CN108277185B - 一种松节油降解微生物菌剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种松节油降解微生物菌剂，该菌剂由阴沟肠杆菌M37、褪色沙雷氏菌M28等2种菌株组成，二者的体积比为（1‑5）︰（5‑1）。本发明的菌剂具有降解松节油的能力，尤其是马尾松中的松节油，其降解率在50%以上。马尾松中因含有松节油，限制了其应用，因此该菌剂在马尾松木屑等含松节油降解中的应用，具有很好的前景，大大拓展了马尾松木屑等富含松节油材料的应用。

Description

一种松节油降解微生物菌剂
技术领域
本发明属于微生物菌剂领域，特别是涉及一种含有阴沟肠杆菌M37和褪色沙雷氏菌M28的松节油降解微生物菌剂。
背景技术
马尾松是我国南方主要造林树种和工业、农业、建筑以及生活的主要用材，木屑全国总量每年达数亿吨，城乡分布范围广，易于收集。马尾松木屑除少数用作燃料外，大多数作废料处理。其主要原因是马尾松木屑纤维细胞间质中含有大量可浸物如树脂、多元酚、松节油等，使得马尾松木屑因这些物质含量高而影响其使用。
松节油主要成分是a-蒎烯，其次是β-蒎烯，长叶烯，石竹烯等。还有少量的倍半萜稀、茨烯、月桂烯等。研究表明，香菇栽培基质中添加原料0.1%松节油时，香菇菌丝不能萌发，最后逐渐枯死，可见这些化学成分对于后续产品在食用菌的运用带来不利的后果。马尾松木屑中萜烯类物质占0.4%，对食用菌菌丝生长具有抑制作用。因此，马尾松木屑中松节油的含量已经严重制约了马尾松木屑的应用，各国的研究者也都在采取各种方法进行马尾松木屑的预处理，如蒸煮法、蒸馏法、石灰水浸泡法、日晒雨淋法、堆积发酵法、化学法等。目前报道的堆积发酵法，主要采用自然堆积发酵法，没有添加任何外源微生物，堆积时间长，效果差，制约着马尾松木屑的规模化和产业化应用。
近年来，针对食用菌行业，一些学者发现马尾松木屑主要成分和食用菌行业常用树种栎树的成分相近，只是马尾松木屑中的萜烯类物质难降解，只能通过一些适当传统方法去除有害物质。
本发明是从自然界腐烂的马尾松树干中筛选的复合微生物菌剂，可以高效降解松节油，尤其是马尾松木屑中的松节油。
发明内容
本发明的目的在于提供一种松节油降解微生物菌剂。
1. 为实现本发明的目的，本发明的松节油降解微生物菌剂，其成分包括：阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）M37和褪色沙雷氏菌（Serratia marcescens）M28。其中，本发明的微生物混合菌剂含有两种，其中阴沟肠杆菌M37菌株，其分类命名为Enterobactercloacae；其中褪色沙雷氏菌M28菌株，其分类命名为Serratia marcescens，该混合菌剂现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所，其中阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）M37保藏编号为CGMCCNO.15459，褪色沙雷氏菌（Serratia marcescens）M28保藏编号为CGMCC NO.15460，保藏日期2018年3月16日。
2.本发明的阴沟肠杆菌M37和褪色沙雷氏菌M28菌株分离自湖北十堰腐烂的马尾松树桩中。
3.本发明的菌种筛选培养基以马尾松中提取的松节油为唯一碳源。
4.本发明的松节油降解微生物菌剂，其包括如下体积比的组分：阴沟肠杆菌M37︰褪色沙雷氏菌M28=（1-5）︰（5-1）。
5. 本发明的阴沟肠杆菌M37特征为：属肠杆菌；革兰氏阴性，兼性厌氧，呈直的棒状，不产芽孢；以周生鞭毛运动，不形成孢子；最适温度为30℃，多数临床菌株在37℃生长，有些环境菌株37℃时生化反应不稳定；广泛分布于自然界，普遍存在于人和动物中
本发明的褪色沙雷氏菌M28特征为：属沙雷氏菌属，革兰氏阴性，兼性厌氧；杆状，端圆，周身鞭毛，不产生孢子，无包膜；菌落大多数不透明，有些虹彩；白色、粉红或红色；几乎所有的菌株能在10~36℃，pH5~9含有0~4%的NaCl生长。
6. 本发明的阴沟肠杆菌M37，其培养和保藏方法为：将阴沟肠杆菌M37接种于LB肉汤培养基中37℃，150r/min振荡培养3d；然后制备LB琼脂培养基试管斜面，待凝固后，将菌株接入试管斜面，培养3d，待长满斜面，放入4-5℃冰箱保存。
本发明的褪色沙雷氏菌M28，其培养和保藏方法为：将褪色沙雷氏菌M28接种于LB肉汤培养基中28℃，150r/min振荡培养3d；然后制备LB琼脂培养基试管斜面，待凝固后，将菌株接入试管斜面，培养3d，待长满斜面，放入4-5℃冰箱保存。
优选的，所述LB肉汤培养基为胰蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，氯化钠10g，pH为7.0-7.2。
优选的，所述LB琼脂培养基为胰蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，氯化钠10g以及琼脂15.0g，pH为7.0-7.2。
7. 本发明的微生物菌剂由阴沟肠杆菌M37和褪色沙雷氏菌M28等2个菌种组成。所述复合微生物菌剂在降解松节油的应用，包括在马尾松木屑堆肥中降解松节油的应用。
本发明具有以下技术特点：
1）本发明中的微生物菌剂易于培养，操作方便，成本低廉。
2）采用本发明的复合微生物菌剂能够将松节油降解，降解率50%以上。
具体实施方式
以下具体实施例是对本发明提供的方法与技术方案的进一步说明，但不应理解成对本发明的限制。
（一）菌株的培养和保藏：
1. 培养基
胰蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，氯化钠10g，以及琼脂15.0g，PH为7。
2. 阴沟肠杆菌M37
将阴沟肠杆菌M37放入LB肉汤培养基中，37℃，150r/min振荡培养3d；然后制备LB琼脂培养基试管斜面，待凝固后，将菌株接入试管斜面，培养3d，待长满斜面，放入4-5℃冰箱保存。
3. 褪色沙雷氏菌M28
将褪色沙雷氏菌M28放入LB肉汤培养基中，28℃，150r/min振荡培养3d；然后制备LB琼脂培养基试管斜面，待凝固后，将菌株接入试管斜面，培养3d，待长满斜面，放入4-5℃冰箱保存。
（二）复合微生物菌剂的制备
1. 斜面接种：将阴沟肠杆菌M37接种于LB琼脂培养基试管斜面上，37℃静置培养3d；褪色沙雷氏菌M28接种于LB琼脂培，28℃静置培养3d。
2. 液体培养：将阴沟肠杆菌M37接种于LB肉汤中，37℃，150r/min培养3d；将褪色沙雷氏菌M28接种于LB肉汤中，28℃，150r/min培养3d。
3. 活菌计数测定：按照稀释涂布平板法，计算活菌数；
4. 菌种混合：将发酵液按阴沟肠杆菌M37︰褪色沙雷氏菌M28=（1-5）︰（5-1）比例混合，得到复合微生物混合菌剂。
（三）本发明生物菌剂降解松节油的实验
无机盐基础培养基，成分及用量（g/L）:（NH4）2SO41.0g，K2HPO41.5g，KH2PO40.5g，NaCl 1.0g，MgSO40.2g，FeSO40.05g，加入水1000ml。调节PH至7.0-7.2，再加入18g的琼脂。
在含有松节油的固体平板上，接种10μL的松节油降解菌的菌液，28℃和37℃培养。降解菌M28和M37在3、7、14和21d的降解圈和菌落直径见表1和表2。
表1褪色沙雷氏菌M28在含有松节油的琼脂培养基上的降解圈和菌落直径（mm）
Figure 121075DEST_PATH_IMAGE001
表2阴沟肠杆菌M37在含有松节油的琼脂培养基上的降解圈和菌落直径（mm）
Figure 466606DEST_PATH_IMAGE002
根据每天观察降解圈和菌落的大小，可以看出，在含有松节油的平板上，两株菌的降解圈基本上相同，菌落也基本相同；然而两株菌对比，降解圈生长较快，菌落基本相同，对松节油的降解效果较好。
因此，本发明的复合微生物菌剂对松节油具有较好的降解效果。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护范围内。

Claims (4)

1.一种松节油降解微生物菌剂，其特征在于，由阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)M37和褪色沙雷氏菌(Serratia marcescens)M28混合而成；其中阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)M37保藏编号为CGMCC NO.15459，褪色沙雷氏菌(Serratia marcescens)M28保藏编号为CGMCC NO.15460。
2.根据权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂阴沟肠杆菌M37和褪色沙雷氏菌M28体积比为(1-5)︰(5-1)。
3.根据权利要求1-2任一所述的微生物菌剂在降解松节油中的应用。
4.根据权利要求3所述的微生物菌剂在降解松节油中的应用，其特征在于，包括在马尾松木屑堆肥中的应用。
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