CN113957098A

CN113957098A - 普罗威登斯属细菌菌株在制备二价锰氧化剂中的应用

Info

Publication number: CN113957098A
Application number: CN202111066632.4A
Authority: CN
Inventors: 李丁; 罗军; 丁哲旭; 陈莎; 阮小芳; 许瑗淇
Original assignee: Hunan University of Technology
Current assignee: Hunan University of Technology
Priority date: 2021-09-13
Filing date: 2021-09-13
Publication date: 2022-01-21

Abstract

本发明公开了普罗威登斯属细菌菌株在制备二价锰氧化剂中的应用，该普罗威登斯属细菌菌株还能应用于污染水体中的阿特拉津的降解。本发明还提供了一种经济简易制备三氧化二锰的试剂盒和方法，克服了现有三氧化二锰化学合成技术的反应条件苛刻、操作繁琐、成本高、效率低等不足。

Description

普罗威登斯属细菌菌株在制备二价锰氧化剂中的应用

技术领域

本发明属于应用微生物技术领域以及环境修复领域，具体而言，涉及普罗威登斯属细菌菌株在制备二价锰氧化剂中的应用。

背景技术

目前，环境污染主要有两种类型，即重金属污染和有机物污染。重金属在环境中以多种形式存在，主要有离子交换态、金属盐结合态、有机物结合态和残渣态等，其中离子交换态的毒性最大。重金属不但不能被生物降解，还可以在处于食物链下游的生物体内不断得到富集，最终对人类健康产生严重的危害，譬如，致癌、致畸、致突变性、破坏人体的激素、酶调节和免疫系统等。由于农药在农业生产中被大规模使用，其残留问题也引发了人们的急切关注。残留于环境中的农药，可破坏土壤、水体的生物多样性，打破生态系统的平衡。同样，农药残留物也可被动植物吸收积累，经食物链最终进入人体，严重威胁着人类的健康。

锰氧化物，作为地球上氧化能力仅次于氧的强氧化剂，广泛分布于陆地土壤、淡水湖泊、海洋沉积物等环境中。自然界中的Mn(II)氧化，包括生物氧化和非生物氧化两种途径，不断地推动着地壳层中锰氧化物的形成与演化。通常，Mn(II)氧化的生物途径被认为与地表中的微生物生理代谢活动密切相关。由微生物氧化Mn(II)得到的锰氧化物定义为生物源锰氧化物(Biogenic Manganese Oxides，BMO)。与化学合成的锰氧化物相比，生物源锰氧化物结晶性稍差，晶体结构中有较多的八面体状空穴，锰的价态较高，具有较高的氧化还原电位。因此，生物源锰氧化物具备强吸附和强氧化的特点，被视为是一种天然的、无二次污染的、经济高效的针对重金属和有机污染物的吸附剂和氧化剂，在处理重金属废水和有机污染物废水等方面，比化学合成的锰氧化物具有更大的应用前景。目前，细菌氧化Mn(II)形成锰氧化物的证据主要来自海相和湖相，细菌介导Mn(II)氧化的研究主要是围绕三种模式菌株开展，如生盘纤发菌(Leptothrix discophora SS-1和SP-6),恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida MnB1和GB-1)，以及芽孢杆菌(Bacillus sp.SG-1)。然而，它们的Mn(II)氧化产物都是高价态的六方水钠锰矿型二氧化锰，其重金属吸附能力和有机物降解能力不及低价态的方铁锰矿型三氧化二锰。

发明内容

本发明旨在发现普罗威登斯属细菌菌株Providencia sp.LLDRA6具有二价锰Mn(II)氧化能力的基础上开发Mn(II)氧化剂，进而开发三氧化二锰制备试剂盒，提供一种三氧化二锰的制备方法，同时将该菌株用于降解阿特拉津。

所述具有锰氧化能力的普罗威登斯属细菌菌株于2018年12月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，中国武汉，保藏编号为CCTCC NO：M 2018876，命名为Providenciasp.LLDRA6。

本发明包括如下内容：

一、三氧化二锰的纯化与鉴定：

(1)将普罗威登斯属细菌菌株活化后按0.2±0.05％接种量接种至二价锰终浓度为50±5mM的LB液体培养基，于35℃、180±5rpm转速条件下恒温摇床培养5±1d；更具体而言：以LB培养基(酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L)作为营养源，调节pH至7.2～7.4，在121℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌20min，冷却至室温后进行分装。然后添加已过滤灭菌的氯化锰(MnCl₂)溶液，使得Mn(II)最终浓度为50mM。将试剂一活化处理12h的菌株LLDRA6，以0.2％(v/v)的接种量接种至含50mM Mn(II)的LB液体培养基中，在35℃，180rpm条件下，放置恒温摇床上连续培养5d。然后，用LBB指示剂法进行染色，取100μL菌液到离心管中，按照1:5的体积比加入至0.04％LBB显色液，在暗处静置反应15min后，通过肉眼观察到深蓝色，从而验证锰氧化物的存在，表明细菌LLDRA6氧化Mn(II)生成了锰氧化物；

(2)将步骤(1)培养后的LB液体培养基于2000±500rpm转速下离心，去上清，得细菌和三氧化二锰混合物；

(3)将细菌和三氧化二锰混合物于8000±500rpm转速下离心清洗；

(4)向清洗后的细菌和三氧化二锰混合物中加入苯酚(苯酚的添加量可以为任意量，只要后续添加的三氯甲烷与之同比例即可)，于功率200±50W条件下超声50±5min；

(5)向经步骤(4)超声处理后的混合物中加入与所加入苯酚同体积的三氯甲烷，于功率200±50W条件下超声20±5min；

(6)向经步骤(5)超声处理后的混合物中加入甲醇和去离子水，所添加的甲醇、去离子水和步骤(5)中所加入的三氯甲烷的体积比为12:(2-4):(4-6)，优选为12:3:5；于功率200±50W条件下超声10±2min后，于2000±500rpm条件下离心，去上清液，得沉积物；

(7)将沉积物于8000±500rpm转速下离心清洗；

(8)将清洗后的沉积物调pH至3.0，于35℃、180±5rpm转速条件下摇床震荡0.5±0.1h；

(9)将经步骤(8)处理后的沉积物于8000±500rpm转速下离心清洗，至上清液pH为中性；

(10)向经步骤(9)离心后的沉积物中加入次氯酸钠(次氯酸钠的添加量可以为任意量)，于35℃、180±5rpm转速条件下摇床震荡4±0.5h；

(11)将经步骤(10)处理后的沉积物(褐色)于8000±500rpm转速下离心清洗，再于60±5℃烘干，得纯净的三氧化二锰。

纯化烘干后的锰氧化物通过扫描电镜和能谱分析(SEM-EDS)来观察锰氧化物的结构形貌以及元素组成，通过粉末X射线衍射(XRD)对纯化烘干后的锰氧化物定性分析。

二、三氧化二锰吸附水体中的重金属：

将提纯烘干后的三氧化二锰加入到重金属水溶液中，在常温、转速为180rpm的摇床条件下，进行吸附反应，反应时间为24h。

上述方法中，向重金属水溶液中加入的三氧化二锰，其投加量为0.2g/L。

三、三氧化二锰降解水体中的阿特拉津：

将提纯烘干后的三氧化二锰加入到阿特拉津水溶液中，在常温、转速为180rpm的摇床条件下，进行降解反应，反应时间为7d。

上述方法中，向阿特拉津水溶液中加入的三氧化二锰，其投加量为10±2g/L，阿特拉津的初始含量分别为0.1mg/L，1mg/L和10mg/L。

总之，本发明将普罗威登斯属细菌菌株应用于制备二价锰氧化剂，应用于污染水体中的阿特拉津的降解。同时提供了一种经济简易制备三氧化二锰的试剂盒和方法，克服了现有三氧化二锰化学合成技术的反应条件苛刻、操作繁琐、成本高、效率低等不足。

附图说明

图1是LBB染色结果：LBB指示剂法验证Providencia sp.LLDRA6的Mn(II)氧化能力，A：0.04％LBB染色液；B：0.04％LBB染色液+LB液体培养基；C：0.04％LBB染色液+LB液体培养基+Mn(II)；D：0.04％LBB染色液+LB液体培养基+Mn(II)+Providencia sp.LLDRA6；

图2是纯化后的三氧化二锰；

图3是纯化后的三氧化二锰的SEM-EDS表征图：SEM电镜扫描(A)和元素能谱EDS分析(B)；

图4是纯化后的三氧化二锰的XRD表征图：XRD(X射线衍射)图谱与标准方铁锰矿XRD图谱；

图5是纯化后的三氧化二锰吸附重金属的吸附量图；

图6是纯化后的三氧化二锰降解阿特拉津的效果图：A：阿特拉津起始浓度为0.1mg/L；B：阿特拉津起始浓度为1mg/L；C：阿特拉津起始浓度为10mg/L。

具体实施方式

本发明提供的普罗威登斯属细菌菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，中国武汉，保藏编号为CCTCC NO：M 2018876。

一、Providencia sp.LLDRA6 Mn(II)氧化能力的鉴定及三氧化二锰的纯化。

1)主要试剂：

①LBB指示剂；②试剂一：菌粉LLDRA6；③试剂二：苯酚；④试剂三：三氯甲烷；⑤试剂四：甲醇；⑥试剂五：次氯酸钠。

2)溶液配置

①LB培养基：5g酵母浸粉，10g蛋白胨，5g氯化钠，1L去离子水，pH至7.2～7.4。

②LBB配置：首先称量40mg的LBB药品粉末，然后在事先配置好的浓度为45mM的醋酸溶液中进行溶解，溶解完全后移至100mL容量瓶中进行定容，配置完成的LBB溶液的质量分数为0.04％。最后在4℃下将配置好的LBB显色液避光保存备用。

3)实验处理

(1)三氧化二锰的制备

配置LB液体培养基，在121℃的高压蒸汽灭菌锅中灭菌20min，冷却至室温后进行分装。然后添加已过滤灭菌的氯化锰(MnCl₂)溶液，使得Mn(II)最终浓度为50mM。将试剂一活化12h后的Providencia sp.LLDRA6，以0.2％(v/v)的接种量接种至含50mM Mn(II)的LB液体培养基中，在35℃，180rpm条件下，放在恒温摇床上连续培养5d。然后用LBB指示剂法进行染色鉴定，取100μL菌液到离心管中，按照1:5的体积比加入至0.04％(w/v)LBB显色液中，在暗处静置反应15min。

(2)三氧化二锰的纯化

将细菌/锰氧化物混合物收集于50mL离心管中，在2000rpm和室温下离心10min，弃去上清液后，沉积物用去离子水清洗离心，重复此步骤，直至上清液澄清，保留沉积物。②沉积物用苯酚进行50min超声处理，然后加入与苯酚同体积的三氯甲烷后混合试剂继续进行20min超声处理，最后加入加入甲醇和去离子水(所添加的甲醇、去离子水和前面所加入的三氯甲烷的体积比为12:(2-4):(4-6)，优选为12:3:5)，再次进行10min超声处理。③离心去上清，用去离子水清洗沉积物，如步骤①。④加入预先配好的HCl溶液重悬沉积物，将50mL离心管中的悬浮液酸化至pH 3.0，摇床摇匀30min。⑤离心弃上清，用去离子水清洗沉积物，如步骤①，直至上清液pH至中性。⑥加入试剂五，摇床震荡处理4h。⑦离心弃去上清液，保留褐色沉淀，用去离子水清洗，如步骤①。然后将褐色沉淀烘干后，常温保存备用。

(3)三氧化二锰的表征鉴定

称取少量纯化烘干后的锰氧化物颗粒粉末，将其放入酒精溶液中，用超声波将其超声分散成悬浮物，然后吸出少量的悬浮物滴入镀铜网上，室温干燥，经真空喷涂金粉后，用扫描电镜观察锰氧化物的表面形貌结构。使用EDS系统检测纯化后的锰氧化物样品，对元素进行半定量分析。

将锰氧化物粉末压片处理后，采用布鲁克D8 advance型X射线衍射仪(Cu靶、Kα射线源、λ＝0.154nm、Ni滤波片)对纯化后的锰氧化物样品进行测试。测试条件为：2θ扫描范围为10°～80°，扫描速度5°/min，电子发生电流为40mA，加速电压为40kV。

二、三氧化二锰应用于重金属的吸附和阿特拉津的降解。

1、重金属吸附实验

1)主要试剂：

①硝酸钠；②硝酸铅；③硝酸镍；④硝酸铜；⑤硝酸锌；⑥硝酸镉。

2)实验处理

将预先配置好的不同重金属母液(1M)分别加入电解质溶液(10mM硝酸钠)中,使得重金属初始浓度为1mM。取10mg纯化烘干后的三氧化二锰，加入50mL重金属溶液中进行吸附反应，溶液pH调节至6.0，25℃摇床反应24h，反应结束后，10000rpm离心10min，用电感耦合等离子体发射光谱(ICP-OES，OPTMA 2000，PerkElmerCo，U.S.A.)测定上清液中重金属离子浓度，根据以下公式计算不同时间点的重金属离子的吸附量，所有吸附试验重复3次。

q＝(C_i-C_e)·V/m

q(mg/g)为吸附平衡时重金属离子的吸附量，C_i和C_e(mg/L)为初始重金属离子和吸附平衡时的浓度，V是吸附溶液体积，m是三氧化二锰的干重。

2、阿特拉津降解实验

1)主要试剂：

①氯化钠；②阿特拉津。

2)实验处理

将预先配置好的母液浓度为0.5g/L的阿特拉津加入电解质溶液(10mM氯化钠)中，使得阿特拉津的初始浓度分别为0.1，1，10mg/L。称取0.5g纯化烘干后的三氧化二锰加入50mL阿特拉津溶液中进行降解反应，以含不同浓度梯度的阿特拉津溶液作为空白对照，各实验组设置三次重复。置于35℃，180rpm的摇床上，在暗条件下进行降解反应，分别在0h、24h、48h、72h、96h、120h、144h和168h的时间点取样。将样品离心(12000rpm，10min)后，上清液用0.22μm聚乙烯注射器过滤，再通过HPLC法(Agilent HPLC 1100；C18反相色谱柱(250mm×4.6mm,5μm))测定阿特拉津的浓度。

结果与分析

Providencia sp.LLDRA6的Mn(II)氧化能力验证的结果如图1所示，当同时含有菌株LLDRA6和Mn(II)的LB液体培养基加入至LBB指示剂后，呈现出深蓝色。然而，当不含菌株LLDRA6的LB液体培养基加入至LBB指示剂时，颜色没有发生变化，仍然呈现为LBB的背景淡蓝色，这表明，Providencia sp.LLDRA6具备氧化Mn(II)生成锰氧化物的能力。

提纯的锰氧化物的形貌如图2和图3所示，从图2中可以发现，提纯的锰氧化物，外观呈褐色、颗粒状，硬度适中。通过SEM电镜扫描发现(图3A)，在微观结构上，提纯的锰氧化物为形状不规则的纳米级颗粒状，这些颗粒聚集在一起形成无定形的聚合体。在这其中，无明显菌丝体残留，表明锰氧化物纯度较好。从EDS能谱图(图3B)中可以看出，相比于C、O、P、S等元素的峰值，Mn的峰值最高，强度最为明显。图3B表格中的结果表明，Mn的含量最高，质量分数占到了32.71％，O的原子百分率(29.25％)与Mn的原子百分率(19.85％)之间的比值为1.47，接近于三氧化二锰的原子数之比(O：Mn＝1.5)，间接说明形成的锰氧化物可能是三氧化二锰。

从XRD(X射线衍射)结果中可以发现(图4)，提纯的锰氧化物的特征衍射峰出现在2θ＝32.95°，55.18°和65.80°处。经过Jade软件比对分析，各峰位与标准卡片库中的PDF#41-1442(Bixbyite Mn₂O₃)吻合，分别对应(222)、(440)、(622)晶面的特征衍射峰，这三个晶面对应的d值(晶格间距)分别为0.2716nm，0.16629nm和0.1418nm。这说明，该锰氧化物属于弱晶质的方铁锰矿型矿物，其主要的物相成分为三氧化二锰(Mn₂O₃)。

纯化后的方铁锰矿型三氧化二锰吸附重金属的结果如图5所示。结果表明，三氧化二锰对五种重金属均具有很强的吸附能力。其中，对铅的吸附能力最强，吸附量达到了537.2mg/g，对锌的吸附量为412.5mg/g，对镍的吸附量为235.8mg/g，对铜的吸附量为221.34mg/g，对镉的吸附量为206.115mg/g。这些结果表明，通过本试剂盒提取的方铁锰矿型三氧化二锰是一种高效、强力的重金属吸附剂，在重金属污染治理中，具备很高的应用价值。

方铁锰矿型三氧化二锰降解阿特拉津的结果如图6所示：可以发现，在48h内，三氧化二锰降解阿特拉津的速率最快，但随着反应时间的延长，降解速率逐渐降低。在120h时，阿特拉津的降解反应趋于平衡。最终，起始浓度为0.1mg/L，1mg/L和10mg/L的阿特拉津的降解率分别达到了83％，67％和55％。

Claims

1.普罗威登斯属细菌菌株在制备二价锰氧化剂中的应用，其特征在于，所述普罗威登斯属细菌菌株为Providenciasp.LLDRA6，菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2018876。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述二价锰氧化剂是将二价锰氧化形成三氧化二锰的氧化剂。

3.一种制备三氧化二锰的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2018876的普罗威登斯属细菌菌株为Providenciasp.LLDRA6。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有苯酚、三氯甲烷、甲醇和次氯酸钠。

5.基于权利要求4所述试剂盒制备三氧化二锰的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

将普罗威登斯属细菌菌株活化后按0.2±0.05%接种量接种至二价锰终浓度为50±5mM的LB液体培养基，于35℃、180±5rpm转速条件下恒温摇床培养5±1d；

将步骤（1）培养后的LB液体培养基于2000±500rpm转速下离心，去上清，得细菌和三氧化二锰混合物；

将细菌和三氧化二锰混合物于8000±500rpm转速下离心清洗；

向清洗后的细菌和三氧化二锰混合物中加入苯酚，于功率200±50W条件下超声50±5min；

向经步骤（4）超声处理后的混合物中加入与所加入苯酚同体积的三氯甲烷，于功率200±50W条件下超声20±5min；

向经步骤（5）超声处理后的混合物中加入甲醇和去离子水，所添加的甲醇、去离子水和步骤（5）中所加入的三氯甲烷的体积比为12:（2-4）:（4-6）；于功率200±50W条件下超声10±2min后，于2000±500rpm条件下离心，去上清液，得沉积物；

将沉积物于8000±500rpm转速下离心清洗；

将清洗后的沉积物调pH至3.0，于35℃、180±5rpm转速条件下摇床震荡0.5±0.1h；

将经步骤（8）处理后的沉积物于8000±500rpm转速下离心清洗，至上清液pH为中性；

向经步骤（9）离心后的沉积物中加入次氯酸钠，于35℃、180±5rpm转速条件下摇床震荡4±0.5h；

将经步骤（10）处理后的沉积物于8000±500rpm转速下离心清洗，再于60±5℃烘干，得纯净的三氧化二锰。

6.普罗威登斯属细菌菌株降解阿特拉津的用途，其特征在于，所述普罗威登斯属细菌菌株为Providenciasp.LLDRA6，菌株保藏编号为CCTCC NO：M 20188766。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述用途是用普罗威登斯属细菌菌株将二价锰氧化形成三氧化二锰，再用该三氧化二锰降解阿特拉津。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述三氧化二锰降解阿特拉津时，三氧化二锰的浓度为10±2g/L。