粉浓度、发酵时间及初始pH的F值均呈现极显著(P<0.01)；其接种量F值呈显著；而发酵温度和装液量F值不明显。以抑菌蛋白对灰葡萄孢的抑菌活性作为参考，发酵各因素经极差分析后的主次顺序为：C>E>B>A>F>D>G。综合发酵各因素显著分析、极差分析以及各因素水平K值分析，最终将菌株SZ-60的最佳发酵条件组合选取为：A2B2C2D1E1F1G3，即我们得到最佳发酵培养条件为：可溶性淀粉15.0g，黄豆粉15.0g，NaCl 5.0g，MnSO4 5.0mg，Ca(HCO3)2 10.0mg，FeSO4 2.0mg，pH 7.0，1000mL去离子水，装液量：200mL/500mL三角瓶，接种量：4％，发酵时间：3d，发酵温度：30℃，转速：180转/min。按照如上发酵方法所得SZ-60菌株发酵液为NB60YF微生物制剂。
表3 菌株SZ-60最佳发酵因子的方差分析
Figure BDA0002377606840000151
Figure BDA0002377606840000161
发酵优化工艺的实验验证
蛋白抑菌效果：如表4所示，经优化后，解淀粉芽孢杆菌SZ-60胞外可溶性抑菌蛋白的抑菌率高达92.13％，较优化前发酵条件组合(牛肉膏蛋白胨培养液配方：牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g，去离子水1000mL，pH 6.8-7.0；装液量：100mL/250mL三角瓶；接种量：5％；发酵时间：5d；发酵温度：34℃；转速：190r/min)的抑菌效率提高8.56％。差异显著性分析表明，优化后胞外可溶性抑菌蛋白的抑菌效果较阳性对照组呈现极显著(p<0.01)。
表4 菌株SZ-60胞外可溶性蛋白抑菌效果
Figure BDA0002377606840000162
不同字母表示经Duncan氏法检验差异显著(p＜0.05、p＜0.01)。下同。
发酵液含菌量：如表5所示，经优化后，SZ-60菌株发酵液含菌量为8.88×109CFU/mL，较优化前发酵条件组合的含菌量提高了157.39％。差异显著性分析表明，优化后的发酵液含菌量较阳性对照组呈现极显著(p<0.01)。
表5 菌株SZ-60发酵液的含菌量
Figure BDA0002377606840000163
发酵液可溶性蛋白含量：如表6所示，经优化后，SZ-60菌株发酵液所含的可溶性蛋白浓度为10.20μg/mL，较优化前发酵条件组合提高了13.71％。差异显著性分析表明，优化后的可溶性蛋白浓度较阳性对照组呈现极显著(p<0.01)。
表6 菌株SZ-60发酵液可溶性抑菌蛋白含量
Figure BDA0002377606840000171
蛋白浓度计算：采用考马斯亮蓝法。取浓度梯度为0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.10μg/μL的牛血清蛋白标准溶液1.0mL，加入考马斯亮蓝染料充分振荡混合5min，于波长A595nm处测定各浓度梯度标准样品的吸光度，用以绘制标准曲线，横坐标描述的是标准蛋白浓度，纵坐标描述的是A595nm测得的吸光度值；取待测蛋白液样品1.0mL，加入染料溶液5mL，混匀5min，于波长A595nm处检测其吸光度，对照标准曲线可知蛋白液样品浓度；考马斯亮蓝染料配方为：100mg考马斯亮蓝G-250加入至100mL的85％的浓磷酸(v/v)和50mL的无水乙醇充分混合溶解，无菌去离子水定容1000mL，经0.45μm微孔滤膜过滤后避光保藏于棕色广口瓶中备用。
实施例2
解淀粉芽孢杆菌SZ-60细菌悬液的制备
将解淀粉芽孢杆菌SZ-60试管种活化于牛肉膏蛋白胨培养基，37℃人工气候箱内培养24h，传代3次，挑取单一菌落接种于含50mL牛肉膏蛋白胨培养液的250mL三角瓶，32℃、180转/min恒温振荡培养18-24h，所得细菌培养液经4℃、4500转/min、20min条件离心2次，弃上清，采用血球计数板法，将所得菌体制成含菌量约为108CFU/mL的细菌悬液，备用。
细菌悬液含菌量计算：采用血球计数板法。将10μL细菌发酵液点接于血球计数板，对血球计数板中间、左上、左下、右上、右下这5个中号方块中的细菌菌体进行记录，并将其编号为a1，a2，a3，a4，a5，含菌量(CUF/mL)＝(a1+a2+a3+a4+a5)×[400×104]×10/80。
牛肉膏蛋白胨培养基的配方为：牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g，琼脂16.0g，pH 6.8-7.0，去离子水1000mL，121℃湿热灭菌30min，冷却后备用。牛肉膏蛋白胨培养液的配方为：不加琼脂的NA培养基质。
实施例3
NB60YF微生物制剂的制备
NB60YF微生物制剂含有解淀粉芽孢杆菌SZ-60的全发酵液培养物，制备方法如下：
(1)吸取实施例2的SZ-60细菌悬液5mL，接种于含125mL NBYM发酵液的500mL三角瓶，33℃、165转/min恒温振荡培养至12h，之后每隔2h对SZ-60菌株发酵液进行发酵质量检测，直到发酵液菌体生长比较饱满即将出现芽孢时，即获得发酵种子液，发酵时间为24-28h；
(2)将发酵种子液以接种量4％接种于含200mL NB60Y发酵液的500mL三角瓶，摇床振荡培养，发酵温度30℃，转速为180转/min，发酵时间为3d，即获得解淀粉芽孢杆菌SZ-60发酵液，将其记为NB60YF微生物制剂。
NBYM发酵液的配方为：牛肉膏4.0g，蛋白胨9.0g，酵母浸膏6.5g，麦芽浸膏8.0g，葡萄糖3.0g，MgSO4 50.0mg，去离子水1000mL，pH 6.8-7.2；制备方法为：称取牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、麦芽浸膏、葡萄糖、MgSO4粉末放入1000mL水中加热煮沸混匀后，将pH调整至6.8-7.2，三角瓶中发酵液装液量为125mL/500mL，用双层封口膜封好三角瓶口，121℃湿热灭菌30min，冷却后备用。
NB60Y发酵液的配方为：黄豆粉15.0g，淀粉15.0g，NaCl 5.0g，MnSO4 5.0mg，Ca(HCO3)2 10.0mg，FeSO4 2.0mg，去离子水1000mL，pH 7.0；制备方法为：称取黄豆粉、淀粉、NaCl粉末、MnSO4粉末、Ca(HCO3)2粉末以及FeSO4粉末加入1000mL水中加热混匀后，将pH调整到7.0，三角瓶中发酵液装液量为200mL/500mL，用双层封口膜封好三角瓶口，121℃湿热灭菌30min，冷却后立即接种。
实施例4
实施例3制备的NB60YF微生物制剂对人参灰霉病的盆栽防治试验
人参灰霉病菌(灰葡萄孢)孢子悬液的制备：
将低温保藏的灰葡萄孢置于室温下恢复30min后，无菌条件下挑取病原菌菌丝体接种于PDA平板中央，28℃人工气候箱内倒置培养，待菌株长满平板传代培养至第4代备用。
灰葡萄孢B.cinerea Pers.ex Fr.孢子悬液的制备：收集B.cinerea Pers.ex Fr.菌体接种分散至6g/L CMC(羧甲基纤维素钠)溶液，经玻璃珠振荡10-20min，无菌脱脂棉过滤后制成孢子悬液，采用血球计数板法计算孢子浓度，而后再用无菌去离子水配制浓度约为6×104孢子囊/mL的孢子悬液，4℃保藏，用于人参灰霉病感染。
孢子浓度计算：将10μL孢子悬液点接于血球计数板，对血球计数板中间、左上、左下、右上、右下这5个中号方块中人参病原菌的孢子进行记录，并将其编号为a1，a2，a3，a4，a5，孢子浓度(孢子囊/mL)＝(a1+a2+a3+a4+a5)×[400×104]×10/80。
室外盆栽防病试验：
试验共设4个处理组：(1)单接病原菌对照组(即表8中的A组)；(2)生防菌+病原菌处理组(即表8中的C组)；(3)农药+病原菌处理组(即表8中的B组)；(4)CK(不接种病原菌)对照组(即表8中的CK组)。
育苗土为栽培土：蛭石(v/v)＝2:1配比的混匀基质。
供试栽培土为改良黑土，具体为，秸秆(kg)：牛粪(kg)按干质量比10:3混合培肥，施加于1m3黑土(吉林中部地区)。供试人参苗为2年生参栽，由参王植保公司提供。
取长势较为接近且根系发达的2年生参栽，参根表面需消毒清洗(经次氯酸钠润洗后，50℃水中再浸泡5min)备用。生防菌+病原菌处理组的参根于NB60YF微生物制剂100倍稀释液中浸泡15-20min，农药+病原菌处理组的参根于70％代森锰锌粉剂1000倍液中浸泡20min，单接病原菌、CK处理组的参根均于无菌NB60Y发酵液中浸泡20min，而后分别移栽至PP塑料盆钵(规格为口径24cm，高16cm)，每盆3株，同时填入等量育苗土。将各处理人参盆钵置于室外参棚下，待其定苗后进行防病试验。人参苗感病采用伤根灌注法，于人参苗1侧，距人参茎基1cm处造成直径约2-3mm的伤口，并向受损部位灌注灰葡萄孢孢子悬液150mL。同时，生防菌+病原菌处理组灌注NB60YF微生物制剂100倍稀释液50mL，农药+病原菌处理组灌注药剂70％代森锰锌粉剂1000倍液50mL，单接病原菌、CK处理组灌注无菌NB60Y发酵液50mL。如上每组处理30盆，重复3次。于病原真菌接种后2个月，对农药+病原菌处理组及生防菌++病原菌处理组分别进行等量补药一次(灌注方式及灌注量同上)。于接种病菌4个月后调查发病情况，计算病情指数和防治效果。病情指数调查参考表7所示。
表7 人参灰霉病的病情指数
Figure BDA0002377606840000201
病情指数＝∑(病级株数×代表值)/(总株数×最高病级代表值)×100
防治效果＝(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数×100
NB60YF微生物制剂对人参灰霉病的防治效果：
接种人参灰霉病菌(灰葡萄孢)4个月后，如表8所示，农药阳性对照组(即B组)、NB60YF微生物制剂处理组(即C组)的人参经过4个月培育后，其病情指数分别为30.19、26.59，对人参灰霉病的相对防效分别为66.10％、70.14％，NB60YF微生物制剂的相对防效较农药对照组高出4.04％(如图9、10所示)。差异显著性分析表明，生防菌液处理组与农药处理组在P＜0.05水平差异性显著，在P＜0.01水平差异极显著。综上所述，与化学农药(70％代森锰锌粉剂1000倍液)相比，NB60YF微生物制剂(100倍稀释液)对人参灰霉病表现出了更为高效的防治效果，其具备有效降低人参灰霉病发生发展的防治能力。
表8 人参灰霉病防治效果
Figure BDA0002377606840000211
A：单接病原真菌，B：农药+病原真菌，C：NB60YF微生物制剂+病原真菌，CK：不接种病原菌。数据系平均数±标准差。Duncan氏法检验(P＜0.01水平和P＜0.05水平)。
本发明只是在摇瓶中对解淀粉芽孢杆菌SZ-60的发酵液组分和培养条件进行了筛选优化，并提供了优化方法，尚需进一步小试、中试完善发酵工艺，以期为工业化发酵生产提供可靠的理论参数。另外，本发明只是在室外参棚条件下进行了盆栽防病试验，尚需进一步进行大田试验，以期为微生物制剂对人参田间病害的有效防治提供理论基础。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种发酵培养液，其特征在于，所述发酵培养液中每含1000mL去离子水时，其含有可溶性淀粉10-20g，黄豆粉10-20g，NaCl 2-7g，MnSO4 2-7mg，Ca(HCO3)2 5-15mg，FeSO4 1-4mg；
优选地，所述发酵培养液的pH为6.5-7.5。
2.权利要求1所述的发酵培养液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
按权利要求1所述用量称取可溶性淀粉、黄豆粉、NaCl、MnSO4、Ca(HCO3)2以及FeSO4，放入去离子水中加热溶解混匀，调整混合液的pH至6.5-7.5，湿热灭菌后冷却备用；
优选地，所述湿热灭菌的温度为115-125℃；
优选地，所述湿热灭菌的时间为10-60min。
3.权利要求1所述发酵培养液在解淀粉芽孢杆菌SZ-60产胞外抑菌蛋白中的应用。
4.一种解淀粉芽孢杆菌SZ-60产胞外抑菌蛋白的发酵方法，其特征在于，所述发酵方法包括如下步骤：
(1)将解淀粉芽孢杆菌SZ-60菌种活化于牛肉膏蛋白胨培养基，培养后挑取单一菌落接种于牛肉膏蛋白胨培养液中，培养后，从得到的细菌培养液中分离出菌体，将所得菌体制成含菌量为108CFU/mL数量级的细菌悬液备用；
(2)吸取步骤(1)所述细菌悬液，接种于NBYM发酵液中，培养至发酵液菌体生长较为饱满即将出现芽孢时，得到发酵种子液；
(3)将步骤(2)所述发酵种子液接种于发酵培养液中，培养得到解淀粉芽孢杆菌SZ-60发酵液；
所述发酵培养液具有如权利要求1所述的含义。
5.根据权利要求4所述的发酵方法，其特征在于，步骤(1)中，所述牛肉膏蛋白胨培养基中每含1000mL去离子水时，其含有牛肉膏2.5-3.5g、蛋白胨7-15g、NaCl 3-8g，琼脂12-20g；
优选地，所述牛肉膏蛋白胨培养液为不含琼脂的所述牛肉膏蛋白胨培养基。
6.根据权利要求4或5所述的发酵方法，其特征在于，步骤(2)中，所述NBYM发酵液中每含1000mL去离子水时，还含有牛肉膏2-7g，蛋白胨5-15g，酵母浸膏2-10g，麦芽浸膏4-12g，葡萄糖2-7g，MgSO4 5-15mg；优选地，所述NBYM发酵液的pH为6.5-7.2；
优选地，步骤(3)中，所述发酵培养液与培养器的体积比为(150-300)mL/500mL；
优选地，步骤(3)中，所述发酵种子液与所述发酵培养液的体积百分比为3-8％；
优选地，步骤(3)中，所述培养的条件包括：28-32℃、150-200转/min恒温振荡培养1.5-5d；
优选地，所述发酵方法为摇瓶发酵方法。
7.一种解淀粉芽孢杆菌SZ-60发酵液，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌SZ-60发酵液中含菌量为5.00×109CFU/mL以上，所述解淀粉芽孢杆菌SZ-60发酵液中可溶性抑菌蛋白的浓度9μg/mL以上；
优选地，所述解淀粉芽孢杆菌SZ-60发酵液由权利要求4-6任一项所述方法制备得到。
8.权利要求7所述的解淀粉芽孢杆菌SZ-60发酵液在制备防治植物真菌病害的微生物制剂中的应用；优选地，所述真菌病害为灰葡萄孢(B.cinerea Pers.ex Fr.)引起的灰霉病；优选地，所述植物为人参。
9.一种微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂中含有权利要求7所述的解淀粉芽孢杆菌SZ-60发酵液。
10.权利要求9所述微生物制剂在制备防治植物真菌病害的微生物制剂中的应用；优选地，所述真菌病害为灰葡萄孢(B.cinerea Pers.ex Fr.)引起的灰霉病；
优选地，所述植物为人参。
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