CN115820494B

CN115820494B - 一株高效降解多环芳烃的分散泛菌及其应用

Info

Publication number: CN115820494B
Application number: CN202211538028.1A
Authority: CN
Inventors: 崔堂兵; 李舒琪; 刘漫纯
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2022-12-02
Filing date: 2022-12-02
Publication date: 2024-03-12
Anticipated expiration: 2042-12-02
Also published as: CN115820494A

Abstract

本发明公开了一株高效降解多环芳烃的分散泛菌及其应用。该高效降解多环芳烃的分散泛菌的保藏编号为GDMCC No:62680，于2022年8月3日保藏于位于广州市先烈中路100号大院59栋5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心。该菌株能在多环芳烃为唯一碳源的环境中生长，可耐受高浓度的蒽、芴；对多环芳烃的降解效率高，对苯并[a]芘降解率为33.29％(4天)，对蒽、芴降解率为100％(1天)。为生态系统去除多环芳烃进行生态修复提供了优良的菌株资源。

Description

一株高效降解多环芳烃的分散泛菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物和环境有机污染物修复治理领域，特别涉及一株高效降解多环芳烃的分散泛菌及其应用。

背景技术

在持久性有机污染物中，多环芳烃(PAHs)是公认的环境和人类健康问题。美国环境保护署(USEPA)、欧洲和中国已将16种多环芳烃列为优先环境污染物。高相对分子质量多环芳烃(HMW-PAH)包括荧蒽、芘、苯并(a)芘、苯并(a)荧蒽等，因其毒性大、保质期长而备受关注。苯并(a)芘是一种典型的HMW-PAH，由五个稠合苯环组成芳香烃，由有机物不完全燃烧形成。由于苯并(a)芘具有稳定的苯环结构，需要大量的能量才能将其开环，因此，苯并[a]芘因为难以被生物降解而更倾向于在环境中积累，并伴随着毒性。

虽然PAHs可以通过化学和物理方法进行降解，但是生物修复被认为是一种高度适用和安全的方法。该方法依赖于微生物的生长能力，以PAHs作为碳源，从而完全或部分去除PAHs。自然界许多微生物包括细菌、真菌和藻类都已经发现具有利用多环芳烃的能力。目前已知的能降解多环芳烃的菌株包括分菌枝杆属、巴氏杆菌属、单胞菌属、假单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属、戈登氏菌属、非脱羧埃希氏菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、微球菌属、窄食单胞菌属、拉乌尔菌属、沙雷氏菌属、产气单胞菌属、纤维菌属和无色杆菌属等。然而目前的研究中能降解多环芳烃的菌株的降解效率较低。

发明内容

本发明的首要目的在于针对现有技术的缺点和不足，提供一株高效降解多环芳烃的分散泛菌；

本发明的另一目的在于提供一种分散泛菌降解多环芳烃的方法。

本发明的再一目的在于提供上述高效降解多环芳烃的分散泛菌的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株高效降解多环芳烃的分散泛菌，命名为分散泛菌(Pantoea dispersa)MSC14，保藏编号为GDMCC No:62680，于2022年8月3日保藏于位于广州市先烈中路100号大院59栋5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心。

所述多环芳烃包括蒽、芴、苯并[a]芘、萘、菲、芘和荧蒽；优选为蒽、芴和苯并[a]芘中的至少一种。

一种降解多环芳烃类有机污染物的方法，包括以下步骤：

向被多环芳烃污染的样品中接种上述高效降解多环芳烃的分散泛菌，降解多环芳烃。

所述的多环芳烃包括蒽、芴、苯并[a]芘、萘、菲、芘和荧蒽；优选为蒽、芴和苯并[a]芘的至少一种；更优选为浓度为1000mg/L以下的蒽、浓度为1000mg/L以下的芴或浓度为20mg/L以下的苯并[a]芘。

所述降解优选在温度为25～35℃和pH值为6.4～8.0的条件下降解；更优选在温度为30℃和pH值为7.2的条件下降解。

上述多环芳烃降解菌在多环芳烃污染的土壤或水体的修复中的应用。

进一步地，多环芳烃污染的水体为含有多环芳烃的工业废水。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明分离筛选得到的分散泛菌(Pantoea dispersa)MSC14菌株可耐受高浓度的蒽、芴；对多环芳烃的降解效率高，对苯并[a]芘降解率为33.29％(4天)，对蒽、芴降解率为100％(1天)。为生态系统去除多环芳烃进行生态修复提供了优良的菌株资源。

附图说明

图1是菌株MSC14和Pantoea dispersa strain 14#对苯并[a]芘的降解曲线图。

图2是基于菌株MSC14和相近菌株的基因序列构建的系统发育树图。

图3是菌株MSC14的菌落形态图。

图4是菌株MSC14在LB培养基中的24h生长曲线图。

图5是菌株MSC14对高浓度蒽降解曲线及生物量变化图。

图6是菌株MSC14对高浓度芴降解曲线及生物量变化图。

图7是菌株MSC14对苯并[a]芘降解曲线及生物量变化图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图说明对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。

实施例1分散泛菌(Pantoea dispersa)MSC14的分离筛选和鉴定

1.培养基的配制

富集培养基：取1250μL以0.22μm滤膜过滤后的浓度为1000mg/L的芘丙酮溶液和浓度为1000mg/L的荧蒽丙酮溶液加入121℃灭菌后的无机盐培养基，使得培养基中芘和荧蒽的浓度均为50mg/L，静置待丙酮完全挥发。所述的无机盐培养基的配制步骤如下：称取1g(NH₄)₂SO₄、1g Na₂HPO₄、0.2g KH₂PO₄、0.2g MgSO₄·7H₂O、0.005g FeCl₃·3H₂O、0.001g(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O和0.1g CaCl₂·2H₂O，并溶于1L超纯水中，调pH至7.2；再分装成25mL体积的培养基，121℃灭菌。

平板分离培养基：取200μL浓度为200mg/L的苯并[a]芘丙酮溶液在无机盐琼脂培养基平板的表面均匀涂布，静置待丙酮完全挥发。所述的无机盐琼脂培养基的配制步骤如下：称取1g(NH₄)₂SO₄、1g Na₂HPO₄、0.2g KH₂PO₄、0.2g MgSO₄·7H₂O、0.005g FeCl₃·3H₂O、0.001g(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O、0.1g CaCl₂·2H₂O和15g/L琼脂，并溶于1L超纯水中，调pH至7.2；121℃灭菌。

LB液体培养基：称取10g蛋白胨,5g酵母粉和10g NaCl，并溶于1L超纯水中，pH7.2。

LB固体培养基：氯化钠10.0g/L，蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，琼脂粉20.0g/L，pH7.2。

无机盐培养基：称取1g(NH₄)₂SO₄、1g Na₂HPO₄、0.2g KH₂PO₄、0.2gMgSO₄·7H₂O、0.005g FeCl₃·3H₂O、0.001g(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O和0.1g CaCl₂·2H₂O，并溶于1L超纯水中，调pH至7.2；121℃灭菌。

筛选培养基：在含有1g/L葡萄糖的无机盐培养基中加入0.25mL浓度为2.0g/L的苯并[a]芘-丙酮溶液，静置待丙酮完全挥发，使苯并[a]芘最终浓度为20mg/L。所述的含有1g/L葡萄糖的无机盐培养基的配制步骤如下：称取1g葡萄糖、1g(NH₄)₂SO₄、1g Na₂HPO₄、0.2gKH₂PO₄、0.2g MgSO₄·7H₂O、0.005g FeCl₃·3H₂O、0.001g(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O和0.1g CaCl₂·2H₂O，并溶于1L超纯水中，调pH至7.2；121℃灭菌。

2.菌株的筛选

(1)驯化培养：采用稀释平板涂布法，称取2g广东省茂名露天矿生态公园的土壤样品，溶解到10mL超纯水中，在摇床中以150r/min，30℃的条件震荡培养12h，静置后取5mL上层液体，加入到45mL富集培养基中。在摇床中以150r/min，30℃的条件避光培养7d，7d后取5mL培养液接入到45mL新鲜的富集培养基中，重复以上步骤，共富集5轮。

(2)分离纯化：将富集后的菌液分别以10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷和10⁸倍稀释，各取50μL稀释菌液涂布于平板分离培养基，放置于37℃培养箱中培养，待菌落生长后，挑取平板上不同形态的菌落多次划线分离，挑取单菌落保存。

(3)筛选鉴定：

挑取保存的单菌落接入LB液体培养基，于37℃和180r/min的摇床上过夜培养，离心后收集细菌，用无机盐培养基冲洗3次，然后将细菌悬浮液调整为OD₆₀₀＝1.0的种子液。在筛选培养基中按照筛选培养基的体积的10％的量接入种子液，于30℃、150r/min及避光条件下培养6d，每个单菌落样品设置三个重复，测定培养后苯并[a]芘的含量，挑选降解率较高高的菌株，从而筛选出苯并[a]芘降解率较高的菌株：分散泛菌(Pantoea dispersa)MSC14和Pantoea dispersa strain 14#。将Pantoea dispersa strain 14#和MSC14菌株送至北京擎科生物科技有限公司进行测序，测定16SrDNA基因序列为SEQ ID No.1，将基因序列在美国国立生物技术信息中心网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行核苷酸序列Blast比对，得到与相关菌株的基因序列同源的若干核苷酸序列，结果表明Pantoeadispersa strain 14#和MSC14菌株与分散泛菌(Pantoea dispersa)的基因序列的同源性为100％，分离的两菌株被鉴定为分散泛菌(Pantoea dispersa)。其中，分散泛菌(Pantoeadispersa)MSC14菌株的降解效率优于Pantoea dispersa strain 14#菌株，结果如图1所示，后续选用MSC14进行后续研究。从比对结果中选出同源性高的菌株16SrDNA序列为参比对象，通过MEGA7.0软件的Neighbor-Joining法构建MSC14菌株的系统发育树，结果如图2所示。

从LB固体斜面培养基挑取保存的分散泛菌(Pantoea dispersa)MSC14单菌落，用接种环接种至LB液体培养基，37℃、180r/min的条件下培养12h，然后取20μL涂布到LB固体培养基平板上，培养1d，观察平板上的菌落生长状况。结果如图3所示，生长较快(如图4所示)，菌落较大，菌落呈黄色，圆形，边缘齐整，粘稠状。革兰氏染色结果为阴性。

分散泛菌(Pantoea dispersa)MSC14菌株，于2022年8月3日保藏于位于广州市先烈中路100号大院59栋5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:62680。

实施例2分散泛菌(Pantoea dispersa)MSC14的生理生化特征

取分散泛菌(Pantoea dispersa)MSC14菌株，分别在含有50-1000mg/L蒽/芴、20-50mg/L菲或10-50mg/L苯并[a]芘的无机盐培养基、pH为7.2、温度为30℃的条件中培养；结果显示菌株在生长过程中能耐受浓度高达1000mg/L的蒽或芴；能耐受浓度高达50mg/L的菲，能耐受浓度高达20mg/L苯并[a]芘；最适生长条件为：pH7.2，温度30℃。

1.实验所需培养基的组分

糖发酵培养基：细菌学蛋白胨10.0g/L、NaCl 5.0g/L、1.6％溴甲酚紫乙醇溶液12mL/L和糖类10.0g/L，pH 7.6。其中糖类为D-阿拉伯糖、麦芽糖、葡萄糖、棉籽糖、乳糖、纤维二糖或山梨醇。

氨基酸脱羧培养基：蛋白胨5.0g/L、葡萄糖1.0g/L、0.2％溴麝香草酚蓝溶液12mL/L和氨基酸0.5g/L，pH 6.8。

脲酶实验培养基(g/L)：蛋白胨1.0g/L、葡萄糖1.0g/L、NaCl 5.0g/L、KH₂PO₄2.0g/L、0.2％酚红水溶液6mL/L和琼脂20.0g/L，灭菌后调pH至6.8～6.9，培养基冷却到50℃～55℃时，添加20％过滤除菌的尿素到培养基，使得浓度为2％，然后摆斜面。

葡萄糖蛋白胨水培养基：细胞学蛋白胨5.0g/L、葡萄糖20.0g/L、酵母粉2.5g/L、K₂HPO₄ 1.0g/L、MgSO₄·7H₂O g/L和琼脂0.4g/L,pH 6.3±0.3。

柠檬酸盐培养基：NaCl 5.0g/L、MgSO₄ 0.2g/L、(NH₄)H₂PO₄ 1.0g/L、K₂HPO₄ 1.0g/L、柠檬酸钠2.0g/L、琼脂20.0g/L和1％溴麝香草酚蓝(酒精溶液)10mL/L，pH 6.8。

硝酸盐培养基：蛋白胨5.0g/L和硝酸钾1.0g/L，pH 6.9～7.1。

2.生理生化特征实验

(1)糖/醇发酵实验

将菌株MSC14接种于糖发酵培养基中于37℃培养48h，观察结果。培养基由紫色变为黄色为阳性；若无颜色变化，为阴性。本实验所测的糖/醇包括D-阿拉伯糖、麦芽糖、葡萄糖、棉籽糖、乳糖、纤维二糖和山梨醇等。

(2)氨基酸脱羧实验

将菌株MSC14接种于氨基酸脱羧酶实验培养基中，于37℃培养18～24h，观察结果。若培养基呈紫色，产碱为阳性；若培养基呈黄色，因葡萄糖产酸为阴性，对照管为黄色。本实验氨基酸包括鸟氨酸和赖氨酸等。

(3)脲酶实验

将菌株MSC14接种于脲酶实验培养基，同时设置不加尿素的空白对照，37℃培养分别于24h、48h过夜观察，培养基呈桃红色为阳性，颜色不变为阴性。

(4)V.P实验

将菌株MSC14接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，37℃培养48 h，取培养液与40％氢氧化钠等量相混，加少许肌酸，10min出现红色反应即为阳性，反之则为阴性。

(5)柠檬酸盐实验

将菌株MSC14接种于柠檬酸盐培养基中，37℃培养2d，观察颜色，绿转蓝为阳性，反之为阴性。

(6)接触酶实验

将保存在LB固体斜面的菌种，用接种环取一小环涂抹于已滴有3％过氧化氢的玻片上，如有气泡产生为阳性，无气泡则为阴性。

(7)甲基红实验

将菌株MSC14接种于葡萄糖蛋白胨水培养基(pH 7.0)中，35℃培养48 h。培养液中加入一滴甲基红试剂，变红色为阳性反应，黄色为阴性反应。

(8)硝酸盐还原实验

将菌株MSC14接种于硝酸盐液体培养基中，37℃培养3 d。于培养3 d的培养液中各加一滴甲液及乙液，设置无菌对照。当培养液中滴入A液和B液后，溶液如变为粉红色、玫瑰红色、橙色、棕色等表示亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性。如无红色出现，则可加1～2滴苯胶试剂，此时如呈蓝色反应，则表示培养液中仍有硝酸盐，又无亚硝酸盐反应，表示无硝酸盐还原作用；如不呈蓝色反应，表示硝酸盐和形成的亚硝酸盐都己还原成其他物质，故仍应按硝酸盐还原阳性处理。

上述实验结果如表1所示。

表1 MSC14菌株生理生化特征

+：阳性反应；-阴性反应

实施例3

分散泛菌MSC14菌株对1000mg/L的蒽、芴的降解率测定及生长曲线的绘制

用接种环将保存在4℃冰箱中的固体LB斜面的MSC14菌株分别接种于25mL含有蒽的无机盐培养基(所述含有蒽的无机盐培养基由以下组成成分组成：1000mg/L蒽、1g/L(NH₄)₂SO₄、1g/L Na₂HPO₄、0.2g/L KH₂PO₄、0.2g/L MgSO₄·7H₂O、0.005g/LFeCl₃·3H₂O、0.001g/L(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O、0.1g/L CaCl₂·2H₂O和水)和含有芴的无机盐培养基(所述含有芴的无机盐培养基由以下组成成分组成：1000mg/L芴、1g/L(NH₄)₂SO₄、1g/L Na₂HPO₄、0.2g/L KH₂PO₄、0.2g/L MgSO₄·7H₂O、0.005g/LFeCl₃·3H₂O、0.001g/L(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O、0.1g/L CaCl₂·2H₂O和水)中，在pH7.2和温度30℃的条件下，分别150r/min振荡培养，每隔6h分别用以等体积(25mL)二氯甲烷萃取，重复萃取两遍，分别取有机层并用二氯甲烷定容至50mL，利用高效液相色谱法测定样品中残留蒽、芴的含量，计算降解率。以时间为横坐标，以蒽或芴的降解率及生物量为纵坐标绘制曲线图，蒽的降解曲线及生物量变化图如图5所示；芴的降解曲线及生物量变化图如图6所示。

由图5和6可见，MSC14菌株可在蒽或芴为唯一碳源的环境中生长，MSC14菌株在1d内能将1000mg/L蒽或芴降解完，明显优于现有其他多环芳烃降解菌的降解率，说明了MSC14菌株对PHAs的降解能力。而且，MSC14菌株还能够耐受浓度高达1000mg/L的蒽、芴，更有利于污染严重的土壤及水体修复。

分散泛菌MSC14菌株对20mg/L的苯并[a]芘的降解率测定及生长曲线的绘制

设置15组平行样，用接种环将保存在4℃冰箱中的固体LB斜面的MSC14菌株分别接种于25mL含有苯并[a]芘的无机盐培养基(所述含有苯并[a]芘的无机盐培养基由以下组成成分组成：1000mg/L苯并[a]芘、1g/L(NH₄)₂SO₄、1g/L Na₂HPO₄、0.2g/L KH₂PO₄、0.2g/LMgSO₄·7H₂O、0.005g/L FeCl₃·3H₂O、0.001g/L(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O、0.1g/L CaCl₂·2H₂O和水)中，在pH7.2和温度30℃的条件下，150r/min振荡培养，从0到4天，每天取三个平行样以等体积二氯甲烷(25mL)萃取，重复萃取两遍，分别取有机层并用二氯甲烷定容至50mL，利用高效液相色谱法测定样品中残留苯并芘的含量，计算降解率。以时间为横坐标，以苯并[a]芘的降解率及生物量为纵坐标绘制曲线图，结果如图7所示。

由图7可见，MSC14菌株可在苯并[a]芘为唯一碳源的环境中生长，MSC14菌株可在4d内能将20mg/L苯并[a]芘降解至30％以上，苯并[a]芘属于毒性较强的高环芳烃，说明MSC14具有明显优于现有其他多环芳烃降解菌的降解率，对于修复环境具有极高的利用价值。

实施例4：

MSC14菌株对不同PHAs有机物为唯一碳源的生长情况

分散泛菌MSC14在不同底物固体无机盐培养基中(培养基配置：无机盐培养基+1.5％琼脂粉，倒平板后取200μL浓度为1000mg/L萘或50mg/L菲或20mg/L芘或50mg/L荧蒽涂布在平板表面)测定的生长情况如表2所示，该菌除了能够在蒽、芴、苯并[a]芘培养基中生长外，还可以在萘、菲、芘和荧蒽的琼脂培养基中生长，说明该菌对PAHs有机物的去除具有一定的广谱性，对各种PAHs都能起到良好的耐受能力。

表2MSC14菌株在不同PAHs有机物培养基中的生长情况

“+”为有菌落生长，“++”为菌落生长较旺盛，“-”为无菌落生长

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1. 一株高效降解多环芳烃的分散泛菌，命名为分散泛菌（Pantoea dispersa）MSC14，其特征在于：保藏编号为GDMCC No:62680，于2022年8月3日保藏于位于广州市先烈中路100号大院59栋5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心。

2.一种降解多环芳烃类有机污染物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

向被多环芳烃污染的样品中接种权利要求1所述的高效降解多环芳烃的分散泛菌，降解多环芳烃；所述的多环芳烃包括蒽、芴、苯并[a]芘、萘、菲、芘和荧蒽中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

所述的多环芳烃为蒽、芴和苯并[a] 芘的至少一种。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：

所述的多环芳烃为浓度为1000 mg/L以下的蒽、浓度为1000 mg/L以下的芴或浓度为20mg/L以下的苯并[a]芘。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

所述降解为在温度为25～35℃和pH值为6.4～8.0的条件下降解。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

所述降解为在温度为30℃和pH值为7.2的条件下降解。

7.权利要求1所述的高效降解多环芳烃的分散泛菌在多环芳烃污染的土壤或水体的修复中的应用；所述的多环芳烃包括蒽、芴、苯并[a]芘、萘、菲、芘和荧蒽中的至少一种。

8.根据权利要求7中所述的应用，其特征在于所述多环芳烃污染的水体为含有多环芳烃的工业废水。