ES2585803T3 - Medio de cultivo selectivo y método para detectar bacterias resistentes a carbapenémicos en una muestra de ensayo - Google Patents

Abstract

Un medio de cultivo que comprende un carbapenémico, un activador de carbapenemasa que es un catión divalente, y una penicilina de tipo M, en el que dicha penicilina de tipo M se selecciona del grupo que consiste en cloxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina, oxacilina, meticilina, nafcilina y mezclas de las mismas, y en el que dicho catión divalente es zinc.

Description

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DESCRIPCIÓN

Medio de cultivo selectivo y método para detectar bacterias resistentes a carbapenémicos en una muestra de ensayo 5

Sector de la técnica

La presente invención se refiere a un medio de cultivo selectivo y a un método para detectar bacterias resistentes a carbapenémicos, en particular productoras de carbapenemasa, en una muestra de ensayo.

Estado de la técnica

De manera progresiva, a nivel mundial, se están identificando aislados de bacterias productoras de carbapenemasa (1-8). Su detección precoz se está convirtiendo en una cuestión principal en el campo de la microbiología clínica

15 para impedir su propagación y preservar la eficacia de los carbapenémicos que se están convirtiendo en los antibióticos del último recurso para el tratamiento de infecciones graves. Además, las carbapenemasas están normalmente asociadas con muchos otros determinantes resistentes a no betalactámicos dando lugar a resistencia a múltiples fármacos y panfarmacológica. Por lo tanto, debido a los cambios y desplazamientos actuales de la población, el reconocimiento precoz de las productoras de carbapenemasa está siendo obligatorio cualquiera que sea la normativa relacionada con los antibióticos o la tasa de infecciones nosocomiales resistentes a múltiples fármacos.

La inmensa mayoría de las carbapenemasas adquiridas pertenecen a tres de las cuatro clases conocidas de betalactamasas, en concreto, Ambler clase A, Ambler clase B (metalobetalactamasas (MBL)) y Ambler clase D

25 (oxacilinasas (Oxa)). Estas tres clases de carbapenemasas confieren resistencia clínica a carbapenémicos. Por consiguiente, los aislados de bacterias productoras de carbapenemasa de estas tres clases se han visto implicados en brotes nosocomiales (1, 2, 7, 9, 10).

La propagación de estas tres clases distintas de carbapenemasas varía significativamente en todo el mundo. Por ejemplo, los productores de KPC (Ambler clase A) están en su mayor parte identificados en América y el Sur de Europa, mientras que los de IMP, VIM, NDM-1 (Ambler clase B) están ampliamente identificados en todo el mundo con una reserva principal para NDM-1 en el subcontinente Indio. En lo que respecta a las enzimas de tipo OXA-48 (Ambler clase D), estas se identificaron por primera vez en Klebsiella pneumoniae en Turquía en el 2003, donde es muy frecuente (11). Sin embargo, las bacterias productoras de OXA-48, en particular Enterobacteriaceae, también

35 se han comunicado en varios otros países tales como Francia, Bélgica, Reino Unido, Alemania, Egipto, India y Norte de África, lo que sugiere su naturaleza endémica (1, 6, 12).

Como se mencionó anteriormente, el reconocimiento precoz de los productores de carbapenemasa es crítico para impedir su propagación. Sin embargo, el nivel de susceptibilidad reducida a los carbapenémicos puede variar significativamente entre los productores de carbapenemasa dificultando su detección (11, 12, 13, 14, 15).

En particular, aunque las enzimas de tipo OXA-48 siguen siendo susceptibles a cefalosporinas de espectro ampliado, estas confieren resistencia a penicilinas y susceptibilidad reducida a carbapenémicos, con lo que en los laboratorios clínicos se dificulta la detección de los aislados productores de tipo OXA-48. De hecho, en aislados

45 resistentes a múltiples fármacos, se ha identificado que a menudo acumulan mecanismos de resistencia múltiple, incluyendo la producción de betalactamasas de espectro ampliado (BLEA). La mayoría de los productores de carbapenemasa coexpresan BLEA, pero diversos aislados productores de tipo OXA-48 que no llevan genes de BLEA pueden seguir siendo susceptibles a las cefalosporinas de espectro ampliado (11).

En el comercio se dispone de medios para la detección de productores de carbapenemasa. Son ejemplos de dichos medios el medio CHROMagar KPC que contiene carbapenémicos (empresa CHROMagar, París, Francia) y el medio chromID BLEA cromogénico que contiene cefpodoxima (bioMerieux, La Balme-les-Grottes, Francia) que está diseñado para explorar productores de BLEA (16-17). Además, cada medio contiene una molécula cromogénica que puede contribuir al reconocimiento de especies. La desventaja principal de la exploración de productores de

55 carbapenemasa usando el medio chromID BLEA es que no puede detectar productores de tipo OXA-48 que son susceptibles a cefpodoxima en ausencia de coproducción de una BLEA (12). Además este medio puede carecer de especificidad ya que los productores de BLEA no carbapenemasa están coseleccionados en este medio. En cuanto al medio CHROMagar KPC, su desventaja principal es su falta de sensibilidad ya que los productores de carbapenemasa con bajo nivel de resistencia a carbapenémicos no se detectan de un modo eficaz en este medio (12).

Por último, el documento WO 2010/010083 comenta un método de detección directa y diferenciación de bacterias resistentes a carbapenémicos en una muestra que comprende (i) la inoculación con dicha muestra de un medio de cultivo que comprende al menos meropenem y/o ertapenem y al menos un agente cromogénico; (ii) la incubación de 65 dicho medio de cultivo en condiciones que permitan el crecimiento de bacterias resistentes a carbapenémicos y (iii) la detección de colonias formadas en dicho medio de cultivo correspondiente a bacterias resistentes a

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carbapenémicos. La solicitud también desvela un medio de cultivo adecuado para su uso en dicho método. Sin embargo, el medio de cultivo utilizado en este método no es lo suficientemente sensible, ni lo suficientemente específico para detectar productores de carbapenemasa con susceptibilidad reducida a carbapenémicos.

5 Pasteran F. et al., Journal of Clinical Microbiology, abril 2010, págs. 1323-1332 desvelan un ensayo para la detección de Carbapenemasa A que comprende ácido borónico.

Giske, C. et al., Clinical Microbiology and infection, 2010, págs. 552-556 desvelan un ensayo para la detección de metalo-β-lactamasas que comprende ácido aminofenilborónico, ácido dipicolínico y cloxacilina.

Lee, K. et al., Journal of Clinical Microbiology, 2003, 4623-4629 desvelan un ensayo para la detección de metalo-βlactamasas que comprende sulfato de zinc.

Objeto de la invención

15 Para facilitar la detección de bacterias resistentes a carbapenémicos en el campo de la microbiología clínica, y en particular, bacterias productoras de carbapenemasa con susceptibilidad reducida a carbapenémicos, el solicitante ha desarrollado un nuevo medio de cultivo fiable y altamente sensible que comprende una combinación de un carbapenémico, un activador de carbapenemasa y una penicilina de tipo M. La ventaja de este nuevo medio para la detección de bacterias productoras de carbapenemasa es que es más sensible y específico que los medios existentes. Además, no se necesita un alto nivel de Concentraciones Mínimas Inhibitorias (CMI) de carbapenémicos (que se requiere en el medio CHROMagar KPC) ni la coexpresión de una betalactamasa de espectro ampliado (BLEA) (que se requiere en el medio ChromoID BLES). Además este medio puede ser útil para la detección de bacterias productoras de carbapenemasa en heces humanas que también contienen una gran cantidad de bacterias

25 productoras de BLEA y/o una gran cantidad de cefalosporinasas AmpC, inhibiéndose la última actividad por penicilinas de tipo M. Este último punto podría ser más relevante en países con altas tasas de estos tipos de aislados.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a un medio de cultivo que comprende un carbapenémico, un activador de carbapenemasa y una penicilina de tipo M.

La presente invención también se refiere a un método para detectar bacterias resistentes a carbapenémicos en una muestra de ensayo que comprende las siguientes etapas sucesivas:

35 a) inocular un medio de cultivo como se define en el presente documento con dicha muestra de ensayo, b) incubar dicho medio de cultivo en condiciones adecuadas para el crecimiento de bacterias resistentes a carbapenémicos, c) detectar colonias formadas en dicho medio de cultivo correspondientes a bacterias resistentes a carbapenémicos.

Descripción detallada de la invención

Definiciones:

45 Como se usa en el presente documento, “muestra de ensayo” significa cualquier material líquido o sólido que va a ensayarse que puede contener bacterias productoras de carbapenemasa. La muestra de ensayo preferida es una muestra biológica.

Como se usa en el presente documento, “muestra biológica” significa cualquier muestra biológica procedente de un sujeto. Los ejemplos de dichas muestras incluyen muestras de fluidos, de frotis cutáneo, de tejidos y de células, etc. Las muestras biológicas preferidas son saliva, sangre entera, suero, plasma, orina y heces.

Como se usa en el presente documento, “sujeto” significa un mamífero, tal como un roedor, un felino, un canino y un primate. Preferentemente un sujeto de acuerdo con la invención es un ser humano.

55 Medio de cultivo:

Como se ha mencionado anteriormente, el reconocimiento precoz de las bacterias productoras de carbapenemasa es crítico para impedir su propagación. Sin embargo, sigue habiendo una dificultad en cuanto a que el nivel de susceptibilidad reducida a los carbapenémicos puede variar significativamente entre las productoras de carbapenemasa dificultando su detección.

Como una solución a este problema, el solicitante ha desarrollado un nuevo medio de cultivo que es fiable, altamente sensible y más específico que los medios existentes para la detección de bacterias productoras de

65 carbapenemasa.

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Por lo tanto, la presente invención se refiere a un medio de cultivo que comprende un carbapenémico, un activador de tipos específicos de carbapenemasa y/o una penicilina de tipo M.

Típicamente, la concentración de carbapenémico está comprendida entre 0,005 a 4 μg/ml. Por ejemplo, la

5 concentración de carbapenémico puede estar comprendida entre 0,01, 0,02, 0,05, o de 0,1 a 0,1, 0,2, 0,5 o 1 μg/ml, por ejemplo, entre 0,2 y 0,5 μg/ml. Por ejemplo, la concentración de carbapenémico es de aproximadamente 0,25 μg/ml.

La concentración preferida dependerá típicamente del carbapenémico usado.

Para ertapenem, la concentración preferida está comprendida entre 0,1 a 1 μg/ml, preferentemente entre 0,2 y 0,5 μg/ml y más preferentemente la concentración de ertapenem es de aproximadamente 0,25 μg/ml.

Para doripenem, la concentración preferida está comprendida entre 0,01 a 0,1 μg/ml, preferentemente entre 0,015 y 15 0,05 μg/ml y más preferentemente la concentración de doripenem es de aproximadamente 0,025 μg/ml.

Una concentración baja de carbapenémico permitirá la selección de productores de carbapenemasa con susceptibilidad reducida a carbapenémicos, el activador de carbapenemasa aumentará la expresión de productores Ambler Clase B, mientras que la penicilina de tipo M impedirá el crecimiento de aislados que son resistentes a carbapenémicos por la producción de cefalosporinasas (y no carbapenemasas) (+/asociado a defectos de permeabilidad de la membrana externa), reforzando de este modo la selectividad del medio. Dichas cefalosporinasas son bien de tipo AmpC o con una actividad de sustrato ampliada, y pueden encontrarse en especies tales como Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Serratia marcescens (es decir, productoras Ambler de Clase C).

25 De acuerdo con la invención, el carbapenémico se selecciona del grupo que consiste en biapenem, ertapenem, doripenem, imipenem, meropenem, tebipenem, panipenem y mezclas de los mismos. Preferentemente el carbapenémico es ertapenem.

Basándose en estudios moleculares, las carbapenemasas pueden dividirse adicionalmente en dos tipos: enzimas de serina que poseen un resto de serina en el sitio activo (Ambler Clase A, C y D), y los MBL (Ambler Clase B) que requieren cationes divalentes, normalmente zinc, como cofactores metálicos para la actividad enzimática, facilitando de este modo la hidrólisis del anillo betalactámico bicíclico (18).

35 Por tanto, de acuerdo con la invención, para aumentar la expresión de los productores de carbapenemasa Ambler de Clase B, el medio de cultivo comprende un activador de carbapenemasa, que se selecciona del grupo que consiste en cationes divalentes y mezclas de los mismos.

En el caso de las carbapenemasas Ambler de clase B, el activador es un catión divalente o una sal del mismo que es zinc (véase Biochem J. 1974; 143(1): 129-35 y el Journal of Biological Chemistry vol. 285, n.º 7, 4570-4577).

Típicamente, la concentración del activador de carbapenemasa que se encuentra en medio de cultivo está comprendida entre 10 o 30 y 100 μg/ml, preferentemente entre 50 y 80 μg/ml, y más preferentemente la concentración del activador de carbapenemasa es de aproximadamente 70 μg/ml.

45 De acuerdo con la invención, la penicilina de tipo M (también denominada penicilina de tipo meticilina) se selecciona del grupo que consiste de cloxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina, oxacilina, meticilina, nafcilina y mezclas de las mismas. Preferentemente, la penicilina de tipo M es cloxacilina.

Típicamente, la concentración de penicilina de tipo M que se encuentra en el medio de cultivo está comprendida entre 100 y 500 μg/ml, preferentemente entre 200 y 300 μg/ml, y más preferentemente la concentración de penicilina de tipo M es de aproximadamente 250 μg/ml.

Sin embargo, el medio de cultivo de acuerdo con la invención comprende preferentemente ertapenem, zinc y

55 cloxacilina, como se desvela en el presente documento, en el medio de cultivo de la presente invención puede usarse cualquier combinación de carbapenémico, activador de carbapenemasa y penicilina de tipo M.

Típicamente, el medio de cultivo de acuerdo con la invención es un medio de cultivo de agar, en el que el medio de cultivo está, por ejemplo, basado en agar. Como alternativa, el medio de cultivo puede ser un medio líquido de caldo.

Además, para la combinación de carbapenémico, activador de carbapenemasa y penicilina de tipo M, el medio de cultivo de acuerdo con la invención también comprende nutrientes necesarios para dar soporte al crecimiento, proliferación y supervivencia de las bacterias. Por lo tanto, un medio de cultivo apropiado de acuerdo con la invención comprende típicamente, además de la combinación de carbapenémico, activador de carbapenemasa y

65 penicilina de tipo M, un medio mínimo en el que las bacterias pueden crecer. Son ejemplos típicos de dichos medios mínimos, Drigalski, Tripticasa de soja y MacConckey.

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Preferentemente, el medio es selectivo para bacterias Gram negativas, tal como el medio Drigalski. Como alternativa, la selección de bacterias Gram negativas puede basarse en la asociación de antibiótico con fármaco antifúngico, usando un medio no selectivo tal como agar de Tripticasa de soja. En ese caso, el medio puede

5 comprender un antibiótico específico para bacterias gram positivas, tal como un antibiótico glucopeptídico o un antibiótico lipopeptídico, tal como daptomicina. Por ejemplo, el antibiótico puede ser un antibiótico glucopeptídico seleccionado del grupo de consiste en vancomicina, teicoplanina, telavancina, ramoplanina y decaplanina. Típicamente, el medio puede comprender un fármaco antifúngico, tal como un fármaco antifúngico de polieno, por ejemplo anfotericina B.

Típicamente el cultivo de acuerdo con la invención puede comprender un componente cromogénico. Un componente cromogénico puede facilitar el reconocimiento de especies. En la técnica se conocen bien componentes cromogénicos adecuados y se usan, por ejemplo, en los medios de exploración KPC Chromagar o ChromID BLEA o CRE.

15

Método de detección:

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un método para detectar bacterias resistentes a carbapenémicos en una muestra de ensayo que comprende las siguientes etapas sucesivas:

a) inocular un medio de cultivo como se define en el presente documento con dicha muestra de ensayo, b) incubar dicho medio de cultivo en condiciones adecuadas para el crecimiento de bacterias resistentes a carbapenémicos, c) detectar colonias formadas en dicho medio de cultivo correspondientes a bacterias resistentes a

25 carbapenémicos.

Típicamente, una vez detectadas las colonias en el medio de cultivo, pueden usarse otras técnicas para caracterizar el contenido betalactamasa. Actualmente, existen diversos métodos para detectar productores de carbapenemasa. En primer lugar, la producción in vivo de carbapenemasa, pueden usarse técnicas basadas en el fenotipo, tales como “Etest®” y el “Ensayo de Hodge”. Como alternativa, pueden usarse técnicas de detección molecular para los genes de carbapenemasa. Finalmente, la identificación de betalactamasa usando moléculas cromogénicas, ensayos biomédicos, yodométricos y acidimétricos puede usarse también como técnicas moleculares para la identificación de genes correspondientes.

35 De acuerdo con la presente invención, el método puede usarse para detectar bacterias resistentes a carbapenémicos en particular bacterias productoras de carbapenemasa, implicadas en infecciones nosocomiales y extrahospitalarias.

Típicamente, las bacterias resistentes a carbapenémicos, y en particular, las bacterias productoras de carbapenemasa que se detectan mediante el método de la invención tienen una susceptibilidad reducida a carbapenémicos. Como se usa en el presente documento, “susceptibilidad reducida” significa susceptibilidad disminuida en comparación con la susceptibilidad de carbapenémicos de tipo silvestre.

Típicamente, las bacterias resistentes a carbapenémicos son bacterias, tales como bacterias productoras de 45 carbapenemasa, que contienen un gen que codifica una betalactamasa Ambler de clase A, B y/o D.

Preferentemente, las bacterias resistentes a carbapenémicos se seleccionan de la familia Enterobacteriaceae y más preferentemente los géneros que consisten en Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella y Providencia.

En una realización de la invención, el método desvelado en el presente documento puede aplicarse directamente a una muestra de ensayo sin procesar que comprende una mezcla de bacterias sin tener que aislar las diversas cepas bacterianas presentes en la muestra de ensayo.

El experto en la materia conoce las condiciones de incubación que permiten el crecimiento de bacterias resistentes a 55 carbapenémicos y no difieren de los métodos habituales.

Dado que ertapenem muestra muy buena o buena estabilidad en medio agar (de 2 a 4 semanas), puede realizarse un método de detección similar a uno de la presente invención eficazmente durante varios meses.

La invención se ilustrará adicionalmente a la vista de los siguientes ejemplos

Ejemplos

Ejemplo 1: Evaluación del medio de cultivo en agar con ETP-Cloxa-Zinc

65 El solicitante evaluó un agar que contenía ertapenem-cloxacilina-zinc (en lo sucesivo en el presente documento denominado medio SUPERCARBA) preparado internamente como una alternativa a CHROMagar KPC y ChromID BLEA.

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Se añadió ertapenem a una baja concentración de 0,25 μg/ml, se añadió ZnSO4 (70 μg/ml) para mejorar el

5 crecimiento de productores de metalobetalactamasa (MBL) (3) y se usó cloxacilina (250 μg/ml) para impedir el crecimiento de aislados que expresasen cefalosporinasas con actividad de sustrato ampliada, tales como Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes y Serratia marcescens.

En el estudio se incluyeron cuarenta y siete aislados productores de carbapenemasa pertenecientes a diversas especies de enterobacterias de origen mundial. Estas cepas se caracterizaron previamente con respecto al contenido betalactamasa a nivel molecular. Las cepas fueron las siguientes:

- productoras de KPC (n=4),

-productoras de VIM/IMP (n=5), 15 -productoras de NDM-1 (n=16),

-

productoras de OXA-48 (n=19),

-

productoras de OXA-181 (n=3).

Veintinueve de cuarenta y cinco productoras de carbapenemasa coexpresaron una BLEA (Tabla 1).

Las cepas que no expresaron ninguna carbapenemasa se usaron como control. Estas cepas de control fueron:

- aislados susceptibles a ertapenem que producen una BLEA (n=6, identificados como “b” en la Tabla 1),

-aislados susceptibles a ertapenem que producen un alto nivel de AmpC (n=5, identificados como “c” en la Tabla 25 1),

-

aislados con susceptibilidad reducida a ertapenem debido sobrexpresión de AmpC (n=4, identificados como “d” en la Tabla 1),

-

aislados con susceptibilidad reducida a ertapenem debido a una deficiencia de BLEA y/o porina (n=12, identificados como “e” en la Tabla 1).

Usando un inóculo de ~ 2 x 107 UFC/ml (intervalo, 1,5 x 107 a 3,5 x 108 UFC/ml), se realizaron diluciones en serie con factor 10 de los aislados en solución salina normal y 100 μl se sembraron en placas sobre agar Drigalski que contenía SUPERCARBA. Las bacterias viables se contaron después de 24 horas de cultivo a 37 ºC y el crecimiento sobre medio SUPERCARBA selectivo se comparó con el crecimiento sobre agar Drigalski sin SUPERCARBA.

35 El límite de detección más bajo de productoras de VIM e IMP varió de 1 x 101 a 1 x 106 UFC/ml (Tabla 1). Aunque la adición de sulfato de zinc ayudó a disminuir este límite de detección para los productores de VIM, los aislados productores de IMP que no se detectaron siempre de un modo eficaz en este medio.

El límite de detección más bajo de productoras de OXA-48, OXA-181, NDM-1 y KPC fue de 1 x 101 a 1 x 102 UFC/ml (Tabla 1). Este resultado es, en opinión del solicitante, una de las formas más eficaces para detectar aisladosproductores de carbapenemasa. Únicamente un aislado (el aislado P. stuartii productor de NDM-1) no se detectó de un modo eficaz en este medio SUPERCARBA (Tabla 1). El nivel de detección bajo de este aislado podría explicarse por la baja CMI (Concentración Mínima Inhibitoria) de ertapenem (0,38 μg/ml) y por su débil expresión de NDM-1.

45 Como se esperaba, la especie K. pneumoniae productora de OXA-181 se detectó de un modo eficaz en SUPERCARBA. Sin embargo, sorprendentemente, se obtuvo una detección muy débil para la especie Providencia rettgeri productora de OXA-181 a pesar de sus altas CMI de carbapenémicos (Tabla 1). Con respecto a P. rettgeri, la contribución de las cefalosporinasas AmpC y la impermeabilidad a muchas moléculas β lactámicas puede ser muy importante en comparación con la de las carbapenemasas para proporcionar el nivel de observación in vivo de resistencia a carbapenémico.

Como se esperaba, los aislados que no expresaban ninguna carbapenemasa (es decir, aislados positivos a AmpC y/o BLEA) se inhibieron en SUPERCARBA (con un límite de detección de >107 UFC/ml). En particular, la cloxacilina

55 ayudó a impedir el crecimiento de aislados que expresaban cefalosporinasas con actividad de sustrato ampliada (Tabla 1). No obstante, entre los 12 aislados no susceptibles a ertapenem (un aislado de C. freundii y once de K. pneumoniae) en los que la pérdida de porina estaba muy probablemente implicada en la resistencia a ertapenem, se detectaron el 50 % (n = 6) en SUPERCARBA (límite de detección inferior ≤ 102 UFC/ml) (Tabla 1, especies identificadas con “e”).

La adición de sulfato de zinc fue útil para eliminar parte (hasta el 42 %, n=5) de los aislados de K. pneumoniae resistentes a ertapenem no productores de carbapenemasa (19, 20, 21). Se requieren estudios adicionales para investigar el efecto del zinc sobre el perfil de las proteínas de la membrana externa de K. pneumoniae.

65

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Tabla 1: Sensibilidad de detección del medio SUPERCARBA para 45 aislados de enterobacterias productoras de carbapenemasa y/o BLEA/AmpC.

Cepas

Betalactamasas CMI (μg/ml) de fármacoa: IPM ETP MEM Límite de Detección más Bajo (UFC/ml)

OXA-48

K.

OXA-48

pneumoniae BIC

0,5 2 0,5 1 X 101

K.

OXA-48 + TEM-1

pneumoniae CHA

0,38 1 0,5 1 X 101

K.

OXA-48 + CTX-M-15

pneumoniae EGY

2 3 2 1 X 101

K.

OXA-48

pneumoniae BEL

1 4 1 1 X 101

K.

OXA-48

pneumoniae RAM

1 4 1 1 X 101

K.

OXA-48

pneumoniae LIB

>32 >32 >32 1 X 101

K.

OXA-48 + CTX-M-15 + TEM-1

pneumoniae BEY

0,38 0,38 0,38 1 X 101-1 X 102

K.

OXA-48 + CTX-M-15 + TEM-1

pneumoniae DAL

0,38 2 0,38 1 X 101

K.

OXA-48 + CTX-M-15 + TEM-1

pneumoniae ROB

0,38 3 0,5 1 X 101

K.

OXA-48

pneumoniae SCO

0,5 0,75 0,25 1 X 101

E. cloacae TUR

OXA-48 + SHV-5 0,5 0,5 0,5 1 X 101

E. coli BER

OXA-48 + CTX-M-15 0,38 1,5 0,19 1 X 101

E. coli AME

OXA-48 + CTX-M-24 0,25 0,5 0,19 1 X 101

E. coli GOG

OXA-48 + CTX-M-24 0,5 1,5 0,25 1 X 101

E. coli NAA

OXA-48 + CTX-M-24 0,5 2 0,25 1 X 101

E. coli HAN

OXA-48 + CTX-M-15 3 16 1 1 X 101-1 X 102

E. coli BOU

OXA-48 + CTX-M-15 0,5 0,75 0,125 1 X 101-1 X 102

E. coli BON

OXA-48 + CTX-M-24+ TEM-1 0,38 0,5 0,19 1 X 102

E. coli BOK

OXA-48 + CTX-M-15 0,25 0,38 0,19 1 X 102

OXA-181

K. pneumoniae OMA

OXA-181 + CTX-M-15+ OXA-1 0,5 2 0,5 1 X 101

K. pneumoniae HOL

OXA-181 + CTX-M-15 1 4 1 1 X 101

P. rettgeri RAP

OXA-181 + OXA-1 8 1 2 5 X 102

NDM-1

K. pneumoniae UK

NDM-1 + CTX-M-15 + CMY-4 + OXA-1 >32 >32 >32 1 X 101

K.

NDM-1 + CTX-M-15 + OXA-1 + OXA-10

pneumoniae 6642 GEN

1 16 3 1 X 101

K.

NDM-1 + CTX-M-15 + OXA-1 + OXA-9 +

OXA-10 + CMY16

pneumoniae 6759 GEN

12 >32 >32 1 X 101

imagen7

Cepas

Betalactamasas CMI (μg/ml) de fármacoa: IPM ETP MEM Límite de Detección más Bajo (UFC/ml)

OXA-48

K.

NDM-1 + CTX-M-15 + OXA-1 + OXA-9

pneumoniae 1 OMA

>32 >32 >32 1 X 101

K.

NDM-1 + OXA-1

pneumoniae 2 OLA

1,5 6 2 1 X 101

K.

NDM-1 + OXA-1 + CTX-M-15 + CMY-6 +

pneumoniae 7 AFR

TEM-1 >32 >32 >32 1 X 101

K.

NDM-1 + OXA-1 + CTX-M-15

pneumoniae IND

1 8 4 1 X 101

E. coli GEN

NDM-1 + OXA-1 + CMY-30 + TEM-1 8 >32 12 1 X 101

E. coli RIC

NDM-1 + OXA-1 + OXA-10 + CMY-16 1 3 1 1 X 101

E. coli GUE

NDM-1 + OXA-1 + TEM-1 3 3 2 1 X 101

E. coli AUS

NDM-1 + CTX-M-15 + TEM-1 6 32 16 1 X 101

E. coli ALL

NDM-1 + OXA-1 + OXA-2 + CTX-M-15 + TEM-1 4 >32 8 1 X 101

E. coli IR5

NDM-1 + CTX-M-15 + TEM-1 16 >32 16 1 X 101

E. cloacae IR38

NDM-1 + CTX-M-15 2 16 2 1 X 101

P. stuartii

NDM-1 + OXA-1 + CMY-6

NDM

12 0,38 1,5 > 5 X 107

C. freundii STE

NDM-1 + OXA-1 + OXA-9 + OXA-10 + CTX-M-15 + TEM-1 >32 >32 >32 1 X 101

KPC-2

E. coli PSP

KPC-2 0,5 0,5 0,5 1 X 102

E. cloacae

KPC-2 4 6 2 1 X 101

E. coli COL

KPC-2 4 4 2 1 X 101

K.

KPC-2 + TEM-1 + SHV-1 + CTX-M-15

pneumoniae COL

4 4 32 1 X 101

VIM o IMP

E. coli MAD

VIM-1 + CTX-M-3 1,5 0,38 0,5 1 X 105

E. coli DIH

VIM-19 8 16 4 1 X 101

K.

VIM-1 + CTX-M-3

pneumoniae MAD

1 0,5 1 1 X 101

E. coli JAP

IMP-1 0,5 3 0,5 1 X 106

K.

IMP-1

pneumoniae TUR

1 2 8 1 X 106

Controles

K.

CTX-M-15

pneumoniae

0,12 0,12 0,12 > 5 X 107

KPNb

> 6 X 107

E. cloacae CLOb

CTX-M-15 0,12 0,12 0,12 > 6 X 107

E. coli FORb

CTX-M-15 0,12 0,12 0,12 > 4 X 107

E. coli E14b

CTX-M-14 0,12 0,12 0,12 > 5 X 107

E. cloacae

VEB-1 0,12 0,12 0,12 > 3 X 107

CVBb

0,12 0,12 0,12 > 5 X 107

E. coli EVBb

VEB-1 0,12 0,12 0,12 > 5 X 107

P. mirabilis PMAc

ACC-1 0,25 0,12 0,12 > 5 X 107

E. coli ECAc

ACC-1 0,12 0,12 0,12 > 5 X 107

K.

DHA-2

pneumoniae

0,12 0,5 0,12 > 5 X 107

KDHc

E. coli METc

Cromosoma que codifica cefalosporinasas de espectro ampliado 0,12 0,12 0,12 > 5 X 107

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Cepas

Betalactamasas CMI (μg/ml) de fármacoa: IPM ETP MEM Límite de Detección más Bajo (UFC/ml)

OXA-48

E. coli SYDc

CMY-2 0,12 0,12 0,12 > 5 X 107

E. cloacae ARFd

AmpC 0,12 1 0,12 > 5 X 107

E. cloacae BLAd

AmpC 0,12 1 0,12 > 5 X 107

E. cloacae CONd

AmpC 0,12 1 0,12 > 5 X 107

E. cloacae AZAd K.

AmpC CTX-M-15 + SHV-11 0,12 1 0,12 > 5 X 107

pneumoniae MEKe K.

CTX-M-15 + TEM-1 + SHV-1 1,5 >32 6 1 X 101

pneumoniae SIMe K.

CTX-M-15 +TEM-1 + SHV-11 8 >31 6 1 X 101

pneumoniae SHMe K.

CTX-M-15 + SHV28 3 >32 1 1 X 101

pneumoniae COOe K.

CTX-M-15 + TEM-1 + SHV-11 8 >32 4 1 X 101

pneumoniae FOSe K.

SHV-2a 6 >32 >32 1 X 102

pneumoniae 648236e K.

TEM-1 + SHV-28 0,25 2 0,38 1 X 102

pneumoniae BERe K.

CTX-M-15 + TEM-1 + SHV-1 1 4 1 1 X 103

pneumoniae BEDe K.

CTX-M-15 + TEM-1 + SHV-1 1,5 >32 4 1 X 104

pneumoniae SHIe K.

CTX-M-15 + TEM-1 + SHV-12 0,25 1 1 7 X 104

pneumoniae LEGe K.

CTX-M-15 + SHV-1 0,75 >32 3 2 X 104

pneumoniae ALEe C. freundii

sobreexpresión de AmpC + TEM-3 1 >32 4 1 X 105

MAUe

1 8 1 1 X 105

a Abreviaturas: IMP, imipenem; ETP, ertapenem; MP, meropenem. b Aislados susceptibles a ertapenem que producen una BLEA. c Aislados susceptibles a ertapenem que producen un alto nivel de AmpC. d Susceptibilidad reducida a ertapenem debido a sobreexpresión de AmpC. e Susceptibilidad reducida a ertapenem debido a una deficiencia de porina. Betalactama de tipo BLEA: CTX-M, TEM, SHV, VEB. Betalactama de tipo AmpC de Alto nivel: ACC, DHA, CMY.

Los resultados anteriores muestran que el solicitante ha desarrollado un nuevo medio de cultivo, fiable y muy sensible, para detectar aislados de bacterias productoras de carbapenemasa a partir de un conjunto de cepas bien caracterizadas, y preferentemente aislados con una susceptibilidad reducida a carbapenémicos. Casi todos los productores de carbapenemasa de tipo OXA-48, NDM-1 y KPC se detectaron con un límite de detección bajo de 1 x 101 a 1 X 102 UFC/ml usando este medio. De hecho, la especificidad y sensibilidad del medio de cultivo de acuerdo con la invención es mucho más elevada que la de los medios ChromID BLEA y CHROMagar-KPC.

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Ejemplo 2: estabilidad de almacenamiento del medio de cultivo de agar con SUPERCARBA

Para evaluar la estabilidad de almacenamiento de agar con SUPERCARBA, E. cloacae ARF con sobreexpresión de AmpC, se subcultivó diariamente en placas a partir de un solo lote de agar Drigalski SUPERCARBA conservado a 5 4 C. El crecimiento de E. cloacae ARF se inhibió homogéneamente en el agar con SUPERCARBA durante un período de siete días.

Ejemplo 3: detección de productores de carbapenemasa en Enterobacteriaceae usando un nuevo medio de exploración

Resumen

Se ensayó un medio de cultivo basado en agar Drigalski que contenía ertapenem, cloxacilina y sulfato de zinc (medio SUPERCARBA) para explorar Enterobacteriaceae productoras de carbapenemasa. Las bacterias

15 productoras de OXA-48 (n = 44), NDM (n = 25), VIM/IMP (n = 27) y KPC (n = 18) se detectaron con un límite de detección bajo. Su sensibilidad general (95,6%) era mayor que la de los medios de exploración ChromID BLEA (bioMerieux) y CHROMagar-KPC (CHROMagar) disponibles en la actualidad. El medio SUPERCARBA proporciona una mejora significativa para la detección de los tipos más habituales de productores de carbapenemasa.

Teniendo en cuenta la importancia actual de la detección de los productores de carbapenemasa con precisión, se ha diseñado un nuevo medio de exploración (denominado SUPERCARBA). La lógica del diseño de este medio fue que podría tener la capacidad de detectar productores de carbapenemasa con una resistencia de bajo nivel a carbapenémicos, y ser tan selectivo como fuese posible, inhibiendo el crecimiento de aislados resistentes a carbapenémicos pero no productores de carbapenemasa.

25 Se ensayaron diferentes concentraciones de diversas moléculas de carbapenémicos, y finalmente se añadió ertapenem a un medio de agar Drigalski a una concentración de 0,25 μg/ml. Se añadió ZnSO4 (70 μg/ml) para mejorar la expresión de metalo-β-lactamasas por productores de MBL. Se usó cloxacilina (250 μg/ml) que es un inhibidor de cefalosporinasa (β lactamasa de tipo AmpC) para impedir el crecimiento de aislados que expresaban alto nivel de expresión de cefalosporinasas, tales como Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Morganella morgannii y Serratia marcescens. Estos aislados son fuentes clínicamente significativas de resistencia a carbapenémicos cuando están asociados con un defecto de permeabilidad de la membrana externa (Girlich, et al., 2009. Antimicrob. Agents Chemother. 53: 832-834, Mammeri et al. 2008. FEMS Microbiol. Lett. 282: 238-240).

35 En el estudio se incluyeron ciento catorce aislados productores de carbapenemasa pertenecientes a diversas especies de enterobacterias de origen mundial, todos tenían un contenido β lactamasa caracterizado a nivel molecular (Tabla 2). Las cepas fueron las siguientes: productores de KPC (n = 18), productores de VIM (n = 12), productores de IMP (n = 15), productores de NDM-1 (n = 25), junto con productores de OXA-48 (n = 41) y OXA-181 (n = 3). Setenta y cinco de estos aislados coexpresaron una BLEA (Tabla 2). Las cepas que no expresaron ninguna carbapenemasa se usaron como controles, que consistían en aislados que mostraban susceptibilidad reducida a ertapenem debido a sobreexpresión de AmpC (n = 10), o a una deficiencia de BLEA (n = 12), y/o de porina. También se incluyeron aislados susceptibles a ertapenem de tipo silvestre, productores de β lactamasa de espectro limitado, productores de BLEA y productores de AmpC a alto nivel como controles (n = 40) (Tabla 2). Usando un inóculo de ~ 2 x 107 UFC/ml (intervalo, 1,5 x 107 a 3,5 x 108 UFC/ml), se realizaron diluciones en serie con factor 10 de los

45 aislados en solución salina normal y 100 μl se sembraron en placas en el medio SUPERCARBA y se comparó con los resultados obtenidos usando CHROMagar KPC y ChromID BLEA. Después de 24 horas de cultivo a 37 ºC se contaron las bacterias viables. Los valores de corte de sensibilidad y especificidad se establecieron a 1 x 103 UFC/ml, es decir, un valor límite de 1 x 103 UFC/ml y por encima se consideró como “no detectado de un modo eficaz”. El límite de detección más bajo de productores de OXA-48, OXA-181, NDM-1 y KPC, varió de 1 x 101 a 1 x 102 UFC/ml (Tabla 2). Un solo productor de NDM (aislado de Providencia stuartii productor de NDM-1 (Poirel et al., 2011. Antimicrob. Agents Chemother. 55:5403-5407) no se detectó de un modo eficaz en el medio SUPERCARBA (límite de detección de 1 x 107 UFC/ml) (Tabla 2). Su ausencia de detección podría explicarse por sus bajos valores CMI de ertapenem (0,38 μg/ml) y por una expresión probablemente débil del gen blaNDM-1, relacionado con la inserción cromosómica del gen blaNDM-1. Como se esperaba, también se detectaron K. pneumoniae productoras de

55 OXA-181 con el medio SUPERCARBA. El límite de detección más bajo de productores de VIM e IMP varió de 1 x 101 a 1 x 106 UFC/ml (Tabla 1). Aunque la adición de sulfato de zinc disminuyó significativamente al límite de detección más bajo para productores de VIM e IMP, algunos productores de VIM e IMP no se detectaron de un modo eficaz en este medio (límite de detección ≥ 1 x 103 UFC/ml). Como se esperaba, el crecimiento de aislados que no expresaban ninguna carbapenemasa (es decir, productores de AmpC y/o BLEA) se inhibió con el medio SUPERCARBA (con un límite de detección mucho mayor de 1 x 103 UFC/ml). En particular, la adición de cloxacilina impidió el crecimiento de los aislados que expresaban cefalosporinasas (Tabla 2). Como previamente se muestra, el defecto de porina que da como resultado una permeabilidad de la membrana externa disminuida, conduce a una susceptibilidad reducida a ertapenem de E. coli y K. pneumoniae. En este estudio, entre los 19 aislados no susceptibles a ertapenem, siendo los valores CMI de ertapenem > 0,25 μg/ml (1 Citrobacter freundii, 2 E. coli, 4 E.

65 cloacae y 12 K. pneumoniae de aislados) y en los que el defecto de porina estaba implicado en la resistencia a ertapenem, se detectó el 58% (n = 11) por selección en el medio SUPERCARBA (límite de detección inferior <102 UFC/ml) (Tabla 2). La adición de sulfato de zinc y de cloxacilina fue útil para la prevención del crecimiento de muchos de los aislados resistentes a carbapenémico no productores de carbapenemasa (hasta el 42%, n = 8). Cabe destacar que las especies Acinetobacter baumannii y Pseudomonas aeruginosa no productoras de carbapenemasa, crecieron en el medio SUPERCARBA (datos no mostrados). Se obtuvieron resultados similares de crecimiento de

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5 bacterias Gram negativas no enterobacterias usando los medios ChromID BLEA y CHROMagar KPC (datos no mostrados). Estos tres medios son adecuados solo para la selección de Enterobacteriaceae.

Una comparación de los resultados obtenidos con los medios ChromID BLEA y CHROMagar KPC con los obtenidos con el medio SUPERCARBA mostraron que este último medio de exploración era más eficaz para detectar aislados 10 productores de carbapenemasa (Tablas 2 y 3). De hecho, la sensibilidad del medio SUPERCARBA fue de 95,6%, más alta que la del medio ChromID BLEA (87,7%) y que la del medio CHROMagar KPC (40,3%). Además, las sensibilidades de SUPERCARBA, determinadas para cada una de las clases de productores de carbapenemasa, fue mayor (100%, 90% y 100% para las clases A, B y D, respectivamente) en comparación con las obtenidas para los otros dos medios de exploración (Tabla 3). La especificidad del medio SUPERCARBA también era alta (82,2%). Una

15 mejora adicional del medio SUPERCARBA podría ser la adición de moléculas cromogénicas que permitirían un reconocimiento de especies.

Para evaluar la capacidad de almacenamiento del medio SUPERCARBA, E. cloacae ARF que sobreexpresa AmpC se subcultivó diariamente en placas con Drigalski a partir de un solo lote de medio SUPERCARBA conservado a 20 4 C. El crecimiento de este aislado se inhibió homogéneamente en el agar de SUPERCARBA durante un período de siete días.

Se propone aquí el primer medio de exploración que puede detectar no solo productores de KPC-, MBL-, sino también de OXA-48. Este medio representa una mejora significativa en comparación con los medios de exploración 25 disponibles para detectar productores de carbapenemasa, y particularmente para la detección de productores de OXA-48 que no coexpresan ninguna BLEA. Teniendo en cuenta que el medio SUPERCARBA contiene ertapenem a baja concentración, este puede detectar productores de carbapenemasa con bajo nivel de resistencia a carbapenémicos, que es una situación frecuentemente observada en productores de OXA-48. Además, este medio es útil para seleccionar productores de carbapenemasa específicamente en heces que contienen también una gran

30 cantidad de productores de BLEA cuyo crecimiento se inhibirá. Esta propiedad es particularmente importante, ya que actualmente en todo el mundo se comunican altas tasas de transmisión de BLEA.

Se prepararon medios SUPERCARBA modificados con resultados similares (véanse las tablas 4 a 11).

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Tabla 3. Sensibilidad y especificidad de medios SUPERCARBA, ChromID BLEA y CHROMagar KPCa

SUPERCARBA ChromID BLEA CHROMagar KPC SN (%)a 95,6 87,7 40,3 SP (%) 82,2 24,2 85,5

SN clase Ab 100 100 66,7 SN clase B 90 98 55,8 SN clase D 100 70 13,6

a Abreviaturas: SN, sensibilidad; SP especificidad. b La sensibilidad se determinó para cada clase de carbapenemasa Ambler: la clase A son las de tipo KPC, la clase B de tipo VIM, IMP y NDM mientras que la clase D son las de tipo OXA-48.

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Tabla 5. Sensibilidad y especificidad de SUPERCARBA y SUPERCARBA modificado con TSA-Vanco-Anfo reemplazando el agar Drigalski

Medio de detección

SUPERCARBA Drig-ETP Cloxa -Zinc

SUPERCARBA modificado con TSA-Vanco-Anfo

SN (%)a

86,7 93,3

SP(%)

66,7 50

aAbreviaturas: SN sensibilidad; SP especificidad.

Tabla 6 Límite de detección de medio SUPERCARBA para 40 aislados de enterobacterias productoras de carbapenemasa y/o BLEA/AmpC en comparación con los obtenidos con SUPERCARBA modificado, es decir con doripenem 0,012, 0,024 o 0,048 μg/ml reemplazando a ertapenem. Para cada cepa se proporcionan los valores CMI de imipenem, ertapenem y meropenem.

Cepas

Contenido β lactamasa CMI (μg/ml) Límite de detección más bajo (UFC/ml)

IPMa

ETP MEM ETP Cloxa DORI DORI DORI

Zinc

0,048 0,024 0,012

(SUPERCARBA)

Cloxa Zinc Cloxa Zinc Cloxa Zinc

CarbapenemasasAmbler clase B Cepas Contenido β CMI (μg/ml) Límite de detección más bajo (UFC/ml) lactamasa

E. coli JAP

IMP-1 0,5 3 0,5 1 x 104 8 x 104 8 x 104 4 x 102

E. cloacae TAW IMP-8 + SHV-12

0,75 0,5 0,5 1 x 102 1 x 102 3 x 101 1 x 101

CarbapenemasasAmbler clase D

K. pneumoniae BEL OXA-48

1 4 1 1 x 101 2 x 101 1 x 101 1 x 101

K. pneumoniae SCO OXA-48

0,5 0,75 0,25 1 x 101 1 x 101 1 x 101 1 x 101

K. pneumoniae ROU OXA-48 + CTX-M-15

0,5 1,5 0,25 1 x 101 1 x 104 1 x 101 4 x 104

K. pneumoniae BAJ OXA-48+ TEM-1 + CTX-M-15 + SHV-28 0,5

1,5 0,38 1 x 101 1 x 101 1 x 101 2 x 101

K. pneumoniae BEN OXA-48 + TEM-1 + CTX-M-15 + SHV-28 0,38 1

0,25 1 x 101 2 x 101 1 x 101 1 x 101

K. pneumoniae SIC OXA-48 + CTX-M-15 + SHV-28 0,25 1

0,25 1 x 101 2 x 102 1 x 102 1 x 101

K. pneumoniae AMS OXA-48 + TEM-1 CTX-M-15 + OXA-1

+ 0,5 2 0,38 1 x 101 2 x 101 1 x 101 2 x 101

K. pneumoniae ELK OXA-48 + TEM-1 + CTX-M-15 + SHV-11 0,5

3 0,38 1 x 101 2 x 102 1 x 101 2 x 101

K. pneumoniae VSG OXA-48 + TEM-1 CTX-M-15 + OXA-1

+ 0,75 3 0,75 1 x 101 2 x 101 2 x 101 1 x 101

E. coli ROB

OXA-48 0,5 0,75 0,25 2 x 101 2 x 101 1 x 101 1 x 101

E. coli BOU

OXA-48 + CTX-M-15 0,5 0,75 0,125 2 x 101 1 x 104 1 x 101 1 x 101

E. coli AME

OXA-48 + CTX-M-24 0,25 0,5 0,19 2 x 101 2 x 106 2 x 101 1 x 101

E. coli BON

OXA-48 + TEM-1 + 0,38 0,5 0,19 1 x 101 2 x 105 2 x 101 1 x 101

CTX-M-24

E.

cloacae OXA-48 + SHV-5 0,5 0,5 0,5 1 x 101 1 x 101 1 x 101 1 x 101

TUR

C. koseri VER

OXA-48 0,75 2 0,38 1 x 101 3 x 102 3 x 101 1 x 101

K. pneumoniae HOL OXA-181 + CTX-M-15

1 4 1 1 x 101 1 x 101 1 x 101 1 x 102

K. pneumoniae OMA OXA-181 + OXA-1

+ CTXM-15 0,5 2 0,5 1 x 101 1 x 101 1 x 101 4 x 101

Productores no

carbapenemasas K. pneumoniae 7725 SHV-1

0,19 0,006 0,032 > 1 x 108 > 1 x 108 > 1 x 108 2 x 102

K. pneumoniae 648236d SHV-2a

0,25 2 0,38 1 x 102 1 x 101 1 x 101 2 x 101

20

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IPMa ETP MEM ETP Cloxa DORI DORI DORI

Zinc 0,048 0,024 0,012 (SUPERCARBA) Cloxa Cloxa Cloxa Zinc Zinc Zinc

K. pneumoniae SHV-28 +TEM-1 1 4 1 1 x 102 1 x 102 1 x 102 1 x 101 BERd

K. pneumoniae CTX-M-14 + TEM-1 + 0,12 0,016 0,016 >1 x 108 > 1x > 1x 1 x 101 1025 SHV-11 DHA-2 108 108

K. pneumoniae 0,12 0,5 0,12 1 x 102 1 x 101 1 x 101 1 x 101 KDHe

E. coli 1034 TEM-1 + SHV-38 0,19 0,006 0,016 >1 x 108 > 1x > 1x 1 x 101 108 108

E. coli 1048 TEM-1 + SHV-2a 0,19 0,012 0,016 >1 x 108 > 1x > 1x 1 x 105 108 108

E. coli 10121 CTX-M-2 0,19 0,016 0,016 >1 x 108 > 1x > 1x 3 x 105 108 108

E. coli SYD CMY-2 0,12 0,012 0,012 >1 x 108 > 1x > 1x 3 x 103 108 108

E. coli MARe sobreexpresión de 16 >32 2 1 x 102 > 1x > 1x 6 x 102 AmpC 108 108

E. coli HB4d (OmpC-, OmpF-) 0,12 1 0,25 1 x 101 > 1 x 1 x 104 6x x 108 102

E. aerogenes TEM-24 0,12 0,19 0,023 108 > 1 x 108 > 1 108 > 1 2 x 101 1085 x x

E. cloacae (tipo silvestre) 0,38 0,016 0,032 > 1 x 108 1 x 106 1 x 102 1 x 101 5434

E. cloacae VEB-1 0,12 0,12 0,12 1 x 104 > 1x 1 x 105 6 x 101 CVB

E. cloacae sobreexpresión de 0,12 1 0,12 1 x 107 > 1x > 1x 6 x 101 CONe AmpC 108 108

E. cloacae sobreexpresión de 0,12 1 0,12 1 x 107 > 1 x 1 x 107 1 x 102 BLAe AmpC 108

C. freundii (tipo silvestre) 0,25 0,008 0,016 > 1 x 108 > 1 x > 1 x 1 x 102 7767 108 108

C. freundii TEM-1 + SHV-12 0,38 0,016 0,023 >1 x 108 > 1x > 1x 2 x 102 10107 108 108

C. freundii CTX-M-15 0,38 0,016 0,023 >1 x 108 > 1x > 1x 3 x 101 10135 108 108

C. freundii sobreexpresión de 1 8 1 1 x 105 5 x 102 3 x 101 1 x 102 MAUe AmpC + TEM-3

S. CTX-M-1 0,25 0,19 0,032 >1 x 108 > 1x > 1x 4 x 101 typhimurium 108 108 1081

Tabla 7. Sensibilidad y especificidad de SUPERCARBA, y SUPERCARBA modificado con doripenem 0,012, 0,024,

o 0,048 μg/ml reemplazando a ertapenem 0,25 μg/ml.a Tabla 8. Límite de detección de medio SUPERCARBA para 60 aislados de enterobacterias productoras de carbapenemasa y/o BLEA/AmpC en comparación con los obtenidos con SUPERCARBA, es decir con oxacilina reemplazando a cloxacilina. Para cada cepa se proporcionan los valores CMI de imipenem, ertapenem y

Media de detección

ETP Cloxa Zinc (SUPERCARBA)

DORI 0,048 Cloxa Zinc DORI 0,024 Cloxa Zinc DORI 0,012 Cloxa Zinc

SN (%)a

94,7 73,7 94,7 94,7

SN clase D

100 76,5 100 94,1

SP (%)

76,2 80,9 76,2 14,3

a Abreviaturas: SN sensibilidad; SP especificidad. b La sensibilidad se determinó para cada clase de carbapenemasa Ambler.

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meropenem.

Cepas

Contenido lactamasa CMI (μg/ml) Límite de detección más bajo (UFC/ml)

IPMa

ETP MEM ETP Cloxa Zinc ETP

(SUPERCARBA)

Oxa Zinc

CarbapenemasasAmbler clase A

(KPC) K. pneumoniae MUS

KPC-2 + TEM-1 + SHV-11 + SHV-12 0,75 4 1,5 1 x 101 2 x 101

E. cloacae HPTU

KPC-2 + TEM-1 + SHV-11 2 4 1,5 1 x 101 1 x 101

CarbapenemasasAmbler clase B

K. pneumoniae OMA419

NDM-1 + OXA-1 1,5 6 2 1 x 101 1 x 101

K. pneumoniae OM2

NDM-1 + TEM-1+ CTX-M-3 + SHV11 + OXA-1 0,75 8 1,5 1 x 101 1 x 101

P. stuartii PS1

NDM-1 + CMY-6 + OXA-1 > 5 x

12

0,38 1,5 1 x 107 107

E. coli JAP

IMP-1 0,5 3 0,5 1 x 104 4 x 104

E. cloacae TAW

IMP-8 + SHV-12 0,75 0,5 0,5 1 x 102 2 x 101

CarbapenemasasAmbler clase D

K. pneumoniae BEL K. pneumoniae SCO K. pneumoniae ROU K. pneumoniae BAJ

OXA-48 OXA-48 OXA-48 + CTX-M-15 OXA-48+ TEM-1 + CTX-M-15 1 0,5 0,5 4 0,75 1,5 1 0,25 0,25 1 x 101 1 x 101 1 x 101 1 x 101 1 x 101 2 x 101

1 x

1 x

+ SHV-28

0,5 1,5 0,38 101 101

K. pneumoniae BEN

OXA-48 + TEM-1 + CTX-M- 15 + SHV-28 0,38 1 0,25 1 x 101 1 x 101

K. pneumoniae SIC

OXA-48 + CTX-M-15 + SHV- 28 0,25 1 0,25 1 x 101 1 x 101

K. pneumoniae AMS

OXA-48 + TEM-1 + CTX-M- 15 + OXA-1 0,5 2 0,38 1 x 101 2 x 101

K. pneumoniae ELK

OXA-48 + TEM-1 + CTX-M- 15 + SHV-11 0,5 3 0,38 1 x 101 1 x 101

K. pneumoniae VSG

OXA-48 + TEM-1 + CTX-M- 15 + OXA-1 0,75 3 0,75 1 x 101 1 x 101

E. coli ROB

OXA-48 0,5 0,75 0,25 2 x 101 6 x 101

E. coli BOU

OXA-48 + CTX-M-15 0,5 0,75 0,125 2 x 101 1 x 101

E. coli AME

OXA-48 + CTX-M-24 0,25 0,5 0,19 2 x 101 1 x 101

E. coli BON

OXA-48 + TEM-1 + CTX-M-

24

0,38 0,5 0,19 1 x 101 2 x 101

E. cloacae TUR

OXA-48 + SHV-5 0,5 0,5 0,5 1 x 101 1 x 101

C. koseri VER

OXA-48 0,75 2 0,38 1 x 101 2 x 101

K. pneumoniae HOL K. pneumoniae OMA

OXA-181 + CTX-M-15 OXA-181 + CTXM-15 + OXA- 1 1 0,5 4 2 1 0,5 1 x 101 1 x 101 1 x 102 3 x 101

P. rettgeri RAP

OXA-181 + OXA-1 8 1 2 5 x 102 5 x 101

Productores no

carbapenemasas

K. pneumoniae 7725

SHV-1 0,19 0,006 0,032 > 1 x 108 > 1 x 108

K. pneumoniae 648236d

SHV-2a 0,25 2 0,38 1 x 102 3 x 101

K. pneumoniae BERd

SHV-28 + TEM-1 1 4 1 1 x 102 1 x 102

K. pneumoniae 1025

CTX-M-14 + TEM-1 + SHV- 11 0,12 0,016 0,016 > 1 x 108 > 1 x 108

imagen22

Cepas

Contenido lactamasa CMI (μg/ml) Límite de detección más bajo (UFC/ml)

IPMa

ETP MEM ETP Cloxa Zinc ETP

(SUPERCARBA)

Oxa Zinc

K. pneumoniae

CTX-M-15 + TEM-1 + SHV- 11 1,5 32 > 4 1 x 101 4 x 101

BEDd

K. pneumoniae ALEd K. pneumoniae KDHe

CTX-M-15 + SHV-1 DHA-2 1 0,12 32 0,5 > 4 0,12 1 x 105 1 x 102 1 x 105 1 x 101

E. coli 6367

(tipo silvestre) 0,19 0,006 0,012 > 1 x 108 > 1 x 108

E. coli 1082

TEM-1 > 1 x

0,19

0,019 0,016 > 1 x 108 108

E. coli 1034

TEM-1 + SHV-38 1> x

0,19

0,006 0,016 > 1 x 108 108

E. coli 1048

TEM-1 + SHV-2a > 1 x

0,19

0,012 0,016 > 1 x 108 108

E. coli 1008

TEM-1 + CTX-M-1 > 1 x

0,19

0,016 0,016 > 1 x 108 108

E. coli 10121

CTX-M-2 0,19 0,016 0,016 > 1 x 108 1 x 101

E. coli FOR

CTX-M-15 0,12 0,012 0,012 > 1 x 108 1 x 101

E. coli EVB

VEB-1 0,12 0,012 0,012 > 1 x 108 1 x 101

E. coli 1092

OXA-1 0,12 0,19 0,023 > 1 x 108 1 x 101

E. coli ECA

ACC-1 0,12 0,012 0,012 > 1 x 108 5 x 103

E. coli SYD

CMY-2 0,12 0,012 0,012 > 1 x 108 1 x 101

E. coli MET E. coli MARe E. coli HB4d

Cromosoma que codifica cefalosporinasas de espectro ampliado sobreexpresión de AmpC (OmpC-, OmpF-) 0,12 16 0,012 0,012 32 > 2 > 1 x 108 1 x 102 1 x 101 1 x 101 1 x 101 > 1 x 108

0,12

1 0,25 > 1 x 108 1 x 101

E. aerogenes 1085

TEM-24 0,12 0,19 0,023 > 1 x 108 > 1 x 101

E. cloacae 5434

(tipo silvestre) 0,38 0,016 0,032 > 1 x 108 1 x 108

E. cloacae CLO

CTX-M-15 0,12 0,12 0,12 1 x 107 1 x 101

E. cloacae 10111e

TEM-1 + CTX-M-15 0,5 0,75 0,094 > 1 x 108 1 x 101

E. cloacae CVB

VEB-1 0,12 0,12 0,12 1 x 104 1 x 101

E. cloacae ARFe E. cloacae BLAe C. freundii 7767

sobreexpresión de AmpC sobreexpresión de AmpC (tipo silvestre) 0,12 0,12 0,25 1 0,12 1 0,12 0,008 0,016 1 x 107 > 1 x 107 > 1 x 108 1 x 101 1 x 101 > 1 x 108

C. freundii 10107

TEM-1 + SHV-12 0,38 0,016 0,023 > 1 x 108 1 x 101

C. freundii 10135

CTX-M-15 0,38 0,016 0,023 > 1 x 108 1 x 101

C. freundii MAUe S. typhimurium 1081

sobreexpresión de AmpC + TEM-3 CTX-M-1 1 0,25 8 1 0,19 0,032 1 x 105 > 1 x 108 1 x 101 1 x 101

P. mirabilis 1031

CTX-M-14 + TEM-1 + SHV-

11

1,5 0,047 0,032 > 1 x 108 1 x 101

P. mirabilis PMA

ACC-1 > 1 x

0,25

0,094 0,064 > 1 x 108 108

Tabla 10. Límite de detección de medio SUPERCARBA (Drigalski + ETP + Cloxa + Zinc) para 51 aislados de enterobacterias productoras de carbapenemasa y/o BLEA/AmpC en comparación con los obtenidos con

Tabla 9. Sensibilidad y especificidad de SUPERCARBA, ETP-Oxa-Zinc.a

Medio de detección

ETP Cloxa Zinc (SUPERCARBA)

ETP Oxa -Zinc

SN (%)a

88 88

SN clase Ab

100 100

SN clase B

40 40

SN clase D

100 100

SP (%)

82,8 80

a Abreviaturas: SN sensibilidad; SP especificidad. b La sensibilidad se determinó para cada clase de carbapenemasa Ambler.

23 SUPERCARBA modificado que contenía agar de Tripticasa desoja reemplazando agar Drigalski complementado con vancomicina (20 μg/ml) y ETP + Cloxa + Zinc. Para cada cepa se proporcionan los valores CMI de imipenem, ertapenem y meropenem.

imagen23

Cepas Contenido lactamasa CMI (μg/ml) Límite de detección más bajo (UFC/ml) IPMa ETP MEM (SUPERCARBA)SUPERCARBA ETP Cloxa modificado con ETP-Zinc Cloxa Zinc-Vanco

CarbapenemasasAmbler clase A

(KPC)

K.

pneumoniae KPC-2 + TEM-1 + SHV-

MUS

11 + SHV-12

0,75 4 1,5 1 x 101 1 x 101

E. cloacae HPTU

KPC-2 + TEM-1 + SHV-

11

2 4 1,5 1 x 101 1 x 101

CarbapenemasasAmbler clase B

K. pneumoniae OMA419

NDM-1 + OXA-1 1,5 6 2 1 x 101 1 x 101

K. OM2

pneumoniae NDM-1 + TEM-1+ CTX

M-3 + SHV-11 + OXA-1

0,75 8 1,5 1 x 101 1 x 101

P. stuartii PS1

NDM-1 + CMY-6 +

OXA-1

12 0,38 1,5 1 x 107 1 x 102

E. coli JAP

IMP-1 0,5 3 0,5 1 x 104 3 x 101

E. cloacae TAW

IMP-8 + SHV-12 0,75 0,5 0,5 1 x 102 2 x 102

CarbapenemasasAmbler clase D

K. BEL

pneumoniae OXA-48 1 4 1 1 x 101 1 x 1 x 101 1 x

K. SCO

pneumoniae OXA-48 0,5 0,75 0,25 101 101

K. ROU

pneumoniae OXA-48 + CTX-M-15 0,5 1,5 0,25 1 x 101 1 x 101

K. BAJ

pneumoniae OXA-48+ TEM-1 +

CTX-M-15 + SHV-28

0,5 1,5 0,38 1 x 101 1 x 101

K. BEN

pneumoniae OXA-48 + TEM-1 +

CTX-M-15 + SHV-28

0,38 1 0,25 1 x 101 1 x 101

K. SIC

pneumoniae OXA-48 + CTX-M-15 +

SHV-28

0,25 1 0,25 1 x 101 1 x 101

K. AMS

pneumoniae OXA-48 + TEM-1 +

CTX-M-15 + OXA-1

0,5 2 0,38 1 x 101 1 x 101

K. ELK

pneumoniae OXA-48 + TEM-1 +

CTX-M-15 + SHV-11

0,5 3 0,38 1 x 101 1 x 101

K. VSG

pneumoniae OXA-48 + TEM-1 +

CTX-M-15 + OXA-1

0,75 3 0,75 1 x 101 1 x 101

E. coli ROB

OXA-48 0,5 0,75 0,25 2 x 101 1 x 101

E. coli BOU

OXA-48 + CTX-M-15 0,5 0,75 0,125 2 x 101 1 x 101

E. coli AME

OXA-48 + CTX-M-24 0,25 0,5 0,19 2 x 101 1 x 101

E. coli BON

OXA-48 + TEM-1 +

CTX-M-24

0,38 0,5 0,19 1 x 101 1 x 101

E. cloacae TUR

OXA-48 + SHV-5 0,5 0,5 0,5 1 x 101 1 x 101

C. koseri VER

OXA-48 0,75 2 0,38 1 x 101 1 x 101

K. HOL

pneumoniae OXA-181 + CTX-M-15 1 4 1 1 x 101 1 x 102

K. OMA

pneumoniae OXA-181 OXA-1 + CTXM-15 + 0,5 2 0,5 1 x 101 1 x 101

P. rettgeri RAP

OXA-181 + OXA-1 8 1 2 5 x 102 1 x 101

imagen24

Cepas Contenido lactamasa CMI (μg/ml) Límite de detección más bajo (UFC/ml)

IPMa ETP MEM (SUPERCARBA) SUPERCARBA Productores no carbapenemasas

K. pneumoniae SHV-1 7725 0,19 0,006 0,032 >1 x 108 >1 x 108

K. pneumoniae SHV-2a 648236d 0,25 2 0,38 1 x 102 3 x 101

K. pneumoniae SHV-28 + TEM-1 BERd 1 4 1 1 x 102 1 x 101

K. pneumoniae CTX-M-15 + TEM-1 + BEDd SHV-11 1,5 32 > 4 1 x 101 1 x 101

K. pneumoniae CTX-M-15 + SHV-1 ALEd 1 32 > 4 1 x 105 1 x 101

E. coli 1034 TEM-1 + SHV-38 0,19 0,006 0,016 > 1 x 108 > 1 x 108

E. coli 1048 TEM-1 + SHV-2a 0,19 0,012 0,016 > 1 x 108 > 1 x 108

E. coli 1008 TEM-1 + CTX-M-1 0,19 0,016 0,016 > 1 x 108 > 1 x 108

E. coli 10121 CTX-M-2 0,19 0,016 0,016 > 1 x 108 > 1 x 108

E. coli FOR CTX-M-15 0,12 0,012 0,012 > 1 x 108 > 1 x 108

E. coli EVB VEB-1 0,12 0,012 0,012 > 1 x 108 > 1 x 108

E. coli ECA ACC-1 0,12 0,012 0,012 > 1 x 108 > 1 x 108

E. coli SYD CMY-2 0,12 0,012 0,012 > 1 x 108 > 1 x 108

E. coli MET Cromosoma que codifica cefalosporinasas de espectro ampliado 0,12 0,012 0,012 > 1 x 108 > 1 x 108

E. coli MARe sobreexpresión de AmpC 16 32 > 2 1 x 102 > 1 x 108

E. coli HB4d (OmpC-, OmpF-) 0,12 1 0,25 1 x 101 1 x 101

E. aerogenes 1085 TEM-24 0,12 0,19 0,023 > 1 x 108 > 1 x 108

E. cloacae CLO CTX-M-15 0,12 0,12 0,12 1 x 107 > 1 x 108

E. cloacae 10111e TEM-1 + CTX-M-15 0,5 0,75 0,094 > 1 x 108 2 x 107

E. cloacae CVB VEB-1 0,12 0,12 0,12 1 x 104 > 1 x 108

E. cloacae CONe sobreexpresión de AmpC 0,12 1 0,12 1 x 107 1 x 107

E. cloacae BLAe sobreexpresión de AmpC 0,12 1 0,12 1 x 107 2 x 107

C. freundii 10107 TEM-1 + SHV-12 0,38 0,016 0,023 > 1 x 108 > 1 x 108

C. freundii 10135 CTX-M-15 0,38 0,016 0,023 > 1 x 108 > 1 x 108

C. freundii MAUe sobreexpresión de AmpC

+ TEM-3 1 8 1 1 x 105 1 x 101

S. typhimurium 1081 CTX-M-1 0,25 0,19 0,032 > 1 x 108 > 1 x 108

Tabla 11. Sensibilidad y especificidad de medios de exploración SUPERCARBA y SUPERCARBA modificado.

Medio de detección

ETP Cloxa Zinc (SUPERCARBA)

Supercarba modificado

SN (%)a

92 100

SP (%)

80,8 77

a Abreviaturas: SN sensibilidad; SP especificidad.

Referencias

5 A lo largo de esta solicitud, diversas referencias describen el estado de la técnica a la cual pertenece esta invención. Las divulgaciones de estas referencias se incorporan en el presente documento por referencia en la presente divulgación.

10 1. Castanheira, M., L. M. Deshpande, D. Mathai, J. M. Bell, R. N. Jones, y R. E. Mendes. 2011. Early dissemination of NDM-1- and OXA-181-producing Enterobacteriaceae in Indian hospitals: report from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program, 2006-2007. Antimicrob. Agents Chemother. 55: 1274-1278.

2. Fukigai, S., J. Alba, S. Kimura, T. Iida, N. Nishikura, Y. Ishii, K. Yamaguchi. 2007. Nosocomial outbreak of

genetically related IMP-1 beta-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae in a general hospital in Japan. Int. J. 15 Antimicrob. Agents. 29: 306-310.

3. Lee, K., Y. S. Lim, D. Yong, J. H. Yum, y Y. Chong. 2003. Evaluation of the Hodge test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-ß-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp. and Acinetobacter spp. J. Clin. Micobiol. 10: 4623-4629.

4. Nordmann, P., G. Cuzon, y T. Naas. 2009. The real threat of Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing 20 bacteria. Lancet Infect. Dis. 9: 228-236.

5.

Nordmann, P., L. Poirel, M. A. Toleman, y T. Walsh. 2011. Does broad-spectrum resistance due to NDM-1 herald the end of the antibiotic era for treatment of infections caused by Gram-negative bacteria? J. Antimicrob.

6.

Poirel, L., A. Ros, A. Carrër, N. Fortineau, A. Carricajo, P. Berthelot, y P. Nordmann. 2011. Cross-border transmission of OXA-48-producing Enterobacter cloacae from Morocco to France. J. Antimicrob. Chemother. 66: 1181-1182.

imagen25

5 7. Psichogiou, M., P. T. Tassios, A. Avlamis, I. Stefanou, C. Kosmidis, E. Platsouka, O. Paniara, A. Xanthaki, M. Toutouza, G. L. Daikos, ay L. S. Tzouvelekis. 2008. Ongoing epidemic of blaVIM-1-positive Klebsiella pneumoniae in Athens, Greece: a prospective survey. J. Antimicrob. Chemother.61: 59-63.

8. Cuzon, G., T. Naas, P. Bogaerts, Y. Glupczynski, T. D. Huang, y P. Nordmann. 2008. Plasmid-encoded

carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase OXA-48 in an imipenem-susceptible Klebsiella pneumoniae strain from 10 Belgium. Antimicrob. Agents Chemother. 52: 3463-3464.

9.

Maltezou, H. C., P. Giakkoupi, A. Maragos, M. Bolikas, V. Raftopoulos, H. Papahatzaki, G. Vrouhos, V. Liakou, y A. C. Vatopoulos. 2009. Outbreak of infections due to KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae in a hospital in Crete (Greece). J. Infect. 58: 213-219.

10.

Carrër, A., L. Poirel, H. Eraksoy, A. A. Cagatay, S. Badur, y P. Nordmann. 2008. Spread of OXA-48-positive

15 carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae isolates in Istanbul, Turkey. Antimicrob. Agents Chemother. 52: 2950-2954.

11. Carrër, A., L. Poirel, M. Yilmaz, O. A. Akan, C. Feriha, G. Cuzon, G. Matar, P. Honderlick, y P. Nordmann. 2010. Spread of OXA-48-encoding plasmid in Turkey. and beyond. Antimicrob. Agents Chemother. 54: 13691373.

20 12. Carrër, A., N. Fortineau, and P. Nordmann. 2010. Use of ChromID extended-spectrum beta-lactamase medium for detecting carbapenemase-producing Enterobacteriaceae. J. Clin. Microbiol. 48: 1913-1914.

13. Landman, D., J. K. Salvani, S. Bratu, y J. Quale. 2005. Evaluation of techniques for detection of carbapenemresistant Klebsiella pneumoniae in stool surveillance cultures. J. Clin. Microbiol. 43: 5639-5641.

14. Poirel, L., J. D. Pitout, y P. Nordmann. 2007. Carbapenemases: molecular diversity and clinical 25 consequences. Future Microbiol. 2: 501-512.

15.

Queenan, A. M., y K. Bush. 2007. Carbapenemases: the versatile beta-lactamases. Clin. Microbiol. Rev. 20: 40-458.

16.

Réglier-Poupet, H., T. Naas, A. Carrer, A. Cady, J. M. Adam, N. Fortineau, C. Poyart, y P. Nordmann. 2008.

Performance of chromID ESBL, a chromogenic medium for detection of Enterobacteriaceae producing extended30 spectrum beta-lactamases. J. Med. Microbiol. 573: 310-315.

17.

Samra, Z., J. Bahar, L. Madar-Shapiro, N. Aziz, S. Israel, y J. Bishara. 2008. Evaluation of CHROMagar KPC for rapid detection of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae. J. Clin. Microbiol. 46: 3110-3111.

18.

Bratu, S., M. Mooty, S. Nichani, D. Landman, C. Gullans, B. Pettinato, U. Karumudi, P. Tolaney, y J. Quale.

2005. Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in Brooklyn, Nueva York: epidemiology and 35 recommendations for detection. Antimicrob. Agents Chemother. 49: 3018-3020.

19. Doumith, M., M. J. Ellington, D. M. Livermore, y N. Woodford. 2009. Molecular mechanisms disrupting porin expression in ertapenem-resistant Klebsiella and Enterobacter spp. clinical isolates from the UK. J. Antimicrob. Chemother 63: 659-667.

20. Girlich, D., L. Poirel, y P. Nordmann. 2009. CTX-M expression and selection of ertapenem resistance in 40 Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli. Antimicrob. Agents Chemother. 53: 832-834.

21. Jacoby, G. A., D. M. Mills, y N. Chow. 2004. Role of β-lactamases and porins in resistance to ertapenem and other ß-lactams in Klebsiella pneumoniae. Antimicrob. Agents Chemother. 48: 3203-06.

Claims (9)

1. imagen1

   REIVINDICACIONES

   1. Un medio de cultivo que comprende un carbapenémico, un activador de carbapenemasa que es un catión divalente, y una penicilina de tipo M,

   5 en el que dicha penicilina de tipo M se selecciona del grupo que consiste en cloxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina, oxacilina, meticilina, nafcilina y mezclas de las mismas, y en el que dicho catión divalente es zinc.
2. 2. El medio de cultivo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la concentración de carbapenémico en el medio

   de cultivo está comprendida entre 0,005 a 4 μg/ml. 10
3. 3. El medio de cultivo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que el carbapenémico se selecciona del grupo que consiste en ertapenem, biapenem, doripenem, imipenem, meropenem, tebipenem, panipenem y mezclas de los mismos.

   15 4. El medio de cultivo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el carbapenémico es ertapenem y la concentración de ertapenem está comprendida entre 0,1 a 1 μg/ml, preferentemente comprendida entre 0,2 y 0,5 μg/ml.
4. 5. El medio de cultivo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el carbapenémico es doripenem y la 20 concentración de doripenem está comprendida entre 0,01 a 0,1 μg/ml, preferentemente entre 0,015 y 0,05 μg/ml.
5. 6. El medio de cultivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la concentración del activador de carbapenemasa en el medio de cultivo está comprendida entre 30 y 100 μg/ml.

   25 7. El medio de cultivo de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la concentración del activador de carbapenemasa está comprendida entre 50 y 80 μg/ml.
6. 8. El medio de cultivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la penicilina de

   tipo M es cloxacilina. 30
7. 9. El medio de cultivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la concentración de la penicilina de tipo M en el medio de cultivo está comprendida entre 100 y 500 μg/ml.
8. 10. El medio de cultivo de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la concentración de la penicilina de tipo M está 35 comprendida entre 200 y 300 μg/ml.
9. 11. El medio de cultivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el carbapenémico es ertapenem, el catión divalente es zinc y la penicilina de tipo M es cloxacilina.

   40 12. Un método para detectar bacterias resistentes a carbapenémico en una muestra de ensayo que comprende las siguientes etapas sucesivas:

   a) inocular un medio de cultivo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores con dicha muestra de ensayo,

   45 b) incubar dicho medio de cultivo en condiciones adecuadas para el crecimiento de bacterias resistentes a carbapenémico, c) detectar las colonias formadas en dicho medio de cultivo correspondientes a bacterias resistentes a carbapenémico.

   50 13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que dicha muestra de ensayo es una muestra de heces.

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