CN103897996A

CN103897996A - 一种农用耐盐菌的生产方法

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Publication number: CN103897996A
Application number: CN201210572344.0A
Authority: CN
Inventors: 魏明重
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-12-26
Filing date: 2012-12-26
Publication date: 2014-07-02

Abstract

一种农用耐盐菌的生产方法。耐盐菌和嗜盐菌都能在盐水里长期生存，但耐盐菌却在无盐环境中生存更佳，这是广域嗜盐菌和极端嗜盐菌不具备的。耐盐菌的特点：寿命长，耐恶劣环境，退化慢，能分解有机质和多种有害物质，分泌代谢多种酶，成为自己的保护膜，耐盐碱腐蚀，保护DNA存活。成本低，用途广泛。以上特点是其他菌不具备的。这里提供耐盐菌的培养基风化煤、褐煤、泥炭。和耐盐菌生产方法。

Description

一种农用耐盐菌的生产方法

所属领域

耐盐菌的生产属生物工程领域

技术背景

我国从传统农业进入“化肥农业”时期，经济迅速增长，人口翻番，粮食和经济作物要适应社会发展需要，化肥立下汗马功劳。

由于“工业文明”消耗了大量资源，造成环境污染，给人类健康带来危害，破坏了土壤结构，生态环境脆弱等一系列问题，社会发展进入“生态文明”时期。

我国要建设“生态文明”，农业要实现现代化，农业现代化核心是：农业生态化，同时农业机械化，农业管理现代化，也是不可少的内容，但是本质问题是农业生态化。

我国当前农业90％以上用的是化肥，我国每年所需化肥1.5亿吨左右。

中国合成氨生产消耗了国内生产的50％无烟块煤和31％的天燃气产量。如果按照现有的化肥发展速度，则中国天然气的产量只能满足55％的化肥产量的需求，而化肥需求对无烟煤块的需求几乎等于现有无烟块煤的全部产量。同时，中国的磷矿、钾矿资源危机已经开始出现，中国磷矿消费超过1亿吨标矿，现有磷矿资源中富矿只能利用10年左右。我们的钾矿资源也非常匮乏，目前国内钾肥市场已被国外占领80％以上。

化学肥料作为一种高耗能产业，以及具有严重破坏生态环境，危害人类健康的特点并受磷、钾矿资源匮乏，农产品安全的限制，美国、德国等发达国家早在10年前已经不再以化学肥料为主了。我国将同欧美发达国家一样，未来的化肥产量将逐渐减少，农业用肥结构将发生根本变化，生物有机、无机、复混肥将成为高效、无毒、无污染的新型肥料之一。

我国农业现状连续十年粮食、经济作物增产，但必须看到10年来农作物增产，对化肥和农药依赖性。这条老路，不能走了，是一条不归路。

由于当前土壤退化严重，耕地盐碱荒漠化过半，要改变生产发展方式要调整结构，经济发展不能走老路，也不能走邪路。

我国土地碳氮比严重失调，半个世纪以化肥为主，很少用有机肥，秸杆过腹还田是少数。由于碳氮比失调，土壤固氮能力下降，70％的氮肥进入环境，最后进入地下水，空气，固化在土壤中，造成巨大浪费和危害，产生严重后遗症。

我国土壤有机质含量太低，全国平均在1％以下，发达国家土壤有机质在4-7％。因为土壤缺乏有机质，土壤失去保水、保肥能力、造成水土流失严重，自然灾害频发。

我国土壤有益菌含量低，农业可持续发展受限，社会经济发展三条链要平衡发展，(植物链、动物链、微生物链)，往往被忽视的是微生物链。2009年国务院45文件强调了，生物工程要作为社会支柱产业来发展。

邓小平同志早就指出：“中国农业的根本出路要靠生物工程来解决，要靠尖端技术。”

温家宝总理指出：“微生物技术，是中国农业未来之希望。”

总之，发展生物肥料是现代农业的出路。

发展生物肥当前存在的问题：

1有益菌寿命短，退化快，成本高；

2手工做坊多，现代规范化生产少。

总之，生物肥发展滞后瓶颈在“有益菌发展滞后。”解决的办法之一，这就是发明的主要内容。

主要内容：一种农用耐盐菌的生产方法。

耐盐菌和嗜盐菌都能在盐水里长期生存，但耐盐菌却在无盐环境中生存更佳、这是广域嗜盐菌和极端嗜盐菌不具备的。

耐盐菌的特点：寿命长，耐恶劣环境，退化慢，能分解有机质和多种有害物质，分泌代谢多种酶，成为自己的保护膜，耐盐碱腐蚀，保护DNA存活、成率低，用途广泛。以上特点是其他菌不具备的。

这里提供耐盐菌的培养基风化煤、褐煤、泥炭。和耐盐菌生产方法。

一种耐盐菌的生产方法，其特征在于；

1、将选择粉碎过100目筛的风化煤或褐煤、泥炭1000克放进容器中；

2、将嗜盐菌(浓度：1.1×10⁸)100克放入600克无菌水中搅匀；

3、将700克含嗜盐菌的水放进1000克风化煤(或褐煤、泥炭)容器中搅匀；

4、把1700克含菌风化煤(或褐煤、泥炭)放进培养箱中，温度25°～35℃，湿度75℃～85℃，适量供氧，培养箱光照用日光灯500勒克其，照射72小时，培养完成，得到400亿/克左右的嗜盐菌，因为广域嗜盐菌和极端嗜盐菌在无盐环境中一段时间细胞膜破裂自溶了，剩下不自溶的就是耐盐菌了；

6、风化煤，褐煤含腐植酸应在35％以上为宜。泥炭含腐植酸应在20％以上为宜。(重量比)

菌种来源：新疆乌鲁木齐市达坂域区盐湖采集样品

新疆农科院化验室检验

耐盐菌通过和风化煤、褐煤结合分解后、间接固氮、解磷、解钾、不亚于固氮菌、解磷钾菌。

提取耐盐菌的参考方法

第一步用提取嗜盐菌的方法先提取嗜盐菌，因为耐盐菌也和嗜盐菌生活在盐湖中，微生物根据对盐的依赖程度可分；

1、耐盐菌，在盐湖中和广域嗜盐菌，极端嗜盐菌一样生活，但它能在无盐环境中生活繁殖最佳。

2、广域嗜盐菌，指在盐浓度从零到饱和的环境中都能生长。但其最佳生长，需要一定盐浓度。

3、是指菌生长需要一定的盐浓度，且在一定盐浓度生长最佳的微生物为嗜盐菌，根据对盐的不同需要，嗜盐菌又分为弱嗜盐菌，中度嗜盐菌和极度嗜盐菌。

因为嗜盐菌和耐盐菌的区别在于嗜盐菌只能在有盐环境中生存，无盐环境它的细胞膜不完整，要产生自溶。

因为在没有含盐的环境中，广域嗜盐菌和极端嗜盐菌都发生自溶，剩下能适应无盐环境的就是耐盐菌。

实施例：一种耐盐菌的生产方法，其特征在于：

2、将嗜盐菌(浓度：1.1×10⁶克)100克放入600克无菌水中搅匀；

4、把1700克含菌风化煤(或褐煤、泥炭)放进培养箱中，温度25°～38℃，湿度75℃～85℃，适量供氧，培养箱光照用日光灯500勒克斯，照射72小时，培养完成，得到400亿/克左右的嗜盐菌，因为广域嗜盐菌和极端嗜盐菌在无盐环境中一段时间细胞膜破裂自溶了，剩下不自溶的就是耐盐菌了；

5、风化煤，褐煤含腐殖酸应在35％以上为宜。泥炭含腐殖酸应在20％以上为宜。(重量比)“方框图说明：附图为一种农用耐盐菌的，生产方法的流程图。1，选矿粉碎2，菌水拌匀3，菌水煤拌匀4，入发酵箱加温5，原料要求说明。

嗜盐菌的分离

了解嗜盐菌在实验室中的培养方法和高产细菌视紫质(Bacteriorhodopsin，BR)的培养条件以及菌种保藏等常规工作。

二、原理

嗜盐菌在系统发生上与甲烷细菌(methanobacteria)、热酸菌(thermoacido philic bacteria)均属于古细菌类(archaebacteria)，这种只有在极高盐浓度介质中才能生长的细菌在分类学上属于盐杆菌科(Halobacteriaceae)。已经知道，此科下有两个属：一个属为盐杆菌属(Halobacterium)，如盐制品盐杆菌(H.salinarium)、盐生盐杆菌(H.halobium)；另一个属为盐球菌属(Halococcus)，如鳕盐球菌(H.morrhuae)。盐杆菌科的细菌有机体具有古细菌类特征的核糖体(如16S rRNA)；不具有一般细菌所具有的那种细胞壁(如细胞壁上不含有一般细菌细胞壁所具有的肽聚糖等典型组分，而是由糖蛋白组成)；有极端嗜盐的原核细胞，仅能在大于2mol/L的NaCl中才能正常生长；它们的酶系也仅在高盐的介质中才具有正常活性；它们的蛋白质含有较多的酸性氨基酸残基等。

这一科的生物大都是蛋白水解型的，属于异养成的需氧呼吸代谢类型。当它们从自然界中分离出来时，都包含有C-50类胡萝卜素，但在自然界中以及在人工培养条件下，均会遇到无色素的菌体。另外，有许多菌株还含有视黄醛(Rctinal)类色素，即细菌视紫质。但BR是否存在以及它在细胞中的含量，在任何一个菌株中均与生长条件有关，因此它不是分类学上的特征。

在20世纪60年代，发现了嗜盐菌中含BR的膜，即紫膜(为细胞膜的一部分)具有光驱动的质子泵功能，并导致产生光合磷酸化。此后对这一细菌的研究有了更加广泛的兴趣，相继开展了有关光能转换、紫膜结构和功能、对极端环境的调节适应以及探讨古细菌进化途径的因子等等多方面的研究。嗜盐菌中细菌的细胞壁由糖蛋白组成，在2mol/L NaCl中会完全失去其坚硬性，在低于1mol/L NaCl的介质中，细胞壁破碎并发生溶胞。在经受中等强度的机械压力时，也能引起溶胞。这些特点是与另一属盐球菌属不同的。它们的细胞壁由坚固的硫酸盐杂多糖组成，在水中其结构也不会破坏，细胞也不呈通常的棒形。

盐杆菌的细胞所要求的生长环境，如介质中离子组分、盐浓度和pH等，常反映了它们的生态特点，如从高碱性、高盐分的沙漠湖中分离到的种类都要求高pH、低镁和高NaCl浓度的介质，而从哂盐场中分离的则要求中性pH、一般镁离子浓度和高NaCl浓度的介质。

嗜盐菌生长的条件除了NaCl盐浓度要大于2mol/L以外，还要求Na⁺、Mg²⁺为细胞外介质中的主要阳离子，而在细胞内部这类离子也保持着同样的强度，但K⁺则是细胞内的主要阳离子。

本实验介绍的培养方法主要是以盐生盐杆菌作为对象，这是一种从盐场中分离出来的，目前世界上各实验室使用最广泛的嗜盐菌。

三、实验材料

培养盐生盐杆菌最好选用Oxoid或Inolex蛋白胨。有些蛋白胨如美国Bacto-Tryptone(Difco0123-01)或Bacto-peptone(Difco 0118-01)因含有一种能使嗜盐菌细胞溶胞的物质，故不能使用。有一些蛋白胨在准备培养基过程中会产生少量沉淀，可以在培养基未加热前用6000g离心30min(20℃)除去，或用0.45um过滤器去除。

液体培养基由蛋白胨加盐基介质(即为保持细菌正常生长所要求的离子组分和高渗浓度的介质，常简称为BS)组成，这样的培养基常简写为RM。盐生盐杆菌RM的化学配方如下：NaCl 233.76g/L，MgSO₄·7H₂O 9.4g/L，Na₈C₆H₅O₇·2H₂O(柠檬酸钠)3.0g/L，KCl 2.0g/L，Oxoid L-37蛋白胨10g/L调节pH为7.2左右。

BS即是指上面配方中不含蛋白胨和柠檬酸钠的溶液。在上述培养基中加入1.5％(质量体积分数)琼脂后即成固体培养基。121℃，灭菌15～20min。

四、方法与步骤

1.液体通气培养

细菌可在大体积、透明的玻璃瓶中培养，如20L体积的玻璃瓶，内盛4L培养液，将瓶水平放置，这样可使培养液有较大的表面接受光照。为了给以充分的光照条件，可以在瓶子的上、下两个方向各放置 4只20W的日光灯管。虽然照明对色素形成不一定是必需的，但在照明条件下(10⁵～10⁶crg/s·cm²)可以使细菌合成最大产率的紫膜。

用1％处于稳定生长期的菌液来接种。细菌可在高达57℃下生长，但为了防止水分过分蒸发，通常调节生长温度为38～40℃，为了保证良好的有氧生长条件，瓶中必须通气，空气在未进入培养液前先流过蒸馏水，以防止培养液的过分蒸发。培养液中可用喷雾微量抗泡剂以防止泡沫大量形成。在开始生长的36h里，介质的通气量可以保持为250L/h，这样的通气量在开始生长的6h里，使4L的培养液达到氧的饱和状态，然后氧浓度迅速下降到10％的饱和水平。故在36h后，通气速率可调节到160L/h，这样的速率使得氧浓度在其后的生长期间保持为低于5％的饱和状态。在这样的氧浓度下，细菌能以最高速率合成紫膜。在110h生长后，此时细菌已处于稳定生长期约30h，可以收获。

细胞的生长情况可用测定在660nm处的浊度米检查，也可以进行细胞计数。紫膜生长通常在细菌生长的对数期快结束时出现，而且在氧的供应降低时有最大产率。随着培养条件的变化，紫膜的产率也会有很大差别。某些条件下可以完全不产紫膜。故在实验室中的不同条件下，需要掌握生长期间的一些参数，如对数生长期的延续时间、稳定生长期的开始时间、介质中氧的接受情况等。

2.摇瓶培养

摇瓶培养既可为较大量的液体培养准备接种液，也可用来收集紫膜。摇瓶所盛的液体通常为瓶体积的1/4～1/3。摇床振荡速率的大小控制着摇瓶内的氧气饱和程度，从而控制着紫膜的合成速率。如振荡频率为100r/min，生长6d，39℃，可以达到最大紫膜产率。而当提高至180r/min时，则菌体有较快的增长速度，但紫膜产率较低。

3.菌种保藏

菌种可以在RM固体培养基的琼脂平板上于4℃下保存6个月至1年。平板必须用石蜡严密封好后，在4℃下可保存1～2年。处于对数生长期的液体培养液(在RM基质中)在-10℃下可以保存更长时间。

4.色素突变菌株的分离

嗜盐菌细胞在RM-琼脂上形成很清晰的菌落，琼脂平板上可见有大数量的细胞，由它们形成的群体可通过双筒显微镜(4×25)放大进行观察。根据不同的颜色可以很容易地识别突变菌落。特别是在反射光下，当它们与大量相邻亲缘群体进行互相对照比较时，更易区别。

在分离时，首先将在RM液体培养中所得到的菌体液在显微镜下进行计数，并用BS稀释成10⁴个/mL，取0.05～0.1mL均匀涂布于琼脂平板上，着平板能得到500～1000个群体，则表明这些细胞的接种效率为100％。必须严防干燥，为此可将琼脂平板保存在密封的塑料袋中，于39℃下培养。第一次观察可在培养15d以后，第二次观察在总共培养了25d后，空泡的存在将严重影响颜色，因为它能将入射光反射回来。在相差显微镜下观察，带有空泡的单个细胞由于有很强的反射，对比细胞的暗背景显得很亮。

突变菌株用在RM-琼脂平板上反复划线的办法来纯化。突变菌株的表现型应加以记录，并在重新划线后再观察检查。

色素突变菌株的分离对于选育BR高产菌株是非常重要的。在连续做液体培养的进程中，由于菌种变异等多种原因，BR产率将逐渐减少，因此至少每隔一年需要进行次高产菌株的分离筛选工作。此外，菌株分离工作还应用于选育除含BR外的其它色素系统的菌体。

Claims

1.将选择粉碎过100目筛的风化煤或褐煤、泥炭1000克放进容器中。

2.将嗜盐菌(浓度：1.1×10⁶克)100克放入600克无菌水中搅匀。

3.将700克含嗜盐菌的水放进1000克风化煤(或褐煤、泥炭)容器中搅匀。

4.把1700克含菌风化煤(或褐煤、泥炭)放进培养箱中，温度25°～35℃，湿度75℃～85℃，适量供氧，培养箱光照用日用灯500勒克斯，照射72小时，培养完成，得到400亿/克左右的嗜盐菌，因为广域嗜盐菌和极端嗜盐菌在无盐环境中一段时间细胞膜破裂自溶了，剩下不自溶的就是耐盐菌了。

5.风化煤，褐煤含腐植酸应在35％以上为宜。泥炭含腐植酸应在20％以上为宜。(重量比) 。