CN103993062B - 利用胶红酵母处理抗生素发酵废水生产类胡萝卜素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用胶红酵母处理抗生素发酵废水生产类胡萝卜素的方法。本发明的技术方案要点为：胶红酵母在处理抗生素发酵废水生产类胡萝卜素中的应用。本发明还公开了利用胶红酵母处理螺旋霉素重液生产类胡萝卜素的方法。本发明利用螺旋霉素重液作为发酵培养基，在不添加其它任何营养源的情况下，将胶红酵母接种到罗算霉素重液中，利用废水中的营养物质发酵生产类胡萝卜素，并对生产菌株进行多轮ARTP（常压室温等离子体）诱变，获得产量较高的诱变菌株，为类胡萝卜素的生产和制药废水的处理提供了一条新的思路。

Description

利用胶红酵母处理抗生素发酵废水生产类胡萝卜素的方法

技术领域

本发明涉及抗生素发酵废水的生物处理技术领域，具体涉及一种利用胶红酵母处理抗生素发酵废水生产类胡萝卜素的方法。

背景技术

类胡萝卜素是主要存在于水果和蔬菜中的一类天然色素的总称。由40个碳分子和多个共轭双键组成的黄色、橙色或红色的多烯类化合物是类胡萝卜素最为常见的成员。这类化合物包括β-类胡萝卜素、虾青素、叶黄素和蕃茄红素等多种与人类生产生活密切相关的重要色素。目前，基于分子水平的科学研究已证实类胡萝卜素具有抗氧化、调节细胞生长及预防癌症发生的功能，并且其作为维生素A 原被人体摄入后还可促进上皮细胞的正常成熟，预防由于维生素A 缺乏而引起的夜盲症，同时它也是理想的食品着色剂和营养增补剂。因此，涉及类胡萝卜素的工业化生产越来越受到人们的期待与关注。

抗生素生产废水是一类富含难降解有机物和生物毒性物质的高浓度有机废水，其含有来自发酵残余营养物的高COD和高SS，而且其中还存在生物抑制性物质，尤其是残留抗生素。抗生素在该类生产废水中的存在导致大多数细菌无法生存，因此，长期以来抗生素废水的处理是国内外污水处理的热点和难点。目前广泛应用的抗生素废水处理技术包括物化处理技术和生物处理技术，其中生物处理技术一般包括：好氧处理法、厌氧处理法和光合细菌处理法等。无论是国内还是国外，尚没用利用红酵母处理抗生素发酵废水生产类胡萝卜素的相关报道。

螺旋霉素的工业化生产通常采用生二素链霉菌（S.azmbo-faeiensis）进行二级发酵，发酵培养基包含淀粉、鱼粉、玉米浆、碳酸钙、硝酸铵、氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾等成分，因此，螺旋霉素的生产废水中含有大量的优质碳源和无机盐类，能为微生物的生长提供必要的营养物质，是废物再利用的一类重要原料。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供了一种利用胶红酵母处理抗生素发酵废水生产类胡萝卜素的方法。

本发明提供的胶红酵母可用于处理抗生素发酵废水生产类胡萝卜素。

本发明提供的胶红酵母可用于处理螺旋霉素发酵废水生产类胡萝卜素。

本发明的技术方案为：一种利用胶红酵母处理螺旋霉素发酵废水生产类胡萝卜素的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）菌种活化，将胶红酵母经过斜面培养和种子培养，得到活化种子液，其中斜面培养温度28℃，培养时间72h，斜面培养基成分以g/L计为：酵母膏1，蛋白胨2，葡萄糖2，琼脂粉2，其余成分为水，种子培养温度为28℃，160rpm振荡培养24h，种子培养基成分以g/L计为：酵母膏1，蛋白胨2，葡萄糖2，其余成分为水；（2）发酵培养，按照体积百分比10%的接种量将种子液接种到已灭菌的螺旋霉素重液中，28℃，190rpm振荡培养即得到含有类胡萝卜素的发酵液。

本发明利用螺旋霉素重液作为发酵培养基，在不添加其它任何营养源的情况下，将胶红酵母接种到螺旋霉素重液中，利用废水中的营养物质发酵生产类胡萝卜素，并对生产菌株进行多轮ARTP（常压室温等离子体）诱变，获得产量较高的诱变菌株，为类胡萝卜素的生产和制药废水的处理提供了一条新的思路。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。

菌株来源：

河南师范大学生命科学学院微生物实验室保藏的产类胡萝卜素菌株，编号KC(马)8，与胶红酵母JN091167.1 Rhodotorula mucilaginosa有100%的相似性。

菌株活化：

采用划线的方法将菌株接种到固体YPD培养基上，固体YPD培养基的成分以g/L计为：酵母膏1，蛋白胨2，葡萄糖2，琼脂粉2，其余成分为水，28℃培养72h，可观察到呈圆形、红色、表面凸起、湿润的菌落。挑取单菌落接种到YPD液体培养基中，YPD液体培养基的成分以g/L计为：酵母膏1，蛋白胨2，葡萄糖2，其余成分为水，28℃，160rpm培养24h，制备种子液。

发酵培养：

将培养24h的种子液按体积百分比10%的接种量接种到已灭菌的螺旋霉素重液中，28℃、190rpm振荡培养，5000rpm离心收集菌体并测定类胡萝卜素产量。

类胡萝卜素产量测定：

采用酸-热法裂解细胞并利用丙酮提取类胡萝卜素，利用紫外/可见分光光度计测定吸光度并计算类胡萝卜素产量。公式如下：

类胡萝卜素（μg/mL）=Aλmax×D×V0/0.16×V

A_{λ max}：类胡萝卜素在最大吸收波长下的吸光度；V₀：提取类胡萝卜素所用溶剂量mL；D：测定试样时的稀释倍数；V：提取的发酵液总体积mL；0.16：类胡萝卜素的分子消光系数。

菌株诱变：

ARTP（常压室温等离子体）诱变条件：处理距离2mm；处理功率120W；气流量10SLM，点样量10μL，处理时间分别为0s，15s，30s，45s，60s，90s，120s，180s。处理后6小时内进行涂布接种，28℃培养3天。挑取单菌落分别接种液体发酵培养基，经多轮筛选后获得类胡萝卜素和油脂产量均提高最多的菌株AR62，分类命名为胶红酵母菌（Rhodotorula mucilaginosa），该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.8926，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期：2014年 3月17 日 。

实施例1

取适量螺旋霉素重液，装液量为50mL/250mL锥形瓶，115℃灭菌30min，pH自然，将YPD液体培养基中经28℃、160rpm培养24h的种子液按体积百分比10%的比例接种到螺旋霉素重液中，28℃、190rpm振荡培养，定期测定类胡萝卜素产量。结果显示，培养24h时类胡萝卜素产量最高为0.32μg/mL。

实施例2

取适量螺旋霉素重液，装液量为50mL/250mL锥形瓶，115℃灭菌30min，pH调至7.0，将YPD液体培养基中经28℃、160rpm培养24h的种子液按体积百分比10%的接种量接种到螺旋霉素重液中，28℃、190rpm振荡培养，定期测定类胡萝卜素产量并利用重铬酸钾滴定法测定废水COD。结果显示，培养24h时类胡萝卜素产量最高为0.80μg/mL，同时其COD由接种前的7920mg/L降至3600mg/L，COD去除率达到54.55%。

实施例3

对菌株KC(马)8进行ARTP（常压室温等离子体）多轮诱变，诱变条件：处理距离 2mm；处理功率 120W；气流量 10SLM，处理时间分别为0s，15s，30s，45s，60s，90s，120s，180s，点样量为10μL，在6小时内进行梯度稀释涂布，于28℃培养3天。最后对所得单菌株接种到螺旋霉素废水中，按照实施例1中的培养方法进行大量筛选，最终得到一株产量提高最多的菌株AR62，该菌株的最终类胡萝卜素产量为2.14μg/mL，较诱变前产量提高了167.5%。

以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。

Claims (3)

1.胶红酵母菌Rhodotorula mucilaginosa在处理抗生素发酵废水生产类胡萝卜素中的应用，所述的胶红酵母菌Rhodotorula mucilaginosa保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.8926。

2.胶红酵母菌Rhodotorula mucilaginosa在处理螺旋霉素发酵废水生产类胡萝卜素中的应用，所述的胶红酵母菌Rhodotorula mucilaginosa保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.8926。

3.根据权利要求2所述的胶红酵母菌Rhodotorula mucilaginosa在处理螺旋霉素发酵废水生产类胡萝卜素中的应用，其特征在于通过以下方式实现：（1）菌种活化，将胶红酵母菌Rhodotorula mucilaginosa经过斜面培养和种子培养，得到活化种子液，其中斜面培养温度28℃，培养时间72h，斜面培养基成分以g/L计为：酵母膏1，蛋白胨2，葡萄糖2，琼脂粉2，其余成分为水，种子培养温度为28℃，160rpm振荡培养24h，种子培养基成分以g/L计为：酵母膏1，蛋白胨2，葡萄糖2，其余成分为水，所述的胶红酵母菌Rhodotorula mucilaginosa保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.8926；（2）发酵培养，按照体积百分比10%的接种量将种子液接种到已灭菌的螺旋霉素重液中，28℃，190rpm振荡培养即得到含有类胡萝卜素的发酵液。