CN114410510B - 一种修复镉-铬复合污染的菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种修复镉‑铬复合污染的菌株及其应用，名称为Serratia marcescens 13017，保藏编号为GDMCC No：62064，能够有效去除重金属镉且能有效将高毒性的六价铬还原为低毒的三价铬，该菌株在镉‑铬复合污染水体中去除镉达62％，去除铬达50％，六价铬的还原率为90％以上。可应用于土壤或水体重金属修复，是一种原位高效且绿色的修复方法。

Description

一种修复镉-铬复合污染的菌株及其应用

技术领域

本发明属于重金属污染生物修复技术领域，涉及一种修复镉-铬复合污染的菌株及其应用。

背景技术

近年来，重金属污染问题越来越受到各国政府的重视，各国政府开展了大量的土壤污染调查研究，建立了土壤污染清单。同样地，饮用水的来源(如地表水、地下水和海水)很可能受到重金属的污染，虽然在海水淡化过程中金属被去除，但淡化后的饮用水可能含有各种金属，它们通过在土壤或水中积累，通过食物链最终危害人体健康。

目前，用于修复重金属的方法大致可分为物理修复、化学修复和生物修复三类，且基于这三类方法的各种修复手段已经被开发且应用于原位或异位修复重金属污染。修复土重金属污染的物理、化学修复方法都存在成本高且易产生二次污染等局限性，为保障修复技术的顺利实施，以达到预期的修复目标，就必须因地制宜地制定最适合的风险控制与修复方案。微生物修复重金属污染技术是目前研究热点，相比较而言，是更适用于重金属修复的绿色修复方法。但据目前报道，能有效修复重金属污染菌株非常少，所以需要筛选出更多可有效修复Cd-Cr复合污染的菌株，以有效缓解重金属污染这一难题。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种修复镉-铬复合污染的菌株及其应用，该菌株能耐受镉-铬复合污染，且能有效吸附镉及还原六价铬，可用于土壤或水体中重金属污染修复。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

本发明提供了一种修复镉-铬复合污染的菌株，名称为Serratia marcescens13017，保藏编号为GDMCC No：62064。

优选地，所述菌株的16S rDNA序列由1439个碱基(bp)组成，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

优选地，所述菌株的培养基为TSB培养基，培养条件为28-36℃，180-220rpm， pH7-8.5，培养24-96h。

更优选地，TSB培养基为：D-葡萄糖2.5g/L，NaCl 5.0g/L，大豆蛋白胨3 g/L，胰酪蛋白胨17g/L，pH 7-7.2。

更优选地，菌株生长最适转速为200rpm，菌株最适生长pH值为7.5，菌株生长最适温度为30℃。

优选地，所述菌株可耐受重金属镉-铬复合污染的浓度均为350ppm。

本发明还提供了上述菌株在土壤或水体重金属修复中的应用。

优选地，所述应用包括吸附土壤或水体中的镉和铬并还原六价铬。

本发明另提供了一种用于修复镉-铬复合污染的生物菌剂，包括上述菌株。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的沙雷氏菌Serratia marcescens 13017能够有效去除重金属镉且能有效将高毒性的六价铬还原为低毒的三价铬，该菌株在镉-铬复合污染水体中去除镉达62％，去除铬达50％，六价铬的还原率为90％以上。可应用于土壤或水体重金属修复，是一种原位高效且绿色的修复方法。

附图说明

图1为本发明Serratia marcescens 13017的平板生长状态。

图2为本发明Serratia marcescens 13017的革兰氏染色图。

图3为本发明Serratia marcescens 13017的生长曲线。

图4为本发明Serratia marcescens 13017的最佳转速检测。

图5为本发明Serratia marcescens 13017的最适pH值检测。

图6为本发明Serratia marcescens 13017的最适温度检测。

图7为本发明Serratia marcescens 13017的主要生化指标检测结果(“+”为阳性，“-”为阴性，“w”为弱阳性)。

图8为本发明Serratia marcescens 13017的透射电镜图(左为正常生长状态下菌株，右为镉-铬污染环境下菌株)。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例

采用海南省乐东县抱伦矿区重金属污染的土壤为筛选土壤，经ICP-MS测定，镉含量8ppm，铬含量212ppm。

1.本发明所用培养基

筛选培养基：LB培养基：氯化钠10g/L，酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L；在此基础上分别加入镉50ppm、铬200ppm。

富集培养基：TSB培养基：D-葡萄糖2.5g/L，NaCl 5.0g/L，大豆蛋白胨3g/L，胰酪蛋白胨17g/L。

2.优势菌株分离纯化

取上述重金属污染土壤与无菌水1:10混合，28℃、180r/min震荡30min，静置15min，制成菌悬液，取上清液均匀涂布到上述筛选培养基中，室温培养3～5 天，挑取长势最佳的菌株用平板划线分离法进行分离纯化，得到本发明菌株，编号13017。

3.优势菌株最大耐受浓度测定

将纯化所得单菌落依次接种到含镉-铬污染复合浓度分别为50-500ppm的系列浓度梯度的同种筛选培养基上，室温下进行培养，观察其生长状态，最终测得优势菌株13017耐受镉-铬复合污染的最大浓度为350ppm。

4.沙雷氏菌形态学观察及主要生理生化特征

优势菌株13017接种于TSB培养基中的状态如图1，菌落表面光滑，较湿润粘稠；由图2的染色结果可知本菌株为革兰氏阴性菌。生理生化鉴定依据《伯杰氏细菌鉴定手册》、《微生物实验技术》进行，主要结果如图7所示，蔗糖、果糖、明胶等呈现阳性。结合图3-6可知，菌株约在96h后进入衰退期，菌株生长最适转速为200rpm，菌株最适生长pH值为7.5，菌株生长最适温度为30℃。结合图8，可见正常生长状态下菌体完整，表面光滑，色素分布均匀，而在重金属胁迫下菌体表面粗糙，色素集中分布不均。

5.菌株分子鉴定

优势菌株16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

经National Center for Biotechnology Information比对，该优势菌为沙雷氏属，数据已上传至National Center for Biotechnology Information数据库，上传编号为SUB10587060。

该菌株已于2021年11月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学微生物研究所；保藏编号为：GDMCC No：62064。

6.优势菌株在镉-铬复合污染水体中的吸附性

无污染菌液按5％的接种量接种至200mL含镉-铬污染100ppm的液体培养基中，30℃，150rpm摇瓶培养24h，取样8000rpm，4℃离心10min，稀释一定倍数后用AA.800原子吸收分光光谱仪测定上清液中镉、铬的浓度。

吸附率的计算方法为：

吸附率＝(Cd(II)初始浓度-Cd(II)终浓度)/Cd(II)初始浓度×100％

吸附率＝(Cr(总)初始浓度-Cr(总)终浓度)/Cr(总)初始浓度×100％

经计算，本发明菌株13017在复合污染水体中吸附镉能力为62％，吸附铬能力为50％。

7.优势菌株在镉-铬复合污染水体中的还原性

无污染菌液按5％的接种量接种至200mL含镉-铬污染100ppm的液体培养基中，30℃，150rpm摇瓶培养24h，取样8000rpm，4℃离心10min，稀释一定倍数后依据国标《总铬和六价铬量的测定-二苯碳酰二肼分光光度法》测定总铬及六价铬含量。

还原率的计算方法为：

还原率＝(Cr(总)-Cr(VI))/Cr(总)×100％

经计算，本发明菌株13017在复合污染水体中还原六价铬的能力达90％以上。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为更清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方法予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

序列表

<110> 海南大学

<120> 一种修复镉-铬复合污染的菌株及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1439

<212> DNA

<213> 粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)

<400> 1

gtttgatcct ggctcagatt gaacgctggc ggcaggctta acacatgcaa gtcgagcggt 60

agcacagggg agcttgctcc cctgggtgac gagcggcgga cgggtgagta atgtctggga 120

aactgcctga tggaggggga taactactgg aaacggtagc taataccgca taacgtcgca 180

agaccaaaga gggggacctt cgggcctctt gccatcagat gtgcccagat gggattagct 240

agtaggtggg gtaatggctc acctaggcga cgatccctag ctggtctgag aggatgacca 300

gccacactgg aactgagaca cggtccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg 360

cacaatgggc gcaagcctga tgcagccatg ccgcgtgtgt gaagaaggcc ttcgggttgt 420

aaagcacttt cagcgaggag gaaggtggtg agcttaatac gttcatcaat tgacgttact 480

cgcagaagaa gcaccggcta actccgtgcc agcagccgcg gtaatacgga gggtgcaagc 540

gttaatcgga attactgggc gtaaagcgca cgcaggcggt ttgttaagtc agatgtgaaa 600

tccccgggct caacctggga actgcatttg aaactggcaa gctagagtct cgtagagggg 660

ggtagaattc caggtgtagc ggtgaaatgc gtagagatct ggaggaatac cggtggcgaa 720

ggcggccccc tggacgaaga ctgacgctca ggtgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt 780

agataccctg gtagtccacg ctgtaaacga tgtcgatttg gaggttgtgc ccttgaggcg 840

tggcttccgg agctaacgcg ttaaatcgac cgcctgggga gtacggccgc aaggttaaaa 900

ctcaaatgaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgatgcaa 960

cgcgaagaac cttacctact cttgacatcc agagaacttt ccagagatgg attggtgcct 1020

tcgggaactc tgagacaggt gctgcatggc tgtcgtcagc tcgtgttgtg aaatgttggg 1080

ttaagtcccg caacgagcgc aacccttatc ctttgttgcc agcggttcgg ccgggaactc 1140

aaaggagact gccagtgata aactggagga aggtggggat gacgtcaagt catcatggcc 1200

cttacgagta gggctacaca cgtgctacaa tggcgtatac aaagagaagc gacctcgcga 1260

gagcaagcgg acctcataaa gtacgtcgta gtccggattg gagtctgcaa ctcgactcca 1320

tgaagtcgga atcgctagta atcgtagatc agaatgctac ggtgaatacg ttcccgggcc 1380

ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag tgggttgcaa aagaagtagg tagcttaac 1439

Claims (9)

1.一种修复镉-铬复合污染的菌株，名称为Serratia marcescens 13017，保藏编号为GDMCC No：62064。

2.根据权利要求1所述的一种修复镉-铬复合污染的菌株，其特征在于，所述菌株的16SrDNA序列由1439个碱基组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示。

3.根据权利要求1所述的一种修复镉-铬复合污染的菌株，其特征在于，所述菌株的培养基为TSB培养基，培养条件为28-36℃，180-220rpm，pH 7-8.5，培养24-96h。

4.根据权利要求3所述的一种修复镉-铬复合污染的菌株，其特征在于，所述TSB培养基为：D-葡萄糖2.5 g/L，NaCl 5.0 g/L，大豆蛋白胨 3 g/L，胰酪蛋白胨 17 g/L，pH 7-7.2。

5.根据权利要求3所述的一种修复镉-铬复合污染的菌株，其特征在于，所述菌株生长最适转速为200rpm，菌株最适生长pH值为7.5，菌株生长最适温度为30℃。

6.根据权利要求1所述的一种修复镉-铬复合污染的菌株，其特征在于，所述菌株可耐受重金属镉-铬复合污染的浓度均为350ppm。

7.权利要求1-6任意一项所述的菌株在土壤或水体镉-铬复合污染修复中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括吸附土壤或水体中的镉和铬并还原六价铬。

9.一种用于修复镉-铬复合污染的生物菌剂，包括权利要求1-6任意一项所述的菌株。

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