CN109722340A - 一种野坝子烟用香料的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种野坝子烟用香料的制备方法和应用，其通过包括以下步骤的方法制备：(1)烟草黄色土源菌X7X菌剂的制备；(2)利用烟草黄色土源菌X7X菌剂对野坝子粉末进行发酵，得到发酵野坝子粉；(3)将发酵野坝子粉利用乙醇浸提，经过滤浓缩得到野坝子浓缩浸提液；(4)野坝子浓缩浸提液经大孔树脂精提，得野坝子烟用香料。所述野坝子烟用香料，应用于卷烟烟丝中，使得烟气中具有特殊花香及药草香，且香韵饱满突出，在降低卷烟烟气刺激性，增强卷烟赋香效果的同时，能够提升卷烟抽吸品质。

Description

一种野坝子烟用香料的制备方法和应用

技术领域

本发明属于卷烟用香精香料技术领域，具体涉及一种野坝子烟用香料的制备方法和应用。

背景技术

卷烟香气是卷烟品质的核心内容，但伴随着低焦化卷烟的发展，卷烟抽吸口感降低，香气不足等成为了烟草发展的凸显问题。卷烟加香加料，已是一种常规的、必需的增补香气的技术手段，通过加香、加料的方式可以弥补卷烟叶组配方上的不足，消除杂气，使卷烟烟香更加丰厚、充足，从而在吸味、嗅香上具有独特风格，增强产品的特征。天然香料在卷烟调香中起到的作用极为重要，而其在烟草调香中的应用也较为普遍，但随着企业卷烟自主调香步伐的加快，现有天然香原料的种类、数量、品质、制备工艺等已不能满足调香技术人员的需求，所以持续开发利用更多的香料植物资源，通过改进制备方法等获取品质更为优秀的天然香精香料，一直是卷烟调香和卷烟产品研发面临的现实课题。

野坝子，为唇形科植物野坝子ElsholtziarugulosaHemsl.的干燥全草，又称野拔子、小铁苏、铁苏苏、铁苏棵、小山苏、青牛夕、地檀香、草拔子、狗巴子、白背蒿、半边香、小芝麻叶、矮香薷(滇)等，分布于广西、四川、贵州和云南等地海拔1300-2800米的山坡草地、旷地、路旁、林中或灌丛中。野坝子有清热解毒，消食化积，止血止痛的功效，其含有多种黄酮、挥发油和微量元素，因花粉和植株均含有特殊香气，主要作为蜜源植物用于生产野坝子蜂蜜。目前，有关于野坝子硬蜜生产方法的报道，但未见将野坝子制备成烟用香料应用于卷烟中的报道。

利用微生物发酵及酶制剂处理可以增加传统提取香料中多种香气物质的含量，将其加入卷烟中，可生产出香气丰富、高品质的卷烟，满足消费者对卷烟品质的要求。利用微生物对自身具有气味的植物原料进行发酵，还能赋予植物以区别于原有气味的独特香味。目前，并没有利用微生物发酵技术用于发酵野坝子制备烟用香料的报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有烟用香精香料种类不够丰富及制备方法不足等问题，提供一种具有花香和药草香香韵的野坝子烟用香料的制备方法及在卷烟中的应用，其利用烟草黄色土源菌X7X发酵工艺对野坝子进行处理，再通过溶剂提取工艺得到一种野坝子烟用香料，应用于卷烟烟丝中，使得烟气中具有特殊花香及药草香，且香韵饱满突出，能够降低卷烟烟气刺激性，增强卷烟赋香效果，提升卷烟抽吸品质，同时丰富了烟用香精香料来源和种类。

*除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。

本发明第一方面涉及一种烟草黄色土源菌X7X，其分离于采自昆明市一个烟草生产基地的烟草根际土样，对其进行了形态学、生理生化性质和16S rRNA 测序分析，鉴定结果表明其属于黄色土源菌属，微生物学分类命名为烟草黄色土源菌Flavisolibactersp.X7X，已于2018年9月10日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCC 16451，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所。

本发明分离得到的烟草黄色土源菌X7X菌株的主要形态特征和生理生化性质特征为：所述X7X菌株的细胞为革兰氏阴性、需氧型，非运动的杆状结构。细胞大小为宽0.6-0.7um，长1.2-2.0um。在R2A琼脂平板30℃培养7天后，菌落呈现黄色、表面光滑、中央凸起边缘整齐，直径为1.0-3.0mm的形状。菌株能够在20-40℃，pH为6.0-8.0的范围内生长，最适生长温度为30℃，最适pH 值为7.0。菌株的明胶液化，氧化酶、过氧化氢酶，吐温40水解反应结果呈阳性，酪蛋白、纤维素、淀粉和吐温20、80水解结果呈阴性。菌株的碱性磷酸酶、脂酶C4、脂酶C8、亮氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、半胱氨酸芳胺酶，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶、α-半乳糖苷酶、β-糖醛酸酶、酸性磷酸酶检测结果呈阳性，精氨酸双水解酶、柠檬酸的利用、吲哚反应、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、色氨酸脱氨酶检测结果呈阴性。

所述X7X菌株能够利用乙醛酸、D-阿拉伯醇、蚁酸、果糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、糖醛酸、D-乳酸甲酯、苹果酸和山梨醇作为碳源，但不能利用天冬氨酸、α-羟基丁酸、纤维二糖、果糖、半乳糖、蔗糖、鼠李糖和丝氨酸。所述X7X菌株细胞的极性主要包括磷脂酰乙醇胺、一个未鉴定的氨基磷脂、两个未鉴定的糖脂；主要的呼吸醌为MK-7；主要的脂肪酸为iso-C_15:0，iso-C_17:0 3OH和summed feature 3(C_16:1ω7c和/或C_16:1ω6c)。

本发明所分离得到的烟草黄色土源菌X7X，其基因组的G+C含量为49.7％的，其16SrRNA基因核苷酸序列如序列表所示，该序列已递交国际核苷酸序列数据库(GenBank)，序列检索号：MG209702。

本发明第二方面涉及一种野坝子烟用香料，其通过包括以下步骤的方法制备：

(1)烟草黄色土源菌X7X菌剂的制备；

(2)利用烟草黄色土源菌X7X菌剂对野坝子粉末进行发酵，得到发酵野坝子粉末；

(3)将发酵野坝子粉利用乙醇浸提，经过滤浓缩得到野坝子浓缩浸提液；

(4)野坝子浓缩浸提液经大孔树脂精提，得野坝子烟用香料。

上述野坝子烟用香料，步骤(1)具体包括：将烟草黄色土源菌X7X液体菌种按10％的接种量接种到发酵培养基中，30℃震荡培养7天，得到培养液；培养液离心分离，用无菌水洗涤沉淀，最后用无菌水震荡均匀，稀释10倍即得菌剂。

上述野坝子烟用香料，步骤(2)具体包括：将干燥的野坝子植株粉碎成粒径30～100目的粉末，平衡水分至10％～13％，每100g野坝子粉中喷施烟草黄色土源菌X7X菌剂20mL，混匀，将处理好的野坝子粉置于22℃，60％的恒温恒湿箱中发酵24～72h，得到发酵野坝子粉。

上述野坝子烟用香料，步骤(3)具体包括如下步骤：

1)浸提：将所得发酵野坝子粉置于121℃灭菌锅中灭菌20～30min后，加入发酵野坝子粉末质量10～25倍的95％浓度乙醇，浸泡提取24～48h；

2)过滤：步骤1)所得野坝子浸提液进行抽滤，过滤孔径目数200～300目；

3)浓缩：收集步骤2)抽滤所得清液，在45～65℃、60～90kPa条件下浓缩至体积不再变化，得到野坝子浓缩浸提液。

上述野坝子烟用香料，步骤(4)具体包括如下步骤：

1)吸附：将4～8倍野坝子浓缩浸提液质量的D101大孔吸附树脂，用95％乙醇浸泡24h后，装入层析柱中，用蒸馏水洗脱至流出液无色无味后，将野坝子浓缩浸提液上样吸附于层析柱顶端；

2)洗脱：依次用3倍大孔树脂柱体积的水、25～35％乙醇溶液、75～85％乙醇溶液、95％乙醇溶液将大孔树脂层析柱进行梯度洗脱，收集75～85％的乙醇洗脱液；

3)浓缩：将收集的75～85％乙醇洗脱液，在45～65℃、60～90kPa条件下浓缩至密度为1.0～1.5g/cm³的野坝子浓缩精提液，即为野坝子烟用香料。

本发明第三方面涉及一种卷烟，其包含本发明第二方面制备的野坝子烟用香料。

上述卷烟中野坝子烟用香料的用量为烟丝质量的0.2～0.5％，其是通过用丙二醇或乙醇稀释3～5倍质量后，以喷雾的方式喷洒到卷烟烟丝上制得。

本发明具有以下有益效果：

(1)本发明充分利用当地香料植物资源，首次将野坝子制备成烟用香料，应用于卷烟加工，丰富了烟用香精香料来源和种类以及卷烟香韵香型特征，满足了消费者的个性化及多元化需求；

(2)本发明首次利用新菌种烟草黄色土源菌X7X对野坝子进行处理，再通过溶剂提取及大孔树脂精制工艺得到野坝子烟用香料，应用于卷烟烟丝中，在卷烟抽吸过程中能产生与卷烟香气相协调的特殊花香及药草香，且香韵饱满突出，在降低卷烟烟气刺激性，增强卷烟赋香效果的同时，能够提升卷烟抽吸品质；

(3)本发明所述野坝子烟用香料，其制备过程不涉及有毒有害试剂的引入，制备方法简单易行，所得香料及加工工艺安全环保，且野坝子来源广泛，原料易得，成本低廉，便于实现工业化生产，有良好的应用价值。

附图说明

图1为本发明烟草黄色土源菌X7X在R2A培养基上的电镜照片；

图2为本发明烟草黄色土源菌X7X及部分相关菌株依据16S rRNA基因序列构建的系统发育树。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1

1.烟草黄色土源菌X7X的分离、培养与鉴定

1.1烟草黄色土源菌X7X的分离

从云南省昆明市的烟草生产基地的烟草根际取土壤样品，塑料袋密封带回， 4℃保存待用。准确称取10g土样，加入100mL无菌水，30℃、200rpm震荡培养30min；用无菌水将浓度稀释至10^-3、10^-4w/v倍，将2个浓度的菌液各取0.1mL 均匀涂布于R2A琼脂平板上，每个浓度的菌液设置3个平行试验，30℃恒温培养箱中培养2周，在培养平板上挑取不同形态单菌落，继续采用平板划线法分离纯化菌株，编号后接种于R2A斜面培养基，或配制成甘油悬液(20％，w/v)，置于-80℃条件下保藏。

将分离得到的微生物分别接种于R2A液体培养基中，30℃、160rpm振荡培养，培养至菌液浓度为OD＝1.5，制得各微生物菌株的种子液，观察种子液外观和香气特征变化，筛选出其中能产生特殊香气的微生物菌株，编号为X7X。

1.2烟草黄色土源菌X7X的鉴定

将上述筛选出的能产生特殊香气的微生物菌株X7X，继续接种于R2A琼脂平板培养基上，30℃恒温培养箱中培养7天。进行形态学、生理生化性质和16S rRNA测序分析，鉴定结果表明属于黄色土源菌属，其微生物学分类命名为烟草黄色土源菌(拉丁文学名：Flavisolibacter sp.X7X)。

烟草黄色土源菌X7X在R2A琼脂平板培养基上的电镜照片如附图1所示。

烟草黄色土源菌X7X菌株的细胞为革兰氏阴性、需氧型，非运动的杆状结构。细胞大小为宽0.6-0.7um，长1.2-2.0um。在R2A琼脂平板30℃培养7天后，菌落呈现黄色、表面光滑、中央凸起边缘整齐直径为1.0-3.0mm的形状。菌株能够在20-40℃，pH为6.0-8.0的范围内生长，最适生长温度为30℃，最适pH 值为7.0。菌株的明胶液化，氧化酶、过氧化氢酶，吐温40水解反应结果呈阳性，酪蛋白、纤维素、淀粉和吐温20、80水解结果呈阴性。菌株的碱性磷酸酶、脂酶C4、脂酶C8、亮氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、半胱氨酸芳胺酶，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶、α-半乳糖苷酶、β-糖醛酸酶、酸性磷酸酶检测结果呈阳性，精氨酸双水解酶、柠檬酸的利用、吲哚反应、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、色氨酸脱氨酶检测结果呈阴性。

所述X7X菌株能够利用乙醛酸、D-阿拉伯醇、蚁酸、果糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、糖醛酸、D-乳酸甲酯、苹果酸和山梨醇作为碳源，但不能利用天冬氨酸、α-羟基丁酸、纤维二糖、果糖、半乳糖、蔗糖、鼠李糖和丝氨酸。所述X7X菌株细胞的极性主要包括磷脂酰乙醇胺、一个未鉴定的氨基磷脂、两个未鉴定的糖脂；主要的呼吸醌为MK-7；主要的脂肪酸为iso-C₁₅:₀，iso-C₁₇:₀3OH和summed feature 3(C₁₆:₁ω7c和/或C₁₆:₁ω6c)。

烟草黄色土源菌X7X的生理生化特征如表1所示：

表1烟草黄色土源菌X7X的生理生化反应鉴定结果

注：“+”表示结果为阳性，“-”表示结果为阴性

烟草黄色土源菌X7X的碳源利用情况如表2所示：

表2烟草黄色土源菌X7X的碳氮源利用情况

注：“+”表示结果为阳性，“-”表示结果为阴性

烟草黄色土源菌X7X的16S rRNA基因核苷酸部分序列如附图说明所示，该序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较分析，并从数据库获得相关种属的16S rRNA基因核苷酸序列，构建系统发育树，见附图2。经比较分析发现，本发明的烟草黄色土源菌X7X与菌株(Flavisolibacterswuensis.SR2-4-2) 亲缘关系最近，在系统进化树上形成独立的分枝，综合形态、生理生化、细胞化学和系统进化分析等特征，两者又有明显差距，表明本发明的烟草黄色土源菌 X7X是一个新物种，命名为Flavisolibacter sp.X7X。

烟草黄色土源菌X7X在GenBank数据库的16S rRNA基因核苷酸序列登录号为MG209702，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为 CGMCC 16451。烟草黄色土源菌X7X及相关种属的16S rRNA基因序列构建的系统发育树如附图2所示。

实施例2

1.烟草黄色土源菌X7X的培养

(1)试管斜面培养

采用斜面保藏培养基，培养基为R2A琼脂培养基，培养基的配方为：葡萄糖 0.5g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.5g，酸水解酪蛋白0.5g，可溶性淀粉0.5g，丙酮酸钠0.3g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.05g，琼脂15g，蒸馏水定容到1000mL，pH7.2。将培养基在121℃下灭菌25分钟，摆成斜面，接种烟草黄色土源菌X7X，30℃下培养2周，获得试管菌种；

(2)种子培养

采用种子培养基，种子培养基为R2A液体培养基，配方为：葡萄糖0.5g；酵母膏0.5g；蛋白胨0.5g；酸水解酪蛋白0.5g；可溶性淀粉0.5g；丙酮酸钠0.3g；磷酸氢二钾0.3g；硫酸镁0.05g；蒸馏水1000mL，pH7.2。将培养基在121℃下灭菌25分钟，从步骤(1)的试管斜面上挑取部分菌丝体接入种子液中，30℃震荡培养48h，获得液体菌种；

(3)烟草黄色土源菌X7X菌剂制备

将烟草黄色土源菌X7X液体菌种按10％的接种量接种到发酵培养基中，30℃震荡培养7天，得到培养液；每1000mL培养液以3500r/min离心10min，用无菌水洗涤沉淀，最后用20mL无菌水震荡均匀，稀释10倍即得烟草黄色土源菌X7X菌剂。

发酵培养基配方为：黄豆饼浸出汁10mL，葡萄糖10g，蛋白胨3g，氯化钠 2.5g，碳酸钙2g，蒸馏水1000mL，PH7.2。将培养基在121℃下灭菌30min，既得发酵培养基。

2.野坝子粉发酵

干燥的野坝子植株粉碎成粒径50目的粉末，称取野坝子粉1000g，预先平衡水分至12％，喷施烟草黄色土源菌X7X菌剂200mL，混匀，将处理好的野坝子粉放入22℃，60％的恒温恒湿箱发酵72h，得到发酵野坝子粉。

3、野坝子浓缩浸提液制备

将所得发酵野坝子粉置于121℃灭菌锅中灭菌30min后，加入发酵野坝子粉末质量10倍的95％浓度乙醇，浸泡提取48h；将浸提液用300目滤网抽滤，所得清液在50℃，80kPa条件下浓缩至体积不再变化，得到野坝子浓缩浸提液。

4.野坝子烟用香料的精制

取4倍于野坝子浓缩浸提液质量的D101大孔吸附树脂，用95％乙醇浸泡24h，然后充填装柱后，用蒸馏水洗脱至流出液无色无味，然后将野坝子浓缩浸提液加入少许蒸馏水稀释后，上样吸附于层析柱顶端。依次用3倍大孔树脂柱体积的水、 30％乙醇溶液、80％乙醇溶液、95％乙醇溶液将大孔树脂层析柱进行梯度洗脱，并收集80％的乙醇洗脱液。80％乙醇洗脱液在50℃、90kPa条件下浓缩至密度为 1.1g/cm³的野坝子浓缩精提液，即为野坝子烟用香料。

5.野坝子烟用香料的应用

取占卷烟烟丝质量0.3％的野坝子烟用香料，用是野坝子烟用香料4倍量的丙二醇溶解后，以喷雾的方式喷洒到卷烟烟丝上，放入恒温恒湿箱内，在湿度 60％±2，温度22℃±2条件下平衡48h，卷制成卷烟烟支，即为含野坝子烟用香料的试验卷烟。

6.野坝子烟用香料的评价

对照卷烟的制备：将野坝子粉碎成粒径为50目的粉末，称取1000g。将该野坝子粉代替发酵野坝子粉，按照实施例2中的步骤3～5，制得含野坝子提取物的对照卷烟。

含野坝子烟用香料的试验卷烟，与空白卷烟以及含野坝子提取物的对照卷烟交由专业的评吸员进行感官对比评吸，参照烟用香精功能性评价方法进行评价，结果如表3所示。含野坝子提取物的对照卷烟，带有一定的花香和药草香香韵，但香气质感单薄，进行卷烟抽吸时，烟气中花香和药草香香韵体现不理想，杂气增加，刺激性改善不明显。含野坝子烟用香料的试验卷烟，较含野坝子提取物的对照卷烟，其带有一种特殊的花香香韵，药草香明显，香气浓郁自然，进行卷烟抽吸时，烟气中花香和药草香更加立体饱满，在降低卷烟烟气刺激性，增强卷烟赋香效果的同时，余味较为干净，能够显著提升卷烟抽吸品质。

表3野坝子烟用香料的感官评价

实施例3

1.烟草黄色土源菌X7X的培养方法同实施例2。

2.野坝子粉发酵

干燥的野坝子植株粉碎成粒径30目的粉末，称取野坝子粉1000g，预先平衡水分至10％，喷施烟草黄色土源菌X7X菌剂200mL，混匀，将处理好的野坝子粉放入22℃，60％的恒温恒湿箱发酵48h，得到发酵野坝子粉。

3、野坝子浓缩浸提液制备

将所得发酵野坝子粉置于121℃灭菌锅中灭菌20min后，加入发酵野坝子粉末质量15倍的95％浓度乙醇，浸泡提取48h；将浸提液用200目滤网抽滤，所得清液在45℃，70kPa条件下浓缩至体积不再变化，得到野坝子浓缩浸提液。

4.野坝子烟用香料的精制

取5倍野坝子浓缩浸提液质量的D101大孔吸附树脂，用95％乙醇浸泡24h，然后充填装柱，用蒸馏水洗脱至流出液无色无味，然后将野坝子浓缩浸提液加入少许蒸馏水稀释后，上样吸附于层析柱顶端。依次用3倍大孔树脂柱体积的水、 25％乙醇溶液、85％乙醇溶液、95％乙醇溶液将大孔树脂层析柱进行梯度洗脱，并收集85％的乙醇洗脱液。85％乙醇洗脱液在45℃、90kPa条件下浓缩至密度为 1.2g/cm³的野坝子浓缩精提液，即为野坝子烟用香料。

5.野坝子烟用香料的应用

取占卷烟烟丝质量0.3％的野坝子烟用香料，用野坝子烟用香料5倍量的95％乙醇溶解后，以喷雾的方式喷洒到卷烟烟丝上，放入恒温恒湿箱内，在湿度60％±2，温度22℃±2条件下平衡48h，卷制成卷烟烟支，即为含野坝子烟用香料的试验卷烟。

6.野坝子烟用香料的评价

对照卷烟的制备：以烟草黄色土源菌X7X的亲缘菌种Flavisolibacterswuensis.SR2-4-2(购自日本微生物保藏中心(JCM))代替烟草黄色土源菌X7X发酵野坝子粉，其余操作步骤同实施例3中步骤1～5，所制得的卷烟即为对照卷烟。

由烟草黄色土源菌X7X发酵的野坝子烟用香料制备而得的试验卷烟，与空白卷烟，以及由亲缘菌种Flavisolibacterswuensis.SR2-4-2发酵的野坝子提取物制备而得的对照卷烟，皆交由专业的评吸员进行感官对比评吸，参照烟用香精功能性评价方法进行评价，结果如表4所示。对照卷烟，与空白卷烟相比，有一定药草香香韵，进行卷烟抽吸时，烟气中杂气、刺激性增加，协调不佳。试验卷烟，相较对照卷烟，其花香和药草香香韵明显，香气清新自然，进行卷烟抽吸时，烟气香韵立体饱满，香气质有较显著提升，在降低卷烟烟气刺激性同时，余味较为干净，能够显著提升卷烟抽吸品质。由此可见，虽是亲缘菌种，但亲缘菌种Flavisolibacterswuensis.SR2-4-2用于野坝子发酵，其并不能取得如烟草黄色土源菌X7X类似效果。

表4野坝子烟用香料的感官评价

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

附序列表：

烟草黄色土源菌X7X的16S rDNA部分序列如下：

序列表

<110> 云南中烟工业有限责任公司

高莉 段焰青 夏建军 李文均 焦俊 杜刚 李先毅

<120> 一种野坝子烟用香料的制备方法和应用

<130> RIB180485

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1490

<212> DNA

<213> 烟草黄色土源菌(Flavisolibacter soli.X7X)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag gatgaacgct agcggcaggc ttaatacatg caagtcgagg 60

ggcagcgcag tgtagcaata catgggcggc gaccggcaaa cgggtgcgga acacgtacgc 120

aacctaccca aaactggggg atagcccacc gaaaggtgga ttaatacctc gtaacctcgt 180

gaagcggcat cgctttatga gtatagctcc ggcggttttg gatgggcgtg cgcctgatta 240

ggtagttggc ggggtaacgg cccaccaagc ctgcgatcag taactggtgt gagagcacga 300

ccagtcacac gggcactgag acacaggccc gactcctacg ggaggcagca gtaaggaata 360

ttggtcaatg gacgcaagtc tgaaccagcc atgccgcgtg agggatgaag gtcctctgga 420

ttgtaaactt cttttatctg ggacgaaacc ctcgttttct aacgggattg acggtaccag 480

aggaataagc accggctaac tccgtgccag cagccgcggt aatacggagg gtgcaagcgt 540

tatccggatt cactgggttt aaagggtgcg taggagggca gggaagtcag tggtgaaatc 600

tccgggctta actcggaaac tgccgttgat actctctgtc ttgaatcccg tggaggtgag 660

cggaatatgt catgtagcgg tgaaatgctt agatatgaca tagaacacca attgcgaagg 720

cagctcgcta cacgaagatt gactctgagg cacgaaagcg tggggatcaa acaggattag 780

ataccctggt agtccacgcc ctaaacgatg gatactcgac atacgcgata cactgtgtgt 840

gtctgagcga aagcattaag tatcccacct gggaagtacg accgcarggt tgaaactcaa 900

aggaattggc gggggtccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga tgatacgcga 960

ggaaccttac ctgggctaga atgctggttg accgtgggtg aaagctcact ttgtagcaat 1020

acacaaccag taaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gccgtgaggt gttgggttaa 1080

gtcccgcaac gagcgcaacc cccatcagta gttgccatca ggtaacgctg ggaactctac 1140

tgaaactgcc gtcgtaagac gcgaggaagg aggggatgat gtcaagtcat catggccttt 1200

atgcccaggg ctacacacgt gctacaatgg ggcgtacaaa gggctgccac ttagcgataa 1260

ggagccaatc ccaaaaaacg cctctcagtt cagatcgcag tctgcaactc gactgcgtga 1320

agctggaatc gctagtaatc gtatatcagc aatgatacgg tgaatacgtt cccggacctt 1380

gcacacaccg cccgtcaagc catggaagct gggtgtacct aaagtcggta accgcaagga 1440

gccgcctagg gtaaaactag taactggggc taagtcgtaa caaggtaacc 1490

Claims (7)

1.一种野坝子烟用香料，其特征在于，其通过包括以下步骤的方法制备：

(1)烟草黄色土源菌X7X菌剂的制备；

(2)利用烟草黄色土源菌X7X菌剂对野坝子粉末进行发酵，得到发酵野坝子粉末；

(3)将发酵野坝子粉利用乙醇浸提，经过滤浓缩得到野坝子浓缩浸提液；

(4)野坝子浓缩浸提液经大孔树脂精提，得野坝子烟用香料。

2.根据权利要求1所述的野坝子烟用香料，其特征在于，步骤(1)具体包括：将烟草黄色土源菌X7X液体菌种按10％的接种量接种到发酵培养基中，30℃震荡培养7天，得到培养液；培养液离心分离，用无菌水洗涤沉淀，最后用无菌水震荡均匀，稀释10倍即得菌剂。

3.根据权利要求1所述的野坝子烟用香料，其特征在于，步骤(2)具体包括：将干燥的野坝子植株粉碎成粒径30～100目的粉末，平衡水分至10％～13％，每100g野坝子粉中喷施烟草黄色土源菌X7X菌剂20mL，混匀，将处理好的野坝子粉置于22℃，60％的恒温恒湿箱中发酵24～72h，得到发酵野坝子粉。

4.根据权利要求1所述的野坝子烟用香料，其特征在于，步骤(3)具体包括如下步骤：

1)浸提：将所得发酵野坝子粉置于121℃灭菌锅中灭菌20～30min后，加入发酵野坝子粉末质量10～25倍的95％浓度乙醇，浸泡提取24～48h；

2)过滤：步骤1)所得野坝子浸提液进行抽滤，过滤孔径目数为200～300目；

3)浓缩：收集步骤2)抽滤所得清液，在45～65℃、60～90kPa条件下浓缩至体积不再变化，得到野坝子浓缩浸提液。

5.根据权利要求1所述的野坝子烟用香料，其特征在于，步骤(4)具体包括如下步骤：

1)吸附：将4～8倍于野坝子浓缩浸提液质量的D101大孔吸附树脂，用95％乙醇浸泡24h后，装入层析柱中，用蒸馏水洗脱至流出液无色无味后，将所得野坝子浓缩浸提液上样吸附于层析柱顶端；

2)洗脱：依次用3倍大孔树脂柱体积的水、25～35％乙醇溶液、75～85％乙醇溶液、95％乙醇溶液将大孔树脂层析柱进行梯度洗脱，收集75～85％的乙醇洗脱液；

3)浓缩：将收集的75～85％乙醇洗脱液，在45～65℃、60～90kPa条件下浓缩至密度为1.0～1.5g/cm³的野坝子浓缩精提液，即为野坝子烟用香料。

6.一种含野坝子烟用香料的卷烟，其特征在于，其包含权利要求1-5任意所述的野坝子烟用香料。

7.根据权利要求6所述的含野坝子烟用香料的卷烟，其特征在于，卷烟中野坝子烟用香料的用量为烟丝质量的0.2～0.5％，其是通过用丙二醇或乙醇稀释3～5倍质量后，以喷雾的方式喷洒到卷烟烟丝上制得。