WO2003094639A1 - Micro-organisme reduisant la teneur en nitrosamine et procede de reduction de teneur en nitrosamine au moyen de ce micro-organisme - Google Patents

Micro-organisme reduisant la teneur en nitrosamine et procede de reduction de teneur en nitrosamine au moyen de ce micro-organisme Download PDF

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Kazuharu Koga
Satoshi Katsuya
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Japan Tobacco Inc.
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    • C12R2001/38—Pseudomonas
    • C12R2001/39—Pseudomonas fluorescens

Definitions

  • the present invention relates to a microorganism that degrades nitrosoamine produced during drying and storage of harvested tobacco, and a two-trough produced during drying and storage of tobacco using the microorganism. Regarding how to reduce the amount of software.
  • Nitrosoamin tobacco Specific Nitrosamine; hereinafter referred to as SNA
  • SNA tobacco Specific Nitrosamine
  • N'-2 torosono-norrenicotin (hereinafter referred to as N'-2
  • NNKJ N-Nitrosomethylamino-1-(3—Pyryl) -1 1-butanone
  • ⁇ ⁇ ⁇ Nitroso Anatabin
  • ⁇ ⁇ ⁇ Nitroso Anabasin
  • Conventionally known methods for reducing the TSNA content in leaf tobacco include (1) a method for suppressing the production of TSNA, (2) There is a method for removing the generated TSNA.
  • Methods of suppressing TSNA production include, for example, a method of reducing the content of alkaloids in leaf tobacco by reducing nitrogen fertilizer, and an interheating method instead of the direct heating method.
  • a method of reducing the content of alkaloids in leaf tobacco by reducing nitrogen fertilizer and an interheating method instead of the direct heating method.
  • the method of removing the produced TSNA from leaf tobacco is less common than the method of suppressing the production of TSNA.
  • a method of removing TSNA from leaf tobacco by supercritical extraction ( WO 01 Z 6 595 4) is known. Nevertheless, this method has not been commercialized in terms of cost.
  • a raw material of tobacco cigarette
  • it maintains a taste suitable for consumption and has a low TSNA content Things are required.
  • the present invention provides a method for reducing the content of TSNA generated during drying and storage among the currently performed drying and storage forms.
  • aspergillus microorganisms which are filamentous fungi isolated from soy sauce mash, have been known to degrade nitrosoamine (Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-276666). No. 1), but the microorganisms of the genus Aspergillus require high moisture for survival and may adversely affect the quality of tobacco leaves, especially the flavor, and are used in the treatment of leaf tobacco. Problems have been pointed out in this regard.
  • the present invention belongs to the species Sphingomonas pacisvivirus and Pseudomonas fluorescens and has the ability to reduce TSNA against leaf tobacco.
  • the present invention provides a method for reducing the TSNA content of leaf tobacco, characterized by treating a microorganism selected from the group consisting of microorganisms.
  • the Sphingomonas.Pasismovirus LG5 strain and the Pseudomonasfluoresceens LG38 strain strain against leaf tobacco are used.
  • a method for reducing the TSNA content of leaf tobacco characterized by treating a microorganism selected from the group consisting of:
  • Sphingomonas n. ⁇ '-Nitrosonor which belongs to Simobilis or Pseudomonas hunoreolessensus and is formed during drying and storage of leaf tobacco Nicotin, 4 _ ( ⁇ '-Nitrosomethinorea Mino) 1 1-(31 pyridyl) _ 1-Butanone), ⁇ '—-Toroso anatabin And at least one component selected from the group consisting of N′-nitrosanabacine and N′-tolosoanabacine is provided.
  • a Sphingomonas pasimobilis LG5 strain (FERMBP-7780) which reduces the TSNA content in leaf tobacco.
  • a Pseudomonas humoreo resuscens LG38 strain which reduces the TSNA content in leaf tobacco is provided.
  • the present inventors have conducted intensive studies and elucidated the TSNA generation process during tobacco drying and storage, and found that microorganisms existing on the tobacco surface include microorganisms that degrade TSNA. And completed the invention.
  • the present inventors isolated microorganisms that decompose the produced TSNA from microorganisms present on the surface of leaf tobacco. Furthermore, by treating the microorganism on // the tobacco during drying and / or the tobacco that has been dried and is to be stored, the content of TSNA in the tobacco can be reduced. Was found.
  • Sphingomonas pasimohiris SD II ingomonaspaucimobi 1
  • LG5 Sphingomonas' Nossimobilis strains
  • LG38 The Pseudomonas fluorescens strain was named LG38 (hereinafter "LG38” or "LG38 strain”).
  • LG 5 has accession number FERMBP — 783 0 and LG 3 8 has accession number FERMBP — 783 1 Independent Research Institute of Industrial Technology on February 18, 2008 Deposited at the Patent Organism Depositary Center (Tsukuba-Higashi 1-1-1, Chuo No. 6 Ibaraki, Japan).
  • microorganisms do not adversely affect the quality of leaf tobacco during drying and / or storage, and have the effect of reducing TSNA.
  • the method according to the present invention can treat and achieve microorganisms without any modification of the current leaf tobacco drying method, so that the quality and quality of the current leaf tobacco can be improved. It can maintain the taste.
  • LG5 has an activity of specifically degrading NNK among the components of TSNA.
  • LG 38 has the activity of decomposing the main components NNN, NNK, NAT and NAB.
  • the leaf tobacco to be treated according to the present invention may be of any variety as long as it is subjected to a normal drying operation, and more specifically, naturally cultivated varieties of Barre and native varieties. , Equipment drying The yellow species that can be used can be given. However, the present invention is not limited to this.
  • the microorganism may be treated according to the present invention at any time between the time immediately before TSNA is produced in the tobacco and the time when it is processed into cigarettes.
  • the period is preferred.
  • the treatment during the storage period may be performed at any time during the storage period, but is preferably performed at the start of storage after drying. Basically, the practitioner can arbitrarily select from the start of drying to the storage period.
  • the treatment of microorganisms performed according to the present invention is not limited to one time, and may be performed continuously at regular intervals during the period.
  • the treatment of the present invention is not limited to the treatment during drying, Z treatment, or storage, but may be carried out in the course of commercialization.
  • the treatment according to the present invention may be carried out by any method known per se, such as spraying of a liquid in which microorganisms are suspended, application of powder containing microbial cells, and the like. An appropriate method may be selected. Alternatively, leaf tobacco may be immersed in a liquid containing microorganisms.
  • microorganisms that are preferably used in the present invention include: LG 5 strain and LG 38 strain.
  • the present invention is not limited to these strains, and is not limited to these strains, but includes Sphingomonas' N. simimobilis species and Pseudomonas fluorescens. Any microorganism belonging to the strain species and having the ability to reduce TSNA is within the scope of the present invention.
  • reducing refers to reducing the content of TSNA in tobacco leaves, for example, by removing TSNA components produced during drying and storage of tobacco leaves. It only needs to be decomposed
  • various known media for culturing microorganisms can be used.
  • the culturing conditions for culturing the microorganism used in the present invention are not particularly limited as long as the temperature S S is in the range of 25 to 35 ° C. and the pH is in the range of 6.0 to 8.0.
  • the temperature ranges from 28 to 32 ° C, and the pH range is around 7.0.
  • the microorganism of the present invention After culturing the microorganism of the present invention for a certain period of time, the microorganism is collected by centrifugation.
  • the collected cells may be used by suspending them in a buffer solution, or may be used in the form of a powder by freeze-drying or the like.
  • a bacterial solution is prepared by suspending the collected cells in a specific buffer, for example, sterilized distilled water and phosphate buffer can be used as the buffer.
  • leaf tobacco treatment may be performed using the cells obtained as described above.
  • Sterile distilled water is added to the bacterial solution containing the required amount of bacteria to prepare an inoculum, and the inoculum is sprayed evenly on leaf tobacco.
  • This treatment is possible at any time, from drying to storage.
  • the treatment should be carried out during the entire drying period and after the end of drying, and in the case of equipment dried seeds, the treatment should be carried out during the initial yellowing stage of drying and after the drying.
  • treatment during the yellowing phase during the drying process and, in the case of natural drying, during the browning phase are preferred.
  • the spraying rate is 2 to 1 Oml immediately after harvesting and in the early stage of drying, and 0.5 to 3 ml after the middle stage of drying.
  • the number of treatments may be at least once during the drying and / or storage period, and it is preferable to perform the treatment two to three times at intervals during the drying and / or storage period.
  • Example 1 Isolation of microorganisms from tobacco leaf surface
  • Microorganisms were collected from the tapaco leaves of the tobacco field in Oyama City, Tochigi Prefecture from the time of harvest to the time of drying. Bacteria were collected three times immediately after harvesting the tobacco leaves, 3 days after drying (ie, yellowing was completed) and 8 days (ie, browning was completed).
  • the obtained suspension was used as a harvest suspension containing microorganisms from leaf tobacco at the time of harvest.
  • microorganisms are collected from the tobacco leaves using the leaf tobacco during the drying of the harvested leaf tobacco described above. I went in the same way as when harvesting tobacco. In other words, after harvesting the true leaves of the above-mentioned harvested Michiniku No. 1 into a pipe house, a part of the leaf meat part of the leaf octopus three and eight days old was cut off and used as a sample. . The obtained sample was chopped into 5 mm squares, and about 1 Og thereof was collected on a 300 ml triangular flask. 200 ml of 1 OmM phosphate buffer (pH: 7.0) was added, and this was ground with a homogenizer. The resulting suspension was used as a dry suspension containing microorganisms from leaf tobacco during the drying period.
  • 1 OmM phosphate buffer pH: 7.0
  • the harvest time suspension and drying phase suspension, respectively, the concentration of microorganisms Ru can be separated was diluted with the above and similar-phosphate buffer.
  • Transfer the diluted solution to a YG agar plate Medium composition is Ri following passage;.... 1 O g of yeast extract, 1 O g of glucose, 0 3 g of K 2 HP 0 4, 0 2 g of KH 2 PO 4, 0. 2 g of M g S 0 4 * 7 H 2 0, 1 5.
  • 0 g of agar is prepared in 1 0 0 0 ml with distilled water. p H 6. 8) to zero. dropped by 1 m 1
  • the cells were cultured at 30 ° C for 7 days. After culturing, the grown colonies were separated into single colonies using a new YG agar plate medium. The isolated microorganism was stored at 180 ° C until use.
  • Example 1 Of the leaf-derived strains isolated in Example 1 above, a total of 14 strains isolated from the tobacco leaves of the harvest season and 37 strains isolated from the tobacco leaves during the dry season 51 are candidates for primary selection The strain was selected.
  • a medium for selecting TSNA-degrading microorganisms was examined. Using the strains selected in Example 1 above, the medium containing each component of TSNA (NNN, NNK :, NAT and NAB) was examined for the growth of the strains. The best results were obtained when the basal medium was used. Therefore, 1/10 TS liquid medium was used as a basal medium for the subsequent culture. The composition of the 1/10 TS liquid medium is shown below first, followed by the 1Z10 TS liquid medium used for culture and the microbes. Describe the composition of the medium containing
  • the above selection medium was prepared by the following method. Dichloromethane solution containing 100 ppm of NNN, NAT, NAB, and NNK was added to triangle flasks in a quantity of 1,501, respectively, to completely evaporate dichloromethane. . Next, a 10-TS TS liquid medium was added, and the concentrations of NNN, NAT, NAB and NNK were adjusted to 5 ppm / 10 ml each. After dissolving NNN, NAT, NAB and NNK, 30 ml was dispensed into 50 ml triangular flasks.
  • Each of the primary selection candidate strains was shake-cultured in 1Z10TS liquid medium, and then collected by centrifugation. After washing each cell twice with sterile distilled water, the cells were suspended again in sterile distilled water. Next, bacteria concentration force S i 0 8 ⁇ 1 0 1 C) cfu / m 1 and Ni Let 's Do that, to prepare the suspension with sterile distilled water.
  • the obtained microbial suspension was mixed with 5 to 10 bacterial strains for each origin to prepare 7 groups of selection suspensions.
  • the TZNA-degrading bacteria selection medium was prepared by the same method as in Example 1 above, except that the above-mentioned 1Z1OTS liquid medium was used and the above-mentioned 7 groups of microorganism suspensions were used.
  • the microbial suspension mixed treatment and control of these 7 groups were subjected to shaking culture at 30 ° C for 24 hours.
  • TSNA components were quantified by the following method. That is, NNN, NAT, TAB and NNK contained in the samples obtained from each medium were analyzed by gas chromatography according to the improved Spiege 1 ha 1 der method.
  • Spiegelhalder B. Kubacki S. and Fischer S. (19989) Beitr. Tabakforsch. Int., 14 (3), 1 3 5-1 4 3, Fisher S. and S piegelhalder B. (1 9 8 9) Beitr. Tabakforsh. Int., 1 4 (3), 1 4 5-1
  • each medium was purified using column chromatography as follows. First, all media were filtered using filter paper (ADVANTEC, No. 5C). 10 ml of each filtrate was added to a column filled with kieselguhr (particle size: 60-160 mm, MERCK) and ascorbic acid. The required fractions were phase-dissolved using dichloromethane and collected. This was used as a sample for gas chromatography. The obtained sample was analyzed using a gas chromatograph HP 6890 (H) equipped with a column DB-17 (J & W) and a detector TEA-543 (Thermedics). ewlett Packard).
  • Table 1 shows the results of quantification of the TSNA components in the 7 groups treated and the control section.
  • groups 1 and 2 are mixed suspensions of bacterial strains collected from the surface of leaf tobacco immediately after harvesting
  • groups 3, 4, and 5 are groups of yellowing in the early drying stage (from the surface of leaf tobacco on day 3).
  • Collected strains) and Groups 6 and 7 are mixed treatments from the browning period (strains collected from the surface of leaf tobacco on day 8).
  • The% in the table indicates the content percentage of each TSNA component in each treatment group when the control group is 100%.
  • the TSNA content of each of the mixed microorganism treatment groups decreased as compared with the TSNA content of the control group.
  • groups 1 and 2 decreased to 47.87% and 64.95%, respectively, as compared to the control group (Table 1). .
  • Each of the microbial suspensions mixed with the TS liquid medium was prepared using the same method as described in Example 2 above, except that the number of microorganisms contained in the microbial suspension was 1 strain collected in Example 1 above. The resolution of each component of TSNA of the strain was investigated.
  • Table 2 shows the obtained results. 0 strokes ⁇ j 3 ⁇ 4s2.STl
  • LG2, LG5 and LG77 strains have the ability to specifically degrade NNK among TSNA components, and in particular, LG5 strain has the ability to reduce the NNK content to 3.24%.
  • Tables 3 and 4 show the bacteriological properties of the LG 5 and LG 38 strains selected above.
  • Table 3 Bacteriological properties of the G5 strain Test item Property Form Bacillus Gram stain-spore-motility + attitude toward oxygen aerobic oxidase + catalase +
  • LG5 was deposited at the Patent Organism Depositary Center and deposited on February 18, 2001 (accession number: FERMBP-7830).
  • LG38 was deposited at the Patent Organism Depositary and deposited on February 18, 2001 (accession number: FERMBP—7831).
  • Example 2 Reduction of TSNA content during drying period by LG38 strain
  • the LG38 strain was inoculated into a 1 / 10TS liquid medium, and cultured at 30 ° C for 72 hours. After the culture, the medium containing the cells was centrifuged at 5,000 rpm to separate and accumulate the cells. After washing the cells twice with sterile distilled water, they were suspended again in sterile distilled water. The cell concentration of the suspension was diluted with sterile distilled water, and adjusted to lOSlOiOcfu / m1.
  • the suspension adjusted to the required number of bacteria, was applied to leaf tobacco of the varieties (Kitakami No. 1) harvested and dried.
  • the treatment is performed on the front and back of the leaves so that the thickness of the leaves is 10 m1 per harvest, three times immediately after harvesting, three times after harvesting, and eight days after harvesting. Spraying was performed using a sprayer.
  • Drying of tobacco leaves was performed using a pipe house. Drying 1 The treated leaves were collected on day 0 and day 21. The collected leaf tobacco was separated into mesophyll (lamina) and midbone (stem), and these were crushed using a mixer. Mesophyll was used for the determination of TSNA content.
  • TSNA4 components NNN, NNK, NAT, and NAB
  • TSN A The total amount of TSN A was shown by the sum of the four components (NNN, NNK :, NAT, and NAB). Table 5 shows the results. Table 5 Total content of each component of SNA (jt / g Zg)
  • the water treatment plots in Table 5 are those treated with only a buffer solution containing no cells at the time of treatment.
  • LG 3 8 strains 0.7 .1 1 .2 0
  • the content of nitrite nitrogen, the causative substance of TSNA formation was significantly reduced in the water treatment area on the 10th day of drying
  • the content of nitrite nitrogen in the LG38 strain was lower than that of the untreated plot, albeit slightly.
  • the LG38 strain was identified as a strain capable of reducing nitrate based on its bacteriological properties.However, based on the above results, it was possible to reduce the reduction of nitrate nitrogen to nitrite nitrogen in the untreated plot. It was suggested that it was suppressed
  • NNK content was quantified in the same manner as in Example 2, except that the microorganism used in Method 5 of Example 2 was replaced by LG5.
  • NNK content (/ Li g Z g)
  • the NNK content increased in the untreated group up to 21 days, but on the 32nd day (at the end of drying), the NNK content increased. Has also been reduced.
  • Both the water treatment section and the LG 5 strain section showed a high content up to the 21st day.
  • the content was lower than that on the 21st day.
  • the content of the LG 5 strain on the 32nd day was slightly lower than that of the untreated group.
  • Example 4 Effect of TSNA-decomposing bacteria treatment on TSNA content in leaf tobacco powder
  • 1/10 TS liquid medium was inoculated with LG5 strain and LG38 strain, respectively, and cultured at 30 ° C for 72 hours.The medium containing these cells was then incubated at 5,000 rpm. The cells were collected by centrifugation. The cells were washed twice with sterile distilled water and then suspended again in sterile distilled water. The microorganism suspension was adjusted cell concentration to 1 0 8 ⁇ 1 0 9 cfu Z ml was inoculum.
  • Tables 8 and 9 show the TSNA content before treatment and 4 weeks after standing.
  • the LG5 strain specifically degraded NNK among the four components of TSNA, and the LG38 strain degraded all four components of TSNA.
  • the NNK content of the mixed leaf powder treated with the LG5 strain after 4 weeks was lower than before treatment.
  • both components decreased in both treatments.
  • the LG5 strain degraded NNK and the LG38 strain degraded NNN and NAT as in the previous experiment.
  • Example 5 Effect of TSNA-decomposing bacteria treatment on TSNA content in stored leaf tobacco
  • the LG38 strain was inoculated into lZOTS liquid medium and cultured at 30 ° C for 72 hours. After the culture, the medium containing the cells was centrifuged at 5,000 rpm to collect the cells. The cells were washed twice with sterile distilled water and then suspended again in sterile distilled water. The microorganism suspension was adjusted cell concentration to 1 0 8 ⁇ 1 0 9 cfu / m 1 was inoculum.
  • a leaf tobacco (a mid-bone dry end, dry day 29, cultivar: Kitakami No. 1), a type of barley being dried in a pipe house. Processed using a sprayer. The treated leaf tobacco was dried in a pipe house for 3 days and then subjected to a storage test.
  • Analytical Sample Collection Before storage, the tobacco leaf-leaved half-leaf leaf medicament was removed from the pipe house and used as a pre-treatment sample. The remaining half-leaved mesophytes with midbone were stored. Storage was performed under constant temperature and humidity conditions. As storage conditions, three sections were set: 70% humidity at 20 ° C, 80% humidity at 20 ° C, and 80% humidity at 30 ° C. Sampling was performed one month and three months after storage. Dried leaves stored under the same conditions as above without treatment of microorganisms were used as control. After separating the collected leaf tobacco into mesophyll and midbone, the freeze-dried mesophyll sample was crushed using a mixer. Only mesophyll samples were used to determine TSNA content.
  • the boost was increased at 20 ° C, 70% and 30 ° C, 70%.
  • the temperature significantly increased at 30 ° C, 70% and 30 ° C, 80% after 3 months.
  • the LG 38 treated group there was a tendency to decrease after 1 month and 3 months. In particular, it decreased significantly after one month of storage.

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Description

明 細 書
二 ト 口 ソァ ミ ンを低減する微生物および該微生物を利用 した 二 ト ロ ソア ミ ンを低減する方法
技術分野
本発明は、 収穫 した葉タバコ の乾燥中および貯蔵中に生成 されるニ ト ロ ソ ァ ミ ンを分解する微生物と 、 該微生物を利用 した葉タバコ乾燥およびノまたは貯蔵中に生成する二 ト ロ ソ ァ ミ ンの低減方法に関する.。
背景技術
葉タ ノくコ に含まれる ニ ト ロ ソァ ミ ン （ T o b a c c o S p e c i f i c N i t r o s a m i n e ; 以 、 S N A と記す） は、 収穫直後の葉タバコ （即ち、 緑の生葉） には存 在 しないが、 乾燥期間 とその後の貯蔵期間中に、 葉タバコ 中 のアル力 ロ イ ドと 亜硝酸態窒素の反応によ って生成される。 こ の亜硝酸は、 葉タバコ表面に生存する硝酸還元能を有する 微生物によ り 生成される。
また、 こ の乾燥およびその後の貯蔵過程において生成され る T S N Aの主成分は、 N '—二 ト ロ ソ ノ ノレニ コ チン （以下
「 N N N J と い う ） 、 4 — ( Ν '—ニ ト ロ ソ メ チルァ ミ ノ ） - 1 - ( 3 — ピ リ ジル） 一 1 —ブタ ノ ン） （以下 「 N N K J と い う ） 、 Ν '—ニ ト ロ ソ アナタ ビ ン （以下 「 Ν Α Τ 」 と い う ） お よび Ν '— ニ ト ロ ソ アナバシ ン （以下 「 Ν Α Β 」 と い う ） 等である。
葉タバコ 中の T S N A含量を低減する方法と して従来から 知 られる方法には （ 1 ) T S N A の生成を抑制する方法、 ( 2 ) 生成 された T S N Aを除去する方法がある。
T S N Aの生成を抑制する方法 と しては、 例えば、 窒素肥 料を低減する こ と に よ って葉タバコ 中のアルカ ロ イ ド含有量 を低く する方法、 直熱方式に換えて間熱方式の乾燥機を用い る こ と に よ っ て乾燥中 に生成する T S N A を低減する方法
(これは主に黄色種に用レ、 られる） 、 アル力 ロ イ ド含量の低 い品種を開発する な どの育種技術の向上に よ り 得られる方法 な どがある。
また最近では、 マイ ク ロ波を照射して葉タバコ を乾燥する こ と によ り 、 T S N Aの生成を抑制する方法も報告されてい る （特表 2 0 0 1 — 5 0 3 2 4 7 ) 。 し力 し、 マイ ク ロ波処 理の よ う な急激な脱水 · 乾燥を行 う と 、 本来乾燥中に生ずる 内容成分の変化が充分に行われないこ と にな り 、 従来の方法 で乾燥した ものよ り 、 急乾に仕上が り 、 喫味に問題が残って しま う 。
一方、 生成された T S N Aを葉タバコ から除去する方法は、 T S N Aの生成を抑制する方法に比べてその例は少な く 、 例 えば、 超臨界抽出に よ って葉タバコ から T S N Aを除去する 方法 （W O 0 1 Z 6 5 9 5 4 ) が知 られている。 し力 しなが ら、 この方法はコ ス ト の面から実用化には至っていない。
以上の状況か ら、 葉タバコの乾燥および貯蔵中に生成する と認識されている T S N Aの含量を低減する こ と が望まれて いる。
併せて、 たばこ （シガレ ッ ト） の原料である葉タバコ と し て消費に適 した喫味を維持 した もので T S N A含量の少ない ものが求め られている。
従って、 本発明は、 現在行われている乾燥および貯蔵形態 の中において、 乾燥および貯蔵中に生成 した T S N Aの含量 を低減する方法を提供する ものである。
また、 従来、 ニ ト ロ ソァ ミ ンを分解する もの と して、 醤油 も ろみ中か ら分離 した糸状菌である ァスペルギルス属微生物 が知 られている （特開平 1 0 — 2 7 6 6 8 1 号） が、 ァ スぺ ルギルス属微生物は生存に高水分を必要とする こ と 、 そ して 葉タ バ コ の品質、 特に香喫味に悪影響を及ぼす恐れがあ り 、 葉たばこの処理に用いる こ と については問題が指摘されてい る。
発明の開示
本発明の第 1 の態様に従 う と 、 葉タバコ に対 して、 ス フィ ン ゴモナス · パゥシモ ビ リ ス種およびシユー ドモナス · フル ォレ ツ セ ンス種に属 し、 T S N Aを低減する能力を有する微 生物からなる群よ り 選択される微生物を処理する こ と を特徴 する葉タ バ コ の T S N A含量を低減する方法が提供される。
本発明の第 2 の態様に従 う と 、 葉タバコ に対 して、 ス フィ ン ゴモナス . パゥシモ ビ リ ス L G 5 菌株お よ ぴシユ ー ドモナ ス · フルォ レ ツ セ ンス L G 3 8 菌株カゝ らなる群よ り 選択され る微生物を処理する こ と を特徴する葉タバコ の T S N A含量 を低減する方法が提供される。
本発明の第 3 の態様に従 う と 、 ス フ イ ン ゴモナス ■ ノ、。 ゥシ モ ビ リ スま たはシユ ー ドモナス · フノレオ レ ツ セ ンス に属 し、 葉タバ コの乾燥お よ び貯蔵中 に生成する Ν '— 二 ト ロ ソ ノ ル ニ コ チ ン、 4 _ ( Ν '— ニ ト ロ ソ メ チノレア ミ ノ ） 一 1 — ( 3 一 ピ リ ジル） _ 1 — ブ タ ノ ン） 、 Ν '— - ト ロ ソ アナ タ ビ ン および N '—二 ト ロ ソアナバシンか らなる群よ り 選択される 少なく と も 1 成分の葉タバコ中の含量を低減する能力を有す る微生物が提供される。
本発明の第 4 の発明に従 う と、 葉タバコ 中の T S N A含量 を低減する ス フ イ ン ゴモナス · パゥシモ ビ リ ス L G 5 菌株 ( F E R M B P — 7 8 3 0 ) が提供される。
本発明の第 5 の発明に従 う と、 葉タバコ 中の T S N A含量 を低減する シユー ドモナス · フノレオ レ ツセ ンス L G 3 8 菌株
( F E R M B P — 7 8 3 1 ) が提供される。
発明を実施するための最良の形態
本発明者らは、 鋭意研究の結果、 葉タバコ乾燥中および貯 蔵中における T S N Aの生成過程を解明 している中において、 葉タバコ表面に存在する微生物に T S N Aを分解する微生物 が存在する こ と を見いだし、 発明を完成した。
本発明者は、 乾燥中の葉タバコ における T S N Aの生成過 程を解明する過程において、 葉タバコ表面に存する微生物か ら、 生成 した T S N Aを分解する微生物を分離した。 更に、 乾燥中の葉タバコおよび //または乾燥が終了 し貯蔵に供され る葉タバコ に対 して該微生物を処理する こ と によって、 葉た ばこ中の T S N Aの含量を低減でき る こ と を見い出 した。
それらの微生物の う ち特に活性の高い 2種類の微生物が、 その菌学的性質から、 それぞれス フ イ ン ゴモナス · パゥ シモ ヒ リ ス ( S D II i n g o m o n a s p a u c i m o b i 1 i s ) 、 お よ びシユ ー ドモナス人 フルォ レ ツ セ ンス （ P s e u d o m o n a s i l u o r e s c e n s ) に属する微生 物 と 同定された。 こ れ ら の微生物について、 本発明者らは、 ス フ イ ン ゴモナス ' ノ ゥ シモ ビ リ ス菌株を L G 5 (以下 「 L G 5 」 ま たは 「 L G 5 菌株」 と レ、 う ） と 、 シユ ー ドモナス ' フルォ レ ツセ ンス菌株を L G 3 8 (以下 「 L G 3 8 」 または 「 L G 3 8 菌株」 と レ、 う ） と命名 した。 L G 5 は受託番号 F E R M B P — 7 8 3 0 と して、 L G 3 8 は受託番号 F E R M B P — 7 8 3 1 と して 2 0 0 1 年 1 2 月 1 8 日 に独立行 政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託セ ン タ ー （ 日本国 茨城県つ く ば巿東 1 丁 目 1 番地 1 中央第 6 ) に寄託された。
これらの微生物は乾燥および または貯蔵中の葉タバコ品 質に悪影響を及ぼさ ない も のであ り 、 且つ T S N Aを低減す る効能を有する ものである。
さ ら に、 本発明に従 う 方法は、 現在の葉タバ コ乾燥法を何 ら変更する こ と な く 、 微生物を処理し達成でき る ものである こ と から、 現行の葉タバコの品質および喫味を維持でき る も のである。
これらの菌株の活性は、 次の通 り である。
L G 5 は、 T S N Aの成分 う ち、 N N Kを特異的に分解す る活性を有する。 また、 L G 3 8 は、 主な成分である N N N、 N N K , N A Tおよび N A B を分解する活性を有してレ、る。 本発明に従って処理される葉タバコ は、 通常の乾燥操作を 行 う も のであれば何れの品種であって も よ く 、 具体的には 自 然乾燥される 品種であるバー レ一種および在来種、 装置乾燥 される黄色種をあげる こ と ができ る。 し力 しなが ら、 これに 限定される ものではない。
本発明に従 う 微生物を処理する時期は、 葉たばこ 中に T S N Aが生成される直前から シガ レ ッ ト に加工される までの間 であればいつでも よいが、 葉タバコの乾燥期間および/また は貯蔵期間が好ま しい。 特に乾燥での処理する 時期 と しては、 T S N Aの生成する時期以前である乾燥過程での収穫直後か ら黄変期および褐変期に処理するのが好ま しいが、 乾燥過程 中であれば何れの時期も可能である。 貯蔵期間での処理は、 貯蔵期間中であればいつでも よいが、 乾燥後の貯蔵開始時に 処理するのが好ま しい。 基本的には、 実施者が、 乾燥開始時 から貯蔵期間中において任意に選択する こ と ができ る。
また、 収穫直前にほ場で処理後、 収穫 し、 乾燥に供する こ と でも可能である。
また、 本発明に従って行われる微生物の処理は、 1 回に限 る ものではな く 、 期間中一定期間 ごと に連続的に行っても よ レヽ
なお、 本発明の処理は、 乾燥 よび Zまたは貯蔵中の処理 に限る ものではな く 、 製品化の過程において処理を行 う こ と も可能である。
本発明に従 う 処理と は、 微生物を懸濁 した液の噴霧、 微生 物の菌体を含む粉末の塗布等、 それ自 体公知の何れの方法に よって行って も よ く 、 実施者が適宜な方法を選択 してよい。 また、 微生物を含む液体に葉タバコ を浸漬 しても よい。
上述 した と お り 、 本発明に好ま し く 使用 される微生物は、 L G 5 菌株および L G 3 8 菌株である。 しカゝしな力 S ら、 本発 明はこれらの菌株に限定される ものではな く 、 ス フ ィ ン ゴモ ナス ' ノ ゥ シモ ビ リ ス種およ びシユー ドモナス . フルォ レ ツ セ ンス種に属 し、 T S N Aを低減する能力を有する微生物で あれば本発明の範疇である。
こ こで使用 される 「低減」 する と は、 葉タバコ 中の T S N Aの含量を低減する こ と を意味 し、 た と えば、 葉タ バ コ の乾 燥および貯蔵中に生成した T S N A各成分を分解する も ので あればよい。
本発明に使用する微生物を培養する培地と しては、 微生物 培養用 と しての公知の各種培地を用いる こ と ができ る。
本発明に使用する微生物を培養する培養条件と しては、 温 度力 S 2 5 〜 3 5 °Cの範囲、 p Hが 6 . 0 〜 8 . 0 の範囲にあ ればよ く 、 好ま し く は温度が 2 8 〜 3 2 °C、 p H力 S 7 . 0 前 後範囲である。
本発明の微生物は、 一定期間培養 した後で、 これを遠心分 離する こ と によ り 集菌する。
集菌 した菌体は、 緩衝液に懸濁 して使用 して も よ く 、 凍結 乾燥等によ り 粉末状に して使用 しても よい。
集菌 した菌体を特定の緩衝液に懸濁 して菌液を作成する場合 には、 緩衝液と して例えば、 滅菌蒸留水および リ ン酸緩衝液 等を使用でき る。
本菌体を緩衝液に懸濁する割合と しては、 緩衝液 1 m 1 当 た り 、 1 0 7 〜 1 0 1 2個、 好ま し く は 1 0 8 〜 1 0 1 。個で ある。 そのよ う な濃度に菌体を懸濁 して用いる こ と が好ま し レヽ
本発明に従 う と 、 上記に よ り 得た菌体を用いて葉たばこの 処理を行えばよい。
必要な菌量を含有 した上記菌液に滅菌蒸留水を加えて接種 液を作成 し、 この接種液を葉タバコ に均一に噴霧する。 この 処理は、 乾燥から貯蔵の期間であれは どの時期でも可能であ る。 自然乾燥種の場合は、 乾燥期間全般および乾燥終了後の 貯蔵時期、 装置乾燥種の場合は、 乾燥初期の黄変期および乾 燥終了後の貯蔵時期に処理する。 好ま し く は、 乾燥過程にお ける黄変期 さ らに 自 然乾燥の場合には、 褐変期に処理するの がよい。
散布量は、 上記によ り 作成 した液量を葉タバ コ 1 枚あた り 、 収穫直後および乾燥初期では 2 〜 1 O m l 、 乾燥中期以降で は 0 . 5 〜 3 m l である。
処理回数は、 乾燥および/または貯蔵期間中に少な く と も 1 回であればよ く 、 乾燥および/または貯蔵期間中に間隔を おいて 2 〜 3 回処理する こ と が好ま しい。
本発明の態様に従 う と 、 当該微生物を処理する こ と以外、 乾燥条件の大き な変化はないので、 本来の味に影響を与える こ と な く T S N A含量を低減する こ と が可能である。
実施例
実施例 1
例 1 . 葉タバコ表面からの微生物の分離
栃木県小山市のタバコ畑の収穫時から乾燥期間中の葉タパ コから微生物を採取 した。 菌の採取は、 葉タ バ コ の収穫直後、 乾燥 3 日 目 （即ち、 黄 変終了） および 8 日 目 （即ち、 褐変終了）' の 3 回行った。
バー レ一種であるみちの く 1 号の本葉を収穫 し、 収穫 した 葉タ バ コ の葉肉部分の一部を切 り 取 り サンプルと した。 得ら れたサンプルを 5 mm 角に細断し、 その約 1 O g を 3 0 0 m 1 の三角 フ ラ ス コ に採取した。 2 0 O m l の 1 O mM リ ン酸 緩衝液 （ P H ： 7 . 0 ) を添加 し、 これをホモジナイ ザーで 粉砕 した。 得 られた懸濁液を、 収穫時の葉タ バ コ か ら の微生 物を含む収穫時懸濁液と した。
乾燥期間中 （即ち、 黄変終了 ： 乾燥 3 日 目 、 褐変終了 ： 乾 燥 8 日 目 ） の葉タ バ コ か ら の微生物採取は、 前記の収穫 した 葉タバコ の乾燥中の葉タバコ を用いて、 収穫時葉タバコ と 同 様に行った。 即ち、 前述の収穫されたみちの く 1 号の本葉を パイ プハ ウス につ り 込み後、 3 日 および 8 日 経過 した葉タ ノ コの葉肉部分の一部を切 り 取 り サンプルと した。 得られたサ ンプルを 5 mm 角 に細断し、 その約 1 O g を 3 0 0 m l の三 角 フ ラ ス コ に採取 した。 2 0 0 m 1 の 1 O mM リ ン酸緩衝液 ( p H ： 7 . 0 ) を添加 し、 これをホモジナイ ザーで粉砕し た。 得られた懸濁液を乾燥期間中の葉タバコからの微生物を 含む乾燥時懸濁液と した。
何れの時期に採取した葉タバコ についてのホモジナイ ザー によ る粉砕も、 サンプリ ングから 2 時間以内に行った。
収穫時懸濁液 と 乾燥期懸濁液を、 それぞれ、 微生物が分離 でき る濃度 （即ち、 1 0 2 〜 1 0 5倍） に上述 と 同様の リ ン 酸緩衝液を用いて希釈 した。 得られた希釈液を Y G寒天平板 培地 （組成は、 以下の通 り である ； 1 . O g の酵母エキス、 1 . O g の グルコ ース、 0 . 3 g の K 2 H P 0 4 、 0 . 2 g の K H 2 P O 4 、 0 . 2 g の M g S 0 4 * 7 H 2 0、 1 5 . 0 g の寒天、 蒸留水で 1 0 0 0 m l に調製する。 p H 6 . 8 ) に 0 . 1 m 1 ずつ滴下して塗抹 し、 これを 3 0 °Cで 7 日 間培 養 した。 培養後、 生育した コ ロ ニーを新しい Y G寒天平板培 地を用いて単一コ ロ ニーに分離 した。 分離された微生物は使 用時まで一 8 0 °Cで保存 した。
こ のよ う に して、 収穫時葉タバコからは 8 7 菌株、 褐変期 葉タバコから 1 7 6 菌株の微生物を分離した。 これらの分離 菌株から、 コ ロ ニー形態の異なる菌株を選択 して以後の実験 に用いた。
例 2 . T S N A分解微生物の一次選抜
上記例 1 で分離した葉面由来の菌株の う ち、 収穫期の葉タ バコ カゝら分離 した 1 4 菌株と 乾燥期葉タバコから分離した 3 7 菌株の合計 5 1 菌株を一次選抜の候補菌株と して選抜 した。
( 1 ) 培地の選択
T S N A分解微生物を選抜するための培地の検討を行った。 前記例 1 において選抜された菌株を用いて、 T S N Aの各 成分 （ N N N、 N N K：、 N A Tおよび N A B ) を含む培地に ついて、 菌株の増殖に関する検討を行った結果、 1 / 1 0 T S液体培地を基礎培地と した場合が最も良好な結果を得られ た。 従って、 以後の培養には、 1 / 1 0 T S 液体培地を基礎 培地と して用いた。 以下に、 まず 1 / 1 0 T S液体培地組成 を示 し、 続いて、 培養に用いた 1 Z 1 0 T S 液体培地と微生 物と を含む培地の組成を記載する。
[ 1 / 1 0 T S液体培地]
最終容量 蒸留水で 1 0 0 0 m l にする カゼイ ン 1 · 7 g
D— グル コ ース 0 . 2 5 g
N a C 1 0 . 5 g
K 2 H P O 4 2 . 5 g
1 / 1 0 T r y p t i c S o y ( D i f c o 社製 B a c t o T r y p t i c S o y B r o t h ; S o y b e a n — C a s e i n D i g e s t M e d i u m ) [ T S N A分解菌選抜用培地]
• 最終容量 3 5 m l
• 1 Z 1 0 T S 液体培地 （ N N N N A T , N A Bおよび N N Kを各々 5 p p m含有） 3 0 m l
• 接種用微生物懸濁液 5 m 1
上記の選抜用培地は次の方法に よ り 調製 した。 各 1 0 0 0 p p mの N N N、 N A T , N A B及び N N Kを含むジク ロ ロ メ タ ン溶解液を 1 5 0 1 ずつ三角 フ ラス コ に添加 し、 ジク ロ ロ メ タ ンを完全に揮発させた。 次に 1 ノ 1 0 T S 液体培地 を添カ卩 して、 N N N、 N A T , N A Bおよび N N Kの濃度を 各々 5 p p m / l 0 m l と なる よ う に調製 した。 N N N、 N A T、 N A B および N N Kを溶解 した後、 3 0 m l ずつ 5 0 m 1 の三角 フ ラ ス コ に分注した。 次に、 接種用微生物懸濁液 を 5 m 1 添加 して、 最終容量が 3 5 m 1 の選抜用培地を得た これらを 2 4 時間、 3 0 °Cで振と う 培養 した。 ( 2 ) T S N A分解微生物の一次選抜
上記で選抜された培地を用いて、 T S N A分解微生物の一 次選抜を行った。
一次選抜の候補菌株を、 それぞれ 1 Z 1 0 T S液体培地中 で振 と う 培養 し、 その後遠心集菌 した。 各菌体を滅菌蒸留水 で 2 回洗浄した後、 再度滅菌蒸留水に懸濁 した。 次に、 菌濃 度力 S i 0 8〜 1 0 1 C) c f u / m 1 と な る よ う に、 滅菌蒸留 水を用いて各懸濁液を調製した。
得 られた微生物懸濁液を、 由来毎に 5 〜 1 0 菌株ずつ混合 して 7 グループの選抜用懸濁液を調製 した。
T S N A分解菌選抜用培地には、 上記の 1 Z 1 O T S 液体 培地を用い、 前記 7 グループの微生物懸濁液を用いる以外は、 上記例 1 と 同様の方法によ って調製した。
コ ン ト ロールには微生物懸濁液に代えて滅菌蒸留水を 5 m 1 添カ卩 した。
これらの 7 グループの微生物懸濁混合処理区 と コ ン ト ロ ー ル区を 3 0 °Cで 2 4 時間の振と う 培養を行った。
その後、 T S N A各成分の含量を定量した。
T S N A各成分の定量は次の方法によ り 行っ た。 即ち、 そ れぞれの培地から得られた試料に含まれる N N N、 N A T、 T A Bおよび N N Kを、 改良 された S p i e g e 1 h a 1 d e r の方法に準 じたガス ク ロ マ ト グラ フ ィ によ って定量 した 、 S p i e g e l h a l d e r B . ， K u b a c k i S . a n d F i s c h e r S . ( 1 9 8 9 ) B e i t r . T a b a k f o r s c h . I n t . , 1 4 ( 3 ) , 1 3 5 - 1 4 3 , F i s h e r S . a n d S p i e g e l h a l d e r B . ( 1 9 8 9 ) B e i t r . T a b a k f o r s h . I n t . , 1 4 ( 3 ) , 1 4 5 - 1
5 3 ) 0
まず、 カ ラ ム ク ロ マ ト グラ フ ィ を用いて以下のよ う にそれ ぞれの培地を精製 した。 最初に、 ろ紙 （ A D V A N T E C、 N o . 5 C ) を用い全ての培地を濾過 した。 各濾液の 1 0 m 1 を、 キーゼルグール （粒径 6 0 — 1 6 0 m m、 M E R C K 社製） およびァ ス コルビ ン酸を充填 したカ ラ ムに添加 した。 ジク ロ ロ メ タ ンを用いて必要な画分を転溶 して分取 した。 こ れをガス ク ロ マ ト グラ フ ィ 用の試料と した。 得 られた試料に ついて、 カ ラ ム D B — 1 7 ( J &W社） 、 検出器 T E A— 5 4 3 ( T h e r m e d i c s 社） を装備 したガス ク ロマ ト グ ラ フ ィ H P 6 8 9 0 ( H e w l e t t P a c k a r d 社 製） を用いて分析 した。
上記の 7 グループの処理区 と コ ン ト ロ ーノレ区の T S N A各 成分含量の定量結果を表 1 に示す。
表 1 一次選抜結果 關 NAT NAB 隱 総 TSNA ゲル-フ'
g/10mL (%) g/10mL (%) //g/10mL (%) /10mL (%) jug/10mL
1 1 34 48 13 2 40 51 95 2 04 51 54 1 37 38 29 7 in 47 87
2 1.96 70.26 3.03 65.39 2.96 74.62 1.77 49.48 9.71 64.95
3 2.16 77.59 3.76 81.33 2.92 73.56 2.48 69.50 11.32 75.75
4 1.89 67.98 4.27 92.26 3.98 100.26 2.81 78.71 12.95 86.62
5 2.92 104.71 4.07 87.97 3.72 93.68 2.99 83.64 13.69 91.57
6 2.43 87.25 4.36 94.13 3.86 97.19 2.76 77.34 13.40 89.65
7 2.33 83.46 3.71 80.12 2.97 74.77 2.38 66.71 11.38 76.12 コントロ-ル
2.79 4.63 3.97 3.57 14.95 区
なお、 表中のグループ 1 および 2 は、 収穫直後の葉タバコ 表面から採取 した菌株の混合懸濁液、 グループ 3 、 4 および 5 は、 乾燥初期の黄変期 （ 3 日 目 の葉タバコ表面から採取し た菌株） 、 グループ 6 および 7 は褐変期 （ 8 日 目 の葉タバコ 表面から採取 した菌株） からの混合処理区であ る。 表中の％ は、 コ ン ト ロ ール区を 1 0 0 % と した場合の各処理区におけ る T S N A各成分の含量％を示すものである。
表 1 から明かである よ う に、 いずれの微生物混合処理区の T S N A含量も、 コ ン ト ロール区の T S N A含量と 比較 して 減少 した。 特に、 総 T S N A量については、 グループ 1 およ び 2 は、 それぞれコ ン ト ロ ール区に比較 してそれぞれ 4 7 . 8 7 %および 6 4 . 9 5 %にまで減少 した （表 1 ) 。
これらの結果から、 葉面微生物から有用な T S N A分解微 生物が複数分離されたこ と が明 らかになった。
例 3 . T S N A分解微生物の二次選抜
上述の例 2 の結果から、 T S N A分解能に優れていたダル ープ 1 と 2 について更に二次選抜試験を行った。
グループ 1 と 2 に含まれる 1 4 菌株の微生物個々 について の T S N A各成分の分解能を調査 した。
1 / 1 0 T S 液体培地に混合する微生物懸濁液に含まれる 微生物の数を上記例 1 で採取 した微生物 1 菌株 と した以外は、 上記例 2 に記載の方法と 同様な方法を用いて各菌株の T S N A各成分の分解能を調査 した。
なお、 各定量は 2 回の反復の平均で行っ た。
得られた結果を表 2 に示す。 0画^j ¾s2.STl
Figure imgf000017_0001
91
St"8S0/C0df/X3d 6f 9 60/£0 OJW 表 2 力 ら明 ら力、な よ う に L G 3 8 菌株、 L G 4 8 菌株、 L G 5 1 菌株および L G 4 3 菌株は T S N Aの主 4 成分、 即ち、 N N N、 N A T、 N A B および N N Kを分解する能力を有 し、 特に L G 3 8 菌株は、 N N N、 N A T , N A Bお よび N N K 成分をそれぞれ 6 7 . 4 3 %、 7 5 . 4 0 %、 6 6 . 6 6 % および 6 0 . 6 3 %まで低減 し、 トータノレでも 6 8 . 0 0 % まで T S N A含量を低減する こ と ができた。
また、 L G 2 菌株、 L G 5 菌株および L G 7 7 菌株は T S N A成分の う ち N N Kを特異的に分解する能力を有し、 特に L G 5 菌株は N N K含量を 3 . 2 4 %までに低減する能力を 有 している菌株であった。
これらの結果から、 N N Kを特異的に分解する L G 5 菌株 と T S N A各成分を特異的に分解する L G 3 8 菌株を選抜 し た。
これらの微生物を用レヽる こ と に よ り 、 葉タバコ の T S N A を低減する こ と が可能である と示唆された。 また、 これ らの 微生物はたばこの葉か ら分離されたため、 葉タバ コ に対する 定着性に優れてお り 、 従って、 葉タバコ における T S N A分 解活性が安定して得られる と考え られる。
例 4 . 微生物の同定
上記で選抜した L G 5 および L G 3 8 菌株についての菌学 的性質を表 3 、 表 4 に示す。 表 3 G 5 菌株の細菌学的性質 試験項目 性質 形態 桿菌 グラム染色性 ― 胞子 ― 運動性 + 酸素に対する態度 好気性 ォキシダーゼ + カ タ ラーゼ +
O F 一 集落の色調 黄色系 硝酸塩の還元 一 ィ ン ドールの生成 ― グルコースの発酵性 一 アルギニンジヒ ドロ ラーゼ ― ゥ レアーゼ 一 エスク リ ンの分解 + ゼラチンの液化 ― 一ガラ ク トシダーゼ ― 資化性
グルコース +
L ーァラ ビノ ース +
D—マ ン ノ ース 一
D — マ ンニ 1 ル ―
N —ァセチル D —グルコ サ ミ ン + マル トース + グルコ ン酸カ リ ウム + n—力 プリ ン酸
アジ ピン酸
d 1 一リ ンゴ酸 + ク ェン酸ナ ト リ ウム
醉酸フ エ ニ レ 表 4 G 3 8 菌株の細菌学的性質
Figure imgf000020_0001
の結果から、 L G 5菌株はス フィ ン ゴモナス · ノ ゥ シモ ビ リ ( S p h i n g o m o n a s p a u c i m o b i 1 i s ) に属 し、 L G 3 8 菌株はシユ ー ドモナス ' フ ノレオ レ ッセ ンス ( P s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s ) に属する ものである と 同定された。
なお、 上記の菌の同定は日本食品分析セ ン ターに依頼して 行った。
また、 L G 5 は、 特許生物寄託セ ンターに寄託を行い、 2 0 0 1 年 1 2月 1 8 3受託された （受託番号 ： F E R M B P - 7 8 3 0号） 。 同様に L G 3 8 は、 特許生物寄託セ ンタ 一に寄託を行い、 2 0 0 1 年 1 2 月 1 8 日 に受託された （受 託番号 ： F E R M B P — 7 8 3 1 号） 。
実施例 2 ： L G 3 8菌株による乾燥期間中の T S N A含量 低減
1 / 1 0 T S液体培地に L G 3 8菌株を接種し、 3 0 °Cで 7 2時間培養した。 培養後、 こ の菌体を含む培地を 5， 0 0 0 r p mで遠心 し、 菌体を分離および集積した。 菌体を滅菌 蒸留水で 2 回洗浄した後で、 再度滅菌蒸留水に懸濁した。 懸 濁液の菌体濃度を滅菌蒸留水で希釈 し、 l O S l O i O c f u / m 1 に調整した。
所要の菌数に調整した懸濁液を、 収穫して乾燥に供したバ 一レー種 （きたかみ 1 号） の葉タバコに対して処理した。 処 理時期は、 収穫直後、 収穫後 3 目、 および収穫後 8 日 目 の 3 回で、 葉タ ノくコ 1 枚当た り 1 0 m 1 になる よ う に葉タ ノ コ の表裏に噴霧器を使用 して噴霧処理した。
葉タ バ コ の乾燥はパイ プハウスを使用 して行った。 乾燥 1 0 日 目 と 、 2 1 日 目 に処理葉を採取 した。 採取 した葉タバコ を葉肉 （ラ ミ ナ） と 中骨 （ス テ ム） に分離 した後、 これ らを ミ キサーを使用 して粉砕した。 T S N A含量の定量には葉肉 を使用 した。
T S N A 4 成分量 （ N N N、 N N K、 N A T お よび N A B ) の定量は、 例 2 に記載 した方法と 同様によ り 行った。
なお、 総 T S N A量は 4 成分 （ N N N、 N N K：、 N A Tお よび N A B ) の合計値で示 した。 結果を表 5 に示す。 表 5 S N A各成分の合計含量 （ jt/ g Z g )
Figure imgf000022_0001
表 5 の水処理区と は、 処理に際 し、 菌体を含有 しない緩衝 液のみで処理 したものである。
表 5 から、 T S N A含量は各区と も 日数の経過 と共に増加 し、 特に水処理区の増加が著 しい こ と が分かった。 L G 3 8 菌株区は無処理区と 比較 して、 2 1 日 目 には無処理区よ り も T S N A含量が低下 していた。
これらの結果から、 L G 3 8 菌株は T S N A含量を低減さ せる能力を有する こ と が示唆された。
ま た . 亜硝酸態窒素含量におけ る L G 3 8 の影響を調べた 前述のよ う に処理 した葉タバコ での亜硝酸態窒素含量の定 量を行った。 定量の方法は次に示す。
まず、 各区の葉タ ノくコの葉肉 0 . 5 g を 5 0 m 1 溶遠沈管 に採取した。 次に、 下記に示す抽出液 2 5 m 1 を添加 し、 3 0分間振と う して、 亜硝酸態窒素を抽出 した。 抽出液をろ紙 ( A D V A N T E C , N o . 1 ) を用いて濾過 した後、 濾液 1 0 m l を採取し、 そこに活性炭 0 . 5 g を添加 して 1 5分 間振と う した。 その後、 ろ紙 （ A D V A N T E C、 N o . 5 C ) を用いて濾過 し、 活性炭を除去 した。 得られた濾液を亜 硝酸態窒素定量用試料と して用いた。
抽出液 ：
K C 1 ( 1 % K C 1 )
ス /レフ ァ ニノレア ミ ド （ 0 . 5 %ス ノレフ ァ ニノレア ミ ド） ト リ ト ン X — 1 0 0 ( 0 . 1 % ト リ ト ン X— 1 0 0 ) 抽出液中の亜硝酸態窒素の定量には、 オー トアナライ ザー
( B R A N + L U E B B E社製、 A A C S I I ) を使用 し、 5 5 0 n mのフイ ノレ タ ーの透過率から亜硝酸態窒素の含量を 換算 した。 尚、 亜硝酸態窒素の発色には、 1 % の スルフ ァ ニ ルア ミ ド と 0 . 1 %の N—ナフ チルエチ レ ンジァ ミ ン二塩酸 塩を使用 した。 結果を表 6 に示す。
表 6 亜硝酸態窒素 （N 0 2 — N )含量 （ jti g Z g )
処理後 iS 過日数
区 0 曰 S 1 0 曰 目
無処理区 0 . 7 1 1 . 2 5
水処理区 0 . 7 1 3 . 2 9
L G 3 8 菌株区 0 . 7 1 1 . 2 0 表 6 から明 らかである よ う に、 T S N A生成の原因物質で ある亜硝酸態窒素の含量は、 乾燥 1 0 日 目 において、 水処理 区では著 し く 增カ卩 してレヽるが、 それに比較 して、 L G 3 8 菌 株区では無処理区よ り も僅かではあるが亜硝酸態窒素の含量 が低下 していた。
L G 3 8 菌株は、 菌学的性質からは硝酸還元能を有する菌 株である と 同定されたが、 上記の結果から、 無処理区よ り は 硝酸態窒素から亜硝酸態窒素への還元を抑制 している こ と が 示唆された
実施例 3 ： L G 5 菌株によ る N N K低減効果
実施例 2 の 5 の方法において使用 した微生物を L G 5 に代 えた以外は、 実施例 2 に記載の方法と 同様に して N N K含量 を定量 した
結果を表 7 に示す。
N N K成分の含量 （ /Li g Z g )
Figure imgf000024_0001
表 7 よ り 明 らかである よ う に、 N N K含量は、 無処理区で は 2 1 日 までは増加 していたが、 3 2 日 目 （乾燥終了時） に は、 2 1 S 目 よ り も低下 していた。 水処理区、 L G 5 菌株区 と も に 2 1 日 目 までは高い含量を示 していたが、 無処理区と 同様に 3 2 日 目 には 2 1 目 の含量よ り も低下 していた。 L G 5 菌株区の 3 2 日 目含量は、 無処理区の含量よ り 僅かでは あるが低下 していた。 これらの結果か ら、 L G 5 菌株は N N K含量を低減する能力を有 している こ と が示唆された。
こ こで引用 される文献は、 引用によ り その全体が本明細書 に組み込まれる。
更なる利益および変更が当業者によ って容易に想到される であろ う 。 従って、 そのよ う な よ り 広い範囲を有する本発明 は、 こ こ に示 し且つ記載された詳細且つ代表的な態様によ つ て限定される ものではない。 従って、 添付 された請求の範囲 およびそれ らの等価物によ って限定さ れる よ う な全般的な発 明の思想の精神および範囲から逸脱する こ と な く 種々 の変更 が可能であ る。
実施例 4 ： T S N A分解菌処理によ る葉タバコ粉末中の T S N A含量への影響
1 / 1 0 T S液体培地に、 L G 5 菌株お よび L G 3 8 菌株 を各々接種 し、 3 0 °Cで 7 2 時間培養 した培養後、 これら菌 体を含む培地を 5 , 0 0 0 r p mで遠心 し、 菌体を集めた。 菌体を滅菌蒸留水で 2 回洗浄後、 再度、 滅菌蒸留水に懸濁 し た。 菌体濃度を 1 0 8〜 1 0 9 c f u Z m l に調整 した微生 物懸濁液を接種源と した。
L G 5 菌株の実験には、 栃木県小山市 3 本たばこ産業（株） 葉たばこ研究所で栽培 した乾燥タバコ （品種：き たかみ 1 号） の合葉着位の凍結乾燥粉末を、 L G 3 8 菌株の実験には本葉 着位の凍結乾燥粉末を供試 した。 各々のタバコ粉末を乳鉢に量 り 取り 、 所定の水分含量にな る よ う に微生物懸濁液を添加した。 乳棒で粉末中の水分含量 が均一になる よ う に混合した。 接種粉末を三角フ ラ ス コ に量 り 入れ、 所定の温度で静置 した。
分析は、 処理前に採取した試料と静置後 4 週間後に採取し た試料について分析した。 各々 の試料の 5 g を 2 0 0 m 1 容 三角 フ ラ ス コ に量 り 取 り 、 0 . O l M N a O H溶液（T h i m e r o s a l : 1 0 0 /i g ノ m l 含有）を 1 0 0 m l カ卩え、 振と う機によ り 室温で 2 時問抽出 した。 その後、 ろ紙（ A D V A N T E C社、 N o . 5 C )を用いて抽出液をろ過 した。
つレヽで T S N Aの 4成分量（N N N、 N N K：、 N A T及ぴ N A B )を実施例 1 に記載の方法で分析 した。
処理前と静置後 4週間後の T S N A含量を表 8 および表 9 に示す。
表 8 LG38菌株処理による葉タバコ粉末中の T S N A含量の変化
ON
Figure imgf000027_0001
* N A B、 NN Kは検出限界以下であつたので示していない
表 9 LG5菌株処理による葉タバコ粉末中の N N K含量の変化
Figure imgf000028_0001
* NABは検出限界以下であつたので示していない
上記の実験よ り 、 L G 5 菌株は T S N Aの 4成分の中で N N Kを特異的に分解し、 L G 3 8 菌株は、 T S N Aの 4成分 全てを分解した。
L G 5 菌株を処理した合葉粉末の 4週間後の N N K含量は、 処理前よ り 減少 していた。 L G 3 8菌株を処理した本葉の 4 週間後の N N Nおよび N A T含量を処理前と比較する と、 2 成分と もいずれの処理区でも減少 していた。 タバコ粉末を供 試した実験においても、 前述の実験と 同様に L G 5菌株は N N Kを分解し、 L G 3 8菌株は N N Nおよび N A Tを分解し た。
実施例 5 ： T S N A分解菌処理によ る貯蔵葉たばこ中の T S N A含量への影響
L G 3 8菌株を l Z l O T S液体培地に接種し、 3 0 °Cで 7 2 時間培養した。 培養後、 菌体を含む培地を 5 , 0 0 0 r p mで遠心 し、 菌体を集めた。 菌体を滅菌蒸留水で 2 回洗浄 後、 再度滅菌蒸留水に懸濁 した。 菌体濃度を 1 0 8〜 1 0 9 c f u / m 1 に調整した微生物懸濁液を接種源と した。
微生物懸濁液を、 パイ プハウス で乾燥中のバー レ一種の葉 タバコ （中骨乾乾燥末期、 乾燥 2 9 日 目 、 品種：きたかみ 1 号）の表裏に 1 枚当た り 1 0 m l ずつ、 噴霧器を使用 して処 理した。 処理した葉タバコを 3 日 間パイプハウスで乾燥した 後、 貯蔵試験に供試 した。
分析試料の採取：貯蔵を開始する前に、 パイ プハウスから 取降ろ した葉タバコ乾棄の半葉葉肉を採取し、 処理前サンプ ルと した。 残り の中骨が付いた半葉葉肉について貯蔵した。 貯蔵は、 一定の条件に設定した恒温恒湿を使用 した。 貯蔵の 条件と して、 温度 2 0 °C湿度 7 0 %、 温度 2 0 °C湿度 8 0 %、 温度 3 0 °C湿度 8 0 %の三区を設定した。 貯蔵後一ヶ月 、 三 ヶ月 後にサンプリ ング した。 微生物を処理せずに上記と 同様 の条件で貯蔵した乾葉を対照区と した。 採取 した葉タバコを， 葉肉 と 中骨に分離した後、 凍結乾燥した葉肉のサンプルを、 ミ キサーを使用 して粉砕した。 T S N A含量の定量には葉肉 のサンプルのみを使用 した。
前述の処理を した各区の葉肉サンプル約 5 g を 2 0 0 m 1 容三角フ ラ ス コ には力 り 取 り 、 0 . O l M N a O H溶液（T h i m e r o s a 1 ： 1 0 0 μ g / m l 含有）を 1 0 0 m lカロ え、 振と う 機に よ り 室温で 2 時間抽出 した。 その後、 ろ紙 (A D V A N T E C社、 N o . 5 C )を用いて抽出液をろ過 し た。
T S N Aの 4成分量（N N N、 N N ：、 N A T及び N A B ) の定量は、 実施例 1 に記載の方法によ り 分析 した。
結果を、 表 1 0 に示す。
表 1 0 微生物処理による貯蔵葉タバコ中の T SNA含量の変化
Figure imgf000031_0002
o
Figure imgf000031_0001
無処理区の貯蔵 1 ヶ月 後では、 2 0 °C、 7 0 %区および 3 0 °C、 7 0 % 区で増力 U した。 特に、 3 力 月 後で 3 0 °C、 7 0 %および 3 0 °C、 8 0 %区で大き く 增カ [1 した。 L G 3 8 菌 株処理区では、 1 ヶ月 、 3 ヶ月 後に減少する傾向が見られた。 特に、 貯蔵 1 ヶ月 後では大き く 減少 していた。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 葉タ ノく コ に対 して、 ス フ イ ン ゴモナス - ノヽ。ゥシモ ビ リ ス種およびシユー ドモナス · フルォレ ツセ ンス種に属 し、 T S N Aを低減する能力を有する微生物から なる群よ り 選択 される微生物を処理する こ と を特徴する葉タ バ コ の T S N A 含量を低減する方法。
2 . 前記 T S N Aを低減する微生物を処理する こ と が、 葉タバコ の収穫直前および Zまたは乾燥期の開始時から貯蔵 期の終了時までの間に行われる こ と を特徴とする請求項 1 に 記載の方法。
3 . 前記 T S N Aを低減する微生物を処理する こ と が、 懸濁液または乾燥菌体の何れかの状態にある前記微生物の菌 体を、 散布または塗布の何れかの方法によ って行われる こ と を特徴と する請求項 1 に記載の方法。
4 . 前記 T S N Aを低減する微生物を処理する こ と が、 懸濁液または乾燥菌体の何れかの状態にある前記微生物の菌 体を、 散布または塗布の何れかの方法によ って行われる こ と を特徴とする請求項 2 に記載の方法。
5 . 前記 T S N Aが、 N '— ニ ト ロ ソ ノ ノレニ コチン、 4 - ( Ν '— ニ ト ロ ソ メ チルァ ミ ノ ） 一 1 — ( 3 — ピ リ ジノレ ） — 1 —ブタ ノ ン） 、 N '—ニ ト ロ ソ アナタ ビンおよび Ν '—二 ト ロ ソアナバシンか ら なる群よ り 選択される少な く と も 1 つ である こ と を特徴と する請求項 1 に記載の方法。
6 . 前記葉タバコ が、 在来種およびバー レ一種か ら なる 群よ り 選択される こ と を特徴と する請求項 1 に記載の葉タパ コ の T S Ν Α含量を低減する方法。
7 . 葉タ ノく コ に対 して、 ス フ イ ン ゴモナス · ノ ゥ シモ ビ リ ス L G 5 菌株およびシユ ー ドモナス · フノレオ レ ツセ ンス L G 3 8 菌株から なる群よ り 選択される T S N Aを低減する微 生物を処理する こ と を特徴する葉タ バ コ の T S N A含量を低 減する方法。
8 . 前記 T S N Aを低減する微生物を処理する こ と が、 葉タバコの収穫直前および Zまたは乾燥期の開始時か ら貯蔵 期の終了時までの間に行われる こ と を特徴と する請求項 7 に 記載の方法。
9 . 前記 T S N Aを低減する微生物を処理する こ と が、 懸濁液または乾燥菌体の何れかの状態にある前記微生物の菌 体を、 散布または塗布の何れかの方法に よ って行われる こ と を特徴とする請求項 7 に記載の方法。
1 0 . 前記 T S N Aが、 Ν '— ニ ト ロ ソ ノ ルニ コ チ ン、 4 — ( Ν '— ニ ト ロ ソ メ チル ァ ミ ノ ） 一 1 — ( 3 — ピ リ ジ ル） 一 1 — ブ タ ノ ン） 、 N '— ニ ト ロ ソ ア ナ タ ビ ンお よ び N ' 一 二 ト ロ ソアナバシンカゝら なる群よ り 選択さ れる少な く と も 1 つである こ と を特徴とする請求項 7 に記載の方法。
1 1 . 前記葉タバ コが、 在来種およびバー レ一種か らな る群よ り 選択さ れる こ と を特徴 と する請求項 7 に記載の葉タ バコ の T S Ν Α含量を低減する方法。
1 2 . ス フ イ ン ゴモナス ' ノ、。 ゥ シモ ビ リ スま たはシユ ー ドモナス · フルォ レ ツ セ ンス に属 し、 葉タ バ コ の乾燥およ び 貯蔵中に生成する N '— 二 ト ロ ソ ノ ノレニ コチン、 4 — ( Ν '— ニ ト ロ ソ メ チルァ ミ ノ ） 一 1 — ( 3 — ピ リ ジル） 一 1 —ブタ ノ ン） 、 Ν '—ニ ト ロ ソアナタ ビンお よび Ν '— ニ ト ロ ソ アナ バシンか ら なる群よ り 選択される少な く と も 1 成分の葉タパ コ 中の含量を低減する能力 を有する微生物。
1 3 . 葉タバコ 中の T S N A含量を低減する ス フ イ ン ゴ モナス . ノヽ0ゥシモ ビ リ ス L G 5 菌株 （ F E R M B P — 7 8 3 0 ) 。
1 4 . 葉タ ノく コ 中 の T S N A含量を低減する シユ ー ドモ ナス . フルォ レ ツ セ ンス L G 3 8 菌株 （ F E R M B P — 7 8 3 1 ) 。
1 5 . 葉タ ノく コ に対して、 ス フ イ ンゴモナス ' ノヽ ° ゥ シモ ビ リ ス種およ びシユ ー ドモナス ■ フルォ レ ツセ ンス種に属 し、 T S N Aを分解する能力を有する微生物か ら なる群よ り 選択 される微生物を処理する こ と を特徴する葉タバコの T S N A 含量を低減する方法。
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