CN108741208A - 一株从再造烟叶浓缩液分离的增香菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及造纸法再造烟叶生产领域，特别是指一种株从再造烟叶浓缩液中分离的增香菌及其应用。所述增香菌为不动杆菌（Acinetobacter sp.），已于2018年01月29号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.15328。所述增香菌的培养条件为：将增香菌单菌落接种到LB液体培养基中，于30℃，150r/min的摇床中培养12h，即得增香菌菌液。所述的一株从再造烟叶浓缩液分离的增香菌的应用，所述增香菌在提升再造烟叶浓缩液香气的应用。
Description
技术领域
本发明涉及造纸法再造烟叶生产领域，特别是指一种株从再造烟叶浓缩液中分离的增香菌及其应用。
背景技术
目前国内造纸法再造烟叶生产工艺流程是：再造烟叶是以水为主要萃取溶剂，将烟草原料（如烟末、碎烟片、片烟、烟梗等）的可溶性成分和不溶性成分固液分离，可溶部分进行浓缩，不溶部分进行制浆，然后经抄造、涂布、干燥等工序制成的均质化烟叶。再造烟叶生产过程中，烟草提取液浓缩的目的是为涂布工序提供香气量足及质量稳定、均一的涂布液，而涂布液的质量直接决定着再造烟叶产品的内在品质。从而使得废次烟草及传统烟草加工过程中废弃物得到充分利用。常规的Acinetobacter sp属于不动杆菌属，有的菌株能代谢一些污染物如联苯、酚、原油、重金属等，还有一些不动杆菌菌株能够产生一些有经济价值的物质如脂肪酶、蛋白酶、藻青素、生物聚合物等。
造纸法再造烟叶虽然是烟草废弃物综合利用的一种新工艺，但在很大程度上只是原材料的物理重组过程，烟叶原料的内在质量缺陷（如杂气重、香气量不足等）无法有限改善，影响了再造烟叶在成品卷烟中的使用。而在其工艺环节水提液（母液或浓缩液）中的微生物，可能对再造烟叶的品质有重要影响，因此对这些微生物的培养和功能分析就显得十分必要，特别是从再造烟叶工艺的再造烟叶浓缩液（烟末或烟梗）中分离出具有一定功能的微生物。目前利用微生物来提升造纸法再造烟叶工艺中浓缩液及其再造烟叶制品的香气的相关报道较少。
发明内容
本发明提出一株从再造烟叶浓缩液中分离的增香菌及其应用，解决了提高造纸法再造烟叶工艺中浓缩液及其再造烟叶制品的香气的技术问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
一株从再造烟叶浓缩液分离的增香菌，所述增香菌为不动杆菌（Acinetobacter sp），已于2018年01月29号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.15328。
所述增香菌的培养条件为：将增香菌单菌落接种到LB液体培养基中，于30℃，150r/min的摇床中培养12h，即得增香菌菌液。
所述的一株从再造烟叶浓缩液分离的增香菌的应用，所述增香菌在提升再造烟叶浓缩液香气的应用。
步骤为：向烟草再造烟叶浓缩液中添加体积分数为5-10%的增香菌菌液，于28-30℃、150r/min摇床中醇化24h。
所述的一株从再造烟叶浓缩液分离的增香菌的应用，所述增香菌在造纸法再造烟叶制品增香中的应用。
步骤为：(1)种子液的培养；（2）再造烟叶浓缩液的发酵；（3）增香菌的应用及检测。
本技术方案能产生的有益效果：微生物通过自身或代谢过程中产生酶类，参与再造烟叶浓缩液的发酵，达到改善再造烟叶浓缩液品质之目的。目前微生物产生、分泌再造烟叶浓缩液中的有益物质，以达到改善其品质的报道较少。本实验就是从再造烟叶浓缩液中筛选出微生物以提高其品质，通过对其进行GC-MS及评吸都得到较好的结果。
不动杆菌（Acinetobacter sp. HS-2）发酵再造烟叶浓缩液后可提高卷烟的香气，使其更加丰满化、细腻化，而且还可以使卷烟的烟气更加丰满浓郁，使卷烟的香气具有特殊的酿香风味，谐调烟香，达到提高卷烟细腻性和甜润性的作用，提高卷烟的整体品质。
附图说明
图1为Acinetobacter sp.HS-2 菌株的系统进化树分析图。
图2为为对照样品和5%的增香菌再造烟叶浓缩液样品的总离子图。
图3为Acinetobacter sp.HS-2 菌株的革兰氏染色图。
图4为前处理流程示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
1.1样品富集培养：
配置LB液体培养基，取0.6mL浓缩液样品接种到装有30mL的LB液体培养基的三角瓶中，将三角瓶在28℃的摇床中培养12h，待其培养液呈现明显的浑浊。（注：LB培养基配方：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，蒸馏水1000mL；LB固体培养基：在LB液体培养基中每升加入20g琼脂粉，调pH至7.0）。
1.2 样品中可培养微生物的分离：
将富集培养完成的菌液，取0.6mL样品接种到装有30mL的50%的再造烟叶浓缩液（灭菌）三角瓶中，将三角瓶在28℃ 150r/min的摇床中培养3d，然后将富集培养的再造烟叶浓缩液用涂布平板法在LB固体培养基平板上进行均匀涂布，再在28℃恒温培养基中培养2-3d，待平板上长出单菌落。（富集培养后再造烟叶浓缩液浓度过高，需要分别做稀释10倍，100倍，1000倍后的涂布平板；使用的平板规格：90mm）。
1.3 功能菌的筛选和分离：
将涂布平板上长出的单菌落转接到筛选平板上，采用平板划线法进行均匀涂布，再在28℃恒温培养箱中培养2-3d；将筛选平板上筛选到的目的菌，在筛选平板上进行多次转接纯化，直至整个平板上长出单一菌落。
1.4 功能菌的摇瓶发酵试验
将纯化出的目的菌，从平板上挑选出单菌落接种到LB液体培养基中，将摇瓶置于28℃、150r/min的摇床中培养12h，然后再按5%体积百分比转接到装有30mL50%的再造烟叶浓缩液的三角瓶中，将三角瓶置于28℃的摇床中培养24h，观察其生长情况。
1.5 菌种鉴定和保藏
分别取固体培养基菌落进行形态和生理生化试验。对分离得到的菌株进行革兰氏染色、拍照，并进行电镜拍照。生理生化实验参照文献（东秀株，2001）进行。
16S rDNA序列和系统发育分析采用Ezup 柱式细菌基因组 DNA 抽提试剂盒提取细菌总DNA，采用细菌16S rDNA的通用引物（上海生工生物工程股份有限公司合成，其正向引物序列：5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，反向引物序列为：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）进行16S rDNA的PCR扩增。PCR产物的纯化和测序由上海生工公司完成。测序结果利用BlastGenBank基因序中进行同源性比较和鉴定，将16S rDNA序列和与其同源性高的序列用DNASTARver.7.1.0中的multiple sequence alignment software CLUSTAL W分析，并用Megalign 构建系统发育树，如图1所示。
增香菌的检测分析
向再造烟叶浓缩液中添加体积分数为5-10%的增香菌菌液，于28-30℃、150r/min摇床中醇化24h得增香菌样品，与空白对照样品相比总离子图如图2，香味物质变化对比表如下：
检测分析结果：
前处理：取空白对照样品、5%的增香菌样品各25g，放入1000mL的烧瓶中，加入500mL的水和100g的无水硫酸钠，进行同时蒸馏萃取2.5h，最后得到右端小烧瓶中的二氯甲烷萃取液约80mL，按图4的前处理流程进行分离，得到中性香味物质的分析液。
分析条件
色谱条件：Agilent HP-5MS 色谱柱（型号为30m×250μm×0.25μm）；进样口温度：280℃；载气为高纯氦气（99.999%），流速为1.0mL/min；程序升温：初始温度为50℃，初始温度为50℃，保持4 min，然后以2 ℃/min的升温速度升至240℃结束；不分流；进样量为1.0μL；GC-MS采用全扫模式。
质谱条件：传输线温度280℃；离子源温度为280℃；四极杆温度为150℃；电离方式为电子轰击（EI）,电子能量为70eV；溶剂延迟时间为8min；全扫质量范围（m/z）；35~550u。
增香菌的应用及评吸结果：
利用前期在再造烟叶浓缩液中分离得到的增香菌，经培养醇化后，按39%涂布率涂布至再造烟叶上，90℃烘10min，回潮至12.5%水分，切丝卷制成样品
附：39%涂布率所需浓缩液计算方法：
先称取再造烟叶，由再造烟叶的重量推算再造烟叶浓缩液的重量
再造烟叶浓缩液重量=再造烟叶重量×0.88×1.64+0.5
加水重量=再造烟叶浓缩液重量×1.6
向再造烟叶浓缩液中添加5%的菌，28℃醇化24h，5%的增香菌样品同空白对照样品相比，在闻香方面：香气量略有增加且闻香有甜香；卷制成再造烟叶制品进行感官评价：烟支在整体方面都有所改善，香气略有增加，杂气有所减轻，口腔粗糙感略有降低。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一株从再造烟叶浓缩液分离的增香菌，其特征在于：所述增香菌已于2018年01月29号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNo.15328。
2.根据权利要求1所述的一株从再造烟叶浓缩液分离的增香菌，其特征在于：所述增香菌的培养条件为：将增香菌单菌落接种到LB液体培养基中，于30℃，150r/min的摇床中培养12h，即得增香菌菌液。
3.根据权利要求1或2所述的一株从再造烟叶浓缩液分离的增香菌的应用，其特征在于：所述增香菌在提升再造烟叶浓缩液香气的应用。
4.根据权利要求3所述的一株从再造烟叶浓缩液分离的增香菌的应用，其特征在于，步骤为：向烟草再造烟叶浓缩液中添加体积分数为3-8%的增香菌菌液，于28-30℃、150r/min摇床中醇化24h。
5.根据权利要求1或2所述的一株从再造烟叶浓缩液分离的增香菌的应用，其特征在于：所述增香菌在造纸法再造烟叶制品增香中的应用。
6.根据权利要求3所述的一株从再造烟叶浓缩液分离的增香菌的应用，其特征在于，步骤为：（1）种子液的培养；（2）再造烟叶浓缩液的发酵；（3）增香菌的检测及应用。
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